DE102015120193B4 - Verbesserter Cytokin-Freisetzungstest - Google Patents
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Abstract
Verfahren zum Nachweis einer Infektions- oder Autoimmunerkrankung, umfassend die Schritte des:a. Inkontaktbringens folgender Komponenten in vitro in einer bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung:i. eine Vollblutprobe,ii. mindestens ein Saccharid,iii. mindestens ein Infektionsantigen und/oder Autoimmunantigen undiv. mindestens ein Agonist eines Toll-Like-Rezeptors,b. Inkubierens der in Schritt a hergestellten Zusammensetzung bei >38-40 °C, undc. Detektierens eines Cytokins in der wässrigen Lösung.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Infektions- oder Autoimmunerkrankung.
- Der Diagnose und Behandlung von Infektions- und Autoimmunerkrankungen kommt in der medizinischen Praxis nach wie vor eine große Bedeutung zu.
- Ein bekanntes Detektionsverfahren ist beispielsweise der Interferon-Gamma-Freisetzungstest (Interferon Gamma Release Assay, IGRA). Der Ex-vivo-Test beruht auf der Messung des Cytokins Interferon-Gamma (Interferon γ, IFNγ), das von T-Lymphozyten bei Stimulation mit entsprechenden Antigenen freigesetzt wird. Eine Infektionskrankheit, zu deren Nachweis der IGRA bereits häufig eingesetzt wird, ist beispielsweise die Tuberkulose. Der Assay testet auf der Basis von Vollblut die zelluläre Immunität beim Menschen und erfasst akute, chronische und ausgeheilte Erkrankungen, und erlaubt Rückschlüsse auf Impfstatus, Infektionsrisiko, Diagnostik sowie Therapieverlauf und -erfolg.
- Die IGRA-basierte In-vitro-Diagnostik hat beispielsweise bei Cytomegalievirus(CMV)-Infektionen von immunsupprimierten Patienten nach Organ- oder Stammzelltransplantation großes Interesse erregt (Lisboa et al., 2012; Tey et al., 2013). Patienten nach Organtransplantation unterliegen einem hohen Risiko für eine CMV-Infektion. Klinisch manifeste CMV-Erkrankungen führen bei diesen Patienten zu signifikanter Morbidität und erfordern kontinuierliche virologische Überwachung gepaart mit antiviraler Prophylaxe oder vorbeugender Therapie (Torres-Madriz and Boucher, 2008). Diese Behandlungen sind verbunden mit hohen Kosten und beträchtlicher Toxizität. Daher wurden neue Strategien entwickelt, um die teure und nebenwirkungsreiche Behandlung an den Patienten anzupassen, indem die CMV-spezifische zelluläre Immunität mit Hilfe von z. B. IGRAs eng überwacht wird und dadurch die Dosierung der Medikamente so gering wie möglich gehalten werden kann (Lisboa et al., 2012; Tey et al., 2013).
- Es wurden einzelne klinische Studien veröffentlicht, die den Vergleich verschiedener aktueller Techniken zur Bestimmung der CMV-spezifischen zellulären Immunität zum Ziel hatten, wie die Durchflusszytometrie (FACS), ELISPOT und IGRAs (Walker et al., 2007; Abu-Khader and Krause, 2013; Abate et al., 2013). Mit Hinblick auf Einfachheit und Robustheit weisen IGRAs als Testsysteme in der Diagnostik gegenüber FACS und ELISPOT große Vorteile auf: Sie liefern innerhalb von 24 Stunden statt zwei bis sieben Tagen Ergebnisse und verzichten auf die sonst übliche Aufreinigung von Leukozyten aus dem Vollblut der Patienten. Dennoch ergaben diese Studien gleichzeitig hohe Raten an falsch-negativen (12-24 %) oder grenzwertigen Ergebnissen (33 %) in Transplantationspatienten (Westall et al., 2008; Clari et al., 2012; Abate et al., 2013; Fleming et al., 2010).
- In kleineren Studien an gesunden Probanden wurde untersucht, ob sich IGRAs durch gezieltes Ansprechen des angeborenen Immunsystems mit Hilfe so genannter Toll-Like Receptor(TLR)-Agonisten verbessern lassen, indem sie u. a. die Cytokinproduktion der zellulären Immunität nach Stimulation mit spezifischen Antigenen verstärken (Dammermann et al., 2013). Das angeborene Immunsystem nutzt TLRs zur Erkennung konservierter Pathogen-assoziierter molekularer Muster, die sich bei Viren, Bakterien, Pilzen und Parasiten wiederfinden lassen. Insbesondere dendritische Zellen beginnen mit einer adaptiven Immunantwort nach TLR-Stimulation, durch die sie weiter reifen und Cytokine produzieren (Iwasaki and Medzhitov, 2004).
- Dazu wurde kürzlich gezeigt, dass die TLR2-Agonisten Lipoteichonsäure und Peptidoglycan als Kostimulatoren in IGRAs nach Stimulation mit Recall-Antigenen (einem definierten Antigen-Mix aus Influenza-, Epstein-Barr- und Cytomegalievirus sowie Clostridium tetani) die IFNγ-Produktion in Proben von gesunden Blutspendern verdoppelten, jedoch die IL2-Produktion unverändert ließen. Die basalen Cytokinkonzentrationen blieben ebenfalls unverändert (Dammermann et al., 2013). Eine Folgestudie mit einem strukturellen CMV-Antigen (CMV-Tegumentprotein pp65) und gesunden Blutspendern konnte diese Ergebnisse bestätigen (Dammermann et al., 2014).
- Es wurde jüngst zum Beispiel auch ein IGRA beschrieben, der die Hepatitis-B-Virus(HBV)-spezifische Immunantwort sowie den Hepatitis B-Impfstatus bei chronischen Hepatitis-B-Patienten und gesunden Blutspendern mit Hilfe synthetischer HBV-Peptidbibliotheken erfassen kann (Dammermann et al., 2015).
- Es besteht jedoch nach wie vor ein hoher Bedarf an einem möglichst einfachen, schnellen und zuverlässigen Testverfahren zur Detektion einer Infektions- oder Autoimmunerkrankung.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Infektions- oder Autoimmunerkrankungen bereit zu stellen, das möglichst einfach und schnell durchzuführen ist und zuverlässige Ergebnisse liefert.
- Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum Nachweis einer Infektions- oder Autoimmunerkrankung, umfassend die Schritte des:
- a. Inkontaktbringens folgender Komponenten in vitro in einer bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung:
- i. eine Vollblutprobe,
- ii. mindestens ein Saccharid,
- iii. mindestens ein Infektionsantigen und/oder Autoimmunantigen und
- iv. mindestens ein Agonist eines Toll-Like-Rezeptors,
- b. Inkubierens der in Schritt a hergestellten Zusammensetzung bei >38-40 °C, und
- c. Detektierens eines Cytokins in der wässrigen Lösung.
- Mit der Erfindung wird ein verbesserter Cytokin-Freisetzungstest bereitgestellt. Die Kombination aus der Stimulierung der Cytokin-Freisetzung, beispielsweise der INFγ-Freisetzung, in Gegenwart eines Saccharids, der Kostimulation des angeborenen Immunsystems mit Hilfe eines Toll-Like-Rezeptor(TLR)-Agonisten und der erhöhten Reaktionstemperatur verbessert die Sensitivität und Spezifität des Nachweises deutlich im Vergleich zum Stand der Technik. Die Kombination der obigen Faktoren verstärkt die spezifische Produktion von Interferon-γ (IFN γ) in Vollblut. Der Test ist bei einer Vielzahl von Infektions- und Autoimmunerkrankungen einsetzbar und bietet beispielsweise auch eine Möglichkeit, Blut von immunsupprimierten Personen, beispielsweise Transplantationspatienten, zu untersuchen.
- Unter einer „Infektionserkrankung“ oder „Infektionskrankheit“ wird hier eine durch Erreger, insbesondere Bakterien und Viren, hervorgerufene Erkrankung insbesondere von Säugetieren, vorzugsweise des Menschen, verstanden. Ein Beispiel für eine bakterielle Infektionskrankheit ist Tuberkulose, ein Beispiel für eine durch ein Virus hervorgerufene Infektionskrankheit ist Hepatitis B.
- Unter einer „Autoimmunerkrankung“ oder „Autoimmunkrankheit“ eine Erkrankung verstanden, die durch Autoantikörper oder Autoimmunzellen hervorgerufen wird.
- Unter einer „Vollblutprobe“ wird eine Blutprobe, insbesondere menschliche Blutprobe, verstanden, die sämtliche Blutbestandteile enthält.
- Unter einem „physiologischen pH-Wert“ in Bezug auf eine Vollblutprobe ist hier der im Blut natürlicherweise herrschende pH-Wert gemeint. Ein physiologischer pH-Wert beim Menschen ist beispielsweise ein pH-Wert von 7,4 ± 0,05.
- Unter dem Begriff „Infektionsantigen und/oder Autoimmunantigen“ werden von einem Erreger einer Infektionskrankheit stammende bzw. abgeleitete Antigene oder Autoantigene, vornehmlich des Menschen, verstanden. Unter dem Begriff werden sowohl native als auch rekombinante oder synthetische Antigene verstanden, beispielsweise antigenische Peptide mit Wildtyp-Aminosäuresequenz oder mutierter Aminosäuresequenz, natives Viruslysat, chemisch synthetisierte Peptide, in z.B. E. coli rekombinant hergestellte Autoantigene des Menschen, etc. Es kann sich beispielsweise auch um eine Mischung von Antigen handeln, beispielsweise eine definierte Mischung aus Influenza-, Epstein-Barr- und Cytomegalievirus- sowie Clostridium tetani-Antigenen).
- Unter dem Begriff „Agonist eines Toll-Like-Rezeptors“ wird ein Ligand eines Toll-Like-Rezeptors (TLR) verstanden, der durch seine Bindung an den Rezeptor die Signaltransduktion in der den Rezeptor tragenden Zelle aktiviert. Unter einem „Toll-Like-Rezeptor“ (TLR) wird ein Mitglied einer Gruppe von Rezeptoren verstanden, die Bestandteil des angeborenen Abwehrsystems sind und der Erkennung von molekularen Strukturen dienen, die ausschließlich auf oder in Krankheitserregern vorkommen. Beispiele für TLR-Agonisten sind CpGs, Lipoteichonsäure (LTA) und Peptidoglycan (PGN).
- Unter einem „Cytokin“ wird hier ein Peptid verstanden, das von einer Zelle freigesetzt wird und das Verhalten anderer Zellen beeinflusst, beispielsweise die Immunantwort steuert. Es handelt sich in der Regel um Proteine mit einem Molekulargewicht unter 30 kDa (z.B. 5-20 kDa). Cytokine werden von Makrophagen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, natürlichen Killerzellen (NKs) und Fibroblasten gebildet. Cytokine umfassen beispielsweise Interferone wie Interferon-Gamma (IPNγ), Interleukine (IL) wie z.B. Interleukin 2 (IL2), IL4, IL17A, IL21 und IL23, Chemokine wie CXCL9 (CXC-Chemokin-Ligand 9), CXCL10 und CXCL11, und Tumornekrosefaktoren wie Tumornekrosefaktor alpha (TNFα).
- Unter dem Begriff „immundiagnostisches Diagnostizieren“ ist ein Nachweis zu verstehen, der auf einer Antigen-Antikörper-Bindung beruht oder eine solche Bindung beinhaltet. Beispielsweise kann ein Antigen direkt nachgewiesen werden, in dem es mit einem entsprechend markierten und das Antigen bindenden primären Antikörper in Bindung gebracht wird. Ein indirekter Nachweis kann erfolgen, indem das Antigen mit einem das Antigen bindenden primären Antikörper in Wechselwirkung gebracht und anschließend ein in geeigneter Weise markierter gegen den primären Antikörper gerichteter sekundärer Antikörper mit dem Komplex aus dem primären Antikörper und dem Antigen in Wechselwirkung gebracht wird. Die Markierung kann beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung sein. Geeignete Antikörper sowie Markierungsmittel und -verfahren sind dem Fachmann bekannt.
- Bereichsangaben wie „39-40“ sind hier immer so zu verstehen, dass jeder Zwischenwert mit offenbart ist, wobei auch nicht-ganzzahlige Werte wie „39,6“ oder „39,05“ erfasst sind. Auch ein beliebiger kleinerer Bereich aus dem Bereich soll dabei mit offenbart sein, wobei unter dem kleineren Bereich auch Bereiche zu verstehen sind, die keinen der Grenzwerte des Bereichs umfassen. So umfasst eine Angabe wie „39-40“ nicht nur Bereiche wie „39-39,5“ oder „39,4-40“, sondern auch Bereiche von „39,2-39,4“ oder „39,1-39,3“, wobei die einzelnen Werte innerhalb des Bereichs ausdrücklich mit erfasst sind, und nicht nur dessen Grenzwerte.
- Die Zusammensetzung wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei einer höheren als der bisher für Cytokin-Freisetzungstests (Cytokine Release Assay, CRA) üblichen Temperatur von 37 °C inkubiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung bei 39-40 °C, bevorzugt bei 39-39,5 °C, weiter bevorzugt bei >39-<40 °C, besonders bevorzugt bei >39-39,5 inkubiert wird. Beispielsweise kann die Zusammensetzung bei 39 °C inkubiert werden.
- In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Cytokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interferon-Gamma (IPNγ), CXCL9, CXCL10, CXCL11, TNF-alpha, IL2, IL4, IL17A, IL21 und IL23. Besonders bevorzugt ist das Cytokin Interferon-Gamma (IFNγ).
- Bei dem mindestens einen Saccharid handelt es sich bevorzugt um ein Monosaccharid oder Disaccharid, besonders bevorzugt um ein Saccharid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Fructose, Galaktose, Saccharose, Mannitol, Raffinose und Trehalose. Das Saccharid wird vorzugsweise in einer Konzentration eingesetzt, die zu einer verstärkten Cytokin-Freisetzung, beispielsweise Interferon-Gamma-Freisetzung, führt. Beispielsweise kann das Saccharid in einer Konzentration von mindestens 0,5 mg/ml, bevorzugt mindestens 1 mg/ml, mindestens 1,5 mg/ml oder mindestens 2 mg/ml eingesetzt werden. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf die Endkonzentration des Saccharids in der anschließend zu inkubierenden Zusammensetzung.
- Bei dem Agonisten eines Toll-Like-Rezeptors handelt es sich vorzugsweise um einen Agonisten eines Toll-Like-Rezeptors, der lediglich eine kostimulatorische Cytokin-Freisetzungswirkung aufweist, d.h. eine verstärkte Cytokin-Freisetzung, z.B. IFNy-Freisetzung, nur in Gegenwart eines Infektions- oder Autoimmunantigens, nicht jedoch allein bewirkt. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Agonisten des Toll-Like-Rezeptors 9, vorzugsweise unmethyliertes CpG (CpG Di- bzw. Oligonukleotide), oder einen Agonisten des Toll-Like-Rezeptors 2, vorzugsweise Lipoteichonsäure (LTA) oder Peptidoglycan (PGN).
- Die Zusammensetzung wird in einer bevorzugten Ausführungsform über 4 bis 24 Stunden bei der erhöhten Temperatur von >38-40 °C inkubiert. Dabei kann die Vollblutprobe zunächst für eine geeignete Zeit, z.B. 1 h, allein mit der Saccharid-haltigen Pufferlösung vorinkubiert werden, bevor die weiteren Komponenten (Antigen, TRL-Agonist) zugegeben werden und eine weitere Inkubation der Zusammensetzung für beispielsweise 15-23 h erfolgt. Die Gesamtinkubationszeit einschließlich der Vorinkubationszeit beträgt vorzugsweise 24 h.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Vollblutprobe heparinisiert, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
- Nach abgeschlossener Inkubation der Zusammensetzung wird das von Blutzellen freigesetzte Cytokin, beispielsweise IPNγ, CXCL9, CXCL10, CXCL11, TNF-alpha, IL2, IL4, IL17A, IL21 oder IL23 detektiert. Gegebenenfalls kann auch mehr als ein Cytokin detektiert werden. Vorzugsweise werden hierzu zunächst die zellulären Bestandteile der Zusammensetzung, beispielsweise durch Zentrifugation, abgetrennt und die Detektion des Cytokins erfolgt anschließend im Überstand.
- Die Detektion des Cytokins kann mit Hilfe geeigneter im Stand der Technik bekannter Verfahren, vorzugsweise mittels immundiagnostischer Verfahren vorgenommen werden. Ein geeignetes immundiagnostisches Verfahren ist beispielsweise der „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ (ELISA).
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte:
- a. Inkontaktbringen einer heparinisierten Vollblutprobe mit einer Glucose enthaltenden bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung,
- b. Vorinkubieren der Mischung aus Vollblut und Glucose-haltiger Pufferlösung für 1 h bei >38-40 °C, vorzugsweise 39-39,5 °C, weiter bevorzugt >39-<40 °C, besonders bevorzugt >39-39,5 °C.
- c. Zusammenbringen der Mischung aus Vollblut und Glucose-haltiger Pufferlösung mit einer bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung mit dem mindestens einen Infektions- und/oder Autoimmunantigen und dem mindestens einen Toll-Like-Rezeptor-Agonisten,
- d. Inkubieren der Zusammensetzung aus Vollblut, Glucose-haltiger Pufferlösung, Infektions- und/oder Autoimmunantigen und Toll-Like-Rezeptor-Agonist für 15-23 h bei >38-40 °C, vorzugsweise 39-39,5 °C, weiter bevorzugt >39-<40 °C, besonders bevorzugt >39-39,5 °C,
- e. Niederschlagung der zellulären Bestandteile der Zusammensetzung durch Zentrifugieren, und
- f. Detektieren, vorzugsweise immundiagnostisches Detektieren mittels ELISA, von Interferon-Gamma im Überstand.
- Die Erfindung wird im Folgenden rein zu Veranschaulichungszwecken anhand von Ausführungsbeispielen und der angehängten Figur näher erläutert.
-
1 . Schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. -
1 zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. 0,1-1 ml heparinisiertes Vollblut 2 werden in einem Reagenzglas 1 mit Glucose-haltigem Puffer vermischt (Schritt a), und die erhaltene Mischung 3 wird 1 h bei 39 °C inkubiert (Schritt b). Anschließend wird die Mischung 3 mit einer gepufferten Lösung 4 aus einem Infektions-/Autoimmunantigen und einem TLR-Agonisten versetzt (Schritt c). Die erhaltene Zusammensetzung 5 wird 16-24 h bei 39 °C inkubiert (Schritt d). Nach Zentrifugation der Zellfraktion 7 (Schritt e) wird der Überstand 6 einem ELISA unterworfen (Schritt f). Hierzu wird der Überstand 6 beispielsweise in mit IFNγ-Antikörpern beschichtete Näpfe 8 einer Mikrotiterplatte 9 gegeben. Nach Inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur (RT), Waschen und Entwickeln der Proben wird die optische Dichte (OD) bestimmt. - Ausführungsbeispiel:
- Evaluierung synthetischer CMV-Peptide:
- Es wird gesunden Blutspendern und Patienten mit klinisch apparenter CMV-Infektion venöses Blut entnommen und in einer sterilen 7,5 ml Lithium-Heparin Monovette gesammelt. 1 ml Vollblut wird dann innerhalb von vier Stunden nach Entnahme in sterile 2 ml-Schraubröhren dispensiert, die zuvor mit 60 µl Volumen mit steriler 0,9 % (w/v) NaCl-Lösung und Glukose (2 mg/ml Endkonzentration) beladen worden sind. Die Röhrchen werden verschlossen und bei 39 °C für 1 Stunde aufrecht stehend inkubiert. Eine Versorgung der Proben mit z.B. 5 % (v/v) CO2 ist nicht erforderlich.
- Nach 1 Stunde werden alle Proben in neue sterile 2 ml-Schraubröhren dispensiert, die zuvor mit 60 µl Volumen mit steriler 0,9 % (w/v) NaCl-Lösung, (Negativkontrolle), SEB (Staphylococcus Enterotoxin B; Erste Positivkontrolle), dem Recall-Antigenmix CEFT (Zweite Positivkontrolle) sowie ausgewählten synthetischen CMV-Peptiden bzw. nativem CMV-Lysat beladen worden sind. In allen Röhrchen kommt wieder Glukose zum Einsatz, um die Cytokinsekretion zu verstärken (2 mg/ml Endkonzentration; vorverdünnt in steriler 0,9 % (w/v) NaCl-Lösung). Neben Glukose kommen auch TLR-Agonisten, z.B. LTA, PGN oder CpG, allein und/oder in Kombination zum Einsatz, um die Cytokinsekretion zu verstärken (1-10 µg/ml Endkonzentration; vorverdünnt in steriler 0,9 % (w/v) NaCl-Lösung).
- 1 ml Vollblut wird auf diesem Weg mit 120 µl Volumen von NaCl & Glukose & TLR-Agonisten, SEB & Glukose & TLR-Agonisten (1 µg/ml Endkonzentration), Recall-Antigenmix CEFT & Glukose & TLR-Agonisten (10 µg/ml Endkonzentration) oder CMV-Antigenen & Glukose & TLR-Agonisten (variable Endkonzentration). SEB dient als erste Positivkontrolle aufgrund seiner Rolle als Superantigen, das MHC-Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen (APC) mit T-Zellrezeptoren (TCR) auf T-Lymphocyten kreuzvernetzt. Hierdurch wird die generelle Stimulierbarkeit der Probe überprüft. CEFT wird als zweite Positivkontrolle eingeführt, um die Funktionalität der APCs mit Blick auf Antigenprozessierung und - präsentation zu bestätigen.
- Die Röhrchen werden verschlossen und bei 39 °C für 24 Stunden aufrecht stehend inkubiert. Eine Versorgung der Proben mit z.B. 5 % (v/v) CO2 ist nicht erforderlich. Anschließend werden nach Zentrifugation die Plasmaüberstände abgenommen, mit 0,045 % (w/v) NaN3 stabilisiert und bei -20 °C gelagert bis zur Cytokinbestimmung mittels ELISA. Zwischen Asservierung und ELISA-Bestimmung liegen in der Regel höchstens 7 Tage. Alle Tests werden unter sterilen Bedingungen an einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2 durchgeführt.
- Die Cytokinbestimmung im Plasma erfolgt mit Hilfe kommerzieller ELISA-Reagenzien und die Mikrotiterplatten-Beschichtung wird selbstständig durchgeführt. Es werden die Cytokine IFNGamma, IL2 und CXCL-10 detektiert. Die vom Hersteller bereitgestellte Avidin-gekoppelte Peroxidase wird gegen ein PolyHRP80-Streptavidin-Konjugat ausgetauscht und so eine zehnfach bessere analytische Nachweisgrenze erreicht. Die Proben werden auf einem Tecan M200 Plattenlesegerät und mit der Magellan-Software (Version 6.5) analysiert. Sämtliche ELISA-Bestimmungen werden auf diesem Wege ausgelesen.
- Synthetische CMV-Peptide werden in sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 50 mg/ml gelöst und als Einmal-Aliquote portioniert bei -20 °C gelagert. Der CEFT Antigenmix besteht aus immunogenen Peptiden des humanen Cytomegalievirus (HHV-5; CMV), des Epstein-Barr Virus (HHV-4; EBV), Influenza A und Clostridium tetani. Diese Positivkontrolle verfügt über 27 Peptide, die unter definierten MHC-Klasse I- und II-restringierten T-Zellepitopen ausgesucht worden sind. In Anbetracht der hohen Impfrate gegen Influenza und C. tetani sowie der hohen Prävalenz von CMV und EBV in der deutschen Bevölkerung können in allen Proben spezifische T-Zellantworten erwartet werden. Als Referenz-Antigenpool wird ein kommerzielles, natives CMV-Lysat verwendet, das für CE-zugelassene IVD-Immunoassays produziert wird.
- Alle ausgewählten synthetischen CMV-Peptide werden einzeln titriert (0,01 - 50 µg/ml Endkonzentration), um die optimale Konzentration für eine antigen-spezifische Stimulation bei CMV-seropositiven gesunden Spendern oder Patienten mit klinisch-apparenter CMV-Infektion zu bestimmen. CMV-seronegative Spender dienen als Kontrolle. Sobald diese Werte bekannt sind, werden alle Antigene in Form einer Schachbretttitration variabel gepoolt und im Vergleich mit dem Referenz-Antigenpool, dem nativen CMV-Lysat, getestet.
- Referenzliste
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Claims (11)
- Verfahren zum Nachweis einer Infektions- oder Autoimmunerkrankung, umfassend die Schritte des: a. Inkontaktbringens folgender Komponenten in vitro in einer bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung: i. eine Vollblutprobe, ii. mindestens ein Saccharid, iii. mindestens ein Infektionsantigen und/oder Autoimmunantigen und iv. mindestens ein Agonist eines Toll-Like-Rezeptors, b. Inkubierens der in Schritt a hergestellten Zusammensetzung bei >38-40 °C, und c. Detektierens eines Cytokins in der wässrigen Lösung.
- Verfahren nach
Anspruch 1 , wobei die Zusammensetzung bei 39-40 °C, bevorzugt bei 39-39,5 °C, weiter bevorzugt bei >39-<40 °C, besonders bevorzugt bei >39-39,5 inkubiert wird. - Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interferon-Gamma, CXCL9, CXCL10, CXCL11, TNF-alpha, IL2, IL4, IL17A, IL21 und IL23, und besonders bevorzugt Interferon-Gamma ist.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Saccharid ein Monosaccharid oder Disaccharid ist, und bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Fructose, Galaktose, Saccharose, Mannitol, Raffinose und Trehalose.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Saccharid in der Zusammensetzung in einer Endkonzentration von mindestens 0,5 mg/ml, bevorzugt mindestens 1 mg/ml, mindestens 1,5 mg/ml oder mindestens 2 mg/ml vorliegt.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Agonisten eines Toll-Like-Rezeptors um einen Agonisten des Toll-Like-Rezeptors 9, vorzugsweise unmethyliertes CpG, oder einen Agonisten des Toll-Like-Rezeptors 2, vorzugsweise Lipoteichonsäure oder Peptidoglycan, handelt.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung über 4 bis 24 Stunden inkubiert wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vollblutprobe heparinisiert ist.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion des Cytokins nach Abtrennung der zellulären Bestandteile der Zusammensetzung, vorzugsweise nach Niederschlagung mittels Zentrifugation, im Überstand der Zusammensetzung vorgenommen wird.
- Verfahren nach
Anspruch 9 , wobei die Detektion des Cytokins immundiagnostisch, vorzugsweise mittels ELISA erfolgt. - Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Schritte: a. Inkontaktbringen einer heparinisierten Vollblutprobe mit einer Glucose enthaltenden bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung, b. Vorinkubieren der Mischung aus Vollblut und Glucose-haltiger Pufferlösung für 1 h bei >38-40 °C, vorzugsweise 39-39,5 °C, weiter bevorzugt >39-<40 °C, besonders bevorzugt >39-39,5 °C, c. Zusammenbringen der Mischung aus Vollblut und Glucose-haltiger Pufferlösung mit einer bei physiologischem pH-Wert gepufferten wässrigen Lösung mit dem mindestens einen Infektions- und/oder Autoimmunantigen und dem mindestens einen Toll-Like-Rezeptor-Agoni sten, d. Inkubieren der Zusammensetzung aus Vollblut, Glucose-haltiger Pufferlösung, Infektions- und/oder Autoimmunantigen und Toll-Like-Rezeptor-Agonist für 15-23 h bei >38-40 °C, vorzugsweise 39-39,5 °C, weiter bevorzugt >39-<40 °C, besonders bevorzugt >39-39,5 °C. e. Niederschlagung der zellulären Bestandteile der Zusammensetzung durch Zentrifugieren, und f. Detektieren von Interferon-Gamma im Überstand, vorzugsweise immundiagnostisches Detektieren mittels ELISA.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DAMMERMANN, W. [u.a.]: Development of a novel IGRA assay to test T cell responsiveness to HBV antigens in whole blood of chronic Hepatitis B patients. J. Transl. Med. (elektronisch veröffentlicht 13.05.2015) 13:157, Druckseiten 1-9 |
| DAMMERMANN, W. [u.a.]: Toll like receptor 2 agonists lipoteichoic acid and peptidoglycan are able to enhance antigen specific IFNγ release in whole blood during recall antigen responses. J. Immunol. Methods (2013) 396(1-2):107-115 |
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