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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur optimierten Herstellung von Proteinen in einem in vitro oder
in vivo Expressionssystem sowie dafür geeignete Reagenzien.
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Hannig, G. & Makrides, S.C. (1998) Tibtech Vol
16, pp 54-60, haben Strategien zur Optimierung der heterologen Proteinexpression
in E. coli beschrieben. Ein entscheidender Faktor ist hierbei die
Effizienz der Initiation der Translation. Die Verwendung bestimmter
Codons spielt hierbei eine gewisse Rolle. So konnten George et al.
(1985) DNA Vol 4, pp 273-281, zeigen, dass die Expression eines
heterologen Genes gesteigert werden kann, wenn man in dem Bereich
nach dem Startcodon solche Codons verwendet, die in E. coli Genen häufig benutzt
werden. Besonders wichtig für
die Translations-Initiation sind hauptsächlich strukturelle Elemente
am 5'-Ende der mRNA.
Von Makrides (1996) Microbiol. Rev. Vol 60, pp 512-538, wurden verschiedene Translations-Verstärker-Sequenzen,
wie beispielsweise eine Sequenz aus dem T7-Phagen Gen10 Leader und eine
U-reiche Sequenz aus der 5'-untranslatierten
Region einiger mRNA's,
wie beispielsweise des E. coli atpE Gens, beschrieben.
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Bislang wurden keine universell einsetzbaren
Translations-Initiationssequenzen
beschrieben. Es wurden jedoch Strategien beschrieben, die das Potential
der Sekundärstruktur-Bildung
am 5'-Ende der mRNA
reduzieren. Insbesondere wurde die Ribosomen-Bindungsstelle mit
Adenin und Thymin Bausteinen angereichert. Stenstöm et al.
(2001) Gene Vol 263, pp 273-284, zeigten, dass stark exprimierte
E. coli Gene insbesondere bei dem dem Startcodon folgenden + 2 Codon
einen hohen Gehalt an Adeninen aufweisen. Allerdings gibt es auch
für diese
Regel viele positive und negative Ausnahmen.
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Schließlich zeigten Pederson-Lane
et al. (1997) Protein Expr. Purif. Vol 10, pp 256-262, dass ein
hoher GC-Gehalt unmittelbar nach dem Startcodon negativ für die Expression
ist und mit Konversion der Purin Basen des 3., 4. und 5. Codons
gegen Thymidin Basen die Expression der Thymidylatsynthase auf 25
% des Gesamtproteins gesteigert werden konnte.
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Es wird angenommen, dass bei all
diesen Maßnahmen
die Zugängigkeit
der 30S Ribosomenuntereinheit zu der messenger RNA eine entscheidende
Rolle spielt. Besonders wichtig ist hierbei der freie Kontakt an die
nach Shine und Dalgarno benannte Sequenz unmittelbar vor dem Startcodon
und der Kontakt zu dem Startcodon selbst. Sind hingegen diese Sequenzelemente
in stabilen RNA-Sekundärstrukturen
gebunden, so läuft
die Initiation der Translation sehr ineffizient. Tessier et al.
11984) Nucl. Ac. Res. Vol 12, pp 7663-7675, zeigten in einer systematischen
Untersuchung, dass durch eine gezielte Mutation diese Form von Stämmchen und
Schleifen (sogenannten Stem-Loops oder Hairpin-Loops) ähnelnden
Sekundärstrukturen
aufgelöst
und damit die Effizienz der Translation erheblich gesteigert werden
kann. Der Effekt dieser Sekundärstrukturen
auf die Translation kann nach deren thermodynamischen Parametern
berechnet werden. So bewirkt eine Stabilisierung um 1,4 kcal/mol
eine 10fache Reduzierung der Expression (Gold (1988) Ann. Rev. Biochem,
Vol 57, pp 199-233) und eine Stabilisierung um 2,3 kcal/mol reduziert
die Bindung des Ribosoms um eine Größenordnung (de Smit & van Duin (1994)
J. Mol. Biol. Vol 244, pp 144-150)
.
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Von Sprengart et al. (1996) EMBO
Vol 15, pp 665-674, wurde als weiterer Translations-Verstärker die sogenannte „Downstream
Box", ein Sequenzelement
direkt nach dem Startcodon der T7-Gene mit Homologie zur ribosomalen
16S RNA beschrieben. Es wird angenommen, dass dieses Element durch
eine Wechsewirkung der beiden homologen Basenpaare die Bindung der
30S Ribosomenuntereinheit verstärkt.
Allerdings eignet sich auch dieses Element nicht als universeller
Translations-Verstärker.
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Die Nachteile bekannter Verfahren
liegen darin, dass für
jedes neue Gen eine Optimierung der 5'-Region der mRNA entweder in der 5'-untranslatierten Region oder in der
translatierten Region durchgeführt
werden muss, um die Codon-Verwendung zu optimieren, oder unerwünschte Sekundärstrukturen
der mRNA mit Auswirkung auf die Shine-Dalgarno Sequenz oder das
Startcodon zu vermeiden. Dies bedarf im Regelfall einer aufwändigen Analyse
der RNA-Struktur mit entsprechenden Programmen (z.B. Mukund et al.
(1999) Curr. Science Vol 76, pp 1486-1490, oder Jaeger et al. (1990) Meth.
Enzymol. Vol 183, pp 281-306), sowie mehrerer PCR-Amplifikationen
und Klonierungsschritte. Will man auf diese Weise eine große Anzahl
von Genen, beispielweise aus einer Genbank exprimieren, so ist dazu
in jedem Falle eine genaue Kenntnis der Sequenz erforderlich, weshalb
diese Methoden nicht auf unbekannte Gene angewendet werden können. Selbst
bei Kenntnis der Sequenzen wäre
dieses Verfahren wesentlich aufwändiger
als eine universell anwendbare Methode.
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Ein weiterer Ansatz zur Verstärkung der
Translation besteht darin, als universellen Translations-Enhancer
ein Fusionsprotein mit einem stark exprimierten Gen zu bilden, an
dessen C-terminates Ende das gewünschte
Gen gesetzt wird. Als Beispiel für
den Erfolg dieser Strategie ist die Fusion mit dem Ubiquitin Gen zu
nennen, wie sie von Butt et al. (1989) PNAS Vol 86, pp 2540-2544,
durchgeführt
wurde.
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Auch dieser Ansatz kann jedoch nicht
ohne Weiteres auf die Expression beliebiger Gene übertragen werden.
Werden nämlich
Fusionsproteine verwendet, so wird am N-Terminus des Proteins eine
mehr oder weniger große
Fusion angefügt,
die aufgrund der Größe und Eigenschaften
des Fusionspartners mit der Funktion des gewünschten Proteins interferieren
können.
Je kleiner die Fusionsproteine oder Teile von diesen gewählt werden,
desto geringer ist in vielen Fällen
auch deren translationssteigernde Wirkung. Bei großen Fusionsproteinen
zeigt sich ein weiterer Nachteil prokaryontischer Expressionssysteme:
Es steigt gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit für unvollständige Transkription oder Translation
durch vorzeitige Termination oder interne Initialisierung. Auch
die Wahrscheinlichkeit für
proteolytischen Abbau ist erhöht.
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Es besteht somit ein Bedürfnis, ein
Verfahren zur optimierten Herstellung von Proteinen bereitzustellen,
bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise
beseitigt sind.
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Ein Gegenstand der Erfindung ist
ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend die Schritte:
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- (a) Bereitstellen einer für das Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz,
wobei 3'-seitig
des Translations-Startcodons eine heterologe Nukleinsäuresequenz
im korrekten Leseraster eingefügt
wird, die so gewählt
wird, dass in einem Abstand von 6-30 Nukleotiden 3'-seitig des Translations-Startcodons
eine Stem-Loop-Struktur ausgebildet wird,
- (b) Bereitstellen eines zur Expression des Proteins geeigneten
Expressionssystems und
- (c) Einbringen der Nukleinsäuresequenz
gemäß (a) in
das Expressionssystem gemäß (b) unter
Bedingungen, dass das Protein synthetisiert wird.
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Die erfindungsgemäße Lösung für ein universell optimiertes
Expressionskonstrukt besteht darin, dass ein kleines heterologes
DNA-Sequenzelement mit vorzugsweise maximal 201 Basenpaaren, besonders
bevorzugt maximal 45 Basenpaaren, unmittelbar nach dem Startcodon
des zu exprimierenden Gens eingefügt wird, welches die Ausbildung
stabiler Stem-Loop-Strukturen im Bereich der Shine-Dalgarno-Sequenz und des Startcodons
weitgehend verhindert und dadurch zur optimierten Translations-Initiation
und optimierter Proteinsynthese führt. Es wird somit ein Fusionsprotein
gebildet, wobei vorzugsweise nur ein kleines Peptid mit maximal 67
Aminosäuren
und besonders bevorzugt maximal 15 Aminosäuren an das gewünschte Protein
angefügt wird.
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Eine wichtige Vorraussetzung für das heterologe
DNA-Sequenzelement ist, dass es im korrekten Leseraster eingefügt wird,
d.h. dass keine Rasterverschiebung im zu exprimierenden Gen stattfindet.
Eine weitere wichtige Eigenschaft des heterologen DNA-Sequenzelements
ist, dass sich in der transkribierten RNA in einem Abstand von 6-30
Basen, vorzugsweise 12-21 Basen, hinter dem Startcodon eine stabile Stem-Loop-Struktur
ausbilden kann, wobei die Basenpaarung in der Stem-Loop-Struktur
zumindest teilweise durch die eingefügte Sequenz bewirkt wird. Diese
Stem-Loop-Struktur soll so beschaffen sein, dass sie nach der erfolgten
Initiation der Translation durch das Ribosom wieder aufgelöst werden
kann und somit nicht zu einem Abbruch der Translation führt. Diese
durch Einführung
der heterologen Nukleinsäuresequenz
in das Expressionskonstrukt entstandete Stem-Loop-Struktur kann
sich bei nahezu jedem Gen in der gleichen Weise ausbilden und dadurch
verhindern, dass die für
die Translations-Initiation wichtigen Sequenzen vor dem Loop größere Sekundärstrukturen
mit der kodierenden Sequenz des Gens eingehen können. Der Bereich unmittelbar
vor dieser Stem-Loop-Struktur und nach dem Startcodon ist vorzugsweise
eine Sequenz ohne Sekundärstruktur
und kann auch keine Sekundärstruktur
mit der 5'-untranslatierten
Region ausbilden. Besonders bevorzugt ist in dieser Region eine
GC-arme Sequenz, da bei einer derartigen Sequenz die Ausbildung
stabiler Sekundärstrukturen
mit Sequenzen innerhalb der translatierten Region minimiert wird.
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Das heterologe Nukleinsäure-Sequenzelement
kann in die Zielsequenz, z.B. in einen Plasmidvektor zur Expression
von heterologen Genen mit bekannten Klonierungs- oder/und Amplifikationstechniken
eingefügt
werden. Möglich
ist z.B. der Aufbau dieser Sequenz durch PCR-Primer zur Klonierung
des gewünschten Gens
oder durch Primer, mit denen DNA-Expressionskonstrukte
für die
in vitro Proteinexpression hergestellt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung
und gegebenenfalls Gewinnung von Proteinen in in vitro Expressionssystemen
eingesetzt werden. Beispiele für
geeignete in vitro Expressionssysteme sind prokaryontische in vitro
Expressionssysteme, wie etwa Lysate von gramnegativen Bakterien,
beispielsweise von Escherichia coli, oder grampositiven Bakterien,
wie beispielsweise Bacillus subtilis, oder eukaryontische in vitro
Expressionssysteme, wie etwa Lysate von Säugerzellen, wie beispielsweise
von Kaninchen, Reticulocyten, humanen Tumorzelllinien, Hamsterzelllinien,
oder anderen Wirbeltierzellen, wie beispielsweise Oozyten und Eiern
von Fischen und Amphibien, sowie Insektenzelllinien, Hefezellen,
Algenzellen oder Extrakte aus Pflanzenkeimen.
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Alternativ kann die Herstellung des
Proteins in einem in vivo Expressionssystem erfolgen, wobei eine prokaryontische
Zelle, z.B. eine gram-negative prokaryontische Wirtszelle, insbesondere
eine E. coli Zelle, oder eine gram-positive prokaryontische Zelle,
insbesondere eine Bacillus subtilis Zelle, eine eukaryontische Wirtszelle,
z.B. eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Wirbeltierzelle,
insbesondere eine Amphibien-, Fisch-, Vogel- oder Säugerzelle,
oder ein nicht-humaner eukaryontischer Wirtsorganismus als Expressionssystem
verwendet werden kann.
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Die Einführung der heterologen Nukleinsäure-Sequenz
in die für
das gewünschte
Protein kodierenden Nukleinsäure-Sequenz
kann durch Standardmethoden der Molekularbiologie, z.B. durch Klonierung,
wie etwa Restriktionsspaltung oder/und Ligation, durch Rekombination
oder/und durch Nukleinsäureamplifikation
erfolgen. Die Nukleinsäure-Zielsequenz
kann dabei auf einem geeigneten Vektor, z.B. einem Plasmidvektor
zur Expression von heterologen Genen, oder auf einem Konstrukt für eine in
vitro Proteinexpression vorliegen. Besonders bevorzugt ist eine
Nukleinsäureamplifikation
in einem oder mehreren Schritten, wobei durch Auswahl geeigneter
Primer die heterologe Nukleinsäuresequenz
und gegebenenfalls Expressionskontrollsequenzen, wie etwa Promotor,
ribosomale Bindungensstellen und Terminatoren, an die für das gewünschte Protein
kodierende Nukleinsäure-Sequenz
angefügt
werden. Besonders bevorzugt ist eine Zweistufen-PCR, wobei in einer ersten
Stufe zumindest ein Teil der heterologen Nukleinsäure-Sequenz
an eine Nukleinsäure-Zielsequenz, die für das gewünschte Protein
kodiert, und in einem zweiten Schritt Expressionskontrollsequenzen
angefügt
werden. Eine bevorzugte Ausführungsform
zur Durchführung
einer Zweischritt-PCR ist in den Beispielen exemplarisch dargestellt.
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Die heterologe Nukleinsäure-Sequenz,
die in der Lage ist, eine Stem-Loop-Struktur 3'-seitig des Translations-Startcodons
auszubilden, wird im korrekten Leseraster 3'-seitig des Translations-Startcodons, üblicherweise
des ersten ATG-Codons, in die für
das gewünschte
Protein kodierende Nukleinsäure-Sequenz
eingefügt.
Vorzugsweise erfolgt die Einfügung
in einem Abstand bis zu 6 Nukleotiden, besonders bevorzugt unmittelbar
nach dem Translations-Startcodon. Eine Einfügung im "korrekten Leseraster" bedeutet dabei, dass keine Verschiebung
des Leserahmen in der Proteinkodierenden Nukleinsäure-Sequenz
erfolgt. Dies bedeutet wiederum, dass die Länge der heterologen Nukleinsäure-Sequenz
in Nukleotiden ein Vielfaches von 3 ist. Bevorzugt ist die Länge im Bereich
von 6-201 Nukleotiden, besonders bevorzugt im Bereich von 12-45
Nukleotiden.
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Die Einfügung der heterologen Nukleinsäure-Sequenz
in die Proteinkodierende Nukleinsäure-Sequenz erfolgt derart,
dass eine Stem-Loop- Struktur
in einem geeigneten Abstand 3'-seitig
des Translations-Codons ausgebildet wird. Der Abstand (zwischen
dem letzten Nukleotid des Translationsstart-Codons und dem ersten
Nukleotid des Stem) beträgt
günstigerweise
6-30 Nukleotide, besonders bevorzugt 12-21 Nukleotide. 5'-seitig derjenigen
Sequenzen, die für
die Bildung der Stem-Loop-Struktur vorgesehen sind, enthält die heterologe
Nukleinsäure-Sequenz
vorzugsweise einen AT-reichen Bereich, d.h. einen Bereich mit einem
AT-Gehalt > 50 %, insbesondere > 60 %.
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Die Länge des Stems in der Stem-Loop-Struktur
liegt vorzugsweise im Bereich von 4 bis 12 Nukleotiden, besonders
bevorzugt von 5 bis 10 Nukleotiden. Der Stem der Stem-Loop-Struktur
enthält
vorzugsweise zwei vollständig
zueinander komplementäre
Abschnitte. Es können
jedoch auch ein oder mehrere Basenfehlpaarungen vorhanden sein,
sofern dadurch die Stabilität
nicht zu stark verringert wird. Die Basenpaarungen im Stem können AT-
und GC-Basenpaarungen und Kombinationen davon sein. Ein Anteil der
GC-Basenpaarungen von > 50
% ist bevorzugt. Die Länge
des Loops beträgt
vorzugsweise 2 bis 8 Nukleotide, sie ist jedoch nicht sonderlich
kritisch. Die thermodynamische Stabilität der Stem-Loop-Struktur ist zweckmäßigerweise hoch
genug, dass die Ausbildung einer Sekundärstruktur im Bereich des ATG-Startcodons,
der 15 5'-liegenden Nukleotide,
welche die Shine-Dalgarno-Sequenz beinhalten, und mindestens der
5 3'-befindlichen
Nukleotide verhindern. Andererseits sollte die thermodynamische
Stabilität
der Stem-Loop-Struktur nicht so hoch sein, dass die Prozessierung
des Ribosoms auf der mRNA behindert wird. Vorzugsweise liegt diethermodynamische
Stabilität
der Stem-Loop-Struktur im Bereich von -4 bis -15 kcal/mol.
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Die zur Expression des gewünschten
Proteins verwendeten Expressionskontroilsequenzen umfassen Promotoren,
ribosomale Bindungsstellen, d.h. Shine-Dalgarno-Sequenzen für prokaryontische
Expressionssysteme bzw. Kozak-Sequenzen für eukaryontische Expressionssysteme,
Enhancer, Terminatoren, Polyadenylierungs-Sequenzen etc. Dem Fachmann sind entsprechende
Expressionskontrollsequenzen aus Standardlehrbüchern der Molekularbiologie,
z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor oder Ausubel et al. (1989) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
New York, bekannt.
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Weiterhin kann die heterologe Nukleinsäuresequenz
auch Abschnitte enthalten, die für
eine Aufreinigungsdomäne,
z.B. eine Poly-His-Domäne,
eine FLAG-Epitop-Domäne
etc., oder/und für
eine Proteinase-Erkennungsdomäne, z.B.
eine IgA-Protease- oder Faktor-X-Domäne, kodieren. Durch die Aufreinigungsdomäne kann
die Gewinnung des gewünschten
Proteins, z.B. aus einem in vitro Translationsansatz oder einer
Wirtszelle bzw. dem zur Kultivierung verwendeten Medium, vereinfacht
werden. Durch Protease-Spaltung innerhalb der Protease-Erkennungsdomäne kann
die heterologe Peptidsequenz von dem gewünschten Protein abgespalten
werden.
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Die heterologe Nukleinsäuresequenz
oder/und die für
das gewünschte
Protein kodierende Nukleinsäuresequenz
werden – um
eine weitere Verbesserung der Expressionshöhe zu erreichen – günstigerweise so
gewählt,
dass sie zumindest teilweise eine an das jeweilige Expressionssystem
angepasste Codon-Nutzung aufweisen.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist ein Reagenz zur Herstellung eines Proteins, umfassend
- (a) eine zu der für das gewünschte Protein kodierenden
Nukleinsäuresequenz
heterologe Nukleinsäuresequenz,
die im korrekten Leseraster in die Protein-kodierende Nukleinsäuresequenz
eingefügt
werden kann, und die in einem Abstand von 6-30 Nukleotiden 3'-seitig des Translations-Startcodons
eine Stem-Loop-Struktur
ausbilden kann, und
- (b) ein zur Herstellung des Proteins geeignetes Expressionssystem.
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Die heterologe Nukleinsäuresequenz
kann in Form einer vollständigen
Sequenz oder in Form von mehreren Teilsequenzen vorliegen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren und Reagenz sind
insbesondere für
die Synthese von Proteinen schwer exprimierbarer Gene sowie der
Synthese von Proteinen ausgehend von Genbanken anwendbar, da hierbei
die Erfolgsrate gegenüber
der bei der Verwendung üblicher
Expressionsvektoren gesteigert werden kann.
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Weiterhin soll die vorliegende Erfindung
durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele näher erläutert werden.
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Es zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung der zur Durchführung einer Zweischritt-PCR
notwendigen Nukleinsäure-Sequenzelemente;
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2 eine
schematische Darstellung von unterschiedlich langen Stem-Loop-Strukturen in
zur Einfügung
in GFP Expressionkonstrukte verwendeten heterologen Nukleinsäure-Sequenzen;
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3 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression von GFP unter Verwendung
der Hairpin-Loop-GFP-Konstrukte gemäß 3 in einem RTS-Expressionssystem. 1 μl jedes Ansatzes
(Doppelbestimmungen) wurde elektrophoretisch über SDS-PAGE aufgetrennt und
auf eine PVDF-Membran geblottet. Die Detektion erfolgte über DCP-Star
und Lumi-Imager;
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4 eine
schematische Darstellung von unterschiedlichen positionierten Stem-Loop-Strukturen
in zur Einfügung
von GFP-Expressionskonstrukte verwendeten heterologen Nukleinsäuresequenzen;
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5 die
Expression von GFP unter Verwendung der in 4 dargestellten heterologen Nukleinsäure-Sequenzen.
Die Durchführung
und Auswertung der Ansätze
erfolgte wie in der Legende zur 3 beschrieben;
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6 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression des CIITA Gens (Wildtyp:
Spur 1; Mutanten Spuren 2-10) unter Verwendung unterschiedlicher
heterologer Nukleinsäuresequenzen
mit Stem-Loop-Strukturen;
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7 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression des CMV Capsid (1049)
Gens (Wildtyp: Spur 1; Mutanten Spuren 2-10) unter Verwendung unterschiedlicher
heterologer Nukleinsäuresequenzen
mit Stem-Loop-Strukturen;
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8 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression des Survivin Gens (Wildtyp:
Spur 10; Mutanten Spuren 1-9) unter Verwendung unterschiedlicher
heterologer Nukleinsäuresequenzen
mit Stem-Loop-Strukturen;
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9 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression des GFP Gens (Wildtyp:
Spur 10; Mutanten Spuren 1-9) unter Verwendung unterschiedlicher
heterologer Nukleinsäuresequenzen
mit Stem-Loop-Strukturen;
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10 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression des GFP und des 1049
Gens unter Verwendung unterschiedlicher heterologer Nukleinsäuresequenzen
mit und ohne Stem-Loop-Strukturen;
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11 eine
Auswertung der Ergebnisse bei der Expression des CIITA und des Survivin
Gens unter Verwendung unterschiedlicher heterologer Nukleinsäuresequenzen
mit und ohne Stem-Loop-Strukturen;
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12 eine
schematische Darstellung von zwei unterschiedlichen Stem-Loop-Strukturen in
den erfindungsgemäßen heterologen
Sequenzen;
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13 eine
Auswertung der Ergebnisse mit den in 12 gezeigten
Stem-Loop-Strukturen.
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Beispiele
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Beispiel 1: Zweischritt-PCR
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Mit Hilfe einer Zweischritt-PCR können zu
exprimierende Gene amplifiziert und mit den entsprechenden Kontrollregionen,
wie T7-Promotor, T7 Gen10-Leader (g10), Ribosomaler Bindungsstelle
(RBS) und T7-Terminator, versehen werden. Im ersten Schritt wird
mittels eines Paares von Primers (A, B), die jeweils auf 15 Basen
Länge mit
dem entsprechenden Gen komplementär sind und 15 weitere Basen
enthalten, die komplementär
zu einem zweiten Primerpaar (C, D) sind, das Gen amplifiziert. Das
zweite Primerpaar enthält
alle wichtigen regulatorisches Elemente, die somit bei einer zweiten
PCR-Amplifikation an das Gen angehängt werden (siehe 1).
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Über
den A-Primer können
bei dieser Methode Veränderungen
im 5'-Bereich des
Gens eingeführt
werden. Bei den Hairpin-Loop-Konstrukten wurden über diesen A-Primer Hairpin-Loops
mit unterschiedlicher Länge
des Hairpin-Loop-Stamms und in unterschiedlicher Position hinter
dem Start-Codon in die Gen-Sequenz inseriert.
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Reaktionsbedingungen
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Die PCR-Reaktionen wurden üblicherweise
nach folgendem Schema mit dem Expand High Fidelity Kit (Roche Applied
Science) im 50 μl
Maßstab
durchgeführt:
PCR
1: Template 10ng/Ansatz; Primer A 20 pmol/Ansatz; Primer B 20 pmol/Ansatz
95 ° C 5 min
+ 20 mal (95 ° C
1 min + 55 1 min + 72 ° C
1 min) + 4 ° C
PCR
2: 2 μl
PCR 1; Primer C 20 pmol/Ansatz; Primer D 20 pmol/Ansatz
95 ° C 5 min
+ 30 mal (95 ° C
1 min + 50 ° C
1 min + 72 ° C
1 min) + 72 ° C
10 min + 4 ° C
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Beide PCR-Reaktionen wurden jeweils
durch Agarose-Gel-Elektrophorese überprüft und die PCR-Produkte der
PCR 2 gleichzeitig mit Hilfe eines DNA-Längenstandards, welcher definierte
DNA-Mengen enthält,
im Lumi- Imager-System
quantifiziert. Die daraus erhaltenen PCR-Produkte wurden direkt
als Template in RTS-Expressions-Ansätzen eingesetzt.
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Beispiel 2: Expression
mit dem RTS in vitro Expressionssystem
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Die Expressionen mit dem RTS 100
HY Kit (Firma Roche Applied Science) wurden in Batch-Ansätzen zu
je 50 μl
nach der dem Kit beiliegenden Anleitung durchgeführt. Dabei wurden DNA-Mengen
von 0,25-1 μg pro
Reaktions-Ansatz eingesetzt. Um die Ergebnisse einer Versuchsreihe
vergleichen zu können,
wurden immer gleiche Mengen des jeweiligen Templates eingesetzt.
Die Ansätze
wurden bei 30°C
für 4 h
inkubiert.
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Beispiel 3: Expression
von Hairpin-Loop-GFP-Konstrukten
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Es wurde am Beispiel von GFP (Grün-Fluoreszenz-Protein)
untersucht, welchen Einfluss Hairpin-Loops (Haarnadel-förmige Schleifen)
in der mRNA direkt nach dem Start-ATG ausüben. Dazu wurden RNA-Sequenzen
ermittelt, die Hairpin-Loops (HL) mit unterschiedlichen Stammlängen ausbilden.
Je länger der
Stamm des Hairpin-Loops ist, um so energetisch stabiler ist diese
Struktur. Bei der Erstellung der Hairpin-Loops wurde darauf geachtet,
dass nur in E. coli Genen häufig
zu findende Codons verwendet wurden. Die ermittelten Sequenzen für die verschiedenen
Hairpin-Loops wurden mittels mRNA-Sekundärstrukturanalyse auf ihre Stabilität im gesamten
Konstrukt hin überprüft. Für Sequenzen,
die genügend
Stabilität
aufwiesen, wurden Primer erstellt, die in der beschriebenen Zweischritt-PCR
gemäß Beispiel
1 eingesetzt wurden.
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Eine schematische Darstellung der
mRNA-Sekundärstrukturen
der Hairpin-Loop-GFP-Konstrukte
ist in 2 gezeigt.
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RTS Expression
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Nach Expression im RTS gemäß Beispiel
2 wurde zur Verifizierung die gebildete GFP-Menge im Fluorimeter
gemessen und der Western-Blot mittels CDP-Star-Detektion und Auswertung
im Lumi-Imager quantitativ analysiert. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
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Es ist eindeutig erkennbar, dass
die Expressionsrate mit der Stammlänge des Hairpin-Loops variiert. Bis
zu einer Stammlänge
von 5 by ist die Expressionsrate relativ konstant, um dann anschließend abzufallen. Bei
einer Stammlänge
von 8 by ist nahezu keine Expression mehr nachweisbar. Diese Untersuchungen
bestätigen
die oben erhaltenen Ergebnisse. Man kann also sagen, dass ein Hairpin-Loop
mit einer Stammlänge
ab 6 by oder besser mit einer Freien Energie von -7,8 kcal/mol eine
Struktur darstellt, die einen erheblichen Einfluss auf die Expression
ausübt.
Zu erklären
ist dies damit, dass diese Struktur bei den Expressionsbedingungen
stabil ist und somit das vorgelagerte Start-ATG nicht frei zugänglich ist.
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Beispiel 4: Ermittlung
des minimalen Abstandes zum Start-ATG
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Um nun zu bestimmen, bis zu welchem
Abstand ein solcher Hairpin-Loop einen Einfluss auf die Expression
ausübt,
wurde der Hairpin-Loop mit der Stammlänge 8 by (Energie -1 1,8 kcal/mol)
in Schritten zu je 3 Basen vom Start-ATG weg in die GFP-Sequenz
verschoben. Die Sequenzen der auf diese Weise erhaltenen A-Primer
war wie folgt:
Stammlänge
8 bp, 6 Basen in die GFP-Sequenz hineinverschoben (SEQ ID NO. 10):
Stammlänge 8 bp,
9 Basen in die GFP-Sequenz hineinverschoben (SEQ ID NO. 191:
Stammlänge 8 bp,
12 Basen in die GFP-Sequenz hineinverschoben (SEQ ID NO.12):
Stammlänge 8 bp,
15 Basen in die GFP-Sequenz hineinverschoben (SEQ ID NO. 13):
Stammlänge 8 bp,
18 Basen in die GFP-Sequenz hineinverschoben (SEQ ID NO. 14):
Stammlänge 8 bp,
21 Basen in die GFP-Sequenz hineinverschoben (SEQ ID NO. 15):
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Diese DNA-Konstrukte mit den in 4 gezeigten Sekundärstrukturen
wurden ebenfalls über
Zweischritt-PCR mit den zuvor beschriebenen Primern B, C und D synthetisiert
und direkt aus der PCR-Reaktion in Expressionsansätzen als
Template eingesetzt. Dabei wurde durch Quantifizierung über ein
Agarose-Gel mit DNA-Marker VII und Auswertung dieses Gels im Lumi-Imager
sichergestellt, dass gleiche Mengen an Template eingesetzt wurden.
Die Expressionsansätze
wurden über
einen Western-Blot ausgewertet. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
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Die Expressionen lassen erkennen,
dass ab einem Abstand von 9 Basen zum Start-ATG die Translation
der mRNA möglich
ist. Es besteht aber noch ein hemmender Einfluss des Hairpin-Loops.
Erst ab einem Abstand von 12 Basen verläuft die Translation wieder
nahezu ungehemmt. Man kann also aus diesen Ergebnissen schließen, dass
das Ribosom einen Platzbedarf von 9-11 Basen nach dem Start-ATG
besitzt. Des Weiteren lässt
sich aus diesen Ergebnissen folgern, dass ein Hairpin-Loop, der
12 oder mehr Basen nach dem Start-ATG entfernt ist, zwar einen Einfluss
auf die mRNA-Sekundärstruktur
aber keinen auf die Initiation der Expression hat.
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Beispiel 5: Einführung von
Stem-Loop-Strukturen zur Auflösung
ungünstiger
Sekundärstrukturen
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Bei früheren Expressionsansätzen mit
dem Rapid Translation System (Roche Applied Science) wurde bei einigen
Genen nur eine geringe oder gar keine Expression gefunden. Als Ursache
hierfür
wurde oft eine ungünstige
RNA-Sekundärstruktur
ermittelt, bei der entweder das Startcodon, oder die Shine-Dalgarno-Sequenz
in einer Sekundärstruktur
mit der Gensequenz involviert war, und damit in gebundener Form
vorlag.
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Für
drei dieser Gene, Survivin, Cytomegalovirus Capsid Protein 1049
(1049) und Class II Transactivator (CIITA) wurde eine heterologe
Nukleinsäuresequenz
mit einem Hairpin-Loop und einer Stammlänge von 7 Basen in einem Abstand
von 15 Basen nach dem Startcodon eingeführt. Direkt anschließend an
den Hairpin Loop wurde das Wildtyp-Gen (siehe unten*) ohne das Start
ATG gesetzt. Vor den Hairpin- Loop wurden jeweils AT reiche Sequenzen
gesetzt, welche weniger stabile Basenpaarungen als GC reiche Sequenzen
ausbilden können.
Außerdem wurde
darauf geachtet keine für
E. coli seltenen Codons innerhalb der eingeführten Sequenzen zu verwenden.
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Dadurch, dass nun einerseits ein
stabiler idealer Hairpin-Loop vorgegeben wird und andererseits direkt
nach dem Startcodon eine Sequenz folgt, welche nicht zu Sekundärstrukturbildung
neigt, sollte unabhängig
vom nachfolgenden Gen eine freie Zugängigkeit für den Initiationskomplex mit
der kleinen ribosomale Untereinheit an die Shine-Dalgarno-Sequenz
und das Start-ATG ermöglicht
werden.
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Es wurden jeweils 9 verschiedene
AT-reiche Sequenzen vor den Hairpin-Loops eingesetzt und mit den Wildtyp-Genen*
verglichen. Als Kontrollgen wurde das GFP cycle 3 Protein mit den
gleichen Hairpin-Loops und AT-reichen Sequenzen über die in Beispiel 1 erwähnte Zweischritt-PCR
synthetisiert. Die Sequenzen der A und B Primer sind unten angegeben.
In Primer 1 wurden jeweils die homologen Bereiche zu Primer C unterstrichen. Die
AT-reiche Sequenz wurde in kursiv, der Hairpin-Loop in Fettdruck
und die Wildtyp Gensequenz in fett und unterstrichen angegeben.
In Primer B wurden die zu Primer D homologen Bereiche unterstrichen
und die Bereiche mit Homologie zum Wildtyp Gen fett angegeben. Als
Primer D wurde abweichend zu Beispiel 1 der folgende Primer benutzt:
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Die unterstrichene Region ist homolog
zu Primer C.
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Im Folgenden sind die Sequenzen der über PCR
erzeugten Expressionskonstrukte für die Mutante 1 und den Wildtyp
angegeben. Die Wildtyp-Gensequenz ist fett angegeben. Am Ende des
Gens wurde mit dem B-Primer jeweils ein hexa-Histidin-Tag zur Detektion
mit einem spezifischen Antikörper
eingeführt
(unterstrichen).
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Man kann an den in den 6 bis 9 gezeigten Expressionen erkennen, dass
die mit den Stem-Loop-Strukturen synthetisierten DNA Templates in
allen Fällen
zu einer Proteinsynthese führten,
während
beim Wildtypgen keine Proteinsynthese stattfand. Die Mutante 9 mit
der Hexa-Histidin Sequenz wird dabei etwas schlechter als die übrigen AT-reichen
Sequenzen exprimiert, hat aber den Vorteil, dass man das entstehende
Protein über
diese Markierung mit sechs Histidinresten an Ni-NTA-Chelat Säulen aufreinigen
kann. Auch im Falle des GFP-Gens, einem ohnehin gut exprimierten
Gen, führten
die Stem-Loop-Konstrukte zu einer Ausbeutesteigerung.
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Beispiel 6: Entfernen
der Stem-Loop-Struktur zum Nachweis der Funktion
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Um die Wirkung der Stem-Loop-Struktur
von der Wirkung der eingeführten
AT-reichen Sequenz zu unterscheiden wurden von je zwei der Mutanten
eine identische PCR jedoch ohne den Teil des Stem-Loops hergestellt
und im direkten Vergleich mit den Stem-Loop-Mutanten exprimiert.
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An diesen Beispielen lässt sich
deutlich der Einfluss der Stem-Loop-Struktur ersehen. Während beim GFP
die AT-reiche Sequenz alleine zu einer gesteigerten Expression führt, bringt
die Stem-Loop-Sequenz bei den schwer exprimierbaren Genen den entscheidenden
Beitrag.
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Beispiel 7; Modifikation
der Stem-Loop-Struktur zur Ermittlung der für die Funktion wichtigen Eigenschaften
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Um die Wirkung der GC-Basen innerhalb
der Stem-Loop-Struktur zu ermitteln, wurde deren Sequenz durch eine
AT-reiche Sequenz mit der gleichen freien Energie wie der des GC-reichen
Stem-Loops ersetzt.
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Für
die Beispiele Survivin, CIITA und 1049 wurden dafür statt
der ursprünglichen
Stem-Loop-Sequenz CTG.CAC.GTG.ATC.GTG.CAG mit (G -9,8 kcal/mol und
einer Stammlänge
von 7 Basenpaaren ein neuer Stem-Loop
(Loop') mit der
Sequenz CAG.ACA.AAT.AGA.TAT.TTG.TCT.GTA mit (G = -9,8 kcal/mol und
einer Stammlänge
von 9 Basenpaaren mit der AT-reichen
Sequenz von Mutante 1 kombiniert. Die beiden Strukturen sind in 12 gezeigt.
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Man kann erkennen, dass beide Stem-Loop-Varianten
die Expression gegenüber
den jeweiligen Wildtypgenen deutlich steigern oder erst ermöglichen.
Die GC-reichen Stem-Loop-Varianten weisen dabei eine etwas deutlichere
Expressionssteigerung auf.
