DE102014008098A1 - Spectrally flexible, fast switchable optical filter device - Google Patents

Spectrally flexible, fast switchable optical filter device

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DE102014008098A1
DE102014008098A1 DE102014008098.6A DE102014008098A DE102014008098A1 DE 102014008098 A1 DE102014008098 A1 DE 102014008098A1 DE 102014008098 A DE102014008098 A DE 102014008098A DE 102014008098 A1 DE102014008098 A1 DE 102014008098A1
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beam
beam deflector
particular
light
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Daniel Schwedt
Peter Westphal
Tiemo Anhut
Matthias Wald
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
Carl Zeiss AG
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
Carl Zeiss AG
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Abstract

Die Erfindung betrifft eine optische Filtervorrichtung (1) mit einem Filter (5), das Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften aufweist. The invention relates to an optical filter device (1) with a filter (5), the regions with different spectral filter characteristics. Die bekannten variablen Filtervorrichtungen weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Umschaltung zwischen verschiedenen zu entfernenden spektralen Teilbereichen relativ lange dauert, da dazu der Verlaufsfilter verschoben und/oder geschwenkt werden muss. However, the known variable filter devices have the disadvantage that the switching between different to remove spectral subareas takes a relatively long time, since this shifted the course filter and / or needs to be swung. Die Erfindung soll auch bei hoher spektraler Trennschärfe und starker Unterdrückung eine schnelle Umschaltung ermöglichen. The invention will allow rapid switching even with high spectral selectivity and severe repression.
Dazu sind zwei variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtungen (6/7) vorgesehen, wobei ein auf die erste Strahlablenkvorrichtung einfallender Lichtstrahl mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung auf unterschiedliche spektral selektive Bereiche des Filters ablenkbar ist und das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet sind, dass der zum Filter abgelenkte und dort reflektierte oder transmittierte Lichtstrahl auf die zweite Strahlablenkvorrichtung trifft. For this purpose, two variably adjustable Strahlablenkvorrichtungen (6/7) are provided, wherein an incident onto the first beam deflector light beam by the first beam deflector is different spectrally selective areas of the filter to deflect and the filter and the Strahlablenkvorrichtungen are arranged such that the deflected to the filter and there reflected or transmitted light beam to the second beam deflector meets. Das ermöglicht eine flexiblere, schnellere Umschaltung zwischen unterschiedlichen Filterbereichen in weniger als 100 ms, da die Strahlablenkvorrichtungen beispielsweise im Falle der Ausgestaltung als drehbare Spiegel deutlich kleiner als das Filter und damit deutlich weniger träge sind, so dass sie schneller bewegt werden können. This allows a more flexible, faster switching between different filter areas in less than 100 ms, as the Strahlablenkvorrichtungen example in the case of the embodiment as a rotatable mirror is significantly smaller than the filter and therefore are significantly less sluggish, so that they can be moved faster.
Fluoreszenzmikroskopie fluorescence microscopy

Description

  • Die Erfindung betrifft eine optische Filtervorrichtung, die ein Filter, insbesondere mit dichroitischen Schichten, umfasst, das parallel zu einer seiner (vorzugsweise planen) Oberflächen angeordnete Bereiche („spektral selektive Bereiche”) mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften aufweist („Verlaufsfilter”). The invention relates to an optical filter device comprising a filter, in particular dichroic layer, the (plan preferably) parallel to one of its surfaces arranged regions ( "spectrally selective areas") with different spectral filter properties ( "graduated filter"). Das optische Transmissionsvermögen des Filters ist also zum einen wellenlängenabhängig (und in demselben Bereich für verschiedene Wellenlängen dem Betrage nach unterschiedlich) und für mindestens eine Wellenlänge in voneinander verschiedenen Bereichen des Filters unterschiedlich. The optical transmittance of the filter is thus on the one hand dependent on the wavelength (and in the same range for different wavelengths in magnitude different) different and represent at least one wavelength in mutually different areas of the filter. Das Filter kann dabei einstückig sein, oder die unterschiedlichen Bereiche sind auf mehreren Stücken verteilt angeordnet. The filter can in this case be integral, or the different areas are distributed on a plurality of pieces. Mehrere Stücke sind dabei zweckmäßigerweise mechanisch miteinander verbunden, müssen dabei aber nicht unmittelbar miteinander in Kontakt sein. Several pieces are advantageously mechanically connected to one another, but do not in this case be in contact with each other directly.
  • Spektrale Filtervorrichtungen werden zur Entfernung eines spektralen Teilbereichs (der auch aus mehreren separaten Bändern bestehen kann) aus einem Lichtstrahl durch spektral selektive Reflexion, Transmission und/oder Absorption eingesetzt (Unterdrückung). Spectral filter devices for removing a partial spectral range (which may also consist of several separate bands) used of a light beam through spectrally selective reflection, transmission and / or absorption (suppression). Im Sinne der Erfindung umfasst der Begriff Licht jede mit optischen Mitteln manipulierbare elektromagnetische Strahlung, also insbesondere ultraviolette, sichtbare und infrarote Strahlung. For the purposes of the invention, the term light includes any electromagnetic radiation manipulable by optical means, thus in particular ultraviolet, visible and infrared radiation. Ein Lichtstrahl kann konvergent, divergent oder kollimiert sein. A beam of light can be convergent, divergent or collimated.
  • Derartige Filtervorrichtungen können insbesondere bei der mikroskopischen Bildgebung von lumineszierenden (fluoreszierenden oder phosphoreszierenden) Proben eingesetzt werden. Such filtering devices can be used in particular samples in the microscopic imaging of luminescent (fluorescent or phosphorescent). In der Fluoreszenzmikroskopie enthält das von der Probe kommende Licht („Probenlicht”) einerseits Fluoreszenzlicht, andererseits reflektiertes und gestreutes Beleuchtungslicht („Anregungslicht”). In fluorescence microscopy, the light coming from the sample light ( "probe light") on the one hand contains fluorescent light, on the other hand, reflected and scattered illumination light ( "excitation light"). Anregungslicht und Fluoreszenzlicht weisen unterschiedliche Wellenlängen (Farben) auf, was ihre Trennung ermöglicht. Excitation light and fluorescence light are of different wavelengths (colors), which allows their separation.
  • Im Stand der Technik sind dichroitische Spiegel als optische Filtervorrichtungen bekannt. In the prior art dichroic mirrors as optical filter devices are known. Diese können beispielsweise wie in This can, for example, as in US 6,167,173 US 6,167,173 in einem Fluoreszenzmikroskop als Hauptfarbteiler zur optischen Kopplung des Beleuchtungsstrahlengangs mit dem Detektionsstrahlengang (auch als „Auffädeln” des Beleuchtungsstrahls auf den Fluoreszenzstrahl bezeichnet) eingesetzt werden. in a fluorescence microscope as the main color splitter for optical coupling of the illumination beam with the detection beam path can be used (also known as "bead" of the illumination beam on the fluorescent beam hereinafter). Dabei sind unterschiedliche Geometrien möglich, die sich auf den Unterdrückungsfaktor für das jeweils unerwünschte Licht auswirken. Different geometries are possible, that affect the suppression factor for each unwanted light. Dieser soll möglichst hoch sein. This is to be maximized.
  • Allgemein gilt, dass dichroitische Spiegel unter senkrechter Inzidenz (0°) eine maximale Trennschärfe und Unterdrückung aufweisen. In general, dichroic mirrors with perpendicular incidence (0 °) have a maximum separation efficiency and suppression. In diesem Fall ist aber keine Kopplung mehrerer Strahlengänge möglich, so dass für Hauptfarbteiler ein von 0° abweichender, aber möglichst kleiner Einfallswinkel gewählt wird. But in this case no coupling of several beam paths is possible so that a deviating from 0 °, but as small as possible angle of incidence for the main color splitter is selected. Ursprünglich wurde wie in Originally, as in US 6,167,173 US 6,167,173 ein Einfallswinkel von 45° verwendet. an incident angle of 45 ° is used. Kleinere, aber von Null verschiedene Einfallswinkel gemäß Smaller, but non-zero angle of incidence in accordance with US 2008/0062511 A1 US 2008/0062511 A1 erlauben demgegenüber eine stärkere Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs in der Transmission. In contrast, allow a stronger suppression to remove spectral portion in the transmission.
  • Als Hauptfarbteiler (Hauptstrahlteiler) werden in der Regel solche dichroitischen Spiegel eingesetzt, die als Kerbfilter (engl. „notch filter”) ausgebildet sind. As the main color splitter (main beam splitter) in general, such as a dichroic mirror, the notch filter (engl. "Notch filter") may be used, are formed. Langpässe oder breite Bandpässe finden dagegen Einsatz als Emissionsfilter im (reinen) Detektionsstrahlengang. however, long passes or wide band-pass filters are used as emission filters in the (pure) detection beam path. Emissionsfilter können auch unter senkrechter Inzidenz angeordnet sein. Emission filter may be disposed under perpendicular incidence. Für alle Anwendungsfälle gilt, dass die spektrale Abhängigkeit von Transmission und Reflexion bei dichroitischen Spiegeln statisch ist. It applies to all applications that the spectral dependence of transmission and reflection is static with dichroic mirrors. Das ist insbesondere in Verbindung mit spektral einstellbaren oder breitbandig emittierenden Lichtquellen, beispielsweise sogenannten Multilinien- oder Weißlichtlasern, problematisch. This is particularly in connection with adjustable or spectrally broad-band emitting light sources, such as so-called Multilinien- or white light lasers problematic. In spektral unterschiedlichen Anregungssituationen darf vor der Detektion nur das momentane Anregungslicht gefiltert werden, um das Messergebnis nicht zu verfälschen. In spectrally different excitation situations, only the current excitation light can be filtered so as not to distort the measurement result before detection. Das gilt insbesondere für den Einsatz einer geeigneten optischen Filtervorrichtung als Hauptfarbteiler. This applies especially to the use of a suitable optical filter device as the main color splitter.
  • Notwendig sind optische Filtervorrichtungen, die hinsichtlich des zu entfernenden spektralen Teilbereichs variabel einstellbar sind. Necessary are optical filter devices, which are adjustable with respect to the to be removed spectral subrange. Sie können zur spektral flexiblen Beleuchtung und/oder zur flexiblen Trennung von Beleuchtungslicht und Probenlicht eingesetzt werden, indem der zu entfernende spektrale Teilbereich an das momentane Beleuchtungsband (oder die momentanen Beleuchtungsbänder) angepasst wird. They can be used to spectrally flexible lighting and / or for flexible separation of illumination light and sample light by having the portion to be removed spectral range of the current band of illumination (or the current illumination bands) is adjusted.
  • Ein Farbteiler, der eine Variabilität der Lichtquelle zulässt, ist beispielsweise in A color splitter which permits variability of the light source is, for example, in US 2010/188741 A1 US 2010/188741 A1 beschrieben. described. Er umfasst mehrere spektral unterschiedliche Filter, die auf einem Rad angeordnet und dadurch selektiv in den Strahlengang schwenkbar sind. It comprises a plurality of spectrally different filters arranged on a wheel, and thereby can be pivoted selectively in the beam path. Dabei kann dem Farbteiler in Beleuchtungsrichtung ein drehbarer Spiegel zur Justierung des Einfallswinkels auf den Farbteiler vorgeordnet sein, um die Kollinearität mindestens eines Beleuchtungslasers zur optischen Achse einzustellen. Here, a rotatable mirror may be arranged in front for adjustment of the incidence angle on the color splitter to the color splitter in the illumination direction to adjust the collinearity of at least one illumination laser to the optical axis. Insbesondere kann es sich um einen durchstimmbaren Laser handeln. In particular, it can be a tunable laser.
  • Des weiteren wird in Furthermore, in US 2002/0097485 A1 US 2002/0097485 A1 eine Filtervorrichtung beschrieben, die einen Strahlteiler und einen Spiegel umfasst, wobei der Strahlteiler als dichroitischer Spiegel mit einer Vielzahl von spektral selektiven Bereichen mit unterschiedlichen Filtereigenschaften ausgebildet ist. describes a filter device which comprises a beam splitter and a mirror, wherein the beam splitter is formed as a dichroic mirror having a plurality of spectrally selective areas with different filter properties. Das Verschieben des Strahlteilers quer zum Lichtstrahl ermöglicht die Anpassung der spektralen Charakteristika des Hauptstrahlteilers an das Beleuchtungslicht. The displacement of the beam splitter transversely to the light beam allows adjustment of the spectral characteristics of the main beam splitter of the illumination light. Aufgrund des Einfallswinkels von 45° ist die Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs relativ gering. Due to the angle of incidence of 45 °, the suppression of the to be removed spectral portion is relatively low.
  • Eine stärkere Unterdrückung ermöglicht die in A stronger suppression allows in US 2008/062511 A1 US 2008/062511 A1 beschriebene Filtervorrichtung aufgrund des dort geringeren Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes beziehungsweise des Probenlichtes von weniger als 45°, insbesondere weniger als 20°, auf die Oberfläche des Hauptfarbteilers oder eines im Detektionsstrahlengang angeordneten weiteren Strahlteilers. Filter apparatus described there, due to the lower incident angle of the illumination light or the sample light of less than 45 °, in particular less than 20 °, to the surface of the main color splitter, or arranged in the detection beam path further beam splitter. Dabei kann der weitere Strahlteiler als variabler Verlaufsfilter ausgebildet und entlang des Verlaufs verschiebbar angeordnet sein. Here, the additional beam splitter may be formed as a variable course filter and slidably disposed along the course. Zusätzlich zur Verschiebung ist aus in addition to the displacement from DE 20 2008 016 287 U1 DE 20 2008 016 287 U1 auch eine Verschwenkung des Verlaufsfilters relativ zum Lichtstrahl bekannt, um die spektrale Lage der Filterkanten zu verschieben. also known a pivoting of the course filter relative to the light beam to move the spectral position of the filter edges.
  • Die vorgenannten variablen Filtervorrichtungen weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Umschaltung zwischen verschiedenen zu entfernenden spektralen Teilbereichen relativ lange dauert, da jeweils mindestens ein träges mechanisches Teil bewegt (Filter im Filterrad gedreht beziehungsweise Verlaufsfilter verschoben und/oder geschwenkt) werden muss. However, the above variable filter devices have the drawback that the switching between different to remove spectral partial regions takes a relatively long time, since at least a slow mechanical part moved (filter in the filter wheel is rotated or shifted course filter and / or pivoted) must be.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine optische Filtervorrichtung der eingangs genannten Art zu verbessern, um auch bei hoher spektraler Trennschärfe und starker Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs eine schnelle Umschaltung zwischen verschiedenen zu entfernenden spektralen Teilbereichen zu ermöglichen. The object underlying the invention is to improve an optical filter device of the type mentioned, in order to allow even at high spectral selectivity and strong suppression of the to be removed partial spectral range, a fast switching between different to remove spectral partial regions.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch eine optische Filtervorrichtung, welche die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist. This object is achieved by an optical filter device having the features indicated in claim. 1
  • Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben. Advantageous embodiments of the invention are specified in the subclaims.
  • Erfindungsgemäß sind zwei variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtungen vorgesehen, wobei ein auf die erste Strahlablenkvorrichtung einfallender Lichtstrahl mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung auf unterschiedliche spektral selektive Bereiche des Filters ablenkbar ist und das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet sind, dass der zum Filter abgelenkte und dort reflektierte oder transmittierte Lichtstrahl (unabhängig von der Lage dieser Bereiche) auf die zweite Strahlablenkvorrichtung trifft. According to the invention two variably adjustable Strahlablenkvorrichtungen are provided, wherein an incident onto the first beam deflector light beam by the first beam deflector is deflectable in different spectrally selective areas of the filter and the filter and the Strahlablenkvorrichtungen are arranged such that the deflected to the filter and reflected there or transmitted light beam impinges on the second beam deflection device (regardless of the location of these regions). Variabel einstellbar bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Strahlablenkvorrichtung hinsichtlich der Ablenkrichtung (Winkeldifferenz zwischen eingehendem und ausgehendem Lichtstrahl) einstellbar ist. Variably adjustable means according to the invention that a beam deflector with respect to the direction of deflection (angular difference between incoming and outgoing light beam) is adjustable.
  • Eine derartig ausgestaltete Filtervorrichtung ermöglicht eine flexiblere, schnellere Umschaltung zwischen unterschiedlichen Filterbereichen in weniger als 100 ms, vorzugsweise sogar in weniger als 10 ms, da die Strahlablenkvorrichtungen beispielsweise im Falle der Ausgestaltung als drehbare Spiegel deutlich kleiner als das Filter und damit deutlich weniger träge sind, so dass sie schneller bewegt werden können als das Filter selbst. Dabei können herkömmliche, mit geringem Aufwand kommerziell verfügbare Verlaufsfilter und Strahlablenkvorrichtungen verwendet werden. A configured in this manner the filter device allows for a more flexible, faster switching between different filter areas in less than 100 ms, preferably even less than 10 ms, since the Strahlablenkvorrichtungen example in the case of the embodiment as a rotatable mirror is significantly smaller than the filter and therefore are significantly less sluggish, so that they can be used as the filter itself be moved faster. this conventional, commercially available with little effort and graduated filters Strahlablenkvorrichtungen can be used. Die zweite Strahlablenkvorrichtung dient dabei zur Kompensation des Richtungsfehlers, der dem Lichtstrahl durch die Ablenkung auf unterschiedliche spektral selektive Bereiche des Filters durch die erste Strahlablenkvorrichtung aufgeprägt wird. The second beam deflector serves to compensate for is impressed on the beam by the deflection to different spectrally selective areas of the filter by the first beam deflection of the directional error. Das Verlaufsfilter kann dabei so ausgebildet sein, dass die Filtervorrichtung eine kontinuierliche Anpassung der spektralen Strahlteilungseigenschaften auf den gewählten zu trennendenden Wellenlängenbereich erlauben, ohne Kompromisse hinsichtlich der Unterdrückung in Filterrichtung hinnehmen zu müssen. The response filter can be formed is that the filter device permit continuous adjustment of the spectral beam splitting characteristics at the selected separate Denden wavelength range, without having to accept compromises as regards the reduction in filter direction. Die Transmission eines Fluoreszenzsignals wird durch die zusätzlichen Optiken im Vergleich zu herkömmlichen, rein dichroitischen Strahlteilerlösungen nur insignifikant reduziert. The transmission of a fluorescence signal is only insignificantly reduced by the additional optics compared to conventional, purely dichroic beam divider units.
  • Die Erfindung kann besonders vorteilhaft bei der bildweisen Mehrfachverfolgung (engl. „multi-tracking”) mehrerer unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffsorten verwendet werden, da hier in Verbindung mit einer schnellen Wellenlängenumschaltung seitens der Anregungslichtquelle nach für jeden Bildaufnahmedurchgang eine andere Wellenlänge eingestellt und so ein anderer Farbstoff angeregt werden kann. The invention may be particularly advantageous in the imagewise multiple tracking (engl. "Multi-tracking") of a plurality of different fluorescent dye species are used here because after in connection with a fast wavelength switching part of the excitation light source is set to a different wavelength for each image receiving passage and so another dye are excited can. Dadurch wird einerseits ein Übersprechen (engl. „cross-talk”) im Anregungslicht unter den Farbstoffen minimiert und andererseits der Bildkontrast optimiert, da beispielsweise Kantenfilter bei einerseits hoher Unterdrückung im nicht transmittierten Spektralbereich andererseits einen steilen Übergang, typischerweise schmaler als 2 nm, zwischen Transmissions- und Sperrbereich aufweisen. This will on the one hand, crosstalk (engl. "Cross-talk") is minimized in the excitation light to the dyes and the other hand, the image contrast is optimized, as, for example, edge filter at one hand, high rejection in the non-transmitted spectral other hand, a sharp transition, typically narrower than 2 nm between transmission and have stopband -. Somit werden dem Fluoreszenzlicht nur geringe Filterverluste beigefügt. Thus, only low filter losses are added to the fluorescent light.
  • Vorzugsweise sind das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet, dass der am Filter reflektierte beziehungsweise durch das Filter transmittierte Lichtstrahl (für jeden der unterschiedlichen spektral selektiven Bereiche des Filters) von der zweiten Strahlablenkvorrichtung so ablenkbar ist, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft. Preferably, the filter and the Strahlablenkvorrichtungen are arranged so that the reflected or the filter through the filter transmitted light beam (for each of the different spectrally selective areas of the filter) is deflected by the second beam deflector is that it is parallel, in particular coaxially, to the incident light beam runs. Zweckmäßigerweise kann die Filtervorrichtung eine Steuereinheit umfassen, die zur Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen mit diesen verbunden ist und dazu eingerichtet ist, die erste Strahlablenkvorrichtung in Abhängigkeit eines vorgebbaren oder vorgegebenen Parameters einzustellen und die zweite Strahlablenkvorrichtung zu einzustellen, dass sie den an dem Filter reflektierten beziehungsweise durch das Filter transmittierten Lichtstrahl so ablenkt, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft. Advantageously, the filter device may comprise a control unit for adjusting the Strahlablenkvorrichtungen connected thereto and is adapted to set the first beam deflector in dependence on a predeterminable or predetermined parameter and to set the second beam deflector that they reflected on the filter or by the filter transmitted light beam deflects so that it is parallel, in particular coaxially, extending to the incident light beam.
  • Vorzugsweise ist die erste und/oder die zweite Strahlablenkvorrichtung ein (jeweiliger) Spiegel, insbesondere basierend auf einem mikroelektromechanischen System (MEMS), oder ein (jeweiliges) akustooptisches Element, insbesondere ein akusto-optisch einstellbarer Deflektor (AOD). Preferably, the first and / or the second beam deflection a (respective) mirror, in particular based on a microelectromechanical system (MEMS), or a (respective) acousto-optic element, in particular an acousto-optically adjustable deflector (AOD). Damit ist die einstellbare Strahlablenkung mit geringem Aufwand und hoher Genauigkeit möglich. So the adjustable beam deflection is possible with little effort and high precision. Der Einsatz eines akustooptischen Elements ermöglicht durch dessen zusätzliche spektral selektive Wirkung eine stärkere Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs. The use of an acousto-optical element made possible by the additional spectrally selective effect greater suppression to remove spectral subrange.
  • Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen mindestens eine der Strahlablenkvorrichtungen (insbesondere beide Strahlablenkvorrichtungen) um zwei verschiedene Achsen drehbar sind. Particularly advantageous are embodiments in which at least one of the Strahlablenkvorrichtungen (in particular both Strahlablenkvorrichtungen) about two different axes are rotatable. Dadurch kann das Licht zweidimensional über das Filter bewegt werden, so dass eine größere Zahl von Schaltstellungen möglich ist. Thus, the light can be moved in two dimensions across the filter so that a larger number of switching positions is possible. Dadurch, dass dann über zwei Achsen synchron abgelenkt werden kann, ist die neue Schaltstellung im Mittel zudem schneller erreichbar. In that then two axes can be deflected in synchronism, the new switch position is also reached more quickly in the center. Insbesondere können die Drehachsen in einer Ebene liegen, vorzugsweise mit zueinander orthogonalem Verlauf. In particular, the pivot axes may lie in a plane, preferably orthogonal to each other with the course. Durch den so bereitgestellten ortsfesten Drehpunkt ist die Ablenkung mit geringerem Ortsfehler möglich. By thus provided fixed pivot point, the deflection is possible with a smaller location error. Zweckmäßigerweise kann der Drehpunkt in der Oberfläche der Strahlablenkvorrichtung liegen, um den Ortsfehler zu minimieren. Conveniently, the pivot point may be on the surface of the beam deflector to minimize the location error.
  • Eine größere Zahl von Filterkonfigurationen kann bereitgestellt werden, wenn die Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften zweidimensional parallel zur Oberfläche des Filters verteilt angeordnet sind. A larger number of filter configurations can be provided when the sections are arranged distributed two-dimensionally parallel to the surface of the filter with different spectral filter characteristics. Insbesondere ist eine Kombination mit einem Antrieb zur Verschiebung des Filters quer zu einer mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung erreichbaren Ablenkrichtung möglich, beispielsweise, wenn die erste Strahlablenkvorrichtung nur um genau eine Achse drehbar ist. In particular, a combination with a drive for displacement of the filter perpendicular to an achievable by means of the first beam deflector deflection possible, for example, when the first beam deflector is rotatable only about precisely one axis.
  • Eine vereinfachte Bauweise ist dadurch möglich, dass die zweite Strahlablenkvorrichtung durch die erste Strahlablenkvorrichtung gebildet ist. A simplified construction is possible in that the second beam deflector is formed by the first beam deflector. Diese Mehrfachnutzung der ersten Strahlablenkvorrichtung ermöglicht eine kompaktere Bauweise und die Verwendung weniger komplexer optischer Komponenten. This multiple use of the first beam deflector allows a more compact design and the use of less complex optical components. Das gelingt beispielsweise durch Anordnung eines Spiegels, insbesondere gebildet durch das Filter selbst, derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin am Filter reflektiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert, und/oder durch Anordnung eines Retroreflektors derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin durch das Filter transmittiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht abseits des Filters oder durch einen farbneutralen Bereich des Filters zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert. This is achieved for example by arranging a mirror, in particular formed by the filter itself, so that it deflected by the first beam deflector on the filter and then reflected at the filter reflects light truly parallel to the deflected onto the filter light to the first beam deflector, and / or by placing a retro-reflector in such a way that it reflects deflected by the first beam deflector on the filter and then transmitted through the filter genuine light parallel to the diffracted light on the filter away from the filter or by a color-neutral region of the filter to the first beam deflector. Die zweite Strahlablenkvorrichtung ist dann virtuell, indem sie aus der Perspektive des Filters als versetztes Spiegelbild der ersten Strahlablenkvorrichtung (oder deren Rückseite) bereitgestellt wird. The second beam deflector is then virtually by (or their back) from the perspective of the filter as offset mirror image of the first beam deflector is provided.
  • Vorzugsweise kann die Filtervorrichtung eine dritte variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung umfassen, die so angeordnet ist, dass diejenigen spektralen Anteile des von der ersten Strahlablenkvorrichtung her auf das Filter treffenden Lichtstrahls, die vom Filter nicht zur zweiten Strahlablenkvorrichtung gelangen, auf die dritte Strahlablenkvorrichtung treffen. Preferably, the filter apparatus may comprise a third variably adjustable beam deflector is arranged so that those spectral components of the striking of the first beam deflector forth on the filter the light beam which does not pass from the filter to the second beam deflector, impinge on the third beam deflector. Analog zur zweiten Strahlablenkvorrichtung dient die dritte Strahlablenkvorrichtung zur Kompensation von Richtungsfehlern und daraus resultierenden Ortsfehlern, die dem zum Filter abgelenkten Lichtstrahl von der ersten Strahlablenkvorrichtung aufgeprägt werden. Analogous to the second beam deflector is used, the third beam deflection to compensate for alignment errors and resultant local errors, which are imparted to the deflected beam to filter the light from the first beam deflector. Im Falle des Einsatzes als Hauptfarbteiler ist die zweite Strahlablenkvorrichtung beispielsweise für den zur Lichtquelle zurückgeleiteten, dem Anregungslicht entsprechenden spektralen Anteil an dem vom Objektiv kommenden Probenlicht und die dritte Strahlablenkvorrichtung für den zum Detektor geleiteten spektralen Anteil des Probenlichts verantwortlich. In case of using as the main color splitter, the second beam deflector is passed back for example, for the light source, charge corresponding to the excitation light spectral component to the next from the objective sample light and the third beam deflection device for the guided to the detector spectral portion of the sample light.
  • Die ausgangsseitige Strahllage kann mit höherer Genauigkeit konstant bleiben, wenn optisch zwischen der ersten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine (vorzugsweise um dieselbe Achse wie die erste Strahlablenkvorrichtung) variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine Kollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der zweiten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere (vorzugsweise um dieselbe Achse wie die zweite Strahlablenkvorrichtung) variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der dritten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist. The output-side beam position can remain constant with higher accuracy, when a (preferably about the same axis as the first beam deflector) variably adjustable Hilfsstrahlablenkvorrichtung or a collimation lens is optically between the first beam deflector and the filter is arranged and / or optically between the second beam deflection device and the filter an more (preferably, about the same axis as the second beam deflector) variably adjustable Hilfsstrahlablenkvorrichtung or inverse acting to collimating optics Dekollimationsoptik is arranged and / or optically another variably adjustable Hilfsstrahlablenkvorrichtung or inverse acting to collimating optics Dekollimationsoptik is disposed between the third beam deflection device and the filter. Die Hilfsstrahlablenkvorrichtung dient zur Kompensation eines dem Lichtstrahl von der ersten Strahlablenkvorrichtung aufgeprägten Ortsfehlers. The Hilfsstrahlablenkvorrichtung used to compensate for a the light beam from the first beam deflection imposed local error. Entsprechend kann mittels der anderen Hilfsstrahlablenkvorrichtung ein dem Lichtstrahl von der zweiten Strahlablenkvorrichtung aufgeprägten Ortsfehlers kompensiert werden. Accordingly, the light beam from the second beam deflection imposed local error can be compensated for by means of the other Hilfsstrahlablenkvorrichtung. Durch entsprechende Kollimations- und Dekollimationsoptiken kann ein solcher Ortsfehler von vornherein vermieden werden. By appropriate collimating and Dekollimationsoptiken such a location error can be avoided from the outset.
  • Vorteilhafterweise kann die Filtervorrichtung eine Sammeloptik zum Verringern des Strahlquerschnitts auf dem Filter umfassen. Advantageously, the filter device may comprise a collecting optical system for reducing the beam cross section on the filter. Dadurch können die spektral unterschiedlich selektiven Bereiche kleiner gestaltet werden, so dass die Filtergröße verringert oder bei gleicher Filtergröße eine größere Anzahl von Filterkonfigurationen bereitgestellt werden kann. Thus, the differently spectrally selective areas can be made smaller, for the same filter size, a larger number may be provided by filtering configurations so that the filter size decreases or. Zudem verringert sich der Flächeninhalt, über den bei Verlaufsfiltern die Filterfunktion integriert wird. In addition, the surface area, the filter function is integrated on one graduated filters reduced. Dementsprechend erhöht sich die Trennschärfe der Anordnung bei Verwendung von Verlaufsfiltern. Accordingly, the selectivity of the arrangement with the use of graduated filters increases. Dabei kann auf der entgegengesetzten Seite des Filters eine Optik zum Rückgängigmachen der fokussierenden Wirkung der Sammeloptik angeordnet sein. It can be arranged on the opposite side of the filter optics to undo the focusing effect of the collection optics. So kann eingangs- und ausgangsseitig der Filtervorrichtung eine identische Strahlgeometrie erreicht werden. Thus, input and output side of the filter device an identical beam geometry can be achieved.
  • Die zuvor beschriebene Filtervorrichtung kann vorteilhafterweise in einem Mikroskop, insbesondere zur Detektion von Lumineszenz, eingesetzt werden, vorzugsweise als Hauptfarbteiler zur optischen Kopplung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine Lichtquelle umfasst, und eines Detektionsstrahlengang, der einen optoelektronischen Detektor umfasst, wobei der vom Filter her auf die zweite Strahlablenkvorrichtung treffende Lichtstrahl mittels der zweiten Strahlablenkvorrichtung in ein Objektiv des Mikroskops, insbesondere durch eine Pupille des Objektivs, ablenkbar ist, oder als Anregungsfilter im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Detektionsstrahlenganges, oder als Nebenfarbteiler im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges, oder als Emissionsfilter im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges. The filtering device described above can be advantageously used in a microscope, in particular for the detection of luminescence, preferably as the main color splitter for optically coupling an illumination beam path, which comprises a light source and a detection beam path, comprising an opto-electronic detector, wherein the the filter forth on the second beam deflector impinging light beam by the second beam deflector in an objective lens of the microscope, in particular by a pupil of the objective, is deflectable, or as excitation filters in the illumination beam path, in particular outside of the detection beam path, or as a secondary color splitter in the detection beam path, in particular outside the illumination beam path, or as emission filters in the detection beam path, in particular outside the illumination beam path.
  • Vorteilhaft ist eine Ausführungsform des Mikroskops, in welcher das Filter in oder zumindest näherungsweise in einem Zwischenbild angeordnet sein, um eine erhöhte Trennschärfe bereitzustellen. An advantageous embodiment of the microscope, in which the filter be disposed in or at least approximately in an intermediate image to provide an increased separation efficiency. Die Strahlablenkvorrichtungen sind dann vorzugsweise in oder zumindest näherungsweise in (zur Pupillenebene des Objektivs) konjugierten Pupillenebenen angeordnet. The Strahlablenkvorrichtungen are then preferably disposed in or at least approximately in conjugated (for pupil plane of the lens) pupil planes. Alternativ kann es vorteilhaft sein, wenn das Filter in oder zumindest näherungsweise in einer konjugierten Pupilleebene und die (reflektierenden Oberflächen der) Strahlablenkvorrichtungen in Zwischenbildebenen angeordnet sind. Alternatively, it may be advantageous if the filter Strahlablenkvorrichtungen are arranged in intermediate image planes in or at least approximately in a conjugate pupil plane and the (reflecting surfaces of). Zwar ist die Trennschärfe in dieser Alternative geringer, die Aufpunkte sind aber konstant und Defekte somit korrigierbar. Although the selectivity is lower in this alternative, but the receptor points are constant and thus defects corrected.
  • Ein solches Mikroskop kann vorzugsweise einen durchstimmbaren Laser, der (unmittelbar oder mittelbar) auf die erste Strahlablenkvorrichtung der Filtervorrichtung (die als Hauptfarbteiler eingesetzt ist) gerichtet ist, umfassen. Such a microscope can be preferably a tunable laser which is (directly or indirectly) to the first beam deflector of the filter device (which is used as the main color splitter) directed include. Dadurch werden unterschiedliche Messungen innerhalb einer großen spektralen Bandbreite mit kurzen Umschaltzeiten ermöglicht. This allows different measurements within a large spectral bandwidth made possible with short switching times. Der Filter kann dabei als Kerbfilter (mit unterschiedlicher spektraler Lage der Kerbe in den verschiedenen spektral selektive Bereichen des Filters) ausgebildet sein. The filter may be designed as a notch filter (with a different spectral position of the notch in the various areas of the spectrally selective filter). Das gilt auch für Multilinien-Laser und spektral breitbandig (nicht durchstimmbare) emittierende Laser. This also applies to multi-line laser and spectrally broadband (not tunable) emitting lasers.
  • Im Sinne der Erfinder liegt ein durchstimmbarer Laser dann vor, wenn durch ein internes Mittel des Lasers oder ein externes Mittel, beispielsweise einen spektral selektiven Modulator, ein Wellenlängenbereich exklusiv ausgewählt werden kann. For the purposes of the present inventors, a tunable laser is one in which if it can be selected exclusively by an internal means of the laser or an external means, for example a spectrally selective modulator, a wavelength range.
  • Zusätzlich kann das Mikroskop einen (statischen) Farbteiler und mindestens einen weiteren Laser umfassen, der (unmittelbar oder mittelbar) auf den diesen Farbteiler gerichtet ist, wobei der weitere Farbteiler so angeordnet ist, dass er Licht von dem weiteren Laser zur zweiten Strahlablenkvorrichtung reflektiert. In addition, the microscope may comprise a (static) color splitter and at least one laser which is (directly or indirectly) directed to the this color separator, said further color splitter is arranged so that it reflects light from the other laser to the second beam deflector. Auf diese Weise kann Anregungslicht verschiedener Wellenlängen simultan eingesetzt werden. In this way, excitation light of different wavelengths may be used simultaneously. Dies ist beispielsweise bei der Lebendzellbildgebung besonders vorteilhaft, wenn schnell ablaufende Prozesse untersucht werden sollen, die beispielsweise bereits innerhalb einer Bildaufnahmedauer Änderungen verursachen, so dass die Bildinformationen zweier Multiverfolgungsaufnahmen einander nicht mehr überdecken. This is particularly advantageous for example in live cell imaging when fast processes are to be examined, for example, already cause within an image recording time changes, so that the image information of two multi tracking shots no longer overlap. Des weiteren können zwei verschiedene, hocheffizient gefilterte und schnell umschaltbare Wellenlängen zur simultanen Anregung in speziellen mikroskopischen Verfahren wie „Stimulated Emission Depletion” (STED) oder auch „Coherent anti-Stokes-Raman Scattering” (CARS) bereitgestellt werden. Further, two different, highly efficient and rapidly filtered switchable wavelengths for simultaneous excitation in particular microscopic techniques such as "Stimulated Emission Depletion" (STED) or be provided "Coherent anti-Stokes Raman Scattering" (CARS).
  • Alternativ oder zusätzlich kann das Mikroskop, wenn die erste und die zweite Strahlablenkvorrichtung in einem von der Oberfläche des Filters definierten ersten Halbraum angeordnet sind, eine zusätzliche variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung, die in einem (von dem ersten Halbraum verschiedenen) zweiten Halbraum angeordnet ist, einen weiteren durchstimmbaren Laser, der (unmittelbar oder mittelbar) auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung gerichtet ist, oder einen Farbteiler, der einen spektralen Teilbereich des ersten durchstimmbaren Lasers separiert und (unmittelbar oder mittelbar) auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung lenkt, und einen Spiegel, der einen von der zusätzlichen Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenkten und dort reflektierten Lichtstrahl in seiner Richtung umkehrt und durch das Filter auf die zweite Strahlablenkvorrichtung reflektiert, umfassen. Alternatively or additionally, the microscope when the first and the second beam deflection device arranged in an area defined by the surface of the filter first half-space, an additional variably adjustable beam deflector is arranged in a (different from the first half-space) second half-space, a further tunable laser, which is directed (directly or indirectly) to the additional beam deflector or a color splitter which separates a spectral portion of the first tunable laser and steers (directly or indirectly) to the additional beam deflector and a mirror, one of the additional beam deflection reverses its direction to the filter deflected and reflected light beam and there reflected by the filter to the second beam deflector include. Auch diese Ausführungsform ermöglicht die simultane Bereitstellung von zwei unterschiedlichen, schnell umschaltbaren Anregungswellenlängen bei hocheffizienter Filterung. This embodiment also allows the simultaneous delivery of two different fast various excitation wavelengths at high efficiency filtering. Bei Kombination mit einem Farbteiler wie im voranstehenden Absatz können auch drei unterschiedliche Anregungswellenlängen simultan bereitgestellt werden. In combination with a color splitter as in the previous paragraph also three different excitation wavelengths can be provided simultaneously.
  • Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen das Mikroskop als Lichtrastermikroskop mindestens eine weitere Strahlablenkvorrichtung zum Rastern des Lichtstrahls durch ein Sehfeld eines Objektivs des Lichtrastermikroskops umfasst, insbesondere mit Anordnung der weiteren Strahlablenkvorrichtung zwischen der Filtervorrichtung und dem Objektiv, insbesondere in einem gemeinsamen Abschnitt von Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, und/oder mit einer konfokalen Blende im Beleuchtungsstrahlengang und/oder mit einer konfokalen Blende im Detektionsstrahlengang. Particularly preferred are embodiments in which includes the microscope as a light-scanning microscope at least one further beam deflector for scanning the light beam by a field of view of a lens of the light scanning microscope, in particular by arrangement of the further beam deflector between the filter device and the objective lens, in particular in a common portion of the illumination beam path and the detection beam path and / or with a pinhole in the illumination beam path and / or with a pinhole in the detection beam path. Der Lichtstrahl kann dabei im probenseitigen Fokus eine beliebige Querschnittsform, beispielsweise punktförmig oder linienförmig, aufweisen. The light beam can be in the sample-side focal any cross-sectional shape, for example, have point-shaped or line-shaped. Lichtrastermikroskope ermöglichen neben spektraler Bildgebung mit optischem Schneiden eine Vielzahl von korrelativen und manipulativen Untersuchungsmethoden, die beispielsweise bei Weitfeldmikroskopen nur begrenzt möglich sind. Light scanning microscopes allow addition of spectral imaging with optical cutting a plurality of correlative and manipulative test methods, which are only to a limited extent, for example, in wide-field microscopes. Zudem ist die Manipulation von Anregungs- und Detektionslicht im Lichtrastermikroskop deutlich einfacher möglich, weil in der Regel kein Bildfeld übertragen wird und sich diese Maßnahmen auf Strahlmanipulationen beschränken können. In addition, the manipulation of excitation and detection light in the light microscope is much easier to do, because no frame is usually transmitted and can restrict these measures to beam manipulation.
  • Vorteilhaft ist es zudem, wenn das Mikroskop Mittel zum Erzeugen mehrerer disjunkter (fokussierter) Beleuchtungsflecken im Fokus des Objektivs, die mittels der weiteren Strahlablenkvorrichtung simultan durch das Sehfeld rasterbar sind, umfasst. It is also advantageous when the microscope comprising means for generating a plurality of disjoint (focused) light spots in the focus of the lens, which are rasterbar means of the further beam deflector simultaneously by the field of view. Mittels einer solchen Mehrfleckabtastung (engl. „multi-spot scanning”) kann die Aufnahme beschleunigt oder die Belastung der Probe reduziert werden. By means of a such a multi-spot scanning (engl. "Multi-spot scanning") can be accelerated to record or the stress of the specimen are reduced. Die Beleuchtungsflecken können beliebige (vorzugsweise identische) Formen, beispielsweise (quasi-)punktförmig oder linienförmig, und beliebige (vorzugsweise regelmäßige) relative Anordnungen zueinander, beispielsweise matrixförmig, aufweisen. The illumination spots can each other arbitrary (preferably identical) forms, for example (quasi-) punctiform or linear fashion, and any (preferably regular) relative arrangements, such as a matrix form having.
  • Das Verlaufsfilter kann als spektraler Langpass, Kurzpass, Bandpass, Bandsperre, Multi-Bandpass, Multi-Bandsperre oder als Kerbfilter ausgebildet sein. The response filter can be configured as a spectral long pass, short pass, band pass, band-stop, multi-band-pass, multi-band rejection or notch filter. Diese Eigenschaften können in Transmission oder Reflexion vorliegen. These properties may be in transmission or reflection. Das Filter kann insbesondere mindestens einen Filterbereich aufweisen, der farbneutral und/oder polarisationsselektiv ist. The filter can in particular have at least one filter area, which is neutral in color and / or polarization-selective.
  • Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Betrieb eines Mikroskops, insbesondere wie oben beschrieben, mit einer Filtervorrichtung wie oben beschrieben und einem durchstimmbaren Laser, wobei eine Einstellung des durchstimmbaren Lasers und eine Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen der Filtervorrichtung mittels einer Steuereinheit synchron, insbesondere simultan, durchgeführt werden. The invention also includes a method of operating a microscope, in particular as described above, with a filter device as described above and a tunable laser, wherein a setting of the tunable laser, and an adjustment of the Strahlablenkvorrichtungen of the filter device by a control unit synchronously in particular simultaneously performed ,
  • Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. The invention will be explained in more detail with reference to embodiments.
  • In den Zeichnungen zeigen: In the drawings:
  • 1 1 ein Lichtrastermikroskop mit einer ersten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und einem einzelnen multispektralen Laser, a light scanning microscope having a first optical filter device as flexible main color splitter and a single multispectral laser,
  • 2 2 ein Lichtrastermikroskop mit einer zweiten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und einem einzelnen multispektralen Laser, a light microscope with a second optical filter device as flexible main color splitter and a single multispectral laser,
  • 3 3 ein Lichtrastermikroskop mit der zweiten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und einem weiteren, statischen Hauptfarbteiler sowie einem durchstimmbaren Laser und mehreren statischen Lasern, a light microscope with the second optical filter device as flexible main color splitter and a further static main color splitter, and a tunable laser, and more static lasers,
  • 4 4 ein Lichtrastermikroskop mit einer dritten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und zwei durchstimmbaren Lasern, a light microscope with a third optical filter device as flexible main color splitter and two tunable lasers,
  • 5 5 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente, a section of the beam paths of another optical scanning microscope including imaging elements,
  • 6 6 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente, a section of the beam paths of another optical scanning microscope including imaging elements,
  • 7 7 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente, a section of the beam paths of another optical scanning microscope including imaging elements,
  • 8 8th einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente und a section of the beam paths of another optical scanning microscope including imaging elements, and
  • 9 9 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente. a section of the beam paths of another optical scanning microscope including imaging elements.
  • In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen. In all drawings, corresponding parts bear like reference numerals.
  • 1 1 zeigt in höchst schematischer Darstellung eine optische Filtervorrichtung shows in a highly schematic representation of an optical filter device 1 1 in einem Mikroskop in a microscope 2 2 als Hauptfarbteiler HFT zur optischen Kopplung des Beleuchtungsstrahlengangs B, der einen durchstimmbaren Laser als Lichtquelle as the main color splitter HFT for optically coupling the illumination beam path B having a tunable laser as a light source 3 3 umfasst, mit einem Detektionsstrahlengang D, der einen Detektor includes, with a detection beam path D, the detector comprises a 4 4 umfasst. includes. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind dabei keine abbildenden Elemente wie Linsen dargestellt. For clarity, this no-imaging elements are as shown lenses. Die Filtervorrichtung The filter device 1 1 umfasst hier ein dichroitisches Verlaufsfilter here comprises a dichroic filter History 5 5 mit einer Vielzahl von spektral selektiven Bereichen mit beispielsweise unterschiedlichen Kurzpassfiltern, eine erste variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung with a plurality of spectrally selective areas with, for example, different short pass filters, a first variably adjustable beam deflector 6 6 in Form eines Galvanometerspiegels und eine zweite variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung in the form of a galvanometer mirror and a second variably adjustable beam deflector 7 7 in Form eines Galvanometerspiegels sowie nicht abgebildete Antriebe für die Strahlablenkvorrichtungen. in the form of a galvanometer mirror and not mapped drives for Strahlablenkvorrichtungen. Im Detektionsstrahlengang D sind außerdem eine konfokale Blende In the detection beam path D also include a confocal aperture 8 8th und beispielsweise ein optionales Emissionsfilter and for example, an optional emission filter 9 9 zur spektralen oder polarisationsoptischen Filterung angeordnet. arranged for spectral or polarization optical filtering.
  • In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können die Ablenkvorrichtungen In alternative embodiments (not shown), the deflectors 6 6 und and 7 7 jeweils beispielsweise als einzelne MEMS-Spiegel oder als AOD ausgebildet sein. each be formed for example as a single MEMS mirror or as an AOD. Im Falle eines MEMS-Spiegels lässt sich dieser vorzugsweise über zwei in derselben Ebene liegende, orthogonale Achsen kippen. In the case of a MEMS mirror, this preferably about two axes lying in the same plane orthogonal to tilt. Um die Möglichkeiten von 2-achsig kippbaren Ablenkvorrichtungen The possibilities of 2-axis tilting deflectors 6 6 / / 7 7 auszunutzen, können die spektral unterschiedlich selektiven Bereiche des Verlaufsfilters exploit the differently spectrally selective areas of the graduated filter can 5 5 in mehreren Spalten und Zeilen angeordnet sein. be arranged in multiple columns and rows. Mit der einen Scan-Richtung wird die Spalte gewählt, mit der anderen die Zeile. With one scan direction, the column is selected, the other line. Dadurch ist es möglich, die spektrale Auflösung zu erhöhen und/oder unterschiedliche spektrale Eigenschaften in mehreren „Etagen” auf einem Filtersubstrat unterzubringen. This makes it possible to increase the spectral resolution and / or different spectral properties in several "floors" to accommodate on a filter substrate. Im Falle eines AOD ist anstelle eines Antriebs eine Treiberschaltung vorzusehen. In the case of AOD instead of a drive a driver circuit is provided. In diesem Fall kann die hohe Geschwindigkeit akusto-optischer Scanner bei gleichzeitiger verbesserter Unterdrückung durch Filter vorteilhaft eingesetzt werden. In this case, the high speed acousto-optical scanner with simultaneous improved suppression can be used to advantage by the filter.
  • Das Verlaufsfilter The Graduated Filter 5 5 kann grundsätzlich alle von Interferenzfiltern bekannten spektralen Eigenschaften aufweisen. can in principle have any known interference filters spectral properties. Anstelle eines Kurzpasses (KP) kann es als Langpass (LP), Bandpass (BP), Bandsperre (BS, bei sehr schmalen BS auch Kerbfilter genannt), Multi-Bandpass (MBP) und Multibandsperre (MBS) ausgelegt sein. it can instead of a short-pass filter (KP) as a long-pass (LP), bandpass (BP), band-stop filter (BS, called at very narrow BS also notch filter), multi-band-pass (MBP) and multi-band-stop filter (MBS) to be designed.
  • Das Emissionsfilter The emission filter 9 9 kann beispielsweise als motorisiert verschiebbares Verlaufsfilter oder als wählbares Filter in einem motorisierten Filterrad ausgebildet sein. for example, can be formed in a motorized filter wheel as a motorized displaceable graduated filter or as a selectable filter. Insbesondere kann es auch als Multi-Bandpass ausgelegt sein, der spektral auf N Stellungen des Strahlablenkvorrichtungs-Paares In particular, it may also be designed as a multi-pass band of the spectrally N positions of the pair Strahlablenkvorrichtungs 6 6 und and 7 7 abgestimmt ist. is tuned. Alternativ kann Filter Alternatively, filter 9 9 in Kombination mit Detektor in combination with detector 4 4 auch als spektral auflösende Vorrichtung ausgeführt sein. be designed as spectrally resolving device.
  • Der Laserstrahl, der zur Lumineszenzanregung in der Probe P dient, trifft zunächst auf den ersten Scan-Spiegel The laser beam that is used for luminescence excitation in the specimen P, first meets the first scanning mirror 6 6 , welcher dazu in der Lage ist, die Schwerpunktrichtung des Laserstrahls nach der Reflexion innerhalb von wenigen Millisekunden gezielt zu verändern. Which is to be able to change selectively the centroid direction of the laser beam after reflection within a few milliseconds. Er dient dazu, den Laserstrahl gezielt an einer beliebigen Stelle eines Verlaufsfilters It serves the laser beam targeted at any point of a graduated filter 5 5 auftreffen zu lassen. strike to make. Der Verlaufsfilter The Graduated Filter 5 5 zeichnet sich dadurch aus, dass seine spektral selektive Eigenschaft räumlich variiert, was beispielsweise durch optische Interferenzschichten, deren Dicke sich kontinuierlich oder in kleinen Schritten ändert, erreicht wird. is characterized in that its spectrally selective property varies spatially, which is achieved, for example, by optical interference layers whose thickness varies continuously or in small steps. Idealer Weise verschieben sich bei Variation des Auftreffortes der zu filternden Strahlung nur die spektralen Filterkanten proportional oder zumindest monoton zum Ort. move Ideally, when varying the impingement of the filtered radiation, only the spectral filter edges, or at least proportional to monotonically place. Das hier beispielhaft eingesetzte Verlaufsfilter The graduated filter example used here 5 5 weist die von Interferenzfiltern bekannte Eigenschaft auf, dass die nicht transmittierte Strahlung nahezu vollständig reflektiert wird, so dass Absorption vernachlässigt werden kann. has the known interference filters property that are not transmitted radiation is almost completely reflected so that absorption can be neglected.
  • Der Auftreffort des Laserstrahls auf dem Filter The point of incidence of the laser beam on the filter 5 5 wird mit Hilfe von Scanner is using scanner 6 6 so eingestellt, dass die Laserstrahlwellenlänge knapp vor der spektralen Kante des Kurzpasses liegt, so dass der Laserstrahl weitgehend durch das Filter adjusted so that the laser beam wavelength is located just in front of the spectral edge of the short-pass filter, so that the laser beam largely by the filter 5 5 transmittiert wird. is transmitted. Nachfolgend trifft der Laserstrahl auf den zweiten Scanner Subsequently, the laser beam is incident on the second scanner 7 7 , welcher beispielsweise baugleich zu Scanner Which, for example, identical to scanner 6 6 ist. is. Scanner scanner 7 7 dient dazu, die von Scanner serves the Scanner 6 6 verursachte Richtungsänderung zu kompensieren, so dass der Laserstrahl nach der Reflexion an Scanner to compensate for direction change caused, so that the laser beam after reflection on scanner 7 7 stets die gleiche Ausbreitungsrichtung aufweist. always has the same direction of propagation. Das Mikroskop the microscope 2 2 ist zur Ausbildung als Lichtrastermikroskop („LSM”) mit einer zusätzlichen variabel einstellbaren Strahlablenkvorrichtung is capable of forming a light-scanning microscope ( "LSM") with an additional variably adjustable beam deflector 10 10 ausgerüstet, mittels derer der Anregungsfleck beispielsweise in zwei Dimensionen über die Probe P rasterbar ist. provided by means of which the excitation spot is rasterbar example, in two dimensions across the sample P. Danach wird der Laserstrahl zur Probe P geleitet. Thereafter, the laser beam to the sample P is passed.
  • Die von der Probe abgegebene Lumineszenzstrahlung, weist in der Regel eine größere Wellenlänge als die Laserstrahlung auf. The output from the sample luminescence radiation has a longer wavelength than the laser radiation in the rule. Daher wird die Lumineszenzstrahlung nach der Umlenkung am LSM-Scanner Therefore, the luminescence radiation is after the deflection at the LSM scanner 10 10 und am Scanner and the scanner 7 7 vom Verlaufsfilter the graduated filter 5 5 reflektiert. reflected. Die konfokale Blende The confocal aperture 8 8th dient zur Unterdrückung von außerfokaler Strahlung. serves to suppress außerfokaler radiation. Sie besteht beispielsweise aus einer Lochblende, kann aber (nicht abgebildet) auch aus einem Schlitz, einer Lochmatrix, einer Gitterblende oder einer noch komplexeren Transmissionsstruktur bestehen. It consists for example of a pinhole, but can (not shown) also consist of a slot, a matrix of holes, a grating panel or a more complex transmission structure exist.
  • Hinter der Konfokalblende Behind the confocal diaphragm 8 8th trifft die Lumineszenzstrahlung auf den photoempfindlichen Detektor meets the luminescence on the photosensitive detector 4 4 , der beispielsweise als Photovervielfacher (engl. „photomultiplier”; PMT) ausgebildet ist. , For example, as a photomultiplier, is formed (eng "photomultiplier" PMT.). In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann es sich um eine Photodiode (PD), eine Avalanche-Photodiode (APD) oder eine Kamera handeln. In alternative embodiments (not shown) may be, a photodiode (PD), an avalanche photodiode (APD) or a camera.
  • Die Funktion von Scanner The operation of the scanner 7 7 kann alternativ (nicht abgebildet) auch dadurch erreicht werden, dass der Laserstrahl ein weiteres Mal über Scanner alternatively (not shown) can also be achieved that the laser beam once more on scanner 6 6 geleitet wird, wobei die Vorder- oder Rückseite von Scanner is conducted, wherein the front or back of the scanner 6 6 verwendet werden kann. can be used. Dadurch kann ein Scanner eingespart werden, wobei sich aber im Gegenzug die Komplexität des optischen Aufbaus erhöhen kann. This can save a scanner, wherein, however, can increase the complexity of the optical assembly in return.
  • In In 2 2 ist wiederum in höchst schematischer Darstellung eine Ausführungsform abgebildet, bei der ein LP-Verlaufsfilter is again in a highly schematic representation of an embodiment shown, wherein a graduated filter LP 5 5 (statt KP wie in (Instead of KP as in 1 1 ) eingesetzt wird. ) Is used. Wiederum lenkt der erste Scanner Turn directs the first scanner 6 6 den vom Laser to the laser 3 3 kommenden Laserstrahl zunächst auf das Verlaufsfilter laser beam coming first on the graduated filter 5 5 . , Der Auftreffort des Laserstrahls wird mittels Scanner The point of incidence of the laser beam using a scanner 6 6 so gewählt, dass die Laserstrahlwellenlänge knapp unterhalb der spektralen Kante des LP-Verlaufsfilters chosen so that the laser beam wavelength just below the spectral edge of the filter LP history 5 5 liegt. lies. Daher wird der Laserstrahl daran reflektiert und über den zweiten Scanner Therefore, the laser beam is reflected thereon and across the second scanner 7 7 über den zusätzlichen Scanner via the additional scanner 10 10 zur Probe P geleitet. directed to the sample P. Im Gegensatz zu In contrast to 1 1 wird hier die Lumineszenzstrahlung am Verlaufsfilter here is the luminescence at Verlauffilter 5 5 transmittiert, bevor sie zum Detektor transmitted before the detector 4 4 gelangt. arrives. Im übrigen stimmen Aufbau und Funktionsweise mit For the rest, structure and function are consistent with 1 1 überein. match. Die abgebildete Ausführungsform weist den Vorteil auf, dass von der Probe P oder von optischen Elementen, beispielsweise Objektivlinsen (nicht abgebildet) reflektiertes oder gestreutes Anregungslicht mit hoher Effizienz vom Verlaufsfilter The embodiment shown has the advantage that (not shown) of the sample P and of optical elements, such as objective lenses reflected or scattered excitation light with high efficiency by the course filter 5 5 abgefangen wird und somit nicht zum Detektor is intercepted and thus not to detector 4 4 gelangt. arrives.
  • 3 3 zeigt – ebenfalls in höchst schematischer Darstellung – eine Ausführungsform wie shows - again in a highly schematic representation, - an embodiment as 2 2 , in der jedoch Anregungslaser verschiedener Wellenlängen, hier ein durchstimmbarer Laser But in which excitation laser of different wavelengths, where a tunable laser 3 3 und mehrere statische Laser and a plurality of static laser 3A 3A , . 3B 3B bis to 3N 3N (N = C, D, E, ...), beliebig miteinander simultan kombiniert werden können. (N = C, D, E, ...), any one another can be combined simultaneously. In diesen Fällen weisen die spektral selektiven Bereiche des Filters In these cases have the spectrally selective areas of the filter 5 5 anstelle von Langpass- oder Kurzpassfiltern spektral verschiedene Kerbfilter auf, wobei die spektrale Lage des Sperrbereiches mit der Position auf dem Filter instead of long pass or short-pass filters spectrally different notch filter, wherein the spectral position of the stop band with the position on the filter 5 5 variiert. varied. Der durchstimmbare Laser The tunable laser 3 3 wird dazu mittels erstem Scanner is to by means of the first scanner 6 6 auf diejenige Position auf dem Filter to that position on the filter 5 5 gelenkt, an der dieser eine hohe Reflektivität für die am Laser directed at which this has a high reflectivity for the laser 3 3 eingestellte Lichtwellenlänge aufweist. has selected wavelength of light. Somit wird Licht des durchstimmbaren Lasers Thus, light of the tunable laser 3 3 in Richtung Probe P zur Fluoreszenzanregung abgelenkt, wobei Scanner deflected in the direction of sample P for fluorescence excitation, said scanner 7 7 wiederum der Auslenkung von Scanner turn the deflection scanner 6 6 entgegenwirkt. counteracts. Da aufgrund des schmalbandigen Sperrbereiches des ausgewählten Kerbfilters Licht größerer und geringerer Wellenlängen durch das Filter As a result of the narrow stop band of the notch filter selected wavelengths of light greater and lesser through the filter 5 5 transmittiert wird, kann gemäß dem Stand der Technik ein herkömmlicher Dichroit als weiterer Strahlteiler is transmitted, according to the prior art, a conventional dichroic beam splitter as a further 11 11 die Laser the laser 3A 3A , . 3B 3B , . 3N 3N fester Wellenlänge auf den Beleuchtungsstrahlengang B auffädeln. fixed wavelength thread on the illumination beam path B. Dies ist insbesondere für Manipulationsexperimente wie FRAP oder Freisetzung (engl. „uncaging”) von Vorteil, da Laser mit fester Wellenlänge im sichtbaren Teil des Spektrums in der Regel eine größere spektrale Leistungsdichte aufweisen. This is particularly for manipulation experiments such as FRAP or release (engl. "Uncaging") is advantageous since laser with fixed wavelength in the visible part of the spectrum have generally a greater spectral power density. Dabei kann der weitere Strahlteiler In this case, the additional beam splitter 11 11 in einem Teilerrad (nicht abgebildet) angeordnet oder als verschiebbarer Verlaufsfilter oder als weitere Filtervorrichtung in a splitter wheel (not shown) arranged as a displaceable or graduated filter or another filter device 1 1 ausgebildet sein. be formed.
  • Eine weitere Ausführungsform ist in Another embodiment is in 4 4 auf höchst schematische Weise dargestellt. shown in a highly diagrammatic manner. Teilfigur subfigure 4B 4B illustriert am Rand höchst schematisch die in Teilfigur illustrated at the edge very schematically in the partial figure 4A 4A nicht erkennbare räumliche Dimension der Strahlengänge. not recognizable spatial dimension of the beam paths. Hierin werden zwei unabhängig voneinander durchstimmbare Laser Herein, two independently tunable laser 3 3 , . 12 12 auf den Beleuchtungsstrahlengang B aufgefädelt. threaded onto the illumination beam path B. Zu diesem Zweck weist die Filtervorrichtung For this purpose, the filter device 1 1 eine zusätzliche Strahlablenkvorrichtung an additional beam deflection 13 13 und eine weitere zweckmäßigerweise einstellbare Strahlablenkvorrichtung M auf. and another expediently adjustable beam deflector M on. Mittels der Scanner Using the scanner 6 6 und and 13 13 werden die beiden resultierenden Strahlen auf die den eingestellten Wellenlängen entsprechenden spektral selektiven Bereiche auf dem Filter The resulting two beams corresponding to the set wavelength spectrally selective areas on the filter 5 5 abgelenkt. distracted. Der Scanner The scanner 7 7 kompensiert die Auslenkung durch die Scanner compensates for the deflection by the scanner 6 6 und and 13 13 und lenkt das Beleuchtungslicht in Richtung zusätzlicher Scanner and directs the illumination light in the direction of additional scanner 10 10 ab. from. Die von der Probe P emittierte Fluoreszenz durchläuft auf dem entgegengesetzten Weg zweimal in verschiedenen spektral selektiven Bereichen das Filter The fluorescence emitted from the sample P passes through the filter in the opposite direction twice in different spectrally selective areas 5 5 und wird danach der Detektionsanordnung and thereafter, the detection device 4 4 zugeführt, ohne noch einmal am Scanner supplied without again on the scanner 7 7 reflektiert zu werden, wobei das Filter to be reflected, wherein the filter 5 5 zum Auffädeln der von der gewählten Emissionswellenlänge des durchstimmbaren Lasers to bead coming from the emission wavelength of the tunable laser 3 3 verschiedenen Emissionswellenlänge des durchstimmbaren Lasers different emission wavelength of the tunable laser 12 12 durch Scanner by scanner 13 13 in zwei verschiedenen Ebenen genutzt wird. is used in two different planes. Deswegen sind zumindest Scanner Therefore, at least Scanner 7 7 und Scanner and scanners 13 13 zur Strahlablenkung in zwei Dimensionen ausgebildet. formed for beam deflection in two dimensions.
  • In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann der Laser mindestens zwei relevante, unabhängig voneinander einstellbare Wellenlängen emittieren, die mittels eines dichroitischen Strahlteilers voneinander separiert werden. In alternative embodiments (not shown) of the laser may be at least two relevant emit independently adjustable wavelengths, which are separated from each other by means of a dichroic beam splitter.
  • Durch Einsatz von Abbildungsoptiken und Faltung der Strahlengänge mittels Planspiegeln und Retroreflektoren (nicht dargestellt) lassen sich die Anzahl der notwendigen Scanner in By using imaging optics and folding of the beam paths by means of plane mirrors and retro-reflectors (not shown), the number of the necessary scanner blank in 1 1 bis to 3 3 auf eins und in on one and 4 4 auf zwei reduzieren. reduce to two. Zudem läßt sich durch eine Fokussierung der Lichtstrahlen auf den Verlaufsfilter die spektrale Auflösung der Anordnung erhöhen und die Größe des Filtersubstrates reduzieren. Also can be increased by focusing the light beams on the course filter the spectral resolution of the assembly and reduce the size of the filter substrate.
  • 5 5 zeigt einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen in einem Mikroskop shows a section of the beam paths in a microscope 2 2 mit einer Filtervorrichtung with a filter device 1 1 im Detail. in detail. Es handelt sich um ein Mikroskop wie in It is a microscope as in 2 2 gezeigt, jedoch mit einer dritten variablen Strahlablenkvorrichtung shown, but with a third variable beam deflector 20 20 ausgestattet, um die durch den Scanner equipped to by the scanner 7 7 verursachten Richtungsfehler im Detektionsstrahlengang D zu kompensieren. direction to compensate errors caused in the detection beam path D. Die Scanner the scanner 6 6 , . 7 7 und and 20 20 befinden sich in zueinander optisch konjugierten Ebenen. are located in mutually optically conjugated planes. Der Scanner The scanner 7 7 wird beispielsweise mittels einer Linse for example, by a lens 14 14 sowohl auf Scanner both scanners 6 6 als auch auf Scanner as well as scanner 20 20 abgebildet. displayed. Eine Fokussierung des Laserstrahls mittels einer beispielhaften Linse A focusing of the laser beam by means of an exemplary lens 15 15 vor dem Scanner front of the scanner 6 6 reduziert die Genauigkeitsanforderung auf dem Scanner reduces the accuracy requirements on the scanner 6 6 und hat den Vorteil, dass das konfokale Pinhole and has the advantage that the confocal pinhole 8 8th ohne Zusatzoptik im „descannten” Strahl hinter Scanner without additional optics in the beam "descanned" behind Scanner 20 20 angeordnet sein kann. may be positioned. Ein Nachteil ist hier, dass das Verlaufsfilter A disadvantage here is that the graduated filter 5 5 für verschiedene Anregungswellenlängen unter unterschiedlichen Winkeln benutzt wird. is used for different excitation wavelengths at different angles. Das bedingt im konvergenten Strahl einen spektral variierenden Astigmatismus. This requires in the convergent beam has a spectrally varying astigmatism. Um dies zu reduzieren, sind kleine Einfallswinkel am Verlaufsfilter To reduce this, small angles of incidence on the Graduated Filter 5 5 und eine geringe numerische Apertur der Fokussierung auf das Pinhole and a low numerical aperture of the focus on the pinhole 8 8th vorteilhaft. advantageous. Die Linse The Lens 21 21 kollimiert die durch die Anordnung propagierte Anregungsstrahlung, um die optische Schnittstelle collimates the propagated by the arrangement of excitation radiation to the optical interface 10 10 zur Anordnung der Strahlablenkvorrichtungen des Lichtrastermikroskops for the arrangement of the light scanning microscope Strahlablenkvorrichtungen 2 2 bereitzustellen. provide.
  • In In 6 6 ist eine is a 5 5 entsprechende Ausführungsform dargestellt, die jedoch mit Kollimationsoptiken corresponding shown embodiment, however, the collimating optics with 16 16 , . 17 17 und einer Dekollimationsoptik and a Dekollimationsoptik 18 18 ausgestattet ist, so dass jedes am Filter is provided so that each of the filter 5 5 auftreffende Lichtbündel kollimiert ist. incident light beam is collimated. Dadurch wird ein in This is one in 5 5 auftretender Astigmatismus vermieden. occurring astigmatism avoided.
  • 7 7 zeigt beispielhaft, wie durch Faltung des Beleuchtungsstrahlenganges B die Anzahl der notwendigen Strahlablenkvorrichtungen reduziert werden kann. shows an example of how the number of necessary Strahlablenkvorrichtungen can be reduced by folding the illumination beam path B. Scanner scanner 6 6 stellt hier durch die Spiegelung am Filter is here by mirroring the filter 5 5 auch die Funktion der zweiten Strahlablenkvorrichtung (Scanner the function of the second beam deflector (scanner 7 7 in in 6 6 ) bereit. ) ready. Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang können wie abgebildet über den Strahlwinkel oder alternativ (nicht abgebildet) über den Strahlort in einer fourierinversen Ebene getrennt werden. Illumination and detection beam path can be separated on the beam location in a Fourier inverse plane as imaged by the beam angle, or alternatively (not shown).
  • In In 8 8th ist dargestellt wie auf die dritte Strahlablenkvorrichtung (Scanner is shown on the third beam deflection device (scanner 20 20 in in 6 6 und and 7 7 ) verzichtet werden kann. ) Can be dispensed with. Zu diesem Zweck wird der Scanner To this end, the scanner 6 6 direkt auf die konfokale Blende directly to the confocal aperture 8 8th abgebildet und ein zweidimensional ortsauflösender Detektor displayed and a two-dimensional position-sensitive detector 4 4 eingesetzt. used. Mit einem 2D-Sensor With a 2D sensor 4 4 hinter der Blende downstream of the orifice 8 8th und können ohne dispersive Elemente verschiedene Elemente des Sensors ohne eine Ablenkungskompensation ausgelesen werden. and can be read without a deflection compensation without dispersive elements, various elements of the sensor.
  • In einer erweiterten Ausführungsform kann eine spektral aufgelöste Detektion ohne „Descanning” des Detektionsstrahlenganges D realisiert werden, wenn Scanner In an enhanced embodiment, a spectrally resolved detection without "Descanning" of the detection beam path D can be realized when Scanner 6 6 lediglich eine eindimensionale Abtastung durchführt und ein dispersives Element (nicht abgebildet) mit einer Dispersionsrichtung quer zu dieser Abtastrichtung vor dem Detektor only performs a one-dimensional scan and a dispersive element (not shown) with a dispersion direction transverse to the scanning direction before the detector 4 4 angeordnet ist. is arranged. Die nutzbare Apertur des dispergierenden Elementes muss ausreichend groß sein, um die betreffenden Ablenkungsrichtungen des Scanners The clear aperture of the dispersing element must be sufficiently large, the deflection directions of the scanner in question 6 6 aufnehmen zu können. to accommodate. Die resultierende dispergierte Abbildung ruht dann in der Sensorebene des Detektors The resulting dispersed picture then rests in the sensor plane of the detector 4 4 . , Für monofokale Bildgebung ist dann ein lineares Sensorarray als Detektor Then, for monofocal imaging a linear sensor array as a detector 4 4 ausreichend. sufficient. Multifokale Bildgebung erfordert einen 2D-Sensor als Detektor Multifocal imaging requires a 2D sensor as a detector 4 4 . , Der Vorteil einer solchen Anordnung ist die geringe Anzahl von Optiken und dadurch eine Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit gegenüber dem Fluoreszenzsignal. The advantage of such an arrangement is the small number of lenses, thereby increasing the detection sensitivity to the fluorescence signal.
  • Schließlich zeigt finally shows 9 9 eine Ausführungsform mit Faltung wie in an embodiment with folding in 7 7 , in der ein Filter In which a filter 5 5 mit einer hohen Dichte von spektral unterschiedlich selektiven Bereichen eingesetzt werden kann. can be used with a high density of differently spectrally selective areas. Zu diesem Zweck sind Optiken For this purpose, optics 19 19 vorgesehen, welche den Querschnitt von auf das Filter provided that the cross section of the filter 5 5 treffenden Lichtstrahlen verringern, indem sie diese auf das Filter reduce light beams incident while keeping them on the filter 5 5 fokussieren beziehungsweise fokussierte Lichtstrahlen auf die Blende focus or focused light beams to the aperture 8 8th abbilden. depict. Der erste Scanner The first scanner 6 6 wird dabei auf den dritten Scanner will be given to the third scanner 20 20 abgebildet. displayed. Diese Ausführungsform kann auch ohne Faltung (nicht abgebildet) realisiert werden. This embodiment can also be (not shown) without folding realized.
  • Mit den oben beschriebenen Filtervorrichtungen als Hauptfarbteiler sind Verfahren wie schnelle Mehrfachverfolgung mit einem schnell umschaltbaren durchstimmbaren Laser möglich, wie zum Beispiel beschrieben in With the above-described filter devices as the main color splitter methods are as fast multiple tracking with a fast-tunable laser switchable possible, for example as described in , wobei eine saubere Trennung der Fluoreszenzsignale erfolgen kann und spektrales Übersprechen deutlich vermindert wird. , It being possible for a clean separation of the fluorescent signals and spectral crosstalk is significantly reduced. Hierzu wird in einem entsprechenden Bildaufnahmeverfahren der Laser und der Hauptfarbteiler simultan angesteuert. For this purpose, in a corresponding image pickup method of the laser and the main color splitter is driven simultaneously. Dabei ist beispielsweise eine Steuerung des Lasers durch den Hauptfarbteiler beziehungsweise dessen Steuereinheit und umgekehrt möglich. In this case, a control of the laser by the main color splitter or its control unit and vice versa, for example. Durch die hohen erreichbaren Umschaltgeschwindigkeiten kann ein zeilenweises Multitracking erfolgen. The high switching speeds attainable line-by multi-tracking can be done. Dies ist insbesondere bei dynamischen Proben wichtig, da in der Zeit zwischen zwei vollen Bildern (engl. „frames”) möglicherweise Veränderungen der Probe stattgefunden haben, die sonst in den aufgenommenen Bildern falsch interpretiert werden, beispielsweise im Rahmen einer Co-Lokalisationsanalyse. This is particularly dynamic samples important because in the time between two full images (Engl. "Frames") may have been changes in the sample that would otherwise be misinterpreted in the captured images, for example as part of a co-localization analysis.
  • Zudem kann der volle spektrale Bereich eines durchstimmbaren Lasers mit einer hohen spektralen Auflösung und damit einer nahezu kontinuierlichen Anpassung des spektralen Teilungsverhaltens genutzt werden. In addition, the full spectral range of a tunable laser with high spectral resolution and therefore a nearly continuous adjustment of the spectral splitting behavior can be used. Das erlaubt zum Beispiel eine Feinabstimmung auf die bestmögliche spektrale Anregungs-/Emissionsposition für einen gegebenen Farbstoff. This allows, for example, a fine tuning to the best possible spectral excitation / emission position for a given dye. Dieses Maximum, welches nicht unbedingt im Anregungsmaximum des Farbstoffes liegen muss, kann aufgrund der hohen Schaltgeschwindigkeit der Erfindung adaptiv beispielsweise mittels eines Rückkopplungsalgorithmus ermittelt werden. This maximum, which need not necessarily be in the excitation maximum of the dye can be determined due to the high switching speed of the present invention adaptively for example by means of a feedback algorithm. Hierzu wird an einer Stelle der Probe, welche die gesuchten Farbstoffe enthält, die Anregungswellenlänge in Kombination mit der zur Filterung genutzten Stelle auf dem Verlaufsfilter auf ein Maximum optimiert. For this purpose, the excitation wavelength is optimized in combination with the filtering used to place on the graduated filter to a maximum at a position of the sample containing the dyes are.
  • Bezugszeichenliste LIST OF REFERENCE NUMBERS
  • 1 1
    Filtervorrichtung filter means
    2 2
    Mikroskop microscope
    3 3
    Lichtquelle light source
    4 4
    Detektor detector
    5 5
    Filter filter
    6 6
    Erste variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung First variably adjustable beam deflector
    7 7
    Zweite variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung Second variably adjustable beam deflector
    8 8th
    Konfokale Blende confocal aperture
    9 9
    Emissionsfilter emission filter
    10 10
    Weitere Strahlablenkvorrichtung Additional beam deflection
    11 11
    Weiterer Strahlteiler Another beam splitter
    12 12
    Durchstimmbarer Laser tunable laser
    13 13
    Zusätzliche Strahlablenkvorrichtung additional beam deflection
    14 14
    Linse lens
    15 15
    Linse lens
    16 16
    Kollimationsoptik collimating optics
    17 17
    (De-)Kollimationsoptik (De-) collimating optics
    18 18
    Dekollimationsoptik Dekollimationsoptik
    19 19
    Sammeloptik collection optics
    20 20
    Dritte variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung Third variably adjustable beam deflector
    21 21
    Linse lens
    C C
    Steuereinheit control unit
    B B
    Beleuchtungsstrahlengang Illumination beam path
    D D
    Detektionsstrahlengang Detection beam path
    HFT HFT
    Hauptfarbteiler Main color splitter
    M M
    Spiegel/Strahlablenkvorrichtung Mirror / beam deflection
    P P
    Probe sample
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. This list of references cited by the applicant is generated automatically and is included solely to inform the reader. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. The list is not part of the German patent or utility model application. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen. The DPMA is not liable for any errors or omissions.
  • Zitierte Patentliteratur Cited patent literature
    • US 6167173 [0004, 0005] US 6167173 [0004, 0005]
    • US 2008/0062511 A1 [0005] US 2008/0062511 A1 [0005]
    • US 2010/188741 A1 [0008] US 2010/188741 A1 [0008]
    • US 2002/0097485 A1 [0009] US 2002/0097485 A1 [0009]
    • US 2008/062511 A1 [0010] US 2008/062511 A1 [0010]
    • DE 202008016287 U1 [0010] DE 202008016287 U1 [0010]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur Cited non-patent literature
    • „High power ultra-widely tuneable femtosecond pulses from a non-collinear optical parametric oscillator (NOPO)” von Lang et al. "High power ultra-Widely tuneable femtosecond pulses from a non-collinear optical parametric oscillator (NOPO)" by Lang et al. in Optics Express 20 (2012), S. 912 [0068] in Optics Express 20 (2012), p 912 [0068]

Claims (17)

  1. Optische Filtervorrichtung ( Optical filter device ( 1 1 ), die ein Filter ( ) Which (a filter 5 5 ), insbesondere mit dichroitischen Schichten, umfasst, das parallel zu einer seiner Oberflächen angeordnete Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften aufweist, insbesondere für Mikroskope ( ), In particular dichroic layer comprises having disposed parallel to one surface thereof areas having different spectral filter characteristics (in particular for microscopes 2 2 ), gekennzeichnet durch zwei variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtungen ( ), Characterized by two variably adjustable Strahlablenkvorrichtungen ( 6 6 , . 7 7 ), wobei ein auf die erste Strahlablenkvorrichtung ( ), Wherein a (the first beam deflector 6 6 ) einfallender Lichtstrahl mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung ( ) Incident light beam by the first beam deflector ( 6 6 ) auf unterschiedliche Bereiche des Filters ( ) (On different areas of the filter 5 5 ) ablenkbar ist und das Filter ( ) Is deflectable and the filter ( 5 5 ) und die Strahlablenkvorrichtungen ( ) And the Strahlablenkvorrichtungen ( 6 6 ) so angeordnet sind, dass der zum Filter ( ) Are arranged so that the (to the filter 5 5 ) abgelenkte und dort reflektierte oder transmittierte Lichtstrahl auf die zweite Strahlablenkvorrichtung ( ) Deflected and there reflected or transmitted light beam to the second beam deflector ( 7 7 ) trifft. ) meets.
  2. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach Anspruch 1, wobei das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet sind, dass der am Filter reflektierte beziehungsweise durch das Filter transmittierte Lichtstrahl von der zweiten Strahlablenkvorrichtung so ablenkbar ist, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft. ) Is deflected according to claim 1, wherein the filter and the Strahlablenkvorrichtungen are arranged so that the reflected or transmitted to the filter through the filter light beam from the second beam deflector is that it is parallel, in particular coaxially, extending to the incident light beam.
  3. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach Anspruch 2, umfassend eine Steuereinheit (C), die zur Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen mit diesen verbunden ist und dazu eingerichtet ist, die erste Strahlablenkvorrichtung in Abhängigkeit eines vorgebbaren oder vorgegebenen Parameters die erste Strahlablenkvorrichtung einzustellen und die zweite Strahlablenkvorrichtung zu einzustellen, dass sie den an dem Filter reflektierten beziehungsweise durch das Filter transmittierten Lichtstrahl so ablenkt, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft. ) According to claim 2, comprising a control unit (C), which is for setting the Strahlablenkvorrichtungen connected thereto and is adapted to set the first beam deflector in dependence on a predeterminable or predetermined parameter, the first beam deflector and to set the second beam deflector is that the reflected at the filter or filters transmitted through the light beam deflects so that it is parallel, in particular coaxially, extending to the incident light beam.
  4. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste und/oder die zweite Strahlablenkvorrichtung ein Spiegel, insbesondere basierend auf einem mikroelektromechanischen System, oder ein akustooptisches Element, insbesondere ein akusto-optisch einstellbarer Deflektor, ist. ) According to one of the preceding claims, wherein the first and / or the second beam deflector is a mirror, in particular based on a micro-electro-mechanical system, or an acousto-optical element, in particular an acousto-optical deflector is adjustable.
  5. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eine, insbesondere beide, der Strahlablenkvorrichtungen um zwei verschiedene Achsen drehbar sind, insbesondere mit einer Lage dieser Achsen in einer Ebene, insbesondere mit zueinander orthogonalem Verlauf der Achsen. ) According to one of the preceding claims, wherein at least one, in particular both, of the Strahlablenkvorrichtungen two different axles are rotatable, in particular with a layer of these axes in a plane, in particular with mutually orthogonal during the axes.
  6. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften zweidimensional parallel zur Oberfläche des Filters verteilt angeordnet sind. ) According to one of the preceding claims, wherein the regions are arranged distributed two-dimensionally parallel to the surface of the filter with different spectral filter characteristics.
  7. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Strahlablenkvorrichtung durch die erste Strahlablenkvorrichtung gebildet ist, insbesondere mit Anordnung eines Spiegels, insbesondere gebildet durch das Filter selbst, derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin am Filter reflektiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert, und/oder mit Anordnung eines Retroreflektors derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin durch das Filter transmittiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht abseits des Filters oder durch einen farbneutralen Bereich des Filters zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert. ) According to one of the preceding claims, wherein the second beam deflector is formed by the first beam deflector, in particular by arrangement of a mirror, in particular formed by the filter itself, so that it deflected by the first beam deflector on the filter and then reflected at the filter lightfast reflected parallel to the deflected onto the filter light to the first beam deflector, and / or arrangement of a retro-reflector in such a way that, at the deflected onto the filter light away from it of deflected by the first beam deflector on the filter and then transmitted through the filter lightfast parallel reflecting filter or a color-neutral region of the filter to the first beam deflector.
  8. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine dritte variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung, die so angeordnet ist, dass diejenigen spektralen Anteile des von der ersten Strahlablenkvorrichtung her auf das Filter treffenden Lichtstrahls, die vom Filter nicht zur zweiten Strahlablenkvorrichtung gelangen, auf die dritte Strahlablenkvorrichtung treffen. ) According to one of the preceding claims, comprising a third variably adjustable beam deflector is arranged so that those spectral components of the striking of the first beam deflector forth on the filter the light beam which does not pass from the filter to the second beam deflector, impinge on the third beam deflector.
  9. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei optisch zwischen der ersten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine Kollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der zweiten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der dritten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist. ) Further variably adjustable Hilfsstrahlablenkvorrichtung or inverse acting to collimating optics Dekollimationsoptik is arranged according to one of the preceding claims, wherein the optically variably adjustable Hilfsstrahlablenkvorrichtung or collimating optics is disposed between the first beam deflector and the filter and / or optically between the second beam deflection device and the filter and / or a further variably adjustable Hilfsstrahlablenkvorrichtung or acting inversely to the collimation optics Dekollimationsoptik is optically positioned between the third beam deflection device and the filter.
  10. Filtervorrichtung ( Filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Sammeloptik zum Verringern des Strahlquerschnitts auf dem Filter, insbesondere umfassend eine auf der entgegengesetzten Seite des Filters angeordnete Optik, zum Rückgängigmachen der fokussierenden Wirkung der Sammeloptik. ) According to one of the preceding claims, comprising a collecting optical system for reducing the beam cross section on the filter, in particular comprising means disposed on the opposite side of the filter optics, to undo the focusing effect of the collection optics.
  11. Mikroskop mit einer optischen Filtervorrichtung ( Microscope with an optical filter device ( 1 1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere als – Hauptfarbteiler zur optischen Kopplung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine Lichtquelle umfasst, und eines Detektionsstrahlengang, der einen optoelektronischen Detektor umfasst, wobei der vom Filter her auf die zweite Strahlablenkvorrichtung treffende Lichtstrahl mittels der zweiten Strahlablenkvorrichtung in ein Objektiv des Mikroskops, insbesondere durch eine Pupille des Objektivs, ablenkbar ist, – Anregungsfilter im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Detektionsstrahlenganges, – Nebenfarbteiler im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges, oder – Emissionsfilter im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges. ) According to one of the preceding claims, in particular as - primary color splitter for optically coupling an illumination beam path, which comprises a light source and a detection beam path, comprising an opto-electronic detector, wherein the striking by the filter forth on the second beam deflector light beam by the second beam deflector in a lens of the microscope, in particular by a pupil of the objective, is deflectable, - excitation filters in the illumination beam path, in particular outside of the detection beam path, - secondary color splitter in the detection beam path, in particular outside the illumination beam path, or - emission filter in the detection beam path, in particular outside of the illumination beam path.
  12. Mikroskop nach Anspruch 11, umfassend einen durchstimmbaren Laser ( Microscope according to claim 11, comprising a tunable laser ( 3 3 ), der unmittelbar oder mittelbar auf die erste Strahlablenkvorrichtung der Filtervorrichtung gerichtet ist, insbesondere mit Ausbildung des Filters als Kerbfilter. ) Which is directed directly or indirectly on the first beam deflector of the filter device, in particular with the formation of the filter as a notch filter.
  13. Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, umfassend einen Farbteiler ( Microscope according to the preceding claim, comprising a color splitter ( 11 11 ) und mindestens einen weiteren Laser ( ) And at least one further laser ( 3A 3A ... ... 3N 3N ), der auf den diesen Farbteiler ( ), Of (on this color splitter 11 11 ) gerichtet ist, wobei der Farbteiler ( is directed), wherein the color divider ( 11 11 ) so angeordnet ist, dass er Licht von dem weiteren Laser ( ), Is arranged so that it (light from the other laser 3A 3A ... ... 3N 3N ) zur zweiten Strahlablenkvorrichtung ( ) (For the second beam deflector 7 7 ) reflektiert. ) Reflected.
  14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die erste und die zweite Strahlablenkvorrichtung in einem von der Oberfläche des Filters definierten ersten Halbraum angeordnet sind, umfassend – eine zusätzliche variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung ( Microscope according to one of claims 11 to 13, wherein the first and second beam deflection device arranged in an area defined by the surface of the filter first half-space, comprising: - an additional variably adjustable beam deflector ( 20 20 ), die in einem zweiten Halbraum angeordnet ist, – einen weiteren durchstimmbaren Laser, der unmittelbar oder mittelbar auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung ( ), Which is arranged in a second half-space, - a further tunable laser which directly or indirectly (on the additional beam deflector 20 20 ) gerichtet ist, oder einen Farbteiler, der einen spektralen Teilbereich des ersten durchstimmbaren Lasers separiert und unmittelbar oder mittelbar auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung lenkt, und – einen Spiegel, der einen von der zusätzlichen Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenkten und dort reflektierten Lichtstrahl in seiner Richtung umkehrt und durch das Filter auf die zweite Strahlablenkvorrichtung reflektiert. ) Is directed, or a color splitter which separates a spectral portion of the first tunable laser and articulated directly or indirectly to the additional beam deflector, and - a mirror, which reverses a deflected by the additional beam deflector on the filter and reflected there light beam in its direction and reflected by the filter to the second beam deflector.
  15. Lichtrastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend mindestens eine weitere Strahlablenkvorrichtung ( Light scanning microscope according to any one of claims 11 to 14, comprising at least one additional beam deflector ( 10 10 ) zum Rastern des Lichtstrahls durch ein Sehfeld eines Objektivs des Lichtrastermikroskops, insbesondere mit Anordnung der weiteren Strahlablenkvorrichtung zwischen der Filtervorrichtung und dem Objektiv, insbesondere in einem gemeinsamen Abschnitt von Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, und/oder mit einer konfokalen Blende im Beleuchtungsstrahlengang und/oder mit einer konfokalen Blende im Detektionsstrahlengang. ) For scanning the light beam by a field of view of a lens of the light scanning microscope, in particular by arrangement of the further beam deflector between the filter device and the objective lens, in particular in a common portion of the illumination beam path and the detection beam path, and / or with a pinhole in the illumination beam path and / or with a pinhole in the detection beam path.
  16. Lichtrastermikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, umfassend Mittel zum Erzeugen mehrerer disjunkter Beleuchtungsflecken im Fokus des Objektivs, die mittels der weiteren Strahlablenkvorrichtung simultan durch das Sehfeld rasterbar sind. Light scanning microscope according to the preceding claim, comprising means for generating a plurality of disjoint illumination spots in the focus of the lens, which are rasterbar means of the further beam deflector simultaneously by the field of view.
  17. Verfahren zum Betrieb eines Mikroskops ( A method of operating a microscope ( 2 2 ), insbesondere nach einem der Ansprüche 11 bis 16, mit einer Filtervorrichtung ( ), In particular according to one of claims 11 to 16, (having a filter device 1 1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einem durchstimmbaren Laser ( ) (According to any of claims 1 to 10 and a tunable laser 3 3 ), wobei eine Einstellung des durchstimmbaren Lasers ( ), Wherein a setting of the tunable laser ( 3 3 ) und eine Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen ( ) And adjustment of the Strahlablenkvorrichtungen ( 6 6 , . 7 7 ) der Filtervorrichtung ( () Of the filter device 1 1 ) mittels einer Steuereinheit (C) synchron, insbesondere simultan, durchgeführt werden. ) C) (synchronously by a control unit, in particular simultaneously performed.
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