DE1022180B

DE1022180B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von mehrwertigen Alkoholen

Info

Publication number: DE1022180B
Application number: DEN12236A
Authority: DE
Inventors: James M Roxburgh; Henry R Sallans; John F T Spencer
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1955-05-16
Filing date: 1956-05-15
Publication date: 1958-01-09

Description

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von mehrwertigen Alkoholen Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von mehrwertigen Alkoholen. Im besonderen bezieht sie sich auf die gleichzeitige Herstellung von Glycerin und d-Arabit durch Zuckergärung.
Die Herstellung von d-Arabit durch chemische Reduktion von d-Arabinose empfiehlt sich wegen der Umständlichkeit und Kostspieligkeit der Verfahren nicht.
Man kann zwar heute Glycerin durch Gärung herstellen; die hierfür vorgeschlagenen Methoden erfordern jedoch den Zusatz großer Mengen von Sulfiten oder Bisulfiten zur Hefegärung oder die Regulierung des pn-Wertes bei der Gärung durch Zusatz großer Mengen Alkalien.
Es ist deshalb ein Ziel der Erfindung, d-Arabit auf wirtschaftlichere Weise zu gewinnen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Gewinnung von Glycerin als wichtiges Nebenprodukt neben d-Arabit.
Man kann diese und andere Ziele erreichen, wenn man einen mehrwertigen Alkohol aus der Gruppe d-Arabit, Glycerin und Erythrit durch Vergärung eines Zuckers mit Hilfe einer osmophilen Hefe herstellt, welche aus der Gruppe Saccharomyces rouxii und Saccharomyces mellis auszuwählen ist.
Die einzelnen Autoren weichen in der Nomenklatur der osmophilen Hefen beträchtlich voneinander ab. Im nachstehenden wird das in dem Buch »The Yeasts<, von Lodder und Kreger van Rij enthaltene Bezeichnungssystem verwendet. Nach diesen Autoren werden alle osmophilen Hefen in Saccharomyces rouxii oder Saccharomyces mellis eingeteilt. Hierunter fallen alle Hefen, welche auf Marmelade, Gelee, Honig, Pollen, getrockneten Früchten oder anderen Materialien mit hohem Zuckergehalt wachsen. Die genannten Autoren kennen keine Gattung oder Untergattung Zygosaccharomyces. Deshalb wird im nachstehenden Z. barkeri und eine Art von Z. nussbaumeri unter der Spezies S. rouxii und Z. mellis, Z. richteri und eine andere Art von Z. nussbaumeri unter der Spezies S. mellis eingeordnet.
Die Gärung wird normalerweise unter Luft- bzw. Sauerstoffzufuhr und in Gegenwart eines stickstoffhaltigen Mittels durchgeführt. Das stickstoffhaltige Mittel ist normalerweise Maisquellwasser und/oder Hefeextrakt, und diese Substanzen können einzeln oder gemeinsam in Verbindung mit einem weiteren stickstoffhaltigen Mittel, wie Harnstoff, Ammoniumsulfat oder Ammoniumtartrat, verwendet werden.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Medium aus 20 % Glukose, 0,8 bis 1;0 % Maisquellwasser oder Hefeextrakt und 0,35 % Harnstoff benutzt. Die Gärung wird unter Verwendung von Arten von Saccharomyces mellis oder S. rouxii vorgenommen. Wie man die am besten geeigneten Arten von S. mellis und S. rouxii auswählen kann, wird weiter unten beschrieben. Eine Belüftung des in Gärbehältern mit Querwänden befindlichen Mediums unter Schütteln führt zur optimalen Gärungsgeschwindigkeit und zur optimalen Ausbeute an dem Nebenprodukt Glycerin, wenn in der Lösung ein Verhältnis von 40 bis 60 Millimol Sauerstoff pro Liter Medium und Stunde erreicht wird. Der Sauerstoffgehalt ist durch jodometrische Titration einer wäßrigen Natriumsulfitlösung mit Kupfersulfat als Katalysator zu bestimmen. Die Ausbeute an d-Arabit wird sehr wenig durch die Sauerstoffzufuhr beeinflußt. Es hat sich herausgestellt, daß die Auswahl einer guten Hefeart wichtig ist, da die einzelnen Arten in der Gesamtausbeute und im Verhältnis Glycerin zu d-Arabit zu Erythrit ganz erheblich voneinander abweichen.
Geeignete Hefen können gut von Brutwabenpollen, von gärendem Honig, von stark zuckerhaltigen getrockneten Früchten, falls diese nicht irgendwie sterilisiert sind, von gärenden Marmeladen, Gelees, Sirups oder von anderen Stoffen mit hohem Zuckergehalt und Anzeichen einer Gärung isoliert werden. Ein besonders gut geeignetes Isolationsmedium besteht aus 60 % Honig, 0,25 °/o Hefeextrakt und 39,75 % Wasser. Proben des Ursprungsmaterials werden in sterile Kulturröhrchen eingebracht, welche mit dem vorstehenden Nährmedium gefüllt sind, und wenn Wachstum zu beobachten ist, werden die Kulturen in Schalen gegeben und daraus nach biologischen Standardmethoden reine Kulturen isoliert. Die Kulturen werden auf Agarstrichkulturen des gleichen ylediums gehalten, welches zur Isolierung benutzt wurde.
Die Kulturen werden auf Erzeugung von d Arabit, Glycerin und Erythrit untersucht, indem sie in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht werden, welche 50 ml eines wäßrigen Mediums aus 201j, Glukose, 10j', Hefeextrakt und 0,150/, Harnstoff enthalten. Diese Kolben werden in eine umlaufende Schüttelmaschine gesetzt. Man züchtet bei 30°, bis die Glukose vollständig umgesetzt ist. Das entstandene Gemisch untersucht man auf d-Arabit, Erythrit und Glycerin und wählt danach eine Art aus, welche in brauchbarer Zeit gute Ausbeuten hervorbringt.
Die in den folgenden Beispielen verwendete Hefe wurde in der v orbeschriebenen Art, ausgehend von Brutwabenpollen, isoliert, jedoch kann auch jede andere Hefe verwendet werden, welche in der vorstehenden Art isoliert wurde.
Es hat sich herausgestellt, daß die schneller wachsenden Kulturen osmophiler Hefen normalerweise große Mengen Glycerin und d-Arabit oder gelegentlich d-Arabit allein hervorbringen. Man hat hier ein brauchbares Kriterium zur Auswahl der besten Spezies. Die Kulturen, welche langsamer wachsen, erzeugen gewöhnlich Glycerin und Erythrit oder Erythrit allein. Eine Steigerung der Stickstoffkonzentration im Medium kann die Wachstumsgeschwindigkeit und die Ausbeute erhöhen.
Im allgemeinen findet die erfindungsgemäße Gärung bei Zuckerkonzentrationen in der Größenordnung von 20 bis 40 °/o statt, während die Gärungszeiten 4 bis 10 Tage betragen. Aus diesen ziemlich konzentrierten Zuckerlösungen entstehen hochkonzentrierte Lösungen der Reaktionsprodukte. Dieser Umstand trägt dazu bei, die Wirksamkeit der Gewinnung zu erhöhen und die Kosten herabzusetzen. Bei Verwendung von 20%iger Zuckerlösung in Schüttelkolben haben sich Konzentrationen von 8 °/o Arabit und 8 °/o Glycerin erzielen lassen. Die Abtrennung sowohl von Arabit als auch von Glycerin ist relativ leicht. Nach der Konzentrierung und der Entfernung des Schleims kristallisiert der Arabit direkt aus dem Filtrat, während das Glycerin in der Lösung zurückbleibt, aus der es bequem nach den gebräuchlichen Verfahren gewonnen werden kann.
Im nachstehenden ist die Erfindung beispielsweise veranschaulicht. Beispiel 1 Herstellung von Impfmaterial für die Kulturbehälter Das Impfmaterial für die 5-1-Gärbehälter wird in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben gezüchtet, welche 150 ml Medium enthalten. Man impft diese Kolben entweder direkt aus dem Agar-Nährboden, welcher im vorstehenden bei der Isolation geeigneter Spezies beschrieben wurde, oder aus einem Rohr mit einer flüssigen Kultur der Organismen oder aus einer vorher gezüchteten Schüttelkolbenkultur. Die Kolben werden in einen umlaufenden Schüttler gesetzt, welcher einen Bewegungsradius von 1,27 cm bei 160 Umdrehungen pro Minute besitzt. Man kultiviert 2 bis 3 Tage. Die Menge des verwendeten Impfstoffes ist nicht entscheidend; es sind 0,5 °/o des Volumens der Schüttelkultur erfolgreich verwendet worden, jedoch werden üblicherweise 50/, benutzt.
Beispiel 2 Gärung Der normalerweise verwendete Gärbehälter bestand aus einem mit Querwänden versehenen 5-1-Tank. Innerhalb des Tanks war ein Rührer mit vier Armen angeordnet, und direkt unter dem Rührer befand sich eine Düse. Jeder ähnliche Gärbehälter, bei dem eine Sauerstoffkonzentration von ungefähr -10 bis 60 Millimol Sauerstoff pro Liter und Stunde erreicht «-erden kann, ist brauchbar. Ein wäßriges Medium aus 20 bis 30 0,'a Glukose, 0,8 bis 1,20i, Maisquellwasser und 0,35 bis 0,520;', Harnstoff wurde verwendet. Die Glukose und das Maisquellwasser wurden gemeinsam im Gärbehälter sterilisiert, während der Harnstoff getrennt sterilisiert und danach dem Rest des Mediums zugeführt wurde.

Geeignete Vorsichtsmaßregeln zur Vermeidung von Harnstoffverlusten während der Sterilisierung waren notwendig. Beispiel 3 Einfluß des Reaktionsgefäßes Die Hefegärung wurde unter Verwendung eines wäßrigen Mediums aus 200i', Glukose in 500-ml-Schüttelkolben und in dem 5-1-Gärbehälter vorgenommen, wobei die 500-ml-Schüttelkolben und der 5-1-Gärbehälter jeweils mit verschiedenen Mengen Medium versetzt wurden. Nach Abschluß der Gärungsperiode wurde bestimmt, welche Mengen der einzelnen Produkte entstanden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Glycerin Zeit

Volumen lind bis zur

des Arabit Glycerin d-Arabit :Wianol

Mediums Glycerin) endigung

mg!ml ingfml ingtml mg, ml in Tagen

100m1 73,5 31,3 81,5 23,9 6

50 ml 108,6 60,2 86,2 1,5 6

25 ml 135,0 83,2 87,5 - 8

Luftströ-

mungs-

geschwin-

digkeit in

ml'Min.

pro Gär-

behälter

30 30,2 9,6 40,3 60,0 5

300 83,6 61,8 46,0 - 6

Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß sich optimale Ausbeuten an Glycerin und d-Arabit erreichen lassen, wenn 25 ml Medium in einem 500-ml-Erlenmever-Kolben vergoren werden.

Im nachstehenden werden die Einflüsse der Belüftung, der Glukosekonzentration, des Stickstoffzusatzes, des Phosphatzusatzes und der Temperatur behandelt. Beispiel -1 Belüftung Das Verfahren nach Beispie12 wurde unter Verwendung eines wäßrigen Mediums wiederholt, welches 2001, Glukose, 0,8°1o Maisquellwasser und 0,35°;o Harnstoff enthielt. Die Ergebnisse der Einwirkung der Belüftung sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Luftmenge Glycerin d-Arabit Gärzeit

mg ml mg. ml in Tagen

12 Millimol O.,

pro Liter und Stunde 60 50 5

38 Millimol 02

pro Liter und Stunde 89 -16 6

Diese Ergebnisse zeigen an, daß die für die kleinen Gärbehälter erforderliche optimale Belüftungsmenge sich auf ungefähr 40 bis 60 Millimol Sauerstoff pro Liter und Stunde beläuft. Unter diesem Wert fängt die Glycerinausbeute an zu sinken, darüber verschlechtert sich die Gärgeschwindigkeit.

Beispiel 5 Glukosekonzentration Die Gärung eines Mediums, welches wie im Beispiel 4 aus Maisquellwasser, Harnstoff und Glukose bestand, ergab bei einer Belüftung von 60 Millimol Sauerstoff pro Liter und Stunde die in Tabelle 3 dargestellten Werte.

Tabelle 3
Mais- Harn- Glukose-
quell- stob konzen- Glycerin d-Arabit Gärzeit
Wasser tration
°/Q. °/°
0/0 mg."ml mg,'ml in Tagen
0,86 0,41 23 72 55 10
1,09
0,51
29
103
51
10

Beispiel 6 Einwirkung des Stickstoffzusatzes Mehrere Gärungsreihen wurden unter Zusatz verschiedener stickstoffhaltiger Stoffe getestet. Die erste Serie verwendete ein wäßriges Medium aus 20 °/p Glukose und 0,114°/o Harnstoff sowie wechselnden Mengen Hefeextrakt oder Maisquellwasser und Harnstoff. Die zweite Versuchsreihe verwendete sowohl Hefeextrakt als auch Maisquellwasser. Die dritte Reihe verwendete ein wäßriges Medium aus 20111, Dextrose und 111/0 Hefeextrakt unter Zusatz verschiedener stickstoffhaltiger Materialien. Die Ergebnisse der drei Versuchsreihen sind in den Tabellen 4, 5 und 6 dargestellt.

Tabelle 4 - Serie 1 -
Hefe- Mais- Glycerin Zeit
extrakt quellwasser und d-Arabit bis zum
(als Glycerin) Abschluß
°/° °/° mg/,nl in Tagen
- 1,25 54,6 9
- 1,30 53,2 8
- 1,40 48,4 7
0,5 - 46,3 24
0,75 - 56,2 10
1,0 - 80,0 7

Tabelle 5 - Serie 2 -

Mais- Glycerin Zeit

Harnstoff und d Arabit bis zum

quellwasser

(als Glycerin) Abschluß

°/° °% mg/ml in Tagen

1,0 0,20 78,1 7

1;0 0,26 82,2 6

0;80 0,20 83,5 8

0,80 0,26 89,0 8

0,80 0,32 89,2 6

Tabelle 6 - Serie 3 -

Glycerin Zeit

Zusätzlicher und d-Arabit bis um

Stickstoff- Menge (als Abschluß

Lieferant Glycerin)

°/° mg;ml in Tagen

- - 73,0 8

Harnstoff 0,114 70,1 5

(NH4)2S04 0,25 (als NH,) 47,0 6

NH4H2P04 0,25 (als N HP) 32,8 54,Omg/ml

Am-

monium-

tartrat .... 0,25 (als NH4+) 64,3 Dextrose-

rest nach

8 Tagen

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß sowohl Maisquellwasser als auch Hefeextrakt bei der erfindungsgemäßen Gärung als Stickstofflieferanten verwendet werden können. Man sieht, daß bei der Verwendung von Maisquellwasser die erzielbaren Ausbeuten etwas geringer sind. Es ist ebenfalls deutlich, daß Harnstoff als wirksamer Stickstofflieferant verwendet werden kann, und zwar in Konzentrationen bis hinauf zu 0,35 °/o. Wie man sieht, können auch Ammoniumsulfat und Ammoniumtartrat an Stelle von Harnstoff verwendet werden, aber die Ausbeuten sind dann etwas niedriger. Der Zusatz von einbasigem Ammoniumphosphat scheint auf die Gärung ungünstig einzuwirken.

Beispiel 7 Einwirkung der Phosphatkonzentration Eine Reihe von Gärungen wurde unter Verwendung von 50m1 eines wäßrigen Mediums aus 201j, Glukose, 10/, Hefeextrakt und 0,228 °/o Harnstoff in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben unter Zusatz wechselnder Mengen Natrium-dihydrogenphosphat durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7

NaH.PO, Glycerin Zeit

Konzen- und d-Arabit Ethanol bis zum

tration - (als Glycerin) Abschluß

(molar) mg/ml mg, ml in Tagen

- 8,40 23,0 4

1/1920 6,40 30,0 4

1/960 52,1 32,-1 3

1i480 51,0 32,3 4

Diese Ergebnisse zeigen, daß Phosphate einen deutlichen Einfluß auf die Gärung ausüben, und zwar setzen kleine Mengen Phosphat die Glycerinausbeute beträchtlich herab, während sie die Äthanolausbeute erhöhen. Jedoch hat sich herausgestellt, daß die Ausbeute an d-Arabit nicht in größerem Umfang beeinflußt wurde.

Beispiel 8 Einfluß der Temperatur Eine Gärung, welche unter Verwendung eines wäßrigen Mediums aus 20 °/o Glukose, 0,8 °/o Maisquellwasser und 0,32 °/o Harnstoff sowie mit einer Belüftung von 58 Millimol Sauerstoff pro Liter und Stunde durchgeführt wurde, ergab die folgenden Resultate, welche in Tabelle 8 zusammengefaßt sind.

Tabelle 8

Temperatur Glycerin d-Arabit Gärzeit

°C mg ml

mg; ml in Tagen

30 39 61 10

37 64 69 5

Die Mindesttemperatur für eine brauchbare Gärgeschwindigkeit ist 30°C, wie aus Tabelle 8 ersichtlich. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37°C verdoppelte die Gärgeschwindigkeit und erhöhte die Ausbeute an Glycerin und d Arabit.
Beispiel 9 Einwirkung der Zuckerkonzentration Eine Gärung wurde unter Verwendung von 31 wäßrigem Medium, bestehend aus 40"/, Glukose, 1,50 °/o Maisquellwasser und 0,70 °/o Harnstoff, in einem 5-1-Gärbehälter durchgeführt, welcher mit einer Rührergescbtwindigkeit von 385 Umdrehungen pro Minute umgerührt wurde. Der Luftdurchfluß betrug pro Gärbehälter 500 ml in der Minute. Die Temperatur war 30°. Die Endkonzentration von Glycerin -[- d-Arabit (als Glycerin) nach 14 Tagen betrug 154 mg/ml. Die verbleibende Glukosekonzentration betrug 40 mg/ml.
Es ist möglich, auch die restliche Glukose nutzbar zu machen, wenn man die Gärung noch einige Tage weiter andauern läßt. Beispiel 10 Erythritbildung Eine Gärung wurde unter Verwendung von 31 wäßrigem Medium, bestehend aus 2001, Glukose, 1,301, Hefeextrakt und 0,3 01'. Harnstoff, in einem 5-1-Gärbehälter durchgeführt. Die Geschwindigkeit des Rührers betrug 385 Umdrehungen pro Minute, der Luftdurchfluß pro Gärbehälter 800 ml in der Minute und die Temperatur 30°. Nach 10 Tagen hatte die Endkonzentration an Erythrit 4,8 °/o erreicht.
Im nachfolgenden sind die analytischen Methoden zur Bestimmung des Gesamtgehaltes an mehrwertigen Alkoholen sowie des Gehaltes an d-Arabit, Glycerin und Äthanol zusammengestellt. Analytische Methoden. a) Die Gesamtmenge an mehrwertigem Alkohol wurde durch Oxydation mit Perjodsäure bestimmt, an die sich eine kolorimetrische Bestimmung des gebildeten Formaldehyds mit Natrium-1,8-dihydroxynaphthalin-3,6-disulfonat anschloß. Dieses Verfahren läßt sich allgemein bei allen azyklischen mehrwertigen Alkoholen anwenden, welche Hydroxylgruppen sowohl am Kohlenstoffatom 1 als auch am Kohlenstoffatom 2 aufweisen, so daß bei Gegenwart eines Gemisches aus Glycerin und d-Arabit die Gesamtausbeute als Glycerin berechnet wurde. Der gefundene Wert ist somit etwas niedriger als das tatsächliche Gesamtgewicht der beiden vorhandenen Komponenten. Dieses Verfahren wurde angewendet, weil es für Reihen-Kontrollbestimmungen hinreichend schnell ist.
b) Glycerin wurde durch Trennung des Gärungsgemisches auf chromatographischem Wege (mit Hilfe einer nassen Celite-Kolonne) und Analysierung der Fraktion der das Glycerin enthaltenden Waschflüssigkeit nach den in a) erwähnten Verfahren bestimmt.
c) Zur Bestimmung von d Arabit wurde die in b) verwendete Kolonne mit Wasser ausgewaschen und nach den unter a) beschriebenen Verfahren analysiert.
d) Zur Äthanolbestimmung wurde die Flüssigkeit in einer Mikrodiffusionszelle nach Conway mit saurem Kaliumdichromat oxydiert und das überschüssige Dichromat unter Zusatz von Kaliumjodid mit Natriumthiosulfat zurücktitriert.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeuten die Prozentangaben Gewichtsprozente.

Claims

PATENT ANSPRCCHE: 1. Verfahren zur biotechnischen Gewinnung mehrwertiger Alkohole der Gruppe d Arabit, Erythrit und Glycerin, dadurch gekennzeichnet, daß zuckerhaltige Nährsubstrate mittels osmophiler Hefen der Gattung Saccharomyces rouxii und Saccharomices mellis unter Belüften in Gegenwart üblicher, stickstoffhaltiger Nährstoffe, wie Maisquellwasser und Hefeextrakt, vergoren «erden.
2. Verfahren nach Anspruch 1; dadurch gekennzeichnet, daß als Zucker eine Hexose, wie z. B. Glukose, Fruktose oder Mannose, verwendet wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung in Gegenwart eines weiteren stickstoffhaltigen Mittels aus der Gruppe Harnstoff, Ammoniumsulfat und Ammoniumtartrat stattfindet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker in einer Menge von 20 bis 30 °;'a in einem Medium vorhanden ist, welches 0,8 bis 10 ,'o eines stickstoffhaltigen Stoffes aus der Gruppe Hefeextrakt und Maisquellwasser sowie 0,3 bis 0,35 °;'o Harnstoff enthält.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Belüftungsgeschwindigkeit 40 bis 60 Millimol Sauerstoff pro Liter Medium und Stunde beträgt. In Betracht gezogene Druckschriften: Grundriß der 1lilzrobiologie von A. Rippe 1- B a 1 d e s , Springer-Verlag, 1952, S.84,85 und 210; Chemisches Zentralblatt 1952, S.1669, Mary P. E n g1 i s h : Die Gärung von 3lalzextrakt.