DE10333509B4

DE10333509B4 - VEGF-directed recognition molecules and the use of these

Info

Publication number: DE10333509B4
Application number: DE10333509A
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr. Schwenzer; Axel Dr. Meye; Yvonne Förster
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2023-07-19
Also published as: DE10333509A1

Abstract

Erkennungsmolekül, gerichtet gegen das Gen des Vascular Endothelial Growth Factor, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungsmolekül, welches ein Nukleinsäurekonstrukt ausgewählt aus einem Antisense-Oligonukleotid, einem DNAzym, einer Peptid-Nukleinsäure, einem Ribozym und/oder einer siRNA ist, mit der mRNA von VEGF in einem Zielsequenzbereich von 718 bis 747, von 852 bis 881 und/oder von 869 bis 898 gemäß der Genbank-Eintragung M32977 spezifisch interagiert.Recognition molecule, directed against the gene of the vascular endothelial growth factor, characterized that the recognition molecule, which is a nucleic acid construct selected from an antisense oligonucleotide, a DNAzyme, a peptide nucleic acid, a Ribozyme and / or a siRNA is, with the mRNA of VEGF in one Target sequence range from 718 to 747, from 852 to 881 and / or from 869-898 according to the Genbank Registry M32977 specifically interacts.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Erkennungsmoleküle, die gegen ein Gen des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) gerichtet sind sowie die Verwendung dieser Erkennungsmoleküle zur Diagnose, Prophylaxe, Behandlung, Verlaufskontrolle von mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen.The The present invention relates to recognition molecules which are directed against a gene of the vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) are directed as well as use of these recognition molecules for diagnosis, prophylaxis, treatment, follow-up of with Cell growth, differentiation and / or division related standing diseases, such as tumors.

Es ist bekannt, dass während der Embryogenese Blutgefäße durch 2 verschiedene Prozesse gebildet werden – Vaskularisation und Angiogenese. Vaskularisation ist die de novo-Differenzierung von Endothelzellen aus mesodermalen Vorläuferzellen, während bei der Angiogenese neue Gefäße aus bereits existierenden Gefäßen gebildet werden. Vaskularisation findet nur während der embryonalen Entwicklung statt und führt zur Formierung eines primären Gefäßgeflechtes. Zu einem späteren Zeitpunkt wird dieses Geflecht aus gleichgroßen Gefäßen in das ausgereifte Gefäßsystem mit unterschiedlich großen, baumartig verzweigten Gefäßen umgebildet. Neue Kapillaren werden durch Angiogenese endweder durch sprießen neuer oder Teilung vorhandener Gefäße geformt. In Erwachsenen ist Angiogenese essentiell für den weiblichen Fortpflanzungszyklus und für die Reparatur, Remodellierung und Regeneration von Gewebe, zum Beispiel bei der Wundheilung. Angiogenese ist ebenfalls entscheidend in pathologischen Prozessen wie Tumorwachstum und Metastasierung.It is known that during embryogenesis of blood vessels 2 different processes are formed - vascularization and angiogenesis. Vascularization is the de novo differentiation of endothelial cells mesodermal precursor cells, while in angiogenesis new vessels already made formed existing vessels become. Vascularization occurs only during embryonic development instead of and leads for the formation of a primary Vascular plexus. At a later time Time, this braid of equally sized vessels in the mature vascular system with different sizes, transformed tree-branched vessels. New capillaries are sprouted by angiogenesis either by new ones or division of existing vessels formed. In adults, angiogenesis is essential for the female reproductive cycle and for the Repair, remodeling and tissue regeneration, for example in wound healing. Angiogenesis is also crucial in pathological Processes such as tumor growth and metastasis.

In der Familie der spezifischen Wachstumsfaktoren für Endothelzellen sind zahlreiche Faktoren bekannt, die für die Entwicklung und Differenzierung des vaskulären Systems verantwortlich sein können. Mit zahlreichen dieser Faktoren wurden Versuche zur Hemmung des Tumorwachstums durchgeführt.In The family of specific growth factors for endothelial cells are numerous Factors known for responsible for the development and differentiation of the vascular system could be. With many of these factors, attempts to inhibit the Tumor growth performed.

Bisher stehen im Stand der Technik nachteilhafter Weise jedoch keine Mittel oder Verfahren zur Verfügung, mit denen Vaskulalrisation bzw. die Angiogenese bei der Bildung von Tumoren verhindert werden kann.So far However, in the prior art disadvantageously no means or procedures available, with which vasculature or angiogenesis in the formation can be prevented by tumors.

Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Erkennungsmoleküls, das gegen die VEGF-mRNA gerichtet ist, wobei das Erkennungsmolekül insbesondere mit Primärstrukturen dieser VEGF-mRNA in einem Zielsequenzbereich von 600 bis 990 gemäß dem Datenbankeintrag M 32977 spezifisch interagiert. Die Zahlen repräsentieren – auch in den folgenden Abschnitten – die entsprechenden Nukleotidpositionen innerhalb der VEGF-mRNA (Gesamtlänge 990 Nukleotide). Die Erfindung betrifft also die überraschende Lehre, dass gegen tumorassoziierte abnorme VEGF-mRNA-Expressionsmuster durch eine mögliche VEGF-Inhibierung mit den erfindungsgemäßen Erkennungsmolekülen vorgegangen werden kann.The Invention solves This technical problem is the provision of a recognition molecule that is resistant to the VEGF mRNA is directed, wherein the recognition molecule in particular with primary structures this VEGF mRNA in a target sequence range of 600 to 990 according to the database entry M 32977 specifically interacts. The numbers represent the corresponding ones, also in the following sections Nucleotide positions within the VEGF mRNA (total length 990 Nucleotides). The invention thus relates to the surprising teaching that against tumor-associated abnormal VEGF mRNA expression patterns by a possible VEGF inhibition proceeded with the recognition molecules of the invention can be.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Erfindungsgemäß interagiert das Erkennungsmolekül spezifisch mit dem Zielsequenzbereich von 718 bis 747, von 852 bis 881 und/oder von 869 bis 898. Vorteilhafterweise ist in diesen Sequenzbereichen eine besonders effiziente VEGF-Inhibierung möglich. Bevorzugt sind ebenfalls kürzere Bereiche mit Veränderungen innerhalb dieser Target-Sequenzen oder mit veränderten Randbereichen oder unterschiedlichen Derivatisierungen/Modifizierungen/Fusionen/Komplexierungen, die auch mit anderen Erkennungsmolekülen kombiniert und/oder gekoppelt sein können.The Invention is realized according to the claims. Interacts according to the invention the recognition molecule specifically with the target sequence range from 718 to 747, from 852 to 881 and / or from 869 to 898. Advantageously, in these sequence regions a particularly efficient VEGF inhibition possible. Preferred are also shorter Areas with changes within these target sequences or with changed Peripheral areas or different derivatizations / modifications / mergers / complexations, which are also combined and / or coupled with other recognition molecules could be.

Durch diese Zielsequenzbereiche ist es dem Fachmann möglich, insbesondere sehr kleine und/oder kompakte Erkennungsmoleküle bereitzustellen, die im Wesentlichen nicht mit anderen Strukturen, insbesondere immunologischen Abwehrstrukturen, innerhalb des Zellgewebes bzw. des Organismus interagieren oder von diesen angegriffen werden, sondern spezifisch mit dem Zielsequenzbereich der VEGF-mRNA interagieren können.By these target sequence areas are possible for the person skilled in the art, in particular very small ones and / or provide compact recognition molecules that are known in the Essentially not with other structures, in particular immunological Defense structures, within the cell tissue or the organism interact or be attacked by them, but specifically can interact with the target sequence region of the VEGF mRNA.

Das Erkennungsmolekül ist ein Nukleinsäurekonstrukt. Im Sinne der Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt ein Antisense(AS)-Oligonukleotid(ON), ein DNAzym, ein Ribozym, eine siRNS und/oder eine Peptid-Nukleinsäure (PNA).The recognition molecule is a nucleic acid construct. For the purposes of the invention, the nucleic acid construct is an antisense (AS) oligonucleotide (ON), a DNAzyme, a ribozyme, a siRNA and / or a peptide nucleic acid (PNA).

Bei AS-Konstrukten handelt es sich um synthetisch hergestellte ON, die eine selektive Inhibition der Biosynthese ausgewählter Proteine ermöglichen. Zum Einsatz kommen zum Beispiel Oligonukleotide (ON), (PNAs), Ribozyme, DNAzyme. Die AS-Wirkung beruht auf der sequenzspezifischen Hybridisierung der Konstrukte durch Watson-Crick-Basenpaarung mit der für das zu reprimierende Protein kodierenden Ziel-mRNA, was über verschiedene Mechanismen zu einer Verhinderung der Proteinsynthese führt (Tab. 1). Tab. 1 AS-Effekte und ihre Wirkungsmechanismen Ss – „single stranded" (Einzelstrang)

AS constructs are synthetically engineered ON that allow selective inhibition of the biosynthesis of selected proteins. For example, oligonucleotides (ON), (PNAs), ribozymes, DNAzymes are used. The AS effect is based on the sequence-specific hybridization of the constructs by Watson-Crick base pairing with the target mRNA coding for the protein to be repressed, which leads to a prevention of protein synthesis via various mechanisms (Table 1). Tab. 1 AS-effects and their mechanisms of action Ss - "single stranded"

Die Entwicklung von AS-ON als therapeutische Substanzen stellt neben verschiedenen anderen Anwendungsfeldern auch ein neues erfolgversprechendes Therapiekonzept für onkologische Erkrankungen dar. Während es bei der konventionellen Chemotherapie zu einer unspezifischen Hemmung der Zellproliferation kommt, werden mit der AS-Therapie ganz gezielt solche mRNAs inaktiviert, die die molekulare Grundlage oder ein wesentlicher Bestandteil für das entartete, deregulierte Wachstum und die Tumorprogression darstellen sowie für die Inhibierung der körpereigenen Immunabwehr verantwortlich sein können.The Development of AS-ON as a therapeutic substance adds various other fields of application also a new promising Therapy concept for oncological diseases. During it is non-specific in conventional chemotherapy Inhibition of cell proliferation comes, are specifically targeted with AS therapy such mRNAs inactivates the molecular basis or a essential ingredient for represent degenerate, deregulated growth and tumor progression also for the inhibition of the body's own Immune defense may be responsible.

AS-ON unterscheiden sich von anderen Therapeutika, wie Antikörpern, Toxinen oder Immuntoxinen dahingehend, dass es sich um relativ kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von üblicherweise etwa 5 kDa handelt. Die geringe Größe der AS-ON ermöglicht eine gute Gewebepenetration. Außerdem ist bekannt, dass Tumorblutgefäße im Gegensatz zu Blutgefäßen normaler Gewebe für Substanzen in einem Größenbereich zwischen 4-10 kDa durchlässig sind. Das bedeutet, dass therapeutische AS-ON gezielt Tumorblutgefäße penetrieren können. Ein weiterer Vorteil dieser Substanzen, zum Beispiel gegenüber Antikörpern, die nahezu ausschließlich gegen extrazelluläre Proteine wirksam sind, besteht darin, dass über die jeweilige Ziel-mRNA prinzipiell alle, also sowohl zytoplasmatische als auch kernlokalisierte sowie membranständige Proteine angegriffen werden können.AS-ON differ from other therapeutics, such as antibodies, toxins or immunotoxins in that they are relatively small molecules with a Molecular weight of usually about 5 kDa is. The small size of the AS-ON allows one good tissue penetration. Furthermore It is known that tumor blood vessels in contrast normal to blood vessels Tissue for Substances in a size range between 4-10 kDa permeable are. This means that therapeutic AS-ON selectively penetrate tumor blood vessels can. Another advantage of these substances, for example, compared to antibodies that almost exclusively against extracellular Proteins are effective, is that on the respective target mRNA in principle all, both cytoplasmic as well as nuclear localized as well membrane-bound Proteins can be attacked.

Die gegen einen Nuklease-Angriff relativ resistente Phosphorthioat-AS-ON werden gegnwärtig in einer Reihe vonklinischen Studien (Phase I-III) hinsichtlich ihres Potentials als Anit-Krebs-Therapeutika evaluiert. Dabei werden in Tumoren überexprimierte Ziel-mRNA Moleküle angegriffen.The phosphorothioate AS-ON relatively resistant to nuclease attack be thanked in a series of clinical trials (Phase I-III) their potential as anit cancer therapeutics. It will be overexpressed in tumors Target mRNA molecules attacked.

Bei der Verwendung der Phosphothioat-ON (PS-ON) wurde eine Reihe von unerwarteten, so genannten „non-AS"-Effekten beobachtet, die zudem zu einer unspezifischen Hemmung des Zellwachstums führen können. Diese Effekte sind stark von der ON-Sequenz bzw. von bestimmten Sequenzmotiven abhängig und treten auf Grund der starken polyanionischen Ladung der PS-ON auf, welche eine Bindung der PS-ON an lebenswichtige Proteine zu folge haben kann. Die erwähnten Effekte können insbesondere durch die Verwendung von partiell phosphothioat-modifizierten AS-ON oder durch weitere Modifikationen, z.B. Einbau von Ribonukleotiden anstatt Desoxyribonukleotiden, vorteilhaft verbessert und effektiviert werden. Eine endständige Modifizierung von ON-Konstrukten (bevorzugt 2 bis 5 Bindungen vom 3'- und 5'-Nukleinsäureterminus sind modifiziert) bietet insbesondere eine verbesserte Stabilität bei einer Applikation in vivo und im extra- und intrazellulären Milieu der Zielzellen (Schutz insbesondere vor Abbau durch Exonukleasen). Ein positiver Nebeneffekt, der bei der Verwendung von PS-ON beobachtet wurde, ist deren immunstimulatorische Wirkung, die bei einigen Tumoranwendungen durchaus einen möglichen Therapieerfolg unterstützen kann.at The use of phosphothioate-ON (PS-ON) has been a number of unexpected, so-called "non-AS" effects, which can also lead to a non-specific inhibition of cell growth. These Effects are strong on the ON sequence or on certain sequence motifs dependent and occur due to the strong polyanionic charge of PS-ON which allows binding of PS-ON to vital proteins can have consequences. The mentioned Effects can in particular by the use of partially phosphothioate-modified AS-ON or by further modifications, e.g. Incorporation of ribonucleotides instead of deoxyribonucleotides, advantageously improved and improved become. A terminal modification of ON constructs (Preferably 2 to 5 bonds from the 3 'and 5' nucleic acid terminus are modified) offers in particular an improved stability in a Application in vivo and in the extracellular and intracellular milieu the target cells (protection in particular against degradation by exonucleases). A positive side effect observed with the use of PS-ON is their immunostimulatory effect, which in some tumor applications quite a possible one Support therapy success can.

Zur Erhöhung der Stabilität und Spezifität von AS-ON und zur Verminderung der „non-AS"-Effekte können weitere chemische Modifikationen zum Einsatz kommen, z.B. Einbau von 2'-O-Methylribonukleotiden, Methylphosphonat-Segmenten, „locked nucleic acids" (Methylenbrücke zwischen 2'-Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff der Ribose), Austausch des Cytosins durch 5'-Methylcytosin und/oder eine 2'-5'-Tetraadenylat-Modifizierung.to increase stability and specificity from AS-ON and to reduce the "non-AS" effects can be further chemical modifications are used, e.g. Incorporation of 2'-O-Methylribonucleotides, Methylphosphonate Segments, "locked nucleic acids "(methylene bridge between 2'-oxygen and 4'-carbon of Ribose), replacement of cytosine by 5'-methylcytosine and / or a 2'-5'-tetraadenylate modification.

Dabei kann es sich sowohl um eine partiell modifizierte oder vollständig via dieser chemischen Modifikationen veränderte ON-Konstrukte handeln.there It can be either a partially modified or completely via These chemical modifications alter ON-constructs.

Ribozyme sind als katalytisch aktive RNA-Moleküle in der Lage, zelluläre RNA-Strukturen als Substrate zu erkennen und sequenzspezifisch an einer Phosphodiesterbindung zu spalten. Die Erkennung erfolgt über AS-Arme, die auf Grund komplementärer Sequenzen eine Hybridisierung mit der Ziel-mRNA ermöglichen. Gegenüber AS-ON besitzen Ribozyme den grundsätzlichen Vorteil, dass ein Riboym-Molekül als echter Katalysator eine große Anzahl identischer Substratmoleküle umsetzen kann. Daher sind Ribozyme bereits in wesentlich geringerer Konzentration als ON wirksam und führen darüber hinaus durch die Substrat-Spaltung zu einem irreversiblen RNA-Abbau [Sun et al.]ribozymes As catalytically active RNA molecules are capable of cellular RNA structures as substrates and sequence-specific to a phosphodiester bond to split. The detection takes place via AS arms, which are based on complementary Sequences enable hybridization with the target mRNA. Opposite AS-ON have ribozymes the fundamental Advantage that a ribozyme molecule as a real catalyst a big one Number of identical substrate molecules can implement. Therefore, ribozymes are already much lower Concentration as ON effective and also lead by the substrate cleavage irreversible RNA degradation [Sun et al.]

Unter den bisher bekannten Ribozymtypen ist das Hammerhead-Ribozym (Review: Birikh et al., 1997; Tanner 1999) für derartige Anwendungen besonders vorteilhaft, weil es als vergleichsweise kleines Molekül (ca. 30-50 Nukleotide) bereits katalytisch aktiv sein kann. Ein sehr wirksames trans-spaltendes Hammerhead-Ribozym besteht zum Beispiel aus lediglich 14 konservierten Nukleotiden in der katalytischen Domäne und zwei variablen Stammsequenzen (vorteilhafterweise aus jeweils 6-8 Nukleotiden), die durch Watson-Crick-Basenpaarung (analog der AS-ON) die sequenzspezifische Erkennung des zu spaltenden Substrates realisieren und dieses anschließend durch Spaltung einer Phosphordiesterbindung inaktivieren. In dieser Form lässt sich praktisch gegen jedes beliebige RNA-Molekül, welches eine potentielle Spaltstelle mit der minimalen Sequenzanforderung -NUX- besitzt, ein spezifisch spaltendes Hammerhead-Ribozym konstruieren und somit beispielsweise zelluläre mRNA oder virale RNA inhibieren. Weitere katalytische Nukleinsäuren vom DNA-Typ (z.B. DNAzyme) sind analog einsetzbar.Under hitherto known ribozyme types is the hammerhead ribozyme (Review: Birikh et al., 1997; Tanner 1999) for such applications in particular advantageous because it is a comparatively small molecule (about 30-50 Nucleotides) may already be catalytically active. A very effective one For example, trans-cleaving hammerhead ribozyme consists of only 14 conserved nucleotides in the catalytic domain and two variable stem sequences (advantageously from 6-8 nucleotides each), by Watson-Crick base pairing (analogous to AS-ON) the sequence-specific Realize detection of the substrate to be cleaved and this then by Inactivate cleavage of a phosphodiester bond. In this form let yourself Virtually against any RNA molecule that has a potential Has cleavage site with the minimum sequence request -NUX-, construct a specific cleaving hammerhead ribozyme and thus for example, cellular Inhibit mRNA or viral RNA. Other catalytic DNA-type nucleic acids (e.g., DNAzyme) are analogously usable.

RNAi („RNA interference") ist eine neue Methodik, die eine spezifische Geninhibierung von Zielmolekülen auf mRNA-Ebene ermöglicht. Hierfür müssen doppelsträngige RNA-Moleküle („small interference RNA", siRNA) mit ihren zwei Nukleotiden langen 3'-Überhängen, bestehend bevorzugt aus Thymidin-Nukleotiden in Zellen transfiziert werden. Zunächst erfolgt eine Assoziation der siRNA-Konstrukte mit spezifischen zellulären Proteinen, gefolgt durch die Erkennung der Ziel-mRNA-Sequenz auf Grund der Komplementarität des AS-siRNA-Stranges. Die intrinsische Endonukleaseaktivität des Ribonukleoproteinkomplexes ermöglicht eine spezifische Degradation der zu inhibierenden mRNA.RNAi ( "RNA interference ") a new methodology involving specific gene inhibition of target molecules mRNA level allows. Therefor have to double RNA molecules ( "Small interference RNA ", siRNA) with its two nucleotide long 3'-overhangs, consisting preferably be transfected from thymidine nucleotides into cells. First there is an association of the siRNA constructs with specific cellular proteins, followed by recognition of the target mRNA sequence due to the complementarity of the AS-siRNA strand. The intrinsic endonuclease activity of the ribonucleoprotein complex allows a specific degradation of the mRNA to be inhibited.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das AS-ON ein PS-ON bzw. ein mit weiteren chemischen Veränderungen modifiziertes Nukleinsäurekonstrukt.In a particular embodiment the invention, the AS-ON is a PS-ON or one with more chemical changes modified nucleic acid construct.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Sequenzbereich der VEGF-mRNA, zu der das Erkennungsmolekül komplementär ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend 720-742, 750-772, 752-774, 858-870 und/oder 875-897. Mit diesen Sequenzbereichen ist es vorteilhafterweise möglich, die Genexpression des Vascular Endothelial Growth Factor zu inhibieren. Durch die Inhibierung können unter anderem Krankheiten, die mit der Expression dieses Gens assoziiert sind, unterdrückt werden, wie zum Beispiel Tumoren.In a further preferred embodiment of the invention, the sequence region of the VEGF mRNA to which the recognition molecule is complementary is selected from the group comprising 720-742, 750-772, 752-774, 858-870 and / or 875-897. With these sequence regions, it is advantageously possible to inhibit the gene expression of the vascular endothelial growth factor. By the inhibition Kings Among other diseases that are associated with the expression of this gene are suppressed, such as tumors.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Erkennungsmolekül immobilisiert. Im Sinne der Erfindung werden unter Immobilisierung verschiedene Verfahren und Techniken zum Fixieren der Erkennungsmoleküle auf bestimmten Trägern verstanden. Die Immobilisierung kann beispielsweise der Stabilisierung der Erkennungsmoleküle dienen, wodurch diese insbesondere bei Lagerung oder bei einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität nicht reduziert oder nachteilig modifiziert werden. Durch die Immobilisierung der Erkennungsmoleküle ist ein wiederholter Einsatz unter technischen oder klinischen Routine-Bedingungen möglich; weiterhin kann die Probe mit den Erkennungsmolekülen kontinuierlich umgesetzt werden. Die kann insbesondere durch verschiedene Immobilisie rungstechniken erreicht werden, wobei die Bindung der Erkennungsmoleküle an andere Erkennungsmoleküle oder Moleküle bzw. an einen Träger so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum der entsprechenden Moleküle, insbesondere der Erkennungsmoleküle, nicht verändert wird. vorteilhafterweise geht die Spezifität zur VEGF-mRNA und die Spezifität der eigentlichen Bindungsreaktion durch die Immobilisierung nicht verloren. Im Sinne der Erfindung können drei grundsätzliche Methoden zur Immobilisierung verwendet werden:

(i) Quervernetzung: Bei der Quervernetzung werden die Erkennungsmoleküle miteinander fixiert, ohne dass ihre Aktivität nachteilig beeinflusst wird. Sie sind vorteilhafterweise durch die Quervernetzung nicht mehr löslich.
(ii) Bindung an einen Träger: Die Bindung an einen Träger erfolgt zum Beispiel durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente Bindung. Dies kann auch innerhalb von mikrobiellen Zellen bzw. Liposomen oder anderen membranhaltigen geschlossenen bzw. offenen Strukturen erfolgen. Das Erkennungsmolekül wird durch die Fixierung vorteilhafterweise nicht in seiner Aktivität beeinflusst. Es kann mit Vorteil zum Beispiel in der Klinik in Diagnose oder Therapie trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzte werden.
(iii) Einschluss: Der Einschluss erfolgt im Sinne der Erfindung insbesondere an eine semipermeable Membran in Form von Gelen, Fibrillen oder Fasern. Gekapselte Erkennungsmoleküle sind durch eine semipermeable Membran so durch die umgebende Probenlösung getrennt, dass sie vorteilhafterweise noch mit VEGF oder Fragmenten interagieren können.

In a further preferred embodiment of the invention, the recognition molecule is immobilized. For the purposes of the invention, immobilization means various methods and techniques for fixing the recognition molecules on specific supports. The immobilization can be used, for example, to stabilize the recognition molecules, so that they are not reduced or adversely modified in their activity, in particular during storage or in the case of a one-time batch batch by biological, chemical or physical agents. Immobilization of the recognition molecules allows for repeated use under routine technical or clinical conditions; Furthermore, the sample can be reacted continuously with the recognition molecules. This can be achieved in particular by various immobilization techniques, wherein the binding of the recognition molecules to other recognition molecules or molecules or to a support takes place in such a way that the three-dimensional structure at the active center of the corresponding molecules, in particular the recognition molecules, is not changed. Advantageously, the specificity to the VEGF mRNA and the specificity of the actual binding reaction is not lost by the immobilization. For the purposes of the invention, three basic methods of immobilization can be used:

(i) Cross-linking: In cross-linking, the recognition molecules are fixed together without adversely affecting their activity. They are advantageously no longer soluble by the crosslinking.
(ii) Binding to a Carrier: Binding to a carrier occurs, for example, by adsorption, ionic bonding or covalent bonding. This can also take place within microbial cells or liposomes or other membrane-containing closed or open structures. The recognition molecule is advantageously not affected by the fixation in its activity. It can be used with advantage for example in hospital in diagnosis or therapy carrier-bound multiple or continuous.
(iii) Inclusion: In the sense of the invention, the inclusion takes place in particular on a semipermeable membrane in the form of gels, fibrils or fibers. Encapsulated recognition molecules are separated by a semipermeable membrane by the surrounding sample solution so that they can advantageously still interact with VEGF or fragments.

Für die Immobilisierung stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, wie beispielsweise die Adsorption an einen inerten oder elektrisch geladenen anorganischen oder organischen Träger. Solche Träger können beispielsweise poröse Gele, Aluminiumoxid, Betonid, Agarose, Stärke, Nylon oder Polyacrylamid sein. Die Immobilisierung erfolgt hierbei durch physikalische Bindungskräfte, oft unter Beteiligung von hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen Bindungen. Derartige Methoden sind vorteilhafterweise einfach zu handhaben und sie beeinflussen die Konformation der Erkennungsmoleküle nur in geringem Umfang. Durch elektrostatische Bindungskräfte zwischen den geladenen Gruppen der Erkennungsmoleküle und dem Träger kann die Bindung vorteilhafterweise verbessert werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Ionenaustauschern, wie zum Beispiel Sephadex. Ein weiteres Verfahren ist die kovalente Bindung an Trägermaterialien. Die Träger können dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare Bindungen eingehen. Geeignete Gruppen in Erkennungsmolekülen sind Carboxy-, Hydroxy- und Sulfidgruppen und insbesondere die endständigen Aminogruppen von Lysinen. Aromatische Gruppen bieten die Möglichkeit für Diazo-Kupplungen. Die Oberfläche von mikroskopischen porösen Glaspartikeln kann durch die Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Erkennungsmolekülen gekoppelt werden. Mit Polyacrylamid-Harzen können zahlreiche Erkennungsmoleküle vorteilhafterweise direkte kovalente Bindungen eingehen. Bei dem Einschluss in dreidimensionale Netzwerke werden die Erkennungsmoleküle in ionotrophe Gele oder andere dem Fachmann bekannte Strukturen eingeschlossen. Die Poren der Matrix sind insbesondere so beschaffen, dass die Erkennungsmoleküle zurückgehalten werden und eine Interaktion mit den Ziel-Molekülen möglich ist. Bei der Quervernetzung werden die Erkennungsmoleküle durch Vernetzung mit bifunktionellen Agenzien in polymere Aggregate umgewandelt. Derartige Strukturen sind gelatinös und leicht verformbar und insbesondere für den Einsatz in verschiedenen Reaktoren geeignet. Durch die Zugabe anderer interaktiver Komponenten, wie zum Beispiel Gelatine, bei der Vernetzung können die mechanischen und enzymatischen Eigenschaften vorteilhafterweise verbessert werden. Bei einer Mikroverkapselung wird der Reaktionsraum der Erkennungsmoleküle mit Hilfe von Membranen eingegrenzt. Die Mikroverkapselung kann zum Beispiel als Grenzflächen-Polymerisation durchgeführt werden. Durch die Immobilisierung bei der Mikroverkapselung werden die Erkennungsmoleküle unlöslich und dadurch wieder verwendbar. Im Sinne der Erfindung sind immobilisierte Erkennungsmoleküle alle Erkennungsmoleküle, die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt. Die Einschränkung der Beweglichkeit und der Löslichkeit der Erkennungsmoleküle auf chemischen, biologischen oder physikalischen Wege führt vorteilhafterweise zu niedrigen Verfahrenskosten.For immobilization Various methods are available, such as the Adsorption to an inert or electrically charged inorganic or organic carrier. Such carriers for example porous Gels, alumina, concrete, agarose, starch, nylon or polyacrylamide be. The immobilization takes place here by physical binding forces, often involving hydrophobic interactions and ionic Bonds. Such methods are advantageously easy to handle and they affect the conformation of the recognition molecules only in small extent. By electrostatic bonding forces between the charged groups of the recognition molecules and the carrier can the bond can be advantageously improved, for example by the use of ion exchangers, such as Sephadex. Another method is covalent bonding to support materials. The carriers can do that have reactive groups homopolar with amino acid side chains Make bonds. Suitable groups in recognition molecules are Carboxy, hydroxy and sulfide groups and in particular the terminal amino groups of lysines. Aromatic groups offer the possibility for diazo couplings. The surface of microscopic porous Glass particles can be activated by treatment with silanes and subsequently with recognition molecules be coupled. With polyacrylamide resins, numerous recognition molecules can be advantageously make direct covalent bonds. When included in three-dimensional Networks are the recognition molecules in ionotropic gels or including other structures known to those skilled in the art. The pores In particular, the matrix is such that the recognition molecules are retained and interaction with the target molecules is possible. In the cross-linking become the recognition molecules by crosslinking with bifunctional agents in polymeric aggregates transformed. Such structures are gelatinous and easily deformable and especially for suitable for use in various reactors. By the addition other interactive components, such as gelatin of networking the mechanical and enzymatic properties advantageously be improved. In a microencapsulation, the reaction space the recognition molecules bounded by membranes. The microencapsulation can For example, be carried out as interfacial polymerization. Due to the immobilization in the microencapsulation, the recognition molecules become insoluble and reusable. For the purposes of the invention are immobilized Recognition molecules all Recognition molecules, which are in a state that allows their reuse. The restriction agility and solubility the recognition molecules by chemical, biological or physical means advantageously at low process costs.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, gegebenenfalls in einer Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Dieser pharmazeutische Träger kann insbesondere zusätzliche Stoffe und Substanzen, wie beispielsweise medizinische und/oder pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe, umfassen. Medizinische Hilfsstoffe sind beispielsweise solche Stoffe, die zur Produktion als Ingredienzien von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Pharmazeutischtechnische Hilfsstoffe dienen der geeigneten Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Arzneimittels und könne sogar – sofern sie nur während des Herstellungsverfahrens benötigt werden – anschließend entfernt werden oder können als pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels. Hierbei kann es sich beispielsweise um phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen und ähnliches, handeln. Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung kann beispielsweise im Zusammenhang mit einer Gentherapie geschehen.The The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the recognition molecules of the invention, optionally in a combination with a pharmaceutically acceptable Carrier. This pharmaceutical carrier especially extra Substances and substances, such as medical and / or Pharmaceutical-technical adjuvants include. Medical adjuvants For example, such substances are those for production as ingredients of pharmaceutical compositions. Pharmazeutischtechnische Auxiliary substances serve for the suitable formulation of the pharmaceutical Composition or of the medicinal product and may even - provided they Manufacturing process needed be - then removed be or can as pharmaceutically acceptable carrier substances Be part of the pharmaceutical composition. The pharmaceutical Composition is optionally in combination with a pharmaceutically acceptable Diluent. This may be, for example, phosphate buffered saline, water, Emulsions, such as oil / water emulsions, various Types of detergents, sterile solutions and the like, act. The administration The pharmaceutical composition may be associated with, for example done a gene therapy.

Im Sinne der Erfindung ist eine Gentherapie eine Behandlungsform unter Einsatz von natürlichen oder rekombinant veränderten Nukleinsäure-Konstrukten, einzelner Gensequenzen oder ganzer Gen- bzw. Chromosomenanschnitte bzw. kodierter Transkriptbereiche, deren Derivate/Modifizierungen mit dem Ziel einer biologischbasierten und selektiven Hemmung bzw. Revertierung der Krankheitssymptome und/oder deren kausalen Ursachen, wobei im speziellen Fall darunter die Inhibierung eines im Verlauf einer Krankheit überexprimierten Zielmoleküls auf Ebene der Nukleinsäuren, insbesondere auf der Transkriptionsebene, verstanden wird.in the According to the invention, gene therapy is a form of treatment Use of natural or recombinantly altered Nucleic acid constructs, single gene sequences or whole gene or chromosome sections or encoded transcript areas, their derivatives / modifications with the aim of biologically based and selective inhibition or Reverting of the disease symptoms and / or their causal causes, in the special case including the inhibition of one in the course a disease over-expressed target molecule at the level of nucleic acids, especially at the transcriptional level.

Die Gentherapie kann beispielsweise auch über geeignete Vektoren, wie beispielsweise virale Vektoren und/oder eine Komplexierung mit Lipiden oder Dendrimeren erfolgen. Die Gentherapie kann insbesondere auch über die Verpackung in Proteinhüllen erfolgen. Weiterhin ist es möglich, dass das Erkennungsmolekül mit einem weiteren Molekül fusioniert oder komplexiert ist, welches den gerichteten Transport zum Zielort, die Aufnahme in und/oder die Verteilung innerhalb der Zielstelle unterstützt. Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Anforderungen bestimmt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie beispielsweise der Größe, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder dem allgemeinen und krankheitsspezifischen Gesundheitszustand des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel, insbesondere in einer Kombinationstherapie, verabreicht werden.The For example, gene therapy may also be via suitable vectors, such as For example, viral vectors and / or complexation with lipids or dendrimers. The gene therapy can in particular also over the Packaging in protein shells respectively. Furthermore, it is possible that the recognition molecule with another molecule fused or complexed, which is the directed transport to the destination, inclusion in and / or distribution within the Target site supported. The type of dosage and the route of administration can be from the treating Physician should be determined according to clinical requirements. It is known to those skilled in the art that the type of dosage of different Factors dependent is, such as the size, the Body surface, the Age, sex or the general and disease-specific Health of the patient, but also of the special means which is administered, the mode of administration and others Medicines that may be administered in parallel, especially in a combination therapy become.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit umfassend das Erkennungsmolekül und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung. Weiterhin betrifft die Erfindung auch einen Array umfassend das Erkennungsmolekül und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung. Der Kit und der Array können zur Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten eingesetzt werden, die mit der Funktion von VEGF assoziiert sind. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Erkennungsmoleküls, des Kits, des Arrays zur Diagnose, Prophylaxe, Verminderung, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten.The The invention also relates to a kit comprising the recognition molecule and / or the pharmaceutical composition. Furthermore, the invention relates also an array comprising the recognition molecule and / or the pharmaceutical Composition. The kit and the array can be used for diagnosis and / or Therapy can be used by diseases that interfere with the function of VEGF are associated. The invention also relates to the use the recognition molecule, of the kit, the array for diagnosis, prophylaxis, reduction, therapy, Follow-up and / or post-treatment of cell growth, differentiation and / or division related diseases.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehende Krankheit ein Tumor. Besonders bevorzugt ist der Tumor ein solider Tumor und/oder ein Blut- oder Lymphdrüsenkrebs.In a preferred embodiment is that related to cell growth, differentiation and / or division standing illness a tumor. Particularly preferred is the tumor a solid tumor and / or a blood or lymph node cancer.

Insbesondere kann es sich bei den Tumoren, die epithelialen oder mesodermalen Ursprungs sein können, im Sinne der Erfindung um gut- oder bösartigen Krebsarten der Organe der Lunge, der Prostata, der Harnblase, der Niere, der Speiseröhre, des Magens, der Bauchspeicheldrüse (Pankreas), des Hirns, des Ovars, des Skelettsystems handeln, wobei insbesondere das Adenokarzinom der Brust, der Prostata, der Lunge und des Darms, Knochenmarkkrebs, das Melanom, das Hepatom, die Kopf-Hals-Tumoren explizit als Vertreter bösartiger (so genannte maligne) Tumoren bevorzugt sind.Especially It can be at the tumors, the epithelial or mesodermal Origin, within the meaning of the invention to benign or malignant cancers of the organs of the lung, the prostate, the bladder, the kidney, the esophagus, the Stomach, the pancreas (Pancreas), brain, ovary, skeletal system, where in particular adenocarcinoma of the breast, prostate, lung and gut, bone marrow cancer, melanoma, hepatoma, head and neck cancer explicitly as a malicious representative (so-called malignant) tumors are preferred.

Zur Gruppe der Blut- und Lymphdrüsenkrebsarten werden im Sinne der Erfindung alle Formen der Leukämien (z.B. im Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen-Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische T-Zellen-Leukämie, HTLV-II-assoziierte Leukämie, akut lymphozytische Leukämie, chronisch-lymphozytische Leukämie, Mastzell-Leukämie und myeloische Leukämie) und Lymphomen gezählt. Beispiele von mesenchymalen bösartigen Tumoren (sogenannte Knochen- und Weichteilsarkome) sind: Fibrosarkom, das maligne Histozytom, das Liposarkom, Hämangiosarkom, das Chondrosarkom und das Osteosarkom, Ewing-Sarkom, das Leio- und Rhabdomysarkom, das Synovialsarkom, Karzinosarkom; weiterhin zählen Tumoren des Blut- und Lymphsystems dazu. Als weitere Tumorarten, die im Sinne der Erfindung auch unter dem Begriff „Neoplasmen" zusammengefasst werden, sind bevorzugt: Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des Verdauungssytems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas-Neoplasmen, Hirnanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens, des Atmungstraktes und des Urogenitaltrakts.For the purposes of the invention, the group of blood and lymphatic gland types includes all forms of leukemia (eg in connection with B-cell leukemia, mixed-cell leukemia, null-cell leukemia, T-cell leukemia, chronic T-cell leukemia, HTLV II-associated leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, mast cell leukemia and myeloid leukemia) and lymphomas. Examples of mesenchymal malignant tumors (so-called bony and soft tissue sarcomas) are: fibrosarcoma, malignant histocytoma, liposarcoma, hemangiosarcoma, chondrosarcoma and the Osteosarcoma, Ewing sarcoma, lei and rhabdomy sarcoma, synovial sarcoma, carcinosarcoma; Furthermore, tumors of the blood and lymphatic system are included. Other tumor types which are also included in the context of the invention under the term "neoplasms" are preferred: bone neoplasms, breast neoplasms, neoplasms of the digestive system, colorectal neoplasms, liver neoplasms, pancreatic neoplasms, pituitary neoplasms, testes Neoplasms, orbital neoplasms, neoplasms of the head and neck, the central nervous system, neoplasms of the auditory organ, pelvis, respiratory tract and urogenital tract.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe: Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend Tumoren der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der Lippen, der Mundhöhle, des Oropharynx, des Larynx, des Hypopharynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des Mediastinums, Tumoren des Gastrointestinaltraktes umfassend Tumoren des Ösophagus, des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege, des Dünndarms, Kolon- und Rektumkarzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der harnröhre, des Penis und der Hoden, gynäkologische Tumoren umfassend Tumoren des Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom, maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkarzinom, Tumoren des Eileiters (Tuba Faloppi), Tumoren der Bauchhöhle, Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen- und Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems, Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose, Neuroblastom, Ewing-Sakom Tumorfamilie, Rhabdomsarkom, Lymphome umfassend Non-Hodgkin-Lymohome, kutane T-Zell-Lymphome, primäre Lymphome des zentralen Nerversystems, Morbud Hodgkin, Leukämien umfassend akute Leukämien, chronische myeloische und lymphatische Leukämien, Plasmazell-Neoplasmen, myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen ohne bekannten Primärtumor (CUP-Syndrom), peritoneale Karzinomatose, Immunsuppression-bezogene malignität umfassend AIDS-bezogene Malignitäten wie Kaposi-Sarkom, AIDS-assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome des zentralen Nervensystems, AIDS-assoziierten Morbus Hodgkin und AIDS-assoziierte anogenitale Tumoren, Transplantations-bezogene Malignitäten, metastasierte Tumoren umfassend Gehirnmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen, Knochenmetastasen, pleurale und perikardiale Metastasen und maligne Aszites.In a further preferred embodiment is the cancer or tumor that treats or prevents will be chosen from the group: tumors of the ear, nose and throat area Tumors of the inner nose, sinuses, nasopharynx, Lips, the oral cavity, of the oropharynx, larynx, hypopharynx, ear, salivary glands and Paragangliomas, tumors of the lung comprising non-small cell lung carcinomas, tumors of the mediastinum, comprising tumors of the gastrointestinal tract Tumors of the esophagus, stomach, pancreas, liver, gall bladder and biliary tract, of the small intestine, Including colon and rectal cancers and anal carcinomas, genitourinary tumors Tumors of the kidneys, the ureter, the bladder, the prostate, the urethra, of the penis and testicles, gynecological Tumors including tumors of the cervix, vagina, vulva, carcino-carcinoma, Malignant trophoblast disease, ovarian carcinoma, tumors of the fallopian tube (Tuba Faloppi), tumors of the abdominal cavity, breast cancers, tumors endocrine organs comprising tumors of the thyroid gland, the parathyroid gland, the Adrenal cortex, endocrine pancreatic tumors, carcinoid tumors and Carcinoid syndrome, multiple endocrine neoplasms, bone and soft tissue sarcomas, Mesotheliomas, skin tumors, melanomas including cutaneous and intraocular Melanomas, tumors of the central nervous system, including tumors in childhood Retinoblastoma, Wilms tumor, Neurofibromatosis, Neuroblastoma, Ewing-Sakom Tumor family, rhabdoma sarcoma, lymphomas comprising non-Hodgkin's lymphomas, Cutaneous T-cell lymphoma, primary Lymphomas of the central nervers, Morbud Hodgkin, including leukemias acute leukemia, chronic myeloid and lymphatic leukemias, plasma cell neoplasms, myelodysplastic syndromes, paraneoplastic syndromes, metastases without known primary tumor (CUP syndrome), peritoneal carcinomatosis, immunosuppression-related malignancy including AIDS-related malignancies like Kaposi's sarcoma, AIDS-associated Lymphomas, AIDS-associated lymphomas of the central nervous system, AIDS-associated Hodgkin's disease and AIDS-associated anogenital Tumors, transplant-related malignancies, metastatic tumors including brain metastases, lung metastases, liver metastases, bone metastases, pleural and pericardial metastases and malignant ascites.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem soliden Tumor um einen Tumor des Urogenitaltraktes und/oder Gastrointestinaltraktes.In a particular embodiment In the invention, the solid tumor is a tumor of the genitourinary tract and / or gastrointestinal tract.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Tumor ein Kolonkarzinom, ein Magenkarzinom, ein pankreaskarzinom, ein Dickdarmkrebs, ein Dünndarmkrebs, ein Ovarialkrebs, ein Zervialkarzinom, ein Lungenkrebs, ein Nierenzellkarzinom, ein Hirntumor, ein Kopf-Hals-Tumor, ein Leberkarzinom und/oder eine Metastase dieser Tumoren/Karzinome ist.In a further preferred embodiment the invention provides that the tumor is a colon carcinoma, a stomach carcinoma, a pancreatic carcinoma, a colon cancer, a Small intestine cancer, an ovarian cancer, a cervical carcinoma, a lung cancer, a renal cell carcinoma, a brain tumor, a head and neck tumor, a liver carcinoma and / or a Metastasis of these tumors / carcinomas is.

In einer weiteren besonders bevotzugten Ausführungsform ist der solide Tumor ein Mamma-, Bronchiaal-, Kolorektal- und/oder Prostatakarzinom.In Another particularly preferred embodiment is the solid tumor a mammary, bronchial, colorectal and / or prostate carcinoma.

In einer ganz bevorzugten Ausführungsform ist der Tumor des Urogenitaltraktes ein Harnblasenkarzinom (BCa). Das BCa stellt in der Bundesrepublik Deutschland die vierthäufigste Krebsform und siebthäufigste Krebstodesursache bei Männern dar. Die TUR-B als generelle Primärtherapie des BCa erlaubt eine organerhaltende Entfernung von oberflächlichen Tumoren. Trotz dieser histopathologisch definierten vollständigen Entfernung des Tumors ist mit 50-70 % der Patienten ein relativ hoher Anteil innerhalbvon 2 Jahren von einem Rezidiv betroffen [Stein et al.]. Ein Diagnose – sowie Therapieproblem stellt das synchrone oder metachrone multifokale Auftreten von Tumorherden dar, wodurch das Auftreten von Rezidiven entfernt von der resezierten Primärtumorlokalisation bedingt sein kann [Sidranski et al.]. Bei Auftreten eines Rezidivs oder bei primär als oberflächlich eingestuften Tumoren erfolgt in der Regel nach der TUR-B eine Langzeitprophylaxe mit einem Immun(Bazillus Calmette-Guérin – BCG) oder Chemotherapeutikum (z.B. Mitomycin-C, Taxol, Gemcitabin/Cisplatin). Patienten mit muselinvasiven BCa und mit entdifferenzierten, oberflächlichen Tumoren, die trotz dieser Therapie rezidivieren, werden in der Regel radikal zystektomiert bzw. unter Erhalt der Blase mittels Mono-/Polychemo-, Immun- oder Strahlentherapie bzw. Kombinationsverfahren dieser Methoden behandelt. Chemo-, Immun- oder Strahlenbehandlungen sind auf Grund ihrer relativ unspezifischen Wirkmechanismen von einer hohen therapieinduzierten Toxizität begleitet.In a very preferred embodiment the urogenital tract tumor is a bladder carcinoma (BCa). The BCa is the fourth most popular in the Federal Republic of Germany Cancer form and seventh most common cause of cancer death in men dar. The TUR-B as general primary therapy of BCa allows a organ preserving removal of superficial tumors. Despite this histopathologically defined complete removal of the tumor is a relatively high proportion within 50-70% of patients 2 years of relapse [Stein et al.]. A diagnosis - as well Therapy problem is the synchronous or metachronous multifocal Occurrence of tumor foci, thereby reducing the occurrence of recurrences removed from the resected primary tumor localization conditionally can be [Sidranski et al.]. If a recurrence occurs or at primary as superficial classified tumors are usually after the TUR-B long-term prophylaxis with an immune (Bacillus Calmette-Guérin - BCG) or chemotherapeutic agent (e.g., mitomycin-C, taxol, gemcitabine / cisplatin). Patients with muscle-invasive BCa and with dedifferentiated, superficial tumors that despite Recurring this therapy is usually radically cystectomized or under preservation of the bladder by means of mono- / polychemo-, immuno- or Radiotherapy or combination method of these methods treated. Chemo-, immune- or radiation treatments are due to their relative Non-specific mechanisms of action of a high therapy-induced toxicity accompanied.

Auf Grund der gesundheitspolitischen Bedeutung des BCa (insbesondere in den westlichen Industrieländern), dem Fehlen tumorspezifischer Marker sowie der bekannten tumorbiologischen und zellulären Heterogenität des Tumors gibt es intensive Suche auf dem klinischen Forschungsgebiet zum BCa, die insbesondere auf die Identifizierung neuer und/oder ergänzender Therapieoptionen zielen.On Reason for the health policy importance of BCa (in particular in western industrialized countries), the absence of tumor specific markers as well as the known tumor biological and cellular heterogeneity There is intensive research into the tumor in the clinical research field to BCa, in particular to the identification of new and / or supplementary Target therapy options.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden das Erkennungsmolekül, die pharmazeutische Zusammensetzung, der Kit und/oder der Array für die Verlaufskontrolle verwendet, die im Wesentlichen eine Überwachung der Wirksamkeit einer Antitumorbehandlung darstellt. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Erkennungsmolekül in einer Kombinationstherapie, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, verwendet wird. Besonders bevorzugt ist hierbei, dass die Kombinationstherapie eine Chemotherapie, eine Zytostatikabehandlung und/oder eine Straheltherapie umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kombinationstherapieeine adjuvante biologisch-spezifizierte Therapieform. Ganz besonders bevorzugt ist hierbei, dass diese Therapieform eine Immuntherapie ist. Weiterhin ist besonders bevorzugt, dass die Kombinationstherapie eine Gentherapie und/oder eine Therapie mit einem Erkennungsmolekül gegen dasselbe oder ein anderes Zielmolekül umfasst. Dem Fachmann sind verschiedene Kombinationstherapien, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, bekannt. Es kann zum Beispiel vorgesehen sein, dass innerhalb einer kombinationstherapie eine Zytostatikabehandlung erfolgt oder beispielsweise eine Bestrahlung eines bestimmten Tumorareals, wobei diese Behandlung mit der Gentherapie kombiniert wird, wobei das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül als Antikrebsmittel eingesetzt wird. Demgemäß kann es ganz besonders bevorzugt sein, dass das Erkennungsmolekül zur Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber Zytostatika und/oder Strahel verwendet wird. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Erkennungsmolekül zur Hemmung der Vitalität, der Proliferationsrate von Zellen und/oder zur Induktion eines Zellzyklus-Arrestes verwendet wird.In a particular embodiment invention, the recognition molecule, the pharmaceutical composition, the kit and / or the array for The follow-up used essentially a monitoring the effectiveness of an anti-tumor treatment. Furthermore is it prefers that the recognition molecule in a combination therapy, especially for the treatment of tumors. Especially it is preferred that the combination therapy is chemotherapy, a cytostatic treatment and / or a radiation therapy. In a particularly preferred embodiment of the invention the combination therapy adjuvant biologically-specified Therapy. It is particularly preferred that this form of therapy is an immunotherapy. Furthermore, it is particularly preferred that the Combination Therapy a gene therapy and / or therapy with a recognition molecule against the same or another target molecule. The skilled person is various combination therapies, especially for treatment of tumors, known. It may for example be provided that within a combination therapy a cytostatic treatment takes place or, for example, irradiation of a specific tumor area, wherein this treatment is combined with gene therapy, wherein the recognition molecule according to the invention as anticancer agent is used. Accordingly, it can very particularly preferred that the recognition molecule for increasing the sensitivity of tumor cells Cytostatics and / or Strahel is used. Furthermore, it is preferred that the recognition molecule to inhibit vitality, the proliferation rate of cells and / or induction of a cell cycle arrest is used.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.in the The invention will be explained in more detail below by means of an example, without being limited to this example to be.

Die gut transfizierbare humane Harnblasenkarzinom-Zelllinie EJ28 zeigte nach Transfektion insbesondere bei der Verwendung von 3 spezifischen anti-VEGF-AS-Konstrukten (vgl. Tab. 2) eine Reduktion des VEGF-Protein-Gehalts um mehr als 60% gegenüber der nonsense-Kontrolle bei gleichzeitiger Reduktion der Viabilität. Zwei der 3 AS-ON sind gegen dasselbe Sequenzmotiv gerichtet.The well transfected human bladder carcinoma cell line EJ28 after transfection, especially when using 3 specific ones anti-VEGF-AS constructs (see Table 2) a reduction of the VEGF protein content compared with more than 60% nonsense control while reducing viability. Two of the 3 AS-ON are directed against the same sequence motif.

Bereits nach einer Behandlung mit dem VEGFAS723-742 waren nahezu keine lebenden Zellen mehr nachweisbar,, während die Zellen, die mit dem nonsense-Oligonukleotid transfiziert wurden, gegenüber nichttransfizierten Zellen keine Veränderungen der Viabilität zeigten. Tab. 2 VEGF-AS- und NS-ON: Nukleotid- und Zielsequenzen

¹ Der Name beinhaltet den Sequenzbereich der VEGF-mRNA (Acc. No.: M32977), zu der das jeweilige AS-ON komplementär ist; ² Die ss-Motive wurden in 5'- und 3'-Richtung um jeweils 10 Nukleotide erweitert; ³ Die fettgedruckten Nukleotide stellen den Bereich im AS-ON dar, der komplementär zur ss-Region des Zielmotivs ist.

SEQUENZPROTOKOLL

Already after treatment with VEGFAS723-742, almost no living cells were detectable, whereas the cells transfected with the nonsense oligonucleotide showed no changes in viability compared to non-transfected cells. Tab. 2 VEGF-AS and NS-ON: nucleotide and target sequences

¹ The name includes the sequence region of the VEGF mRNA (Acc No: M32977), to which the respective AS-ON is complementary; ² The ss motifs were extended in the 5 'and 3' direction by 10 nucleotides each; ³ The fat printed nucleotides represent the region in AS-ON that is complementary to the ss region of the target motif.

SEQUENCE LISTING

Claims

Recognition molecule directed against the gene of the Vascular Endothelial Growth Factor, characterized in that the recognition molecule, which is a nucleic acid construct selected from an antisense oligonucleotide, a DNAzyme, a peptide nucleic acid, a ribozyme and / or a siRNA, with the mRNA of VEGF specifically interacts in a target sequence region from 718 to 747, from 852 to 881 and / or from 869 to 898 according to Genbank entry M32977.

recognition molecule according to claim 1, characterized in that the recognition molecule immobilized is.

recognition molecule according to claim 1, characterized in that it with another molecule fused or complexed, which is the directed transport to the destination, inclusion in and / or distribution within the Target cell supported.

recognition molecule according to claim 1, characterized in that the antisense oligonucleotide a phosphorothioate antisense oligonucleotide is.

recognition molecule according to one of the claims 1 to 4, characterized in that the sequence region of the VEGF mRNA, to the the recognition molecule complementary is, selected is from the group comprising 720-742, 750-772, 752-774, 858-870 and / or 875-897.

A pharmaceutical composition comprising a recognition molecule according to one the claims 1 to 5, optionally in combination with a pharmaceutical acceptable Carrier.

Kit comprising a recognition molecule according to one of claims 1 to 5 and / or a pharmaceutical composition according to claim 6.

An array comprising a recognition molecule according to one the claims 1 to 5 and / or a pharmaceutical composition according to claim 6th

Use of a recognition molecule according to any one of claims 1 to 5, a kit according to claim 7 and / or an array according to claim 8 for diagnosis, phrophylaxis, therapy, follow-up and / or follow-up related to tent growth, differentiation and / or division standing diseases.

Use according to claim 9, characterized that the disease is a tumor.

Use according to claim 10, characterized that the tumor is a solid tumor or a leukemia.

Use according to claim 11, characterized that the solid tumor is a tumor of the urogenital tract and / or the Gastrointestinal tract is.

Use according to claim 10, characterized that the tumor is a colon carcinoma, a gastric carcinoma, a pancreatic carcinoma, a colon cancer, a small intestine cancer, an ovarian carcinoma, a cervical carcinoma, a lung cancer, a Renal cell carcinoma, a brain tumor, a head-neck tumor, a liver carcinoma and / or is a metastasis of these tumors.

Use according to claim 10, characterized that the solid tumor is a mammary, bronchial, colorectal and / or prostate carcinoma and / or a metastasis of these tumors.

Use according to claim 12, characterized that the tumor of the genitourinary tract is a bladder carcinoma and / or is a metastasis of these tumors.

Use according to claim 9, characterized that the follow - up monitoring is a monitoring of Effectiveness of an anti-tumor treatment is.

Use according to one of Claims 9 to 16, characterized that the recognition molecule used in a combination therapy.

Use according to claim 17, characterized that the combination therapy chemotherapy, a cytostatic treatment and / or radiotherapy.

Use according to claim 18, characterized that the combination therapy is an adjuvant biologically-specified form of therapy includes.

Use according to claim 19, characterized that the form of therapy is an immunotherapy.

Use according to one of claims 9 to 20 for increasing the sensitivity of tumor cells Cytostatics and / or radiation.

Use according to any one of claims 9 to 20 for the inhibition of Vitality, the proliferation rate of cells to induce a cell cycle arrest.