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A method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte

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Publication number
DE10227042A1
DE10227042A1 DE2002127042 DE10227042A DE10227042A1 DE 10227042 A1 DE10227042 A1 DE 10227042A1 DE 2002127042 DE2002127042 DE 2002127042 DE 10227042 A DE10227042 A DE 10227042A DE 10227042 A1 DE10227042 A1 DE 10227042A1
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DE
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DE2002127042
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Emil Palecek
Hans Kosak
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November AG Novus Medicatus Bertling Gesell f Molekular Medizin
Original Assignee
November AG Novus Medicatus Bertling Gesell f Molekular Medizin
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    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6827Hybridisation assays for mutation or polymorphism detection

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten 10 mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten 10 mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten 10 aufweisenden ersten 20 und zweiten Sonde 22, wobei die Affinität der ersten Sonde 20 durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle 12 des Analyten 10 bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste 20 und die zweite Sonde 22 an den Analyten 10 binden, DOLLAR A b) Markieren der ersten Sonde 20 durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker 24, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, DOLLAR A c) Markieren der zweiten Sonde 22 durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker 26, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachwe The invention relates to a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte 10 contained in a first liquid comprising the steps of: DOLLAR A a) contacting and incubating the analyte 10 each having an affinity for the analyte 10 having first 20 and second probe wherein the affinity of the first probe 20 is effected by a specific affinity to at least one first binding site 12 of the analyte 10 and the incubating is carried out under conditions under which bind the first 20 and second probe 22 to the analyte 10, DOLLAR a b 22, ) marking the first probe 20 by at least one electrochemically specifically detectable first marker 24, at least if it is not already electrochemically specifically detectable DOLLAR a c) labeling the second probe 22 by at least one electrochemically specifically detectable second label 26, at least if they are not already electrochemically specifically nachwe isbar ist, DOLLAR A d) Absondern der an den Analyten 10 gebundenen ersten 20 und zweiten Sonde 22, DOLLAR A e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde 20 oder den ersten Marker 24 verursachten ersten elektrochemischen Signals Si1 und eines durch die abgesonderte zweite Sonde 22 oder den zweiten Marker 26 verursachten zweiten elektrochemischen Signals Si2 und DOLLAR A f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten 10 mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten Si1 und dem zweiten Signal Si2. is Isbar, DOLLAR A d) segregating the bound to the analyte 10 first 20 and second probe 22, DOLLAR A e) detecting a first through the separate probe 20 or the first marker 24 caused first electrochemical signal Si1 and a second through the separate probe 22 or the second marker 26 caused second electrochemical signal Si2 and DOLLAR a f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte 10 by means of a ratio between the first and the second signal Si1 Si2.

Description

  • [0001] [0001]
    Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines Analyten in einer Flüssigkeit. The invention relates to a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte in a liquid.
  • [0002] [0002]
    Mit elektrochemischen Verfahren können redoxaktive Analyte untersucht und spezifiziert werden. With electrochemical methods, redox-active analytes can be investigated and specified. Die Umsetzung der Analyte findet an einer Arbeitselektrode statt. The implementation of the analytes takes place on a working electrode. Zur stromlosen Messung der Spannung wird eine Referenzelektrode verwendet. For currentless measurement of the voltage, a reference electrode is used. Der über die Arbeitselektrode fließende Strom oder die Spannung, welche zwischen der Arbeits- und der Referenzelektrode abfällt, wird über eine Gegenelektrode gesteuert. The current flowing across the working electrode current, or the voltage which drops between the working and the reference electrode is controlled by a counter electrode. Die elektrochemische Detektion von Analyten kann potentiometrisch oder amperometrisch erfolgen. The electrochemical detection of analytes can be done potentiometric or amperometric. In einem potentiometrischen Messprotokoll wird die über der Arbeits- und Referenzelektrode abfallende Spannung zeitabhängig gemessen. In a potentiometric measurement protocol, the voltage dropped across the working and reference electrode voltage is measured with time. Während dieser Messung kann ein kontrollierter Stromverlauf angelegt werden. During this measurement, a controlled current profile can be created. Im Falle eines konstanten Stroms wird diese Messung als Konstantstrom-Chronopotentiometrie bezeichnet. In the case of a constant current, this measurement is referred to as a constant-current chronopotentiometry. Die Untersuchung von an einer Arbeitselektrode adsorbierten oder komplexierten Analyten mittels Konstantstrom-Chronopotentiometrie wird auch als Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse (KSPSA) bezeichnet. The investigation of adsorbed or complexed analyte on a working electrode by means of constant-current chronopotentiometry is also referred to as a constant-current potentiometric stripping analysis (KSPSA). Die Kathodische-Konstantstrom-Potentiometrische- Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren in dem durch das Anlegen eines positiven Stromes sukzessive Analyte oxidiert werden. The cathodic constant flow potentiometric stripping analysis includes a method in which are oxidized by the application of a positive current successively analytes. Aus diesen spannungsabhängigen Oxidationsreaktionen können Rückschlüsse auf oxidierbare Analyte gezogen werden. These voltage-dependent oxidation reactions conclusions can be drawn on oxidizable analytes. Die Anodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren, bei dem ein negativer Strom angelegt wird, um aus dem erhaltenen Spannungsverlauf Rückschlüsse auf reduzierbare Analyte schließen zu können. The anodic constant current potentiometric stripping analysis includes a method in which a negative current is applied to close from the resulting voltage waveform conclusions reducible analytes.
  • [0003] [0003]
    In einem amperometrischen Messprotokoll wird die Spannung, welche zwischen der Referenz- und der Arbeitselektrode abfällt, über eine Gegenelektrode nach einem vorgegebenen Protokoll verändert. In an amperometric measurement record the voltage drop between the reference and working electrode, a counter electrode changed over according to a predetermined protocol. Gleichzeitig wird der Strom gemessen, welcher über die Arbeitselektrode fließt. At the same time the current is measured which flows through the working electrode. Je nach angelegter Spannung können redoxaktive Analyte reduziert oder oxidiert werden. Depending on the applied voltage redox-active analytes can be reduced or oxidized. Durch eine Auswertung des Stromverlaufs können Rückschlüsse auf die Analyte gezogen werden. By evaluating the current waveform conclusions can be drawn about the analytes. Ein elektrochemisches Messverfahren mit einer stationären Arbeitselektrode, in welchem eine Strom-Spannungskennlinie aufgenommen wird, wird auch als Voltammetrie und die zugehörige grafische Darstellung als Voltammogramm bezeichnet. An electrochemical measurement method with a stationary working electrode in which a current-voltage characteristic curve is recorded is referred to as voltammetry and the corresponding graphical representation as a voltammogram. Für sehr sensitive Messungen von Redoxprozessen wurden spezielle Messprotokolle entwickelt, bei welchen neben den Redoxprozessen stattfindende die Messung beeinflussende kapazitive Prozesse weit gehend unterdrückt werden. For very sensitive measurements of redox processes, special measurement protocols have been developed in which addition to the redox measurement takes place affecting capacitive processes are largely suppressed. Ein sehr effizientes Messprotokoll ist die Differenzielle-Puls-Voltammetrie (DPV). A very efficient measurement protocol is the differential pulse voltammetry (DPV).
  • [0004] [0004]
    Aus der US 6,100,045 ist ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten bekannt. From US 6,100,045 a method for detecting an analyte is known. Dabei wird der Analyt mit einer redoxaktiven Substanz markiert und an eine feste Phase gebunden. In this case, the analyte is labeled with a redox-active substance and bound to a solid phase. Bei der festen Phase kann es sich um magnetische Mikropartikel handeln. In the solid phase may be magnetic microparticles. Die feste Phase ist in der Nähe einer Elektrode angebracht. The solid phase is mounted in the vicinity of an electrode. Mittels der redoxaktiven Markierung wird die Bindung des Analyten an die feste Phase als amperometrisches Signal über die Elektrode nachgewiesen. By means of the redox-active label, the binding of the analyte to the solid phase as amperometric signal through the electrode is detected. Das bekannte Verfahren kann vor allem Informationen über das Vorhandensein des Analyten, kaum aber über dessen Eigenschaften liefern. The known method can mainly supply information on the presence of the analyte, but little about its characteristics. Weiterhin ist es nicht besonders sensitiv. Furthermore, it is not particularly sensitive. Zu dessen Durchführung ist eine relativ kompliziert aufgebaute Vorrichtung erforderlich. For its implementation a relatively complicated structure device is required.
  • [0005] [0005]
    Aus der US 5,871,918 ist es bekannt, einen Analyten, z. From US 5,871,918 it is known an analyte, eg. B. eine DNA, mit einer an eine Elektrode gebundenen Fänger-Sonde zu hybridisieren. B. hybridizing with a bound to an electrode capture probe a DNA. Nach dem Inkontaktbringen des Analyten mit einer Reporter-Sonde erfolgt der elektrochemische Nachweis der Hybridisierung. After contacting the analyte with a reporter probe of the electrochemical detection of the hybridization is carried out. Dazu werden die Basen einer Reporter- Sonde nach der Bindung an die Ziel-DNA mit Übergangsmetallkomplexen zu elektrochemisch nachweisbaren Markern umgesetzt. For this purpose, the bases of a reporter probe to be implemented after binding to the target DNA with transition metal complexes to electrochemically detectable markers. Dabei werden auch Basen der Ziel-DNA umgesetzt und erzeugen beim Nachweis ein elektrochemisches Signal. In this case, also bases of the target DNA are reacted and generate the detection of an electrochemical signal. Das beschränkt die Nachweisempfindlichkeit dieses Verfahrens. This limits the detection sensitivity of this method.
  • [0006] [0006]
    Aus Authier et al., (2001), Anal. From Authier et al., (2001), Anal. Chem. 73, Seiten 4450 bis 4456 ist es bekannt, eine Nukleinsäure als Ziel-DNA unspezifisch an einer inneren Oberfläche eines Gefäßes zu binden. Chem. 73, pages 4450-4456, it is known to bind a nucleic acid as a target DNA nonspecifically to an inner surface of a vessel. Die Ziel-DNA wird mit einer mit einem Goldpartikel markierten Oligonukleotid als Reporter-Sonde hybridisiert. The target DNA is hybridized with a labeled oligonucleotide with a gold particle as a reporter probe. Die Reporter- Sonde wird elektrochemisch unter Verwendung von einmalig zu verwendenden Mikroband-Elektroden nachgewiesen. The reporter probe is electrochemically detected using unique-to-use micro-strip electrodes. Dieses Verfahren hat zahlreiche Nachteile. This method has numerous disadvantages. Die Verwendung eines Gefäßes zum Binden der Ziel-DNA macht es unmöglich, die Ziel-DNA in einem kleinen Volumen zu konzentrieren. The use of a vessel for binding the target DNA makes it impossible to concentrate the target DNA in a small volume. Das beschränkt die Nachweisempfindlichkeit. This limits the detection sensitivity. Weiterhin kann die unspezifische Bindung von Substanzen, insbesondere der Reporter-Sonde, an die innere Oberfläche des Gefäßes zu einem hohen Hintergrundsignal und einer Wechselwirkung mit der elektrochemischen Detektion führen. Furthermore, the non-specific binding of substances, in particular of the reporter probe which lead to the inner surface of the vessel to a high background signal and an interaction with electrochemical detection.
  • [0007] [0007]
    Aus der WO 93/20230 ist ein polarografisches elektrochemisches Verfahren zum Nachweis einer DNA-Hybridisierung bekannt. From WO 93/20230 a polarographic electrochemical method for detection of DNA hybridization is known. Bei diesem Verfahren wird eine Elektrode zunächst mit einzelsträngiger DNA in Kontakt gebracht und ein polarografisches Signal für diese einzelsträngige DNA gemessen. In this method, an electrode is first brought into contact with single-stranded DNA and a polarographic signal for that single-stranded DNA is measured. Anschließend wird eine Oligonukleotid-Sonde unter Hybridisierungsbedingungen hinzugefügt, überschüssiges Reagenz entfernt und ein polarografisches Signal ermittelt. Subsequently, an oligonucleotide probe is added under hybridisation conditions, excess reagent removed and determines a polarographic signal. Durch Vergleich der beiden ermittelten Signale kann festgestellt werden, ob es zu einer Hybridisierung gekommen ist. By comparing the two detected signals can be determined whether there has been a hybridization. Mit dem Verfahren können nur wenige Informationen über die Eigenschaften der untersuchten DNA gewonnen werden. With the process is little information on the properties of the examined DNA can be obtained.
  • [0008] [0008]
    Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art. Es soll insbesondere ein möglichst schnell und einfach durchführbares Verfahren mit hoher Sensitivität zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines Analyten angegeben werden. It is possible in particular a fast and simple to carry out method with high sensitivity for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte to be specified. Das Charakterisieren kann dabei z. Characterizing can, for. B. im Hinblick auf die Länge bzw. Größe des Analyten erfolgen. B. in view of the length or size of the analyte take place.
  • [0009] [0009]
    Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 2 gelöst. This object is solved by the features of claims 1 and 2. FIG. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 3 bis 33. Expedient refinements emerge from the features of claims 3 to 33rd
  • [0010] [0010]
    Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten mit folgenden Schritten vorgesehen: According to the invention a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte contained in a first liquid is provided comprising the steps of:
    • a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten aufweisenden ersten und zweiten Sonde, wobei die Affinität der erste Sonde durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle des Analyten bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste und die zweite Sonde an den Analyten binden, a) contacting and incubating the analyte with a respective an affinity for the analyte having first and second probe, the affinity of the first probe is effected by a specific affinity to at least one first binding site of the analyte and incubating is carried out under conditions under which the first and binding the second probe to the analyte,
    • b) Markieren der ersten Sonde durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, b) marking the first probe by at least one electrochemically detectable specific first marker, at least if it is not already specifically electrochemically detectable,
    • c) Markieren der zweiten Sonde durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, c) labeling of the second probe by at least one electrochemically detectable specific second marker, at least if it is not already specifically electrochemically detectable,
    • d) Absondern der an den Analyten gebundenen ersten und zweiten Sonde, d) segregating the bound to the analyte first and second probes,
    • e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde oder den ersten Marker verursachten ersten elektrochemischen Signals und eines durch die abgesonderte zweite Sonde oder den zweiten Marker verursachten zweiten elektrochemischen Signals und e) detecting a secreted caused by the first probe or the first marker first electrochemical signal and a second through the separate probe or the second marker caused second electrochemical signal and
    • f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten und dem zweiten Signal. f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte by means of a ratio between the first and the second signal.
  • [0011] [0011]
    Weiterhin ist ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten mit folgenden Schritten vorgesehen: Furthermore, a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte contained in a first liquid is provided comprising the steps of:
    • a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten aufweisenden ersten Sonde, wobei die Affinität der erste Sonde durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle des Analyten bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste Sonde an den Analyten bindet, a) contacting and incubating the analyte with a respective an affinity for the analyte having first probe, wherein the affinity of the first probe is effected by a specific affinity to at least one first binding site of the analyte and incubating is carried out under conditions under which the first probe binds to the analyte,
    • b) Markieren der ersten Sonde durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, b) marking the first probe by at least one electrochemically detectable specific first marker, at least if it is not already specifically electrochemically detectable,
    • c) Markieren des Analyten durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker, zumindest wenn der Analyt nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, c) labeling the analyte by at least one electrochemically detectable specific second marker, at least if the analyte is not already specifically electrochemically detectable,
    • d) Absondern des von der ersten Sonde gebundenen Analyten und der von dem Analyten gebundenen ersten Sonde, d) segregating the bound from the first probe and the analyte bound by the analyte, the first probe,
    • e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde oder den ersten Marker verursachten ersten elektrochemischen Signals und eines durch den abgesonderten Analyten oder den zweiten Marker verursachten zweiten elektrochemischen Signals und e) detecting a secreted caused by the first probe or the first marker first electrochemical signal and a separate by the analyte or the second marker caused second electrochemical signal and
    • f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten und dem zweiten Signal. f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte by means of a ratio between the first and the second signal.
  • [0012] [0012]
    Der Begriff "Analyt" umfasst insbesondere einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren, Proteine und sonstige Biomoleküle. The term "analyte" includes especially single or double stranded nucleic acids, proteins and other biomolecules. Bei der ersten oder zweiten Sonde kann es sich um monoklonale oder polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Rezeptoren, Nukleinsäuren oder Liganden handeln. In the first or second probe may be monoclonal or polyclonal antibodies, antibody fragments, receptors, nucleic acids, or ligands. Unter "Nukleinsäuren" im Sinne dieser Erfindung sind neben DNA und RNA auch Nukleinsäureanaloga wie Peptidnukleinsäuren (PNA) sowie Hybride und Chimäre aus DNA und RNA und Analoga von Nukleinsäuren zu verstehen. By "nucleic acids" in the sense of this invention are to be understood in addition to DNA and RNA also includes nucleic acid analogues such as peptide nucleic acids (PNA), as well as hybrids and chimeras of RNA and DNA and analogs of nucleic acids.
  • [0013] [0013]
    "Spezifisch" im Hinblick auf die elektrochemische Nachweisbarkeit bedeutet, dass die erste oder zweite Sonde, der Analyt oder der erste oder zweite Marker jeweils elektrochemisch, dh durch eine Redoxreaktion, getrennt voneinander und gegebenenfalls von anderen, z. "Specific" in view of the electrochemical-repudiation means that the first or second probe, the analyte or the first or second marker respectively electrochemically, ie, by a redox reaction, separated from each other and, optionally, of other such. B. weiteren in der ersten Flüssigkeit enthaltenen, Substanzen nachgewiesen werden können. B. further contained in the first liquid substances can be detected. Das kann durch ein spezifisches Signal möglich sein oder dadurch, dass das Signal in anderer Weise von anderen Signalen, insbesondere auch Hintergrund- oder Störsignalen, differenziert werden kann. This may be possible, or characterized by a specific signal that the signal can be differentiated from other signals, in particular background or noise signals in other ways. Das ist z. This is for. B. durch ein differenzielles Ablösen der ersten Sonde und/oder Aufreinigungsprozesse möglich. B. possible by a differential detachment of the first probe and / or purification processes.
  • [0014] [0014]
    Zum spezifischen Nachweisen können die erste und/oder zweite Sonde und/oder der Analyt jeweils durch mindestens einen elektrochemisch nachweisbaren Marker bzw. eine elektrochemisch nachweisbare Markergruppe markiert werden. To specifically detect the first and / or second probe and / or analyte may be labeled in each case by at least one electrochemically detectable marker or an electrochemically detectable marker group. Durch Markierung mit mehreren Markern bzw. Markergruppen können deutlich intensivere Signale erzeugt werden als mit einem elektrochemisch selbst nachweisbaren Analyten oder einer elektrochemisch selbst nachweisbaren Sonde. By labeling with more markers or marker groups significantly more intense signals can be generated as with an electrochemically detectable analyte itself or an electrochemically detectable probe itself. Die Sensitivität und die Spezifität des Verfahrens können dadurch erhöht werden. The sensitivity and the specificity of the method can be increased. Auch wenn der Analyt oder die Sonde ohne Markierung elektrochemisch nachweisbar sind, wie z. Even if the analyte or the probe without labeling are electrochemically detectable such. B. Nukleinsäuren, welche eine Purinbase, wie Guanin oder Adenin enthalten, können sie markiert werden. As nucleic acids which contain a purine base, such as guanine or adenine, they can be marked. Das Markieren kann dadurch erfolgen, dass ein elektrochemisch nachweisbarer Marker über ein Affinitätsmolekül, z. The marking can take place in that an electrochemically detectable label on an affinity molecule, z. B. Avidin, an einem an dem Analyten oder der ersten oder der zweiten Sonde angeordneten dazu korrespondierenden Affinitätsmolekül, z. B. avidin to a corresponding arranged to affinity molecule to the analyte or to the first or the second probe, such. B. Biotin, bindet. B. Biotin binds. Unter einem Affinitätsmolekül wird ein Molekül verstanden, welches eine spezifische hohe Affinität zu einem korrespondierenden weiteren Affinitätsmolekül aufweist. Among affinity molecule is meant a molecule which has a specific high affinity to a corresponding further affinity molecule. Die Markierungsschritte lit. The labeling steps lit. b und lit, c müssen vor Schritt lit. b and lit, c must prior to step lit. e, können aber jeweils vor oder nach Schritt lit. e, but can lit. respectively before or after step a oder lit. a or lit. d durchgeführt werden. d are performed.
  • [0015] [0015]
    Die Bindung der zweiten Sonde kann spezifisch oder unspezifisch erfolgen. The binding of the second probe can be carried out specifically or nonspecifically. Bei einem aus Nukleinsäure bestehenden Analyten wird unter einer spezifischen Bindung bevorzugt eine sequenzspezifische Hybridisierung verstanden. In a group consisting of nucleic acid analyte sequence-specific hybridization is meant a specific binding preferable. Es kann sich dabei auch um eine sequenzspezifische Bindung eines Proteins handeln. These may also be a sequence-specific binding of protein. Die Bindung einer aus Nukleinsäure bestehenden ersten oder zweiten Sonde an einen aus Nukleinsäure bestehenden Analyten kann auch über eine Hoogsteen-Basenpaarung, welche eine Triplex-Struktur bildet, erfolgen. The binding of a nucleic acid consisting of the first or second probe to a group consisting of nucleic acid analytes may also be effected via a Hoogsteen base pairing which forms a triplex structure. Dies geschieht bevorzugt bei einer Bindung von PNA an einen aus doppelsträngiger DNA bestehenden Analyten. This is preferably done at a binding of PNA to a group consisting of double-stranded DNA analyte. Als zweite Sonde kann z. The second probe z can. B. ein sequenzunabhängig an den Analyten bindender Nukleinsäureindikator, wie ein DNA-Interkalator, dienen. a sequence-independent, serve as binding to the analyte nucleic acid indicator, such as a DNA intercalator.
  • [0016] [0016]
    Unter dem Absondern wird ein weitgehendes Trennen der gebundenen von den ungebundenen ersten bzw. zweiten Sonden oder des gebundenen vom ungebundenen Analyten verstanden. Under the discriminating a far-reaching separation of the bound from the unbound first and second probe or the bound is understood from unbound analyte. Es kann z. It can, for. B. durch Abbau ungebundener erster oder zweiter Sonden oder des ungebundenen Analyten oder durch Zentrifugieren, Binden oder Waschen erfolgen. Example, by removal of unbound first or second probes or unbound analyte or by centrifugation, binding or washing. Das Trennen der gebundenen von der ungebundenen ersten Sonde und des von der ersten Sonde gebundenen Analyten von dem ungebundenen Analyten kann auch in einem Schritt erfolgen, z. Separating the bonded first of unbound probe and bound by the first probe analyte from the unbound analyte can also be performed in one step, for example. B. indem der gebildete Komplex aus Analyt und erster Sonde abzentrifugiert oder gebunden und anschließend gewaschen wird. B. by the complex formed or spun bound analyte-first probe and is then washed. Beim Waschen wird der Komplex in einer weiteren Flüssigkeit aufgenommen. When washing the complex is taken up in another liquid. Die Detektion des ersten und des zweiten Signals kann gleichzeitig oder nacheinander und mit ein und demselben oder verschiedenen elektrochemischen Verfahren erfolgen. The detection of the first and the second signal may be simultaneous or with one and the same or different electrochemical methods in succession. Die Detektion umfasst gegebenenfalls auch ein Quantifizieren der Signale. The detection optionally also includes a quantification of the signals. Das kann auch eine mathematische Operation, insbesondere eine Integration, beinhalten. This can also be a mathematical operation, in particular the integration include.
  • [0017] [0017]
    Das Verfahren ist besonders gut geeignet, um eine Nukleinsäure durch ihre Länge zu charakterisieren. The method is particularly well suited to characterize a nucleic acid by its length. Wird das zweite Signal beispielsweise durch einen DNA-Interkalator als zweite Sonde verursacht und weist die DNA eine spezifische Bindungsstelle für eine erste Sonde auf, so gibt das Verhältnis des ersten Signals zum zweiten Signal Auskunft über die Länge der Nukleinsäure. If the second signal caused for example by a DNA intercalator as the second probe and the DNA has a specific binding site for a first probe, as are the ratio of the first signal to the second signal information about the length of the nucleic acid. Weiterhin kann die Länge von Nukleinsäuren mit sich häufig wiederholenden Sequenzen bspw. dadurch bestimmt werden, dass die erste Sonde spezifisch an eine nur einmal in dem Molekül vorkommende Sequenz bindet während die zweite Sonde spezifisch an die sich wiederholenden Sequenzen bindet. Further, the length of nucleic acids can with frequently repeating sequences, for example. Be determined that the first probe is specific to one occurring only once in the molecule sequence binds while the second probe specifically to the repetitive sequences bind. Das erste Signal kann für das zweite Signal einen internen Standard darstellen, der, insbesondere wenn ein zu erwartendes erstes Signal bekannt ist, eine Differenzierung eines spezifischen Anteils von einem unspezifischen Anteil des zweiten Signals erlaubt. The first signal may represent an internal standard, in particular when an expected first signal is known, differentiation of a specific proportion of a non-specific component of the second signal allows for the second signal. Dadurch wird eine hohe Sensitivität bzw. Spezifität des Verfahrens erreicht. Thus, a high sensitivity and specificity of the method is achieved. Unspezifische zweite Signale können z. Nonspecific second signals z can. B. durch nicht restlos abgesonderte ungebundene zweite Sonden verursacht werden. caused by not completely separate unbound second probes example.
  • [0018] [0018]
    Vorzugsweise wird eine zur Detektion eingesetzte Elektrode nicht mit der ersten Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Preferably, an electrode used for detection is not brought into contact with the first liquid. Dadurch kann die Empfindlichkeit des Verfahrens deutlich erhöht werden, weil in der ersten Flüssigkeit, wie z. Thus, the sensitivity of the method can be significantly increased, because in the first liquid such. B. Blutserum, enthaltene Substanzen dadurch nicht unspezifisch an die Elektrode binden und bei der Detektion unspezifische Signale erzeugen können. characterized bind substances as blood serum, contained a non-specific to the electrode and can generate non-specific signals during the detection. Unspezifische Hintergrundsignale können so weitgehend vermieden werden. Nonspecific background signals can be largely avoided. Erreicht werden kann das beispielsweise indem der Analyt vor dem Schritt lit. This can be achieved for example by lit. the analyte prior to the step e von der ersten Flüssigkeit abgetrennt und in eine zweite Flüssigkeit überführt wird. e is separated from the first liquid and transferred into a second liquid. Bevorzugt wird der Analyt vor Durchführung des Schritts lit. the analyte is preferred before step lit. a von der ersten Flüssigkeit abgetrennt und in eine zweite Flüssigkeit überführt. a separated from the first liquid and transferred into a second liquid. Dadurch können in der ersten Flüssigkeit enthaltene Stoffe abgetrennt werden, die an die erste oder zweite Sonde binden, sie abbauen oder in anderer Hinsicht deren Funktion stören. This substances contained can be separated in the first liquid, which bind to the first or second probe, take it down or interfere with their function in other ways. Weiterhin können Stoffe abgetrennt werden, die bei der Detektion stören. Further substances can be separated, which interfere with the detection. Das können z. This can eg. B. Stoffe sein, die ein ähnliches elektrochemisches Signal wie die erste oder zweite Sonde erzeugen. his example, substances that produce a similar electrochemical signal as the first or second probe. Es können auch Stoffe sein, die die Funktion der zur elektrochemischen Detektion verwendeten Elektroden stören. It may also be substances that interfere with the function of the electrodes used for electrochemical detection. Zum Abtrennen kann der Analyt, insbesondere spezifisch, von einem Fänger-Molekül gebunden werden. For separating can be bound by a capture molecule, the analyte, and in particular specific.
  • [0019] [0019]
    Die Bindung des Analyten an dem Fänger-Molekül kann durch eine, vorzugsweise sequenzspezifische, Hybridisierung erfolgen. The binding of the analyte to the capture molecule can be accomplished by, preferably sequence-specific hybridization. Das Fänger-Molekül kann, insbesondere vor dem Binden des Analyten, an einer ersten oder zweiten Oberfläche immobilisiert werden. The capture molecule may, in particular prior to binding of the analyte, are immobilized on a first or second surface. Dadurch wird das Abtrennen des Analyten von der ersten Flüssigkeit vereinfacht. Characterized the separation of the analytes of the first liquid is simplified. Durch die Immobilisierung der Fänger-Moleküle kann der Analyt in einem kleinen Volumen angereichert werden. Due to the immobilization of the capture molecules of the analyte can be concentrated in a small volume. Das erhöht die Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens. This increases the sensitivity of the process.
  • [0020] [0020]
    Das Fänger-Molekül kann eine Nukleinsäure, ein Analogon einer Nukleinsäure, insbesondere eine Peptidnukleinsäure (PNA), ein Antikörper oder ein Rezeptor sein. The capture molecule may be a nucleic acid, an analog of a nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA), an antibody or a receptor. Bevorzugt weist das Fänger-Molekül ein Affinitätsmolekül, insbesondere Streptavidin, Avidin oder Biotin, oder ein biotinyliertes Oligonukleotid auf. Preferably, the capture molecule to an affinity molecule, especially streptavidin, avidin or biotin or a biotinylated oligonucleotide. Dieses Affinitätsmolekül kann entweder dazu dienen, das Fänger-Molekül an der ersten oder zweiten Oberfläche zu immobilisieren, oder den Analyten zu binden. This affinity molecule may either serve to immobilize the capture molecule on the first or second surface, or to bind the analyte.
  • [0021] [0021]
    In einer bevorzugten Ausgestaltung enthält die erste oder zweite Sonde oder der Analyt ein Affinitätsmolekül, insbesondere Biotin, Avidin oder Streptavidin. In a preferred embodiment the first or second probe or the analyte contains an affinity molecule, in particular biotin, avidin or streptavidin. Die Affinitätsmoleküle sind dabei derart zu wählen, dass es nicht zu Bindungen kommen kann, welche die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hindern. The affinity molecules are to be chosen in such a way that it can not come to bonds which hinder the process of the invention. Insbesondere soll es nicht über die Affinitätsmoleküle zu Bindungen zwischen der ersten und der zweiten Sonde oder zu Bindungen der ersten Sonde an den Analyten kommen. In particular, it is not intended to come to the analyte through the affinity molecules to bond between the first and the second probe or bonds the first probe. Dadurch ist es auf einfache Weise möglich, den Analyten von der ersten Flüssigkeit abzutrennen. This makes it possible to easily separate the analyte from the first liquid. Weiterhin ermöglicht das Affinitätsmolekül ein Binden eines Markers an der ersten oder zweiten Sonde oder dem Analyten oder auch ein Immobilisieren des Analyten. Furthermore, the affinity molecule allows binding of a marker to the first or second probe or the analyte or an immobilizing the analyte. Der Analyt kann eine, insbesondere ein Poly-T-Ende oder ein Poly-A-Ende aufweisende, Nukleinsäure sein. The analyte may be one, in particular a poly-T-end or a poly-A-containing end, be nucleic acid. Die Nukleinsäure kann doppel- oder einzelsträngig ausgebildet sein. The nucleic acid can be designed double- or single-stranded. Auch an eine doppelsträngige Nukleinsäure ist eine sequenzspezifische Bindung, z. Also, a double-stranded nucleic acid is a sequence-specific binding, z. B. durch eine Hoogsteen- Bindung einer aus PNA bestehenden ersten oder zweiten Sonde möglich. B. possible by Hoogsteen binding of a PNA consisting of the first or second probe. Das Poly-T-Ende oder das Poly-A-Ende ermöglicht die Bindung des Analyten an eine eine Poly-A-Sequenz oder eine Poly-T-Sequenz aufweisende als Fänger-Molekül dienende Nukleinsäure. The poly-T-end or the poly-A end allows the binding of the analyte to a poly A sequence or a poly-T sequence having serves as a catcher molecule nucleic acid. Dadurch kann der Analyt leicht aus der Flüssigkeit abgetrennt werden. Thus, the analyte can be easily separated from the liquid. Weiterhin ermöglicht ein Poly-T-Ende eine Markierung mit mehreren Osmium-Komplexen. Furthermore, a poly-T-end allows a mark with a plurality of osmium complexes. In einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt das Charakterisieren durch das Bestimmen der Länge der Nukleinsäure. In a particular embodiment of the method characterizing effected by determining the length of the nucleic acid.
  • [0022] [0022]
    Bevorzugt wird der Analyt vor oder während Schritt lit. the analyte is preferably before or during step lit. a mittels einer Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere einer PCR, vervielfältigt. a by means of a nucleic acid amplification reaction, in particular a PCR amplified. Das erhöht die Sensitivität des Verfahrens deutlich. This increases the sensitivity of the method significantly. Als Analyt wird dann im Wesentlichen das Produkt der Vervielfältigungsreaktion nachgewiesen, quantifiziert und/oder charakterisiert. the product of the amplification reaction as the analyte then substantially detected, quantified and / or characterized. Das gilt auch dann, wenn das Produkt wegen der für die Vervielfältigungsreaktion verwendeten Primer nicht völlig mit dem Analyten übereinstimmt oder es sich um ein zu dem Analyten komplementäres Produkt der Vervielfältigungsreaktion handelt. This applies even if the product does not match because of the used for the amplification reaction primer completely with the analyte or it is a complementary to the analyte product of the amplification reaction. Bei der PCR kann als Primer das Fänger-Molekül oder die erste oder zweite Sonde dienen. In the PCR, the capture molecule or the first or second probe may serve as a primer. Durch die PCR können in den Analyten spezifische Bindungssequenzen eingeführt werden. By PCR specific binding sequences can be introduced into the analyte.
  • [0023] [0023]
    Der Analyt kann vor dem Schritt lit. The analyte may prior to step lit. d, insbesondere vor dem Schritt lit. d, in particular before step lit. a an der ersten oder zweiten Oberfläche immobilisiert werden. a are immobilized on the first or second surface. Das kann auch über die Bindung an das Fänger- Molekül erfolgen. This can also be done via binding to the catcher molecule. Das erleichtert das Abtrennen von der ersten Flüssigkeit und das Absondern gemäß lit. This facilitates the separation of the first liquid and segregating according lit. d, das dann z. d, then the z. B. durch Waschen der ersten Oberfläche erfolgen kann. B. can be effected by washing the first surface. Die erste Oberfläche kann die Oberfläche eines, insbesondere superparamagnetischen, Partikels sein. The first surface may be the surface of an, in particular superparamagnetic particle. Ein superparamagnetisches Partikel kann auf einfache Weise mittels eines Magnetfelds abgetrennt werden. A superparamagnetic particles can be separated in a simple manner by means of a magnetic field. Das Partikel kann ansonsten auch durch Zentrifugation abgetrennt werden. The particles may be otherwise separated by centrifugation. Es ermöglicht eine Konzentrierung des Analyten. It allows a concentration of the analyte. Weiterhin ist es durch Partikel möglich, eine große Bindungsoberfläche bereitzustellen. Furthermore, it is possible by particles provide a large binding surface. Das Partikel weist vorzugsweise einen Durchmesser von 10 nm bis 100 µm, insbesondere 1 bis 10 µm, auf. The particle preferably has a diameter of 10 nm to 100 microns, especially 1 to 10 .mu.m. Diese Partikelgröße ermöglicht es, die Partikel in der Flüssigkeit zu suspendieren und dadurch einen intensiven Kontakt des Analyten mit der ersten und ggf. zweiten Sonde herzustellen. This particle size makes it possible to suspend the particles in the liquid and thereby to produce an intensive contact of the analyte with the first and possibly the second probe.
  • [0024] [0024]
    In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der Analyt vor Durchführung des Schritts lit. In a preferred embodiment, the analyte prior to performing the step is lit. a mittels eines Fänger-Moleküls an der ersten Oberfläche immobilisiert. a immobilized by a capture molecule at the first surface. Das Fänger-Molekül kann dabei vor oder nach der Bindung an den Analyten an der ersten Oberfläche immobilisiert werden. The capture molecule may be immobilized to the analyte thereby to the first surface before or after binding. Anschließend erfolgt ein Waschschritt, bei welchem die erste Flüssigkeit entfernt und durch eine zweite Flüssigkeit ersetzt wird. This is followed by a washing step, in which the first liquid is removed and replaced by a second liquid. Die zweite Flüssigkeit kann dabei so gewählt werden, dass optimale Bedingungen für das Binden der ersten oder der ersten und der zweiten Sonde beim Schritt lit. The second liquid may be selected so that optimal conditions for the binding of the first or the first and second probe in step lit. a gegeben sind. a are given. Schritt lit. lit. step d wird bevorzugt durchgeführt, indem der immobilisierte Analyt mit daran gebundener erster oder erster und zweiter Sonde zum Entfernen der nicht gebundenen ersten bzw. ersten und zweiten Sonde gewaschen wird. d is preferably carried out by the immobilized analyte is washed with attached thereto the first or the first and second probe to remove the non-bound first or first and second probe. Dabei kann die zweite Flüssigkeit durch eine dritte Flüssigkeit ersetzt werden. Here, the second liquid can be replaced by a third liquid. Die dritte Flüssigkeit ist dabei bevorzugt so gewählt, dass die Detektion gemäß lit. The third liquid is preferably chosen so that the detection according to lit. e darin unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden kann. e can be performed in optimal conditions.
  • [0025] [0025]
    Vorzugsweise ist die zweite Oberfläche eine zur Detektion dienende, insbesondere einen elektrisch leitfähigen Kunststoff oder ein elektrisch leitfähiges Polymer, Quecksilber, Amalgam, Gold, Platin, Kohlenstoff oder Indium-Zinnoxid enthaltende, Elektrode. Preferably, the second surface is a serving for detection, in particular containing an electrically conductive plastics or an electrically conductive polymer, mercury, amalgam, gold, platinum, carbon, or indium tin oxide electrode.
  • [0026] [0026]
    Bevorzugt weist die zweite Sonde eine spezifische Affinität zu mindestens einer spezifischen zweiten Bindungsstelle des Analyten auf. Preferably, the second probe to a specific affinity to at least a second specific binding site of the analyte. Aus dem Verhältnis zwischen dem ersten und dem zweiten Signal lässt sich dann eine Information über das Verhältnis der Zahl der ersten zur Zahl der zweiten Bindungsstellen gewinnen. From the ratio between the first and the second signal then information about the ratio of the number of the first number to the second binding sites can be obtained. Vorzugsweise weist der Analyt eine bekannte Anzahl erster Bindungsstellen und eine unbekannte Anzahl zweiter Bindungsstellen auf. Preferably, the analyte in a known number of first binding sites and an unknown number of second binding sites. Das Charakterisieren kann dann in dem Ermitteln der unbekannten Anzahl der zweiten Bindungsstellen durch das Verhältnis von gebundener ersten zu gebundener zweiten Sonde bzw. das Verhältnis des ersten Signals zum zweiten Signal erfolgen. Characterizing can then take place in the determination of the unknown number of the second binding sites by the ratio of bound to the first bound second probe, or the ratio of the first signal to the second signal. Das Signalverhältnis bzw. die Zahl der daraus ermittelten zweiten Bindungsstellen kann mit der Länge des Analyten korreliert werden. The signal ratio or the number of determined therefrom second binding sites can be correlated with the length of the analyte. Der Analyt kann ein DNA-Fragment sein, welches infolge einer Triplex-Ausdehnungskrankheit, wie dem fragilen X-Syndrom, der Huntingtonschen Krankheit, der bulbären Muskelatrophie, der spinozerebellaren Ataxie Typ I, der myotonischen Dystrophie oder der Friedreich Ataxie, repetetive Sequenzen aufweist. The analyte may be a DNA fragment which has as a result a triplex expansion disease, such as the fragile X syndrome, Huntington's disease, bulbar muscular atrophy, the spinocerebellar ataxia type I, myotonic dystrophy, or Friedreich's ataxia, repetitive sequences. Derartige Krankheiten werden üblicherweise über eine Polymerase-Kettenreaktion mit anschließendem Southern-Blot nachgewiesen. Such diseases are typically detected by a polymerase chain reaction followed by Southern blotting. Im Verhältnis zum erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die repetetiven Sequenzen als zweite Bindungsstellen dienen können, ist das sehr aufwändig und dauert lange. In relation to the inventive method, in which the repetitive sequences can serve as the second binding site, which is very expensive and takes a long time.
  • [0027] [0027]
    In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Sonde von dem Analyten und/oder der Analyt von der ersten oder zweiten Oberfläche zwischen Schritt lit. In a preferred embodiment, the first probe of the analyte and / or the analyte of the first or second surface between step is lit. d und Schritt lit. d and step lit. e, insbesondere durch Hitzedenaturierung, chemische Denaturierung, enzymatischen Verdau oder chemischen Abbau, freigesetzt. e, in particular by heat denaturation, chemical denaturation, enzymatic digestion or chemical degradation are released. Das Freisetzen von der Oberfläche ermöglicht das Aufkonzentrieren des Analyten oder der ersten Sonde in einem sehr kleinen Flüssigkeitsvolumen und erhöht damit die Sensitivität des Verfahrens. The release from the surface enables the concentration of the analyte or the first probe in a very small volume of liquid, thereby increasing the sensitivity of the method. Es ermöglicht ferner einen engen Kontakt der ersten Sonde oder des Analyten mit der zur Detektion eingesetzten Elektrode. It also allows a close contact of the first probe or the analyte with the used for the detection electrode. Weiterhin ist es somit möglich die Detektion durchzuführen, ohne dass die Elektrode mit der ersten Oberfläche in Kontakt kommt. Furthermore, it is thus possible to perform the detection, without the electrode comes into contact with the first surface. Dadurch können mögliche Störungen der elektrochemischen Detektion durch die erste Oberfläche vermieden werden. This potential interference of electrochemical detection by the first surface can be avoided. Es können auch Materialien als erste Oberfläche eingesetzt werden, welche die elektrochemische Detektion normalerweise stören würden. It can be used as a first surface and materials which would normally interfere with electrochemical detection. Beispielsweise können Streptavidin-beschichtete Partikel als erste Oberfläche und Cystein-markierte PNA als erste Sonde verwendet werden, ohne dass bei der elektrochemischen Detektion der Cystein- Markierung durch die Cystein-Reste des Streptavidins Störungen auftreten können. For example, streptavidin-coated particles as the first surface and cysteine-labeled PNA can be used as the first probe without the marking can be caused by the cysteine ​​residues of the streptavidin disturbances in the electrochemical detection of the cysteine. Weiterhin ist es durch das Freisetzen der ersten Sonde von dem Analyten möglich, das erste und das zweite Signal getrennt voneinander zu detektieren. Furthermore, it is by the release of the first probe of the analyte possible, the first and second signals to detect separately. Dadurch ist die Durchführung des Verfahrens auch möglich, wenn das erste und das zweite Signal identisch sind, etwa weil es von jeweils identischen Markern verursacht wird. Characterized carrying out the process is also possible, when the first and the second signal are identical, for example because it is caused by each identical markers.
  • [0028] [0028]
    Es ist auch möglich, die erste und die zweite Sonde von dem Analyten oder die erste Sonde von dem Analyten und den Analyt von der ersten oder zweiten Oberfläche jeweils getrennt voneinander freizusetzen und dann zu detektieren. It is also possible for the first and the second probe of the analyte or the first probe of the analyte and the analyte of the first or second surface of each separately release from each other and then detected. Auch dadurch ist eine Differenzierung zwischen identischen Signalen nach dem verursachenden Molekül möglich. Also be a differentiation between identical signals according to the causative molecule is possible. Weiterhin ist eine Aufkonzentrierung in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen möglich. Furthermore, a possible concentration in a small volume of liquid.
  • [0029] [0029]
    Alternativ ist es auch möglich, den ersten Marker und/oder den zweiten Marker, insbesondere jeweils getrennt voneinander, von der ersten und/oder zweiten Sonde oder dem Analyten freizusetzen und dann zu detektieren. Alternatively, it is also possible for the first marker and / or the second marker, in particular separated from each other, release of the first and / or second probe or the analyte and then detect. Das Freisetzen kann durch enzymatischen Verdau oder chemischen Abbau erfolgen. The release can be carried out by enzymatic digestion or chemical degradation. Beispielsweise könnte der erste und/oder der zweite Marker jeweils über eine Nukleinsäuresequenz mit einer spezifischen Restriktionsschnittstelle an die erste oder zweite Sonde oder den Analyten gebunden sein. For example, the first and / or second marker could be bound in each case via a nucleic acid sequence with a specific restriction site to the first or second probe or the analyte. Ein spezifisches Freisetzen ist dann durch Restriktionsenzyme möglich. A specific release is possible by restriction enzymes.
  • [0030] [0030]
    Die erste und/oder zweite Sonde kann eine Nukleinsäure oder ein Analogon einer Nukleinsäure, insbesondere eine Peptidnukleinsäure (PNA), sein. The first and / or second probe, a nucleic acid or an analog of a nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA), his. Bevorzugt bindet die erste und/oder zweite Sonde sequenzspezifisch, insbesondere durch Hybridisierung, an den Analyten. Preferably, the first and / or second probe binds sequence-specifically, in particular by hybridization to the analyte. Die Sonde kann dabei beispielsweise eine Nukleinsäure sein, welche komplementär zu einer Sequenz des Analyten ist. The probe may for example be a nucleic acid which is complementary to a sequence of the analyte. Bei der Sonde kann es sich aber auch um einen Antikörper handeln, welcher eine bestimmte Aminosäuresequenz in einem aus einem Protein bestehenden Analyten erkennt. But The probe can also be an antibody that recognizes a particular amino acid sequence in a group consisting of a protein analyte.
  • [0031] [0031]
    Das erste oder zweite Signal kann jeweils von einer durch den ersten oder zweiten Marker bewirkten katalytischen Wasserstofffreisetzung verursacht werden. The first or second signal may be caused by a respective caused by the first or second marker catalytic hydrogen release. Bevorzugt ist der erste und/oder der zweite Marker reversibel reduzierbar oder oxidierbar. Preferably, the first and / or the second marker can be reversibly reduced or oxidized. Der erste oder der zweite Marker kann einen Osmium- Komplex, ein Nanogold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe oder einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, aufweisen. The first or the second marker may include an osmium complex, a gold nano-particles, have a cysteine, ferrocenyl, Daunomyzin-, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p-aminophenol group or a dye, in particular indophenol, thiazine or phenazine, have.
  • [0032] [0032]
    Bevorzugt ist die erste oder die zweite Sonde durch mehrere Marker markiert. Preferably, the first or the second probe is labeled by a plurality of markers. Dadurch ist es möglich, eine Sonde für verschiedene elektrochemisch unterschiedlich nachweisbare Analyten zu verwenden. This makes it possible to use a probe for various different electrochemically detectable analyte. Bevorzugt weist die erste oder zweite Sonde eine linieare Primärstruktur auf, an deren einem Ende der Marker angeordnet ist. Preferably, the first or second probe to a linieare primary structure, is arranged at one end of the markers. Durch die endständige Anordnung des Markers wird die Gefahr der Beeinflussung der Wechselwirkung zwischen der ersten oder der zweiten Sonde mit dem Analyten minimiert. By the terminal arrangement of the marker, the risk of influencing the interaction between the first or the second probe with the analyte is minimized.
  • [0033] [0033]
    Die Detektion des ersten und des zweiten Signals kann an derselben Elektrode und/oder durch dasselben elektrochemische Nachweisverfahren erfolgen. The detection of the first and the second signal may take place at the same electrode and / or that the same electrochemical detection methods. Die Detektion erfolgt vorzugsweise mittels kathodischer Stripping-Voltammetrie (CSV), Rechteckwellen-Voltammetrie, zyklischer Voltammetrie oder Chronopotentiometrie. The detection is preferably carried out by means of cathodic stripping voltammetry (CSV), square wave voltammetry, cyclic voltammetry or chronopotentiometry. Die Detektion kann mittels eines reversiblen Redoxprozesses oder einer katalytischen Wasserstoffentwicklung erfolgen. The detection can be effected by means of a reversible redox process or a catalytic hydrogen evolution.
  • [0034] [0034]
    Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. Es zeigen: Show it:
  • [0035] [0035]
    Fig. 1 eine schematische Darstellung der Markierung einer ersten Sonde durch Osmiumtetroxid und 2, 2'-Bipyridin, Fig. 1 is a schematic representation of the labeling of a first probe by osmium tetroxide and 2, 2'-bipyridine,
  • [0036] [0036]
    Fig. 2a, b DPV-Voltammogramme zur Bestimmung der Nachweisgrenze, FIG. 2a, b DPV voltammograms for determining the detection limit,
  • [0037] [0037]
    Fig. 3a, b, c schematische Darstellung des Nachweises eines aus Nukleinsäure bestehenden Analyten durch Hybridisierung mit einer Osmium-markierten ersten Sonde, Fig. 3a, b, c are schematic representation of the detection of a nucleic acid consisting of the analyte by hybridization with an osmium-labeled first probe,
  • [0038] [0038]
    Fig. 4 DPV-Voltammogramm zum Nachweis des aus Nukleinsäure bestehenden Analyten durch Hybridisierung mit einer Osmiummarkierten ersten Sonde, Fig. 4 DPV voltammogram for detecting the group consisting of nucleic acid analytes by hybridisation with a Osmiummarkierten first probe,
  • [0039] [0039]
    Fig. 5a, b Voltammogramme einer Chronopotentiometrischen Stripping Analyse (CPSA) zur Bestimmung der Sensitivität von Cystein- PNA-Sonden, Fig. 5a, b voltammograms a chronopotentiometric Stripping Analysis (CPSA) to determine the sensitivity of cysteine PNA probes,
  • [0040] [0040]
    Fig. 6a-f schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer ersten und einer zweiten Sonde, FIGS. 6a-f schematic representation of a method according to the invention with a first and a second probe,
  • [0041] [0041]
    Fig. 7a-f schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer sequenzspefizischen ersten und einer sequenzunspezifischen zweiten Sonde, Fig. 7a-f schematic representation of a method according to the invention with a sequenzspefizischen first and a sequence-nonspecific second probe,
  • [0042] [0042]
    Fig. 8a-f schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei eine erste Sonde und der Analyt zur Erzeugung elektrochemischer Signale verwendet werden und FIG. 8a-f schematic representation of an inventive method, wherein a first probe and the analyte are used to generate electrochemical signals and
  • [0043] [0043]
    Fig. 9a-g eine schematische Darstellung der Bestimmung der Anzahl von für eine Triplex- Krankheit spezifischen reversiblen Sequenzen. Fig. 9a-g is a schematic representation of the determination of the number of specific for a disease reversible triplex sequences.
  • [0044] [0044]
    Um eine Osmium-markierte Sonde herzustellen, ist ein 97mer mit der Sequenz 5-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT C-3 (SEQ ID NO : 1) aus dem anliegenden Sequenzprotokoll mit 2 mmol/l OsO 4 , 2 mmol/l 2,2'-Bipyridin in 100 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0, für 180 Minuten bei 37°C inkubiert worden. To prepare a osmium labeled probe is a 97mer with the sequence 5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT C- 3 (SEQ ID NO: 1) from the attached sequence protocol with 2 mmol / l OsO 4, 2 mmol / l 2,2'-bipyridine in 100 mmol / l Tris-HCl, pH 7.0, for 180 minutes at 37 ° incubated C. Anschließend ist freies OsO 4 und Bipyridin durch Dialyse gegen entionisiertes Wasser für 5 Stunden entfernt worden. Subsequently free OsO 4 and bipyridine has been removed by dialysis against deionized water for 5 hours. Schematisch ist die Markierung in Fig. 1 dargestellt. Schematically, the mark in Fig. 1 is shown. Ein Oligonukleotid, mit einer ersten zu einem Bereich eines aus Nukleinsäure bestehenden Analyten komplementären Sequenz 9 und einer zweiten viele Thymin-Reste T enthaltenden Sequenz wird mit Osmiumtetroxid und 2,2'-Bipyridin behandelt. An oligonucleotide sequence containing a first complementary to a region of a nucleic acid analyte sequence consisting of 9 and a second many thymine residues T is treated with osmium tetroxide and 2,2'-bipyridine. Dabei bilden die Thymin-Reste spezifische osmiumhaltige Komplexe Os, welche sich als elektrochemische Marker nachweisen lassen. The thymine residues form specific complexes osmium Os, which can be detected as an electrochemical marker.
  • [0045] [0045]
    Zur Bestimmung der Nachweisgrenze der so hergestellten Sonde werden je 3 µl einer 10, 25, 50, 100, 250 und 500 ng/ml der Osmium-markierten Sonde in Britton Robinson-Puffer (0,04 mol/l H 3 BO 3 , 0,04 mol/l H 3 PO 4 und 0,04 mol/l CH 3 COOH gemischt mit 0,2 mol/l NaOH), pH 3,9 mittels Differenzieller Puls-Voltammetrie (DPV) mit einer Scan-Rate von 10 mV/s, einer Amplitude von 50 mV/s, einer Absorbtionszeit von 240 s und einer Scan-Zeit von 120 s bis 240 s vermessen. To determine the limit of detection of the probe thus prepared are each 3 ul of a 10, 25, 50, 100, 250 and 500 ng / ml of osmium labeled probe in Britton Robinson buffer (0.04 mol / l H 3 BO 3, 0 , 04 mol / l H 3 PO 4, and 0.04 mol / l of CH 3 COOH is mixed with 0.2 mol / l NaOH), pH 3.9 (by means of differential pulse voltammetry DPV) at a scan rate of 10 mV / s, an amplitude of 50 mV / s, an absorption time of 240 s and a scan time of 120 s to 240 s measured. Das Ergebnis ist dem in Fig. 2a dargestellten DPV-Voltammogramm zu entnehmen. The result is shown in the illustrated DPV voltammogram in FIG. 2a. Die Kurven 36 , 38 , 40 , 42 , 44 und 45 entsprechen jeweils 500, 250, 100, 50, 25 oder 10 ng/ml der Osmiummarkierten Sonde. The curves 36, 38, 40, 42, 44 and 45 respectively correspond to 500, 250, 100, 50, 25 or 10 ng / ml of Osmiummarkierten probe. Fig. 2b zeigt ein mit demselben Verfahren mit 3 µl einer 250 pg/ml Osmium-markierte Sonde enthaltenden Lösung erzeugtes DPV-Voltammogramm 46 und ein ohne Sonde erzeugtes DPV-Voltammogramm 47 . Fig. 2b containing the same procedure with 3 ul of a 250 pg / ml of osmium labeled probe solution is generated DPV voltammogram 46 and a probe generated without DPV voltammogram 47th Die Nachweisgrenze der Osmiummarkierten Sonde liegt demnach unter 250 pg/ml. The detection limit of Osmiummarkierten probe is therefore less than 250 pg / ml. Das entspricht 25 attomol Sonde. This corresponds to 25 attomol probe.
  • [0046] [0046]
    In Fig. 3a ist ein aus Nukleinsäure bestehender Analyt 10 mit einem Poly-A-Strang (A) n an einem Ende, welcher mit einem mit Poly-T (T) n als Fänger-Molekül 8 beschichteten Partikel in Kontakt gebracht wird, dargestellt. In Fig. 3a is an existing from nucleic acid analyte 10 with a poly-A strand (A) n at one end of which 8 coated particles is brought into contact with a poly-T (T) n as capture molecule represented , Der Analyt 10 bindet an das Partikel 18 durch Hybridisierung von (A) n mit (T) n . The analyte 10 binds to the particles 18 by hybridization of (A) n (T) n. Der partikelgebundene Analyt wird mit einer Osmium-markierten ersten Sonde 20 in Kontakt gebracht ( Fig. 3b). The particle-bound analyte is contacted with an osmium-labeled first probe 20 in contact (Fig. 3b). Die erste Sonde 20 weist eine zu dem nicht hybridisierten Bereich des Analyten 10 komplementäre Sequenz auf. The first probe 20 has a shape complementary to the unhybridized portion of the analyte 10 sequence. Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an den Analyten 10 . Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the analyte 10th Ungebundene erste Sonde 20 wird durch Waschen der Partikel entfernt. Unbound first probe 20 is removed by washing the particles. Anschließend wird die gebundene erste Sonde 20 von dem Analyten 10 durch Hitzebehandlung freigesetzt ( Fig. 3c). Subsequently, the bound first probe 20 is released from the analyte 10 by heat treatment (Fig. 3c). Die erste Sonde 20 kann mittels ihrer Osmium-Markierung elektrochemisch detektiert werden. The first probe 20 can be detected electrochemically by means of their osmium marker.
  • [0047] [0047]
    Der Nachweis kann beispielsweise mit folgenden Komponenten durchgeführt werden: The detection can be carried out, for example, with the following components:
  • 1. Analyt 1. analyte
  • [0048] [0048]
    5'-CTT TT CCT TCT CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA (SEQ ID NO : 2) 5'-CTT TT CCT TCT CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA (SEQ ID NO: 2)
  • 2. Sonde I mit komplementärer Sequenz zum Analyten: 2. Probe I with complementary sequence to the analyte:
  • [0049] [0049]
    5'-TTT TTT TTT TGA GAA GGA AAA AG (SEQ ID NO : 3) 5'-TTT TTT TTT TGA GAA GGA AAA AG (SEQ ID NO: 3)
  • 3. Sonde II ohne komplementäre Sequenz zum Analyten: 3. II probe without complementary sequence to the analyte:
  • [0050] [0050]
    5'-TTT TTT TTT TAG AGA AAG GGA AA (SEQ ID NO : 4) 5'-TTT TTT TTT TAG AGA AAG GGA AA (SEQ ID NO: 4)
  • [0051] [0051]
    Die Thymin-Reste der Sonden I und der zur Kontrolle eingesetzt Sonde II sind mit Osmiumtetroxid und 2,2'-Bipyridin wie oben beschrieben markiert worden. The thymine residues of the probes I and II are used to control probe labeled with osmium tetroxide and 2,2'-bipyridine as described above.
  • [0052] [0052]
    Zur Immobilisierung des Analyten werden 40 µl superparamagnetische Partikel mit daran immobilisierten Oligo-T-25meren der Firma Dynal, Norwegen zu 40 µl einer 10 µgjml des Analyten in 0,1 mol/l NaCl, 0,05 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,4 (Inkubationspuffer) enthaltenden Lösung zugesetzt. For the immobilization of the analyte 40 ul superparamagnetic particles with immobilized thereon T-oligo 25-mer Dynal, Norway to 40 .mu.l of a 10 μgjml of the analyte in 0.1 mol / l NaCl, 0.05 mol / l phosphate buffer, pH 7, 4 (incubation buffer) was added containing solution. Die Suspension wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. The suspension is incubated for 30 minutes at room temperature. Die Partikel werden zwei mal in 100 µl Inkubationspuffer gewaschen und in einem Volumen von 40 µl aufgenommen. The particles are washed two times in 100 ul incubation buffer and added in a volume of 40 ul.
  • [0053] [0053]
    Zur Hybridisierung des Analyten mit der Sonde werden 40 µl des 400 ng/ml der Sonde enthaltenden Inkubationspuffers zu den Partikeln gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. For the hybridization of the analyte with the probe 40 ul of 400 ng / ml incubation buffer containing the probe is added to the particles and incubated for 30 minutes at room temperature. Ungebundene Sonden werden durch viermaliges Waschen in 100 µl Inkubationspuffer entfernt. Unbound probes are removed by washing four times in 100 .mu.l of incubation buffer. Die gebundene Sonde wird durch Erhitzen auf 85°C freigesetzt und durch Abtrennen des die Sonde enthaltenden Überstands abgesondert. The bound probe is released by heating to 85 ° C and isolated by separating the said probe containing supernatant. Zur elektrochemischen Detektion der Osmium-markierten Sonde werden 3 µl des Überstands durch DPV mit einer Absorptionszeit von 2 Minuten in Britton-Robinson-Puffer, pH 3,87 analysiert. For the electrochemical detection of the osmium-labeled probe 3 .mu.l of the supernatant by DPV with an absorption time of 2 minutes in Britton-Robinson buffer, pH 3.87 are analyzed. Zur Bestimmung einer unspezifischen Bindung wird der Analyt mit der Sonde II in einem separaten Ansatz unter identischen Bedingungen in Kontakt gebracht und Inkubiert. To determine non-specific binding, the analyte is contacted with the probe II in a separate batch, under identical conditions in contact and incubated.
  • [0054] [0054]
    Das in Fig. 4 dargestellte DPV-Voltammogramm zeigt ein deutliches Signal 48 der Sonde I und ein sehr schwaches Signal 50 der zur Kontrolle eingesetzten Sonde II. The illustrated in Fig. 4 DPV voltammogram showing a clear signal 48 of the probe I and a very weak signal 50 of the probe II used for the control.
  • [0055] [0055]
    Zur Bestimmung der Sensitivität der Chronopotentiometrischen Stripping Analyse (CSPA) bei Verwendung von Cystein-PNA-Sonden sind verschiedene Konzentrationen von Cystein-PNA (cys- PNA) in 5 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0 für eine Absorbtionszeit von 7 Minuten an einer Elektrode absorbiert worden. To determine the sensitivity of the chronopotentiometric stripping analysis (CSPA) using cysteine ​​PNA probes are various concentrations of PNA cysteine ​​(Cys PNA) in 5 mmol / l phosphate buffer, pH 7.0 for an absorption time of 7 minutes at a been absorbed electrode. Fig. 5a zeigt ein dann in 0,2 mol/l Ammoniumphosphatpuffer, pH 8,5 bei einem Stripping Strom von -2 µA aufgenommenes DPV- Diagramm mit den Wasserstoff-Peak-Kurven 52 , 54 und 56 von jeweils 0,375, 0,180 und 0,094 ng/ml cys-PNA. Fig. 5a shows a then, pH 8.5 recorded in 0.2 mol / l ammonium phosphate buffer at a flow of stripping uA -2 DPV diagram with the hydrogen peak curves 52, 54 and 56 of respectively 0.375, 0.180 and 0.094 ng / ml cys-PNA. Die Nachweisgrenze von cys-PNA lag dabei unter 0,09 ng/ml. The detection limit of cys-PNA here was less than 0.09 ng / ml. Das entspricht 36 attomol cys-PNA in 1 µl. This corresponds to 36 attomol cys-PNA in 1 ul. Fig. 5b zeigt ein DPV-Diagramm von Brdicka's Signalkurven 58 , 60 und 62 von jeweils 0,750, 0,375 und 0,187 ng/ml cys-PNA in 1 mmol/l Co 3+ , 0,1 mol/l Ammoniumphosphatpuffer, pH 9,47. Fig. 5b shows a 0.1 DPV diagram of Brdicka's signal curves 58, 60 and 62 respectively 0.750, 0.375 and 0.187 ng / ml cys-PNA in 1 mmol / l Co 3+, mol / l of ammonium phosphate buffer, pH 9.47 , Dabei lag die Nachweisgrenze von cys-PNA unter 0,19 ng/ml. The detection limit of cys-PNA was less than 0.19 ng / ml.
  • [0056] [0056]
    Fig. 6a-f zeigen eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem eine erste 20 und eine zweite Sonde 22 sequenzspezifisch an den Analyten 10 binden. FIGS. 6a-f show a schematic representation of an inventive method, in which bind a first 20 and a second probe 22 sequence specific to the analyte 10th Fig. 6a zeigt einen Analyten 10 mit einer singulären ersten Bindungsstelle 12 und drei repetetiven zweiten Bindungsstellen 14 . FIG. 6a shows a analyte 10 having a singular first binding site 12 and three repetitive second binding sites 14. Der Analyt 10 wird an einer ersten Oberfläche 16 eines Partikels 18 immobilisiert ( Fig. 6b). The analyte 10 is at a first surface 16 of a particle 18 immobilized (Fig. 6b). Der Analyt 10 wird mit der ersten Sonde 20 und der zweiten Sonde 22 in Kontakt gebracht ( Fig. 6c). The analyte 10 is contacted with the first probe 20 and second probe 22 is in contact (Fig. 6c). Die erste Sonde 20 weist eine Affinität zur ersten Bindungsstelle 12 und die zweite Sonde 22 eine Affinität zu den zweiten Bindungsstellen 14 auf. The first probe 20 has an affinity for the first binding site 12 and the second probe 22 on an affinity to the second binding sites fourteenth Die erste Sonde 20 ist mit einem ersten elektrochemischen Marker 24 und die zweite Sonde 22 mit einem zweiten elektrochemischen Marker 26 markiert. The first probe 20 is labeled with a first electrochemical marker 24 and second probe 22 with a second electrochemical marker 26th
  • [0057] [0057]
    Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an die erste Bindungsstelle 12 und die zweite Sonde 22 an die zweiten Bindungsstellen 14 ( Fig. 6d). Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the first binding site 12 and the second probe 22 to the second binding sites 14 (Fig. 6d). Ungebundene Sonden werden durch Waschen entfernt. Unbound probes are removed by washing. Die Sonden werden von dem Analyten freigesetzt und zum Nachweis mit einer zweiten als Elektrode dienenden Oberfläche 27 in Kontakt gebracht ( Fig. 6e). The probes are released from the analyte and for detecting brought to a second electrode serving as surface 27 in contact (Fig. 6e). Das durch den Marker 24 verursachte Signal Si1 und das durch den Marker 26 verursachte Signal Si2 werden gemessen ( Fig. 6f) und zueinander ins Verhältnis gesetzt. This caused by the marker 24 signal Si1 and that caused by the marker signal Si2 26 are measured (Fig. 6f) and a ratio is. Das Verhältnis von Si2 zu Si1 entspricht dem Verhältnis der Zahl der zweiten Bindungsstellen 14 zur ersten Bindungsstelle 12 . The ratio of Si2 to Si1 corresponds to the ratio of the number of second binding sites 14 to the first binding site 12th Fig. 7a-f zeigen eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei eine erste Sonde 20 sequenzspezifisch und eine zweite Sonde 22 sequenzunspezifisch an den Analyten 10 bindet. Fig. 7a-f show a schematic representation of the method according to the invention, wherein a first probe 20 and a second probe sequence specific 22 sequence-unspecific binding to the analyte 10th
  • [0058] [0058]
    Fig. 7a zeigt einen Analyten 10 , welcher eine singuläre erste Bindungsstelle 12 aufweist. Fig. 7a shows an analyte 10, having a singular first binding site 12. Der Analyt 10 wird an einer ersten Oberfläche 16 eines Partikels 18 immobilisiert ( Fig. 7b). The analyte 10 is at a first surface 16 of a particle 18 immobilized (Fig. 7b). Der Analyt 10 wird mit den ersten Sonden 20 und zweiten Sonden 22 in Kontakt gebracht ( Fig. 7c). The analyte 10 is 20 and second probes 22 associated with the first probes into contact (Fig. 7c). Die erste Sonde 20 weist eine Bindungsaffinität zur ersten Bindungsstelle 12 auf. The first probe 20 has a binding affinity for the first binding site 12th Die zweite Sonde 22 weist eine sequenzunspezifische Affinität zu dem Analyten 10 auf. The second probe 22 has a non-sequence specific affinity for the analyte 10th Die zweite Sonde 22 kann beispielsweise ein DNA-Interkalator sein. The second probe 22 may for example be a DNA intercalator. Die erste Sonde 20 ist durch einen ersten elektrochemischen Marker 24 und die zweite Sonde 22 durch einen zweiten elektrochemischen Marker 26 markiert. The first probe 20 is labeled with a first electrochemical marker 24 and the second probe 22 by a second electrochemical marker 26th
  • [0059] [0059]
    Unter den gewählten Bedingungen binden die erste Sonde 20 und die zweite Sonde 22 an den Analyten 10 ( Fig. 7d). Under the selected conditions, the first probe 20 and second probe 22 bind to the analyte 10 (Fig. 7d). Ungebundene erste 20 und zweite Sonde 22 werden durch Waschen entfernt. Unbound first 20 and second probe 22 are removed by washing. Gebundene erste 20 und die zweite Sonde 22 werden von dem Analyten freigesetzt und mit einer zweiten als Nachweiselektrode dienenden Oberfläche 27 in Kontakt gebracht ( Fig. 7e). Bound first 20 and the second probe 22 are released from the analyte, and contacted with a second electrode serving as a detection surface 27 in contact (Fig. 7e).
  • [0060] [0060]
    Das durch den Marker 24 verursachte erste Signal Si1 und das durch den Marker 26 verursachte zweite Signal Si2 werden gemessen ( Fig. 7f) und zueinander ins Verhältnis gesetzt. This caused by the marker 24 and the first signal Si1 caused by the marker 26 second signal Si2 to be measured (Fig. 7f) and a ratio is. Das Verhältnis entspricht dem Verhältnis der ersten Bindungsstelle 12 zu der Gesamtlänge des Analyten 10 . The ratio corresponds to the ratio of the first binding site 12 to the overall length of the analyte 10th
  • [0061] [0061]
    In Fig. 8a ist ein aus Nukleinsäure bestehender Analyt 10 mit einer singulären ersten Bindungsstelle 12 und einer bestimmten Anzahl von Guanin-Resten G dargestellt. In Fig. 8a, an existing nucleic acid from the analyte 10 is shown having a singular first binding site 12 and a certain number of guanine residues G. Der Analyt 10 wird an einer erste Oberfläche 16 eines Partikels 18 immobilisiert ( Fig. 8b). The analyte 10 is at a first surface 16 of a particle 18 immobilized (Fig. 8b). Er wird mit einer ersten Sonde 20 , welche mit einem elektrochemischen Marker 24 markiert ist und eine spezifische Affinität zu der ersten Bindungsstelle 12 aufweist, in Kontakt gebracht ( Fig. 8c). He is reacted with a first probe 20, which is labeled with an electrochemical marker 24 and having a specific affinity for the first binding site 12 in contact (Fig. 8c). Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an die erste Bindungsstelle 12 ( Fig. 8d). Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the first binding site 12 (Fig. 8d). Ungebundene erste Sonde 20 wird durch Waschen entfernt. Unbound first probe 20 is removed by washing. An den Analyten 10 gebundene erste Sonde 20 und die Guanin-Reste G werden von bzw. aus dem Analyten 10 , z. Bound to the analyte 10 first probe 20 and the guanine residues G are contained in or on the analyte 10, z. B. durch saure Hydrolyse, freigesetzt und mit einer zweiten als Nachweis-Elektrode dienenden Oberfläche 27 in Kontakt gebracht ( Fig. 8e). (. Fig 8e), by acidic hydrolysis, released and brought into contact with a second electrode serving as the detection surface 27. Das durch G erzeugte Signal Si1 und das durch den Marker 24 erzeugte Signal Si2 werden gemessen ( Fig. 8f) und zueinander ins Verhältnis gesetzt. The generated by G signal Si1 and that generated by the marker 24 signal Si2 to be measured (Fig. 8f) and a ratio is. Das Verhältnis der Signale Si1 zu Si2 entspricht dem Zahlenverhältnis der ersten Bindungsstelle 12 zu der Gesamtanzahl an G in dem Analyten 10 . The ratio of the signals Si1 Si2 to corresponds to the ratio of the first binding site 12 to the total number of G in the analyte 10th
  • [0062] [0062]
    In Fig. 9a ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment 11 , welches eine unbekannte Anzahl von für eine Triplex-Krankheit spezifischen repetetiven je eine zweite Bindungsstelle 14 enthaltende Sequenzen und eine singuläre eine erste Bindungsstelle 12 enthaltende Sequenz aufweist. In Fig. 9a is a double-stranded DNA fragment 11, which has an unknown number of specific triplex disease repetitive per a second binding site 14 sequences containing a singular and a first binding site 12 containing sequence. Das DNA-Fragment wird mit einem ersten, an seinem 5'-Ende einen Poly-A-Anteil pA aufweisenden Primer 28 und einem zweiten Primer 30 in Kontakt gebracht. The DNA fragment is contacted with a first, at its 5 'end a poly-A proportion pA having primer 28 and a second primer 30 in contact. Die ersten 28 und zweiten Primer 30 binden an jeweils einen DNA-Strang des DNA-Fragments 11 und rahmen dabei die zweiten Bindungsstellen 14 und die erste Bindungsstelle 12 ein ( Fig. 9b). The first 28 and second 30 primer bind to each have a DNA strand of the DNA fragment 11 and frame while the second binding sites 14 and the first binding site 12 (FIG. 9b).
  • [0063] [0063]
    Durch eine Vervielfältigungsreaktion wird ein Amplifikationsprodukt 32 erzeugt, welches die zweiten Bindungsstellen 14 und die erste Bindungsstelle 12 sowie den Poly-A-Anteil an einem 5'-Ende enthält ( Fig. 9c). By an amplification reaction, an amplification product 32 is produced which the second binding sites 14 and the first binding site 12 and the poly-A portion of a 5 'end contains (Fig. 9c). Das Amplifikationsprodukts 32 wird durch Denaturierung von seinem Gegenstrang 33 getrennt und mit einem eine Poly-T-Sonde als Fänger-Molekül pT aufweisenden superparamagnetischen Partikel 18 in Kontakt gebracht. The amplification product 32 is separated by denaturation of its opposite strand 33 and brought into contact with a poly-T probe having as capture molecule pT superparamagnetic particles 18th Dabei bindet der Poly-A-Anteil pA spezifisch an die Poly-T-Sonde pT ( Fig. 9d). Here, the poly-A portion Pa specifically binds to the poly-T probe pT (Fig. 9d).
  • [0064] [0064]
    Das an das Partikel 18 gebundene Amplifikationsprodukt 32 wird mit einer ersten Sonde 20 , welche eine spezifische Affinität zu der ersten Bindungsstelle 12 aufweist und einer zweiten Sonde 22 , welche eine spezifische Affinität zu den zweiten Bindungsstellen 14 aufweist, in Kontakt gebracht. The bound to the particle 18 32 amplification product is contacted with a first probe 20, which has a specific affinity for the first binding site 12 and a second probe 22, which has a specific affinity to the second binding sites 14, in contact. Die erste Sonde 20 ist mit einem elektrochemischen Marker 24 und die zweite Sonde 22 mit einem elektrochemischen Marker 26 markiert ( Fig. 9e). The first probe 20 is provided with an electrochemical marker 24 and second probe 22 with an electrochemical marker 26 marks (Fig. 9e).
  • [0065] [0065]
    Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an die erste Bindungsstelle 12 und die zweite Sonde 22 an die zweiten Bindungsstellen 14 ( Fig. 9f). Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the first binding site 12 and the second probe 22 to the second binding sites 14 (Fig. 9f). Der Überschuss an ungebundener erster 20 und zweiter Sonde 22 wird durch Waschen entfernt. The excess of unbound first 20 and second probe 22 is removed by washing.
  • [0066] [0066]
    Gebundene erste 20 und zweite Sonden 22 werden von dem Amplitikationsprodukt 32 freigesetzt und mit einer Nachweiselektrode 27 in Kontakt gebracht ( Fig. 9g). Bound first 20 and second probe 22 are released from the Amplitikationsprodukt 32 and brought into contact with a detection electrode 27 in contact (Fig. 9g). Durch die Marker 24 und 26 verursachte elektrochemische Signale werden getrennt voneinander erfasst. Caused by the markers 24 and 26 electrochemical signals are detected separately. Die Anzahl der repetetiven Sequenzen wird aus dem Verhältnis der durch die Marker 24 und 26 erzeugten Signale ermittelt. The number of repetitive sequences is determined from the ratio of signals generated by the marker 24 and 26th Das Verfahren ist somit zum Nachweisen und Identifizieren einer Triplex-Krankheit geeignet. The method is therefore suitable for detecting and identifying a triplex disease. SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING



Claims (33)

1. Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten ( 10 ) mit folgenden Schritten: 1. A method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte contained in a first liquid (10) comprising the steps of:
a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten ( 10 ) mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten ( 10 ) aufweisenden ersten ( 20 ) und zweiten Sonde ( 22 ), wobei die Affinität der erste Sonde ( 20 ) durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle ( 12 ) des Analyten ( 10 ) bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste ( 20 ) und die zweite Sonde ( 22 ) an den Analyten ( 10 ) binden, a) contacting and incubating the analyte (10) each having a (an affinity for the analyte 10) having first (20) and second probes (22), wherein the affinity of the first probe (20) by a specific affinity to at least one first binding site (12) of the analyte (10) is effected, and the incubating is carried out under conditions under which the first (20) and the second probe (22) to the analyte (10) bind
b) Markieren der ersten Sonde ( 20 ) durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker ( 24 ), zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, b) labeling said first probe (20) by at least one electrochemically detectable specific first marker (24), at least if it is not already specifically electrochemically detectable,
c) Markieren der zweiten Sonde ( 22 ) durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker ( 26 ), zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, c) marking the second probe (22) by at least one electrochemically detectable specific second marker (26), at least if it is not already specifically electrochemically detectable,
d) Absondern der an den Analyten ( 10 ) gebundenen ersten ( 20 ) und zweiten Sonde ( 22 ), d) secreting (to the analyte 10) bonded first (20) and second probes (22),
e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde ( 20 ) oder den ersten Marker ( 24 ) verursachten ersten elektrochemischen Signals (Si1) und eines durch die abgesonderte zweite Sonde ( 22 ) oder den zweiten Marker ( 26 ) verursachten zweiten elektrochemischen Signals (Si2) und e) detection of a (by the separated first probe 20) or the first marker (24) caused first electrochemical signal (Si1) and a (through the separate second probe 22) or the second marker (26) caused the second electrochemical signal (Si2) and
f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten ( 10 ) mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten (Si1) und dem zweiten Signal (Si2) f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte (10) (by means of a ratio between the first (Si1) and the second signal Si2)
2. Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten ( 10 ) mit folgenden Schritten: 2. A method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte contained in a first liquid (10) comprising the steps of:
a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten ( 10 ) mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten ( 10 ) aufweisenden ersten Sonde ( 20 ), wobei die Affinität der erste Sonde ( 20 ) durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle ( 12 ) des Analyten ( 10 ) bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste Sonde ( 20 ) an den Analyten ( 10 ) bindet, a) contacting and incubating the analyte (10) each having an affinity for the analyte (10) having the first probe (20), wherein the affinity of the first probe (20) by a specific affinity to at least one first binding site (12) of the analyte (10) is effected, and the incubating is carried out under conditions under which the first probe (20) to the analyte (10) binds
b) Markieren der ersten Sonde ( 20 ) durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker ( 24 ), zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, b) labeling said first probe (20) by at least one electrochemically detectable specific first marker (24), at least if it is not already specifically electrochemically detectable,
c) Markieren des Analyten ( 10 ) durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker ( 26 ), zumindest wenn der Analyt ( 10 ) nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, c) labeling the analyte (10) by at least one electrochemically detectable specific second marker (26), at least if the analyte (10) is not already specifically electrochemically detectable,
d) Absondern des von der ersten Sonde ( 20 ) gebundenen Analyten ( 10 ) und der von dem Analyten ( 10 ) gebundenen ersten Sonde ( 20 ), d) discharging the (by the first probe 20) bound analyte (10) and (10 from the analyte) bound first probe (20),
e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde ( 20 ) oder den ersten Marker ( 24 ) verursachten ersten elektrochemischen Signals (Si1) und eines durch den abgesonderten Analyten ( 10 ) oder den zweiten Marker ( 26 ) verursachten zweiten elektrochemischen Signals (Si2) und e) detection of a (by the separated first probe 20) or the first marker (24) caused first electrochemical signal (Si1) and a (through the separate analytes 10) or the second marker (26) caused the second electrochemical signal (Si2), and
f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten ( 10 ) mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten (Si1) und dem zweiten Signal (Si2) f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte (10) (by means of a ratio between the first (Si1) and the second signal Si2)
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine zur Detektion eingesetzte Elektrode ( 27 ) nicht mit der ersten Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein an electrode used for detection (27) is not brought into contact with the first liquid.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ( 10 ) vor dem Schritt lit. 4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte (10) prior to step lit. e, insbesondere vor dem Schritt lit. e, in particular before step lit. a, von der ersten Flüssigkeit abgetrennt und in eine zweite Flüssigkeit überführt wird. a, is separated from the first liquid and transferred into a second liquid.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ( 10 ), insbesondere spezifisch, von einem Fänger-Molekül (pT, (T) n ) gebunden wird. 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte (10), in particular specifically, from a capture molecule (pT, (T) n) is bound.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fänger-Molekül (pT, (T) n ) an einer ersten ( 16 ) oder zweiten Oberfläche immobilisiert wird. 6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the capture molecule (pT, (T) n) is immobilized on a first (16) or second surface.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fänger-Molekül (pT, (T) n ) eine Nukleinsäure, ein Analogon einer Nukleinsäure, insbesondere eine Peptidnukleinsäure (PNA), ein Antikörper oder ein Rezeptor ist. Is 7. A method according to any of the preceding claims, wherein the capture molecule (pT, (T) n) a nucleic acid, an analog of a nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA), an antibody or a receptor.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fänger-Molekül (pT, (T) n ) ein Affinitätsmolekül, insbesondere Streptavidin, Avidin oder Biotin, oder ein biotinyliertes Oligonukleotid aufweist. Has 8. A method according to any of the preceding claims, wherein the capture molecule (pT, (T) n) an affinity molecule, especially streptavidin, avidin or biotin or a biotinylated oligonucleotide.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste ( 20 ) oder zweite Sonde ( 22 ) oder der Analyt ( 10 ) ein Affinitätsmolekül, insbesondere Biotin, Avidin oder Streptavidin, enthält. 9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (20) or second probe (22) or the analyte (10) an affinity molecule, in particular biotin, avidin or streptavidin contains.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ( 10 ) eine, insbesondere ein poly-T-Ende (pT, (T) n ) oder ein poly-A-Ende (pA, (A) n ) aufweisende, Nukleinsäure ist. 10. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte (10), in particular a poly-T-end (pT, (T) n) or a poly-A tail (pA, (A) n) comprising, nucleic acid is.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Charakterisieren durch das Bestimmen der Länge der Nukleinsäure erfolgt. 11. The method according to any one of the preceding claims, wherein said characterization is carried out by determining the length of the nucleic acid.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ( 10 ) vor oder während Schritt lit. 12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte (10) before or during step lit. a mittels einer Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere einer PCR, vervielfältigt wird. a is amplified by a nucleic acid amplification reaction, in particular a PCR.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ( 10 ) vor dem Schritt lit. 13. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte (10) prior to step lit. d, insbesondere vor dem Schritt lit. d, in particular before step lit. a, an der ersten ( 16 ) oder zweiten Oberfläche immobilisiert wird. at the first (16) or second surface is immobilized a.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Oberfläche ( 16 ) die Oberfläche eines, insbesondere superparamagnetischen, Partikels ( 18 ) ist. 14. A method according to any one of the preceding claims, wherein the first surface (16) of, in particular superparamagnetic, the surface, the particle (18).
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Partikel ( 18 ) einen Durchmesser von 10 nm bis 100 µm, insbesondere 1-10 µm, aufweist. 15. The method of claim 14, wherein the particles (18) having a diameter of 10 nm to 100 .mu.m, particularly 1-10 .mu.m.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Oberfläche eine zur Detektion dienende, insbesondere einen elektrisch leitfähigen Kunststoff oder ein elektrisch leitfähiges Polymer, Quecksilber, Amalgam, Gold, Platin, Kohlenstoff oder Indium-Zinnoxid enthaltende, Elektrode ( 27 ) ist. 16. The method according to any one of the preceding claims, wherein the second surface is a serving for detection, in particular containing an electrically conductive plastics or an electrically conductive polymer, mercury, amalgam, gold, platinum, carbon, or indium tin oxide electrode (27).
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Sonde ( 22 ) eine spezifische Affinität zu mindestens einer spezifischen zweiten Bindungsstelle ( 14 ) des Analyten ( 10 ) aufweist. 17. The method according to any one of the preceding claims, wherein said second probe (22) has a specific affinity to at least one second specific binding site (14) of the analyte (10).
18. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Analyt ( 10 ) eine bekannte Anzahl erster Bindungsstellen ( 12 ) und eine unbekannte Anzahl zweiter Bindungsstellen ( 14 ) aufweist. 18. Method according to the preceding claim, wherein the analyte (10) having a known number of first knuckles (12) and an unknown number of second binding sites (14).
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ( 10 ) ein DNA-Fragment ist, welches infolge einer Triplex-Ausdehnungskrankheit, wie dem fragilen X- Syndrom, der Huntingtonschen Krankheit, der bulbären Muskelatrophie, der spinozerebellaren Ataxie Typ I, der myotonischen Dystrophie oder der Friedreich Ataxie, repetetive Sequenzen aufweist. 19. A method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte (10) is a DNA fragment due to a triplex expansion disease, such as the fragile X syndrome, Huntington's disease, bulbar muscular atrophy, the spinocerebellar ataxia type I, the myotonic dystrophy comprising or Friedreich's ataxia, repetitive sequences.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Sonde ( 20 ) von dem Analyten ( 10 ) und/oder der Analyt ( 10 ) von der ersten ( 16 ) oder zweiten Oberfläche zwischen Schritt lit. 20. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first probe (20) from the analyte (10) and / or the analyte (10) from the first (16) or second surface between step lit. d und Schritt lit. d and step lit. e, insbesondere durch Hitzedenaturierung, chemische Denaturierung, enzymatischen Verdau oder chemischen Abbau, freigesetzt wird. e, in particular by heat denaturation, chemical denaturation, enzymatic digestion or chemical degradation, is released.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste ( 20 ) und die zweite Sonde ( 22 ) von dem Analyten ( 10 ) oder die erste Sonde ( 20 ) von dem Analyten ( 10 ) und der Analyt ( 10 ) von der ersten ( 16 ) oder zweiten Oberfläche jeweils getrennt voneinander freigesetzt und dann detektiert werden. 21. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (20) and the second probe (22) from the analyte (10) or the first probe (20) from the analyte (10) and the analyte (10) from the first (16) or second surface are released each separately and then detected.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste Marker ( 24 ) und/oder der zweite Marker ( 26 ), insbesondere jeweils getrennt voneinander, von der ersten ( 20 ) und/oder zweiten Sonde ( 22 ) oder dem Analyten ( 10 ) freigesetzt und dann detektiert werden. 22. The method according to any one of the preceding claims, wherein said first marker (24) and / or the second marker (26), in particular in each case separated from the first (20) and / or second probe (22) or the analyte (10 ) are released and then detected.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste ( 24 ) und/oder der zweite Marker ( 26 ) durch enzymatischen Verdau oder chemischen Abbau freigesetzt werden. 23. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (24) and / or the second marker (26) may be released by enzymatic digestion or chemical degradation.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste ( 20 ) und/oder zweite Sonde ( 22 ) eine Nukleinsäure oder ein Analogon einer Nukleinsäure, insbesondere eine Peptidnukleinsäure (PNA), ist. 24. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (20) and / or second probe (22) is a nucleic acid or an analog of a nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA).
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste ( 20 ) und/oder zweite Sonde ( 22 ) sequenzspezifisch, insbesondere durch Hybridisierung, an den Analyten ( 10 ) bindet. 25. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (20) and / or second probe (22) sequence-specifically, in particular by hybridization to the analyte (10) binds.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste (Si1) oder zweite Signal (Si2) jeweils von einer durch den ersten ( 24 ) oder zweiten Marker ( 26 ) bewirkten katalytischen Wasserstofffreisetzung verursacht wird. 26. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (i1) or the second signal (Si2) is caused in each case effected by a by the first (24) or second marker (26) catalytic hydrogen release.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste ( 24 ) und/oder der zweite Marker ( 26 ) reversibel reduzierbar oder oxidierbar ist. 27. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (24) and / or the second marker (26) can be reversibly reduced or oxidized.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste ( 24 ) oder zweite Marker ( 26 ) einen Osmium-Komplex, ein Nanogold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe oder einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, aufweist. 28. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (24) or second marker (26) comprises osmium complex, a nano-gold particle, a cysteine, ferrocenyl, Daunomyzin-, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p-aminophenol group or a dye, in particular indophenol, phenazine or thiazine has.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste ( 20 ) oder zweite Sonde ( 22 ) durch mehrere Marker ( 24 , 26 ) markiert ist. 29. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (20) or second probe (22) by a plurality of markers (24, 26) is highlighted.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste ( 20 ) oder zweite Sonde ( 22 ) eine lineare Primärstruktur aufweist, an deren einem Ende der Marker ( 24 , 26 ) angeordnet ist. 30. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (20) or second probe (22) having a linear primary structure, at one end of the marker (24, 26) is arranged.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion des ersten (Si1) und des zweiten Signals (Si2) an derselben Elektrode und/oder durch dasselbe elektrochemische Nachweisverfahren erfolgt. 31. A method according to any one of the preceding claims, wherein the detection of the first (Si1) and the second signal (Si2) is carried out at the same electrode and / or by the same electrochemical detection methods.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion mittels kathodischer Stripping Voltammetrie (CSV), Rechteckwellen-Voltammetrie, zyklischer Voltammetrie oder Chronopotentiometrie erfolgt. 32. The method according to any one of the preceding claims, wherein the detection means of cathodic stripping voltammetry (CSV), square wave voltammetry, cyclic voltammetry or chronopotentiometry occurs.
33. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion mittels eines reversiblen Redoxprozesses oder einer katalytischen Wasserstoffentwicklung erfolgt. 33. The method according to any one of the preceding claims, wherein the detection means of a reversible redox process or a catalytic hydrogen evolution takes place.
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