DE102013209880A1

DE102013209880A1 - Method for laser microdissection and laser microdissection system

Info

Publication number: DE102013209880A1
Application number: DE102013209880.4A
Authority: DE
Inventors: Falk Schlaudraff; Florian Hoffmann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-12-04
Also published as: WO2014191383A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem ein Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10) verwendet wird, wobei aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt (51) mittels eines Laserstrahls (b), der mittels einer Auflichteinrichtung (76) des Mikroskops (10) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf das zu dissektierende Objekt (51) fokussiert wird, wenigstens ein Dissektat (511) herausgetrennt wird und in einem Dissektatauffangbehälter (55) aufgefangen wird, wobei zumindest eine Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) unter Erzeugung von Bilddaten (550) zumindest abschnittsweise bildgebend erfasst wird, vorgeschlagen. Die Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) wird zu wenigstens zwei Zeitpunkten bildgebend erfasst und die hierbei erzeugten Bilddaten (550) werden miteinander verglichen. Ein Lasermikrodissektionssystem (100), das zur Durchführung eines solchen Verfahrens eingerichtet ist, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.The invention relates to a method for laser microdissection, in which a laser microdissection system (100) with a microscope (10) is used. 10) is focused by a microscope objective (41) of the microscope (10) on the object (51) to be dissected, at least one dissectate (511) is separated out and collected in a dissectate collecting container (55), at least one collecting surface (551) of the Dissectate receptacle (55) with image data (550) is recorded at least in sections, is proposed. The collecting surface (551) of the dissectate collecting container (55) is recorded in an imaging manner at at least two times and the image data (550) generated in this process are compared with one another. The invention also relates to a laser microdissection system (100) which is set up to carry out such a method.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem zumindest eine Auffangfläche eines Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung von Bilddaten bildgebend erfasst wird, und ein zur Durchführung des Verfahrens eingerichtetes Lasermikrodissektionssystem. The present invention relates to a method for laser microdissection, in which at least one collecting surface of a dissektate collecting container is imaged to generate image data, and a laser microdissection system set up for carrying out the method.

Stand der Technik State of the art

Verfahren zur Bearbeitung mikroskopischer Proben durch die sogenannte Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre (siehe z.B. Isenberg, G. et al.: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Band 107, 1976, Seiten 19–24 ) und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Methods for processing microscopic samples by the so-called laser microdissection already exist since the mid-1970s (see, eg Isenberg, G. et al .: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Vol. 107, 1976, pages 19-24 ) and have been continuously developed since then.

Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einem Präparat („Objekt“) isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt des Gewebes mit dem Laserstrahl, durch den das Gewebe kaum verändert wird. Die spezifische Gewinnung der Dissektate kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen (siehe z.B. Bancroft, J.D. und Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier Science, 2008, Seite 575, Kapitel „Laser Microdissection“ ). In laser microdissection, cells, tissue regions, etc., can be isolated from a preparation ("object") and recovered as so-called dissectates. A particular advantage of laser microdissection is the short contact of the tissue with the laser beam, through which the tissue is hardly changed. The specific recovery of the dissectates can be done in different ways (see, eg Bancroft, JD and Gamble, M .: Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier Science, 2008, page 575, chapter "Laser Microdissection" ).

Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einem Objekt mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das entweder unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt oder gegen die Schwerkraft in einen solchen katapultiert wird (sogenanntes Laser Pressure Catapulting). Das Dissektat kann dabei aus dem Objekt auch zusammen mit einer anhaftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten Laser Capture Microdissection wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich des Objekts und kann in einem darauffolgenden Schritt entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben katapultierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden. For example, in known methods, a dissectate can be isolated from an object by means of an infrared or ultraviolet laser beam, either falling under the influence of gravity into a suitable Dissektatauffangbehälter or catapulted against gravity into such (so-called laser pressure catapulting). The dissectate can also be cut out of the object together with an adherent membrane. In the so-called laser capture microdissection, however, a thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding laser beam. The membrane merges with the desired area of the object and can be removed in a subsequent step. Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffangbehälters. In known inverse microscope systems for laser microdissection, catapulted dissectates can also be attached to the bottom of a dissected collecting container provided with an adhesive coating.

Die vorliegende Erfindung kommt hierbei insbesondere bei den Verfahren zum Einsatz, bei dem ein Dissektat aus einem Objekt herausgetrennt und in einem Dissektatauffangbehälter aufgefangen wird. Insbesondere ist die Erfindung für kontaktfreie Auffangsysteme für Dissektate geeignet. The present invention is used in particular in the methods in which a dissectate is separated from an object and collected in a dissected collecting container. In particular, the invention is suitable for contact-free collection systems for dissectates.

Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion, wie sie beispielsweise aus der WO 98/14816 A1 bekannt sind, weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf das Objekt fokussiert, das auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie wird dadurch erzeugt, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um das Objekt relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter anderem den Nachteil, dass das Objekt während des Erzeugens der Schnittlinie nicht sinnvoll betrachtet werden kann, da sich dieses kontinuierlich oder schrittweise im Gesichtsfeld bewegt. Known microscope systems for laser microdissection, as for example from the WO 98/14816 A1 are known, have a Auflichteinrichtung, in whose beam path a laser beam is coupled. The laser beam is focused by the respectively used microscope objective on the object, which rests on a motor-automatically movable microscope stage. A cutting line is created by moving the microscope stage during cutting to move the object relative to the fixed laser beam. However, this has, inter alia, the disadvantage that the object during the generation of the cutting line can not be considered meaningful, as this moves continuously or gradually in the field of view.

Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf dem dann feststehenden Objekt entsprechend zu verschieben. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikrodissektionssystem, das eine Laserscaneinrichtung mit gläsernen Keilplatten aufweist, ist in der EP 1 276 586 B1 beschrieben. Therefore, laser microdissection systems which have laser deflection or laser scanning devices which are set up to correspondingly displace the laser beam or its point of impact on the then stationary object are more advantageous. Such laser microdissection systems, which also offer particular advantages in the context of the present invention, are explained in detail below. A particularly advantageous laser microdissection system comprising a laser scanning device with glass wedge plates is disclosed in US Pat EP 1 276 586 B1 described.

In beiden Fällen, also sowohl in Lasermikrodissektionssystemen, in denen der Mikroskoptisch verfahren wird, als auch in Lasermikrodissektionssystemen, die eine Laserscaneinrichtung aufweisen, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls beispielsweise ein Loch im Objekt erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher, gegebenenfalls mit Überlappung. In both cases, ie both in laser microdissection systems in which the microscope stage is moved and in laser microdissection systems which have a laser scanning device, pulsed lasers are generally used, with each laser pulse producing a hole in the object, for example. A cutting line is created by a juxtaposition of such holes, possibly with overlap.

Die Lasermikrodissektion wird üblicherweise mit voll- oder halbautomatischen Mikroskopsystemen durchgeführt, wobei ein Monitor zur Visualisierung des Objekts und von entsprechenden Schnittlinien vorgesehen ist. Auch bei den frühesten Systemen, wie sie beispielsweise aus dem eingangs erwähnten Artikel von Isenberg et al. bekannt sind, wird zwar ein mechanisches Mikroskop verwendet, die Visualisierung erfolgt jedoch auch hier über eine „Fernsehkamera“. The laser microdissection is usually performed with fully or semi-automatic microscope systems, with a monitor for visualization of the object and of corresponding cutting lines is provided. Even with the earliest systems, as described, for example, in the article by Isenberg et al. Although a mechanical microscope is used, the visualization is also done here via a "television camera".

In den erläuterten Systemen erweist sich die Überwachung des Dissektionsvorgangs bzw. eine Kontrolle des Dissektionserfolgs häufig als schwierig. In der Regel wird nach dem Heraustrennen des Dissektats das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv, das auch zur Fokussierung des Laserstrahls auf das Objekt verwendet wird, auf den Boden bzw. die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters fokussiert. Das Objekt befindet sich bei einem Dissektionsvorgang notwendigerweise in der Schärfenebene des Mikroskopobjektivs, so dass ein derartiges „Umfokussieren“ erforderlich ist. In Fällen, in denen der freie Arbeitsabstand des verwendeten Objektivs zur Erfassung der Dissektate in dem Dissektatauffangbehälter nicht ausreicht, ist sogar ein Objektivwechsel erforderlich. In the illustrated systems, the monitoring of the dissection process or control of the dissection success often proves difficult. As a rule, after the dissecting out, the respective microscope objective used, which is also used to focus the laser beam on the object, is focused onto the bottom or the collecting surface of the dissected collecting container. The object is at a Dissection process necessarily in the focal plane of the microscope objective, so that such a "refocusing" is required. In cases where the free working distance of the objective used to detect the dissected matter in the dissected collecting container is insufficient, even a lens change is required.

In herkömmlichen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion ist ferner nur eine rein visuelle Kontrolle des Dissektatauffangbehälters möglich. Insbesondere bei Optimierungsarbeiten, beispielsweise zur Ermittlung der zur Dissektion erforderlichen Laserleistung, oder in Fällen, in denen eine bestimmte, vorgegebene Anzahl an Dissektaten gewonnen werden soll, ist dies außerordentlich aufwendig. Furthermore, in conventional microscope systems for laser microdissection, only a purely visual inspection of the dissected collecting container is possible. In particular, in optimization work, for example, to determine the laser power required for the dissection, or in cases where a certain predetermined number of dissections to be obtained, this is extremely expensive.

Es besteht daher der Bedarf nach verbesserten Möglichkeiten zur Überwachung des Dissektionsvorgangs bzw. zur Kontrolle des Dissektionserfolgs bei der Lasermikrodissektion. There is therefore a need for improved possibilities for monitoring the dissection process or for controlling the dissection success in laser microdissection.

Offenbarung der Erfindung Disclosure of the invention

Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem zumindest eine Auffangfläche eines Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung von Bilddaten bildgebend erfasst wird, und ein zur Durchführung des Verfahrens eingerichtetes Lasermikrodissektionssystem mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung. Against this background, the present invention proposes a method for laser microdissection, in which at least one collecting area of a dissectate collecting container is imaged to generate image data, and a laser microdissection system designed for carrying out the method with the features of the independent patent claims. Preferred embodiments are the subject of the dependent claims and the following description.

Vorteile der Erfindung Advantages of the invention

Die Erfindung geht von einem an sich bekannten Verfahren zur Lasermikrodissektion aus, bei dem aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt mittels eines Laserstrahls wenigstens ein Dissektat herausgetrennt und in einem Dissektatauffangbehälter aufgefangen wird. The invention is based on a method known per se for laser microdissection, in which at least one dissectate is separated from at least one object to be dissected by means of a laser beam and collected in a dissecting collecting container.

Das erfindungsgemäße Verfahren kommt insbesondere in solchen Lasermikrodissektionssystemen zum Einsatz, in denen ein herausgetrenntes Dissektat aufgrund der Schwerkraft in einen entsprechenden Dissektatauffangbehälter fällt. Das Objekt ist dabei an einer Seite, in Aufrechtsystemen der Unterseite, eines Objektträgers befestigt und wird durch den Objektträger hindurch von dessen anderer Seite aus mit dem Laserstrahl bearbeitet. The method according to the invention is used in particular in such laser microdissection systems in which a segregated dissectate falls due to gravity into a corresponding dissektate collecting container. The object is attached to one side, in upright systems of the underside, a slide and is processed through the slide through the other side of the laser beam.

Derartige Lasermikrodissektionssysteme umfassen ein Mikroskop mit einem Mikroskoptisch, der das zu dissektierende Objekt trägt, und einer Auflichteinrichtung. Mittels der Auflichteinrichtung wird ein Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten des zu dissektierenden Objekts verwendet wird, auf das zu dissektierende Objekt fokussiert. Such laser microdissection systems include a microscope having a microscope stage carrying the object to be dissected, and an incident light device. By means of the incident light device, a laser beam from a laser light source is coupled into the observation beam path of the microscope. The laser beam is focused by the microscope objective, which is also used for viewing the object to be dissected, onto the object to be dissected.

Anders ausgedrückt geht die vorliegende Erfindung beispielsweise von einem Lasermikrodissektionssystem mit einem Mikroskop aus, das eine Auflichteinrichtung, ein Mikroskopobjektiv, eine Lasereinheit und eine Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtung aufweist. Ein Strahlengang eines Laserstrahls der Lasereinheit verläuft in diesem Lasermikrodissektionssystem durch die Auflichteinrichtung, durch die Laserscaneinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs. Es handelt sich damit um ein Lasermikrodissektionssystem, bei dem der Laserstrahl in die Auflichteinrichtung eingekoppelt und durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf das Objekt fokussiert wird. Das erläuterte Lasermikrodissektionssystem entspricht in seinem grundsätzlichen Aufbau beispielsweise dem in der EP 1276 586 B1 offenbarten. In other words, for example, the present invention proceeds from a laser microdissection system having a microscope that includes an incident light device, a microscope objective, a laser unit, and a laser scanning device. A beam path of a laser beam of the laser unit in this laser microdissection system runs through the incident light device, through the laser scanning device and through the microscope objective and intersects an object plane of the microscope objective. It is therefore a laser microdissection system in which the laser beam is coupled into the incident light device and focused on the object by the respectively used microscope objective. The illustrated laser microdissection system corresponds in its basic structure, for example, in the EP 1276 586 B1 disclosed.

Durch die Laserscaneinrichtung kann der Schnittpunkt des Strahlengangs des Laserstrahls mit der Objektebene und damit der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem Objekt durch geeignete Ablenkmittel verschoben werden. Dies erfolgt dadurch, dass der Strahlengang des Laserstrahls nach Maßgabe wenigstens eines Einstellwerts der erwähnten Lasereinstellmittel abgelenkt wird. By the laser scanning device, the intersection of the beam path of the laser beam with the object plane and thus the point of impact of the laser beam on the object can be moved by suitable deflection. This is done by deflecting the beam path of the laser beam in accordance with at least one set value of the mentioned laser adjustment means.

Ist im Rahmen dieser Anmeldung von einem „Auftreffpunkt“ des Laserstrahls auf einem Objekt bzw. dessen „Zielpunkt“ die Rede, handelt es sich hierbei um Positionen, die sich direkt aus dem Schnittpunkt des Strahlengangs des Laserstrahls mit der Objektebene ergeben, wenn ein Objekt in diese eingebracht ist. Diese Begriffe können daher synonym verwendet werden. Is in the context of this application of a "point of impact" of the laser beam on an object or its "target point" the speech, these are positions that arise directly from the intersection of the beam path of the laser beam with the object plane when an object in this is introduced. These terms can therefore be used synonymously.

Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit zu dissektierenden Objekten verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt werden. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von zu dissektierenden Objekten sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die Erfindung auch mit anderen zu dissektierenden Objekten, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, beispielsweise mit Ausstrichen, Mazeraten usw. To avoid misunderstandings, it should be emphasized at this point that the laser microdissection system used in the context of the invention is used with objects to be dissected which have already been prepared for microscopy. These may be, for example, thin sections which are separated out of a larger tissue block by means of a microtome. Such a tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ. The laser microdissection system according to the invention therefore does not serve for the extraction of objects to be dissected but for their processing as well as for the isolation of certain areas thereof. It is understood that the invention also with other objects to be dissected, not by means of a microtome be recovered, can be used, for example, with smears, macerates, etc.

Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Objekten eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, ggf. dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach objektabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen Kriterien, eingerichtet sind. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen nicht auf Lasermikrodissektionssysteme übertragen. Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic objects. Microtomes can also have lasers for this purpose. The sections obtained by means of a microtome are applied to a microscope slide as mentioned above, possibly attached there, stained, etc. Only then are these available for use in the laser microdissection system according to the invention. Among other things, a microtome differs fundamentally in its operation from a laser microdissection system in that it produces cuts with as homogeneous a cutting thickness as possible. Microtomes are therefore designed to produce a large number of identical cuts with parallel cut surfaces, whereas laser microdissection systems are set up for separating dissects according to object-dependent criteria, for example according to visual criteria. The person skilled in the art would therefore not transfer technical solutions used in microtomes to laser microdissection systems.

Mikrotome umfassen ferner keine Mikroskope, in deren Beobachtungsstrahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird daher in Mikrotomen auch niemals durch ein Mikroskopobjektiv, das auch zur Betrachtung verwendet wird, auf ein bearbeitetes Objekt, z.B. einen Gewebeblock, fokussiert. Furthermore, microtomes do not include microscopes in whose observation beam path a laser beam is coupled. The laser beam in microtomes will therefore never be transmitted through a microscope objective, which is also used for viewing, onto a processed object, e.g. a tissue block, focused.

Ferner kommt im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise ein Lasermikrodissektionssystem mit einer Laserscaneinrichtung zum Einsatz. Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer Laserscaneinrichtung bezüglich der x-y-Richtung (also in den Richtungen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) beim Heraustrennen des Dissektats, also während des Dissektiervorgangs, feststehend angeordnet. Die Laserscaneinrichtung ist in der Auflichteinrichtung integriert. Furthermore, in the context of the present invention, advantageously a laser microdissection system with a laser scanning device is used. The microscope stage is fixedly arranged in laser microdissection systems with a laser scanning device with respect to the x-y direction (that is to say in the directions perpendicular to the optical axis of the microscope objective) during separation of the dissect, ie during the dissecting process. The laser scanning device is integrated in the incident light device.

Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserscaneinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile. In contrast to laser microdissection systems with a microscope stage (scanning stage) moved by a motor during the dissecting process, which must have a high positioning accuracy, especially in the case of high-magnification objectives, in order to allow precise cuts, laser microdissection systems with a laser scanning device are simpler and less expensive to produce and have precision advantages ,

Ferner erscheint einem Betrachter in Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch das Bild während des Dissektiervorgangs bewegt. Insbesondere störend ist dies, wenn die Betrachtung mit einer langsamen Kamera und einem Monitor erfolgt. Das Monitorbild verschwimmt in diesem Fall und zeigt ruckartige Veränderungen. Diesen Nachteil zeigen Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserscaneinrichtung hingegen nicht, weil der Mikroskoptisch feststeht. Furthermore, a viewer in laser microdissection systems with a microscope stage which is moved by a motor during the dissecting process, moves the image during the dissecting process. This is especially annoying when viewed with a slow camera and a monitor. The monitor image blurs in this case and shows jerky changes. By contrast, laser microdissection systems with a laser scanning device do not show this disadvantage because the microscope stage is established.

Die Laserscaneinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um die optische Achse drehbare gläserne Keilplatten auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserscaneinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs. In a particularly advantageous embodiment, the laser scanning device has two thick glass wedge plates which are inclined relative to an optical axis and can be rotated independently of one another about the optical axis, and which generate a beam deflection by means of their wedge angles. Due to the rotation of the glass wedge plates, the resulting deflection angle of the laser beam relative to the optical axis is variable. At the output of the laser scanning device, the laser beam has a lateral beam offset with respect to the optical axis due to the thickness and the oblique position of the glass wedge plates and strikes the center of the objective pupil of the microscope objective for all deflection angles.

Eine derartige Laserscaneinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserscaneinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern, Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Mikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserscaneinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 genannt. Such a laser scanning device is therefore particularly advantageous over other laser scanning devices such as mirror scanners, galvanometer scanners or stepper motor scanners because they do not have to be arranged in a plane conjugate to the objective pupil. Thus, no so-called pupil imaging is required in order to achieve that the deflected beam hits the objective pupil. In the case of microdissection with UV laser light, for example, a UV-capable pupil image would be required. Further advantages of such a laser scanning device with wedge plates are for example in the EP 1 276 586 B1 called.

Zumindest eine Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters wird unter Erzeugung von Bilddaten bildgebend erfasst. Wie eingangs erläutert, erfolgt dies in herkömmlichen Systemen dadurch, dass ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem „umfokussiert“ wird. Wie nachfolgend noch erläutert, können jedoch auch (zusätzliche) und unabhängig von dem Mikroskopobjektiv fokussierte oder fokussierbare Visualisierungskameras vorgesehen sein. At least one collecting surface of the dissected collecting container is imaged to generate image data. As explained above, in conventional systems, this is done by "refocusing" a corresponding laser microdissection system. As explained below, however, (additional) and independently of the microscope objective focused or focusable visualization cameras can be provided.

Die „Auffangfläche“ ist dabei insbesondere der Boden des Dissektatauffangbehälters. Allgemein ist eine „Auffangfläche“ eines Dissektatauffangbehälters der Bereich, auf dem ein Dissektat nach dem Heraustrennen aus dem Objekt auftrifft. The "collection surface" is in particular the bottom of the Dissektatauffangbehälters. Generally, a "collection area" of a dissectate collection container is the area on which a dissectate impacts upon removal from the object.

Ist hier von einem „Dissektatauffangbehälter“ die Rede, kann es sich auch insbesondere um einen Deckel eines bekannten Deckelgefäßes handeln, wie es üblicherweise im Labor zur Aufnahme geringer Flüssigkeitsmengen eingesetzt wird. Ein entsprechendes Deckelgefäß ist beispielsweise in der EP 1 317 961 B1 in einer speziellen Ausgestaltung gezeigt. Bei einem entsprechenden Deckelgefäß handelt es sich im Allgemeinen um ein röhrenförmiges und ggf. im unteren Bereich spitz zulaufendes Kunststoffgefäß, das eine Gefäßöffnung aufweist, die durch den genannten Deckel verschließbar ist. Der Deckel, der als Dissektatauffangbehälter dienen kann, weist einen Deckelboden und auf einer Seite des Deckelbodens mindestens einen Hohlzylinder auf, der durch die Gefäßöffnung in einen Dichtsitz an der Gefäßinnenwand einsetzbar ist. Der Deckelboden bildet damit die erwähnte Auffangfläche. Durch Umklappen des Deckels und damit Verschließen des Deckelgefäßes kann das Dissektat in das Deckelgefäß befördert werden. If this is referred to as a "dissektate collecting container", it can also be, in particular, a lid of a known lidded container, as is usually used in the laboratory for receiving small amounts of liquid. A corresponding lidded vessel is for example in the EP 1 317 961 B1 in a special Design shown. A corresponding lid vessel is generally a tubular plastic vessel, which may be tapered in the lower region, and which has a vessel opening which can be closed by said lid. The lid, which can serve as a dissected collecting container, has a lid bottom and on one side of the lid bottom at least one hollow cylinder, which can be inserted through the vessel opening into a sealing seat on the vessel inner wall. The lid base thus forms the mentioned collecting surface. By folding the lid and thus closing the lidded vessel, the dissectate can be carried into the lidded vessel.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters zu wenigstens zwei Zeitpunkten bildgebend zu erfassen, wobei die zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten miteinander verglichen werden. Die Erfindung ermöglicht damit die automatische Visualisierung von Dissektaten, die Auszählung entsprechender Dissektate, und sämtliche hieraus abgeleiteten Berechnungen und/oder Voraussagen auf einfache und bedienerfreundliche Weise. According to the invention, the collecting surface of the dissected collecting container is to be imaged at least two times, wherein the image data generated at the at least two points in time are compared with one another. The invention thus enables the automatic visualization of dissections, the enumeration of appropriate dissectates, and all calculations and / or predictions derived therefrom in a simple and user-friendly manner.

Vorteilhafterweise wird dabei die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters jeweils vor und nach dem Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt bildgebend erfasst. Dies ermöglicht eine unmittelbare Kontrolle des Dissektionsvorgangs, insbesondere wird hierdurch sichergestellt, dass eine Dissektion in der vorgegebenen Weise durchgeführt wurde. Wie ebenfalls nachfolgend erläutert, kann hierzu insbesondere ein Zählverfahren und/oder ein Vergleich von Formparametern durchgeführt werden. Advantageously, the collecting surface of the Dissektatauffangbehälters is respectively detected before and after the separation of the at least one dissected from the at least one object imaging. This allows an immediate control of the dissection process, in particular, this ensures that a dissection was performed in the specified manner. As also explained below, in particular a counting method and / or a comparison of shaping parameters can be carried out for this purpose.

In besonderer Weise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn mehrere Dissektate aus wenigstens einem Objekt herausgetrennt werden. Die Dissektate können dabei aus einem einzigen Objekt herausgetrennt werden, beispielsweise in Form mehrerer gleichartiger und/oder unterschiedlicher Zellen oder Gewebestrukturen; entsprechende Dissektate können jedoch auch aus mehreren Objekten herausgetrennt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei mittels eines Sollwertvergleichs durchgeführt werden, beispielsweise indem eine Sollanzahl von Dissektaten mit einer Istanzahl von Dissektaten, die in dem Dissektatauffangbehälter auf der Auffangfläche erfasst werden, verglichen wird. In a special way, the method according to the invention is suitable when several dissectates are separated from at least one object. The dissectates can be separated out of a single object, for example in the form of several similar and / or different cells or tissue structures; However, corresponding dissecting can also be separated out of several objects. In this case, the method according to the invention can be carried out by means of a desired value comparison, for example by comparing a desired number of dissectates with an actual number of dissectates which are detected in the dissektate collecting container on the collecting surface.

Wie eingangs erläutert, umfassen herkömmliche Verfahren die bildgebende Erfassung der Auffangfläche eines Dissektatauffangbehälters, beispielsweise dessen Bodens, unter Verwendung eines Mikroskopobjektivs, das beim Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt zur Fokussierung des Laserstrahls verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls entsprechend durchgeführt werden. Ein entsprechendes Verfahren erweist sich als besonders vorteilhaft, weil hierzu keine zusätzlichen baulichen Veränderungen an einem Lasermikrodissektionssystem erforderlich sind. As discussed above, conventional methods include imaging the collection surface of a dissectate collection container, such as its bottom, using a microscope objective used in separating the at least one dissectate from the at least one object to focus the laser beam. The method according to the invention can likewise be carried out accordingly. A corresponding method proves to be particularly advantageous because no additional structural changes to a laser microdissection system are required for this purpose.

Hierbei kann zur bildgebenden Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ein Abstand der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters zu dem Mikroskopobjektiv gegenüber einem Abstand des Dissektatauffangbehälters zu dem Mikroskopobjektiv während des Heraustrennens des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt (also während des Dissektionsvorgangs) verändert werden. Dies entspricht dem eingangs erläuterten Umfokussieren eines Lasermikrodissektionssystems. Das Umfokussieren kann vorteilhafterweise automatisch durchgeführt werden, nämlich immer dann, wenn eine bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ansteht. In Form eines automatischen Ablaufs kann dabei jeweils alternierend dissektiert und die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung der Bilddaten bildgebend erfasst werden. Die Umfokussierung erfolgt dabei vollautomatisch, wodurch ein entsprechendes Verfahren besonders anwenderfreundlich wird. Ein entsprechendes Umfokussieren kann in einem hierzu geeignet ausgebildeten Lasermikrodissektionssystem auch „eingelernt“ werden, was bedeutet, dass der Benutzer die Umfokussierung zunächst einmalig manuell vornimmt und sich das Lasermikrodissektionssystem den hierzu erforderlichen Verstellbereich bzw. Verstellbetrag „merkt“. Wie erläutert, kann ein Umfokussieren auch nach dem Heraustrennen mehrerer Dissektate aus einem oder mehreren Objekten erfolgen. In this case, for the imaging detection of the collecting surface of the Dissektatauffangbehälters a distance of the collecting surface of the Dissektatauffangbehälters to the microscope objective relative to a distance of the Dissektatauffangbehälters to the microscope objective during the separation of the at least one dissectate from the at least one object (ie during the dissection process) can be changed. This corresponds to the refocusing of a laser microdissection system explained in the introduction. The refocusing can advantageously be carried out automatically, namely whenever an imaging detection of the collecting surface of the dissektate collecting container is pending. In the form of an automatic process, it is possible in each case to dissect alternately and to record the collecting surface of the dissectate collecting container by generating the image data. The refocusing takes place fully automatically, whereby a corresponding method is particularly user-friendly. A corresponding refocusing can also be "taught-in" in a laser microdissection system designed for this purpose, which means that the user first makes the refocusing manually once and the laser microdissection system "notices" the adjustment range or adjustment required for this purpose. As discussed, refocusing may also be done after separating several dissectors from one or more objects.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren umfasst, die bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters durchzuführen, solange sich die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters außerhalb einer Schärfenebene des Mikroskopobjektivs befindet. Ein entsprechendes Mikroskopobjektiv wird, mit anderen Worten, gemäß dieser Verfahrensvariante nicht oder nur teilweise auf die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters scharf eingestellt, ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem also nicht oder nur teilweise umfokussiert. Hierbei werden naturgemäß unscharfe Bilder erhalten. Insbesondere dann, wenn durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten nur qualitative Aussagen erhalten werden sollen – beispielsweise zum Auszählen von Dissektaten – reicht eine derartige unscharfe bildgebende Erfassung jedoch gegebenenfalls aus. Auch in entsprechend unscharfen Bildern können die Dissektate zählbar erkannt werden. Ein entsprechendes Verfahren ist daher besonders zeitsparend. In derartigen Fällen kann auch eine nur teilweise Umfokussierung eines Lasermikrodissektionssystems vorgenommen werden, die gerade noch zur qualitativen Erfassung der Dissektate auf der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausreicht und dabei schneller als eine vollständige Umfokussierung ist. A particularly advantageous method comprises carrying out the imaging detection of the collecting surface of the dissected collecting container, as long as the collecting surface of the dissected collecting container is located outside a focal plane of the microscope objective. In other words, according to this variant of the method, a corresponding microscope objective is not or only partially focused on the collecting surface of the dissectate collecting container, that is, it does not or only partially refocuses a corresponding laser microdissection system. Naturally, blurry images are obtained here. In particular, if only qualitative statements are to be obtained by the comparison of the image data generated at the at least two points in time-for example, for counting dissecting data-such blurred imaging acquisition is however sufficient if necessary. Even in correspondingly blurred images, the dissected can be counted recognized. A corresponding method is therefore particularly time-saving. In such Cases can also be made only partial refocusing of a laser microdissection system, which is just sufficient for the qualitative detection of the dissected areas on the collecting surface of the Dissektatauffangbehälters and is faster than a complete refocusing.

In bestimmten Fällen können jedoch auch Verfahren vorteilhaft sein, bei denen die bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Verwendung einer oder mehrerer unabhängig von dem Mikroskopobjektiv fokussierter oder fokussierbarer Visualisierungskameras durchgeführt wird. Entsprechende Kameras sind dabei auf die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausgerichtet oder ausrichtbar. Entsprechende Kameras können, wie unten unter Bezugnahme auf die 2 und 3 noch näher erläutert, dabei öffnungsseitig eines Dissektatauffangbehälters angeordnet sein und in den Dissektatauffangbehälter „blicken“. Die Visualisierungskameras können direkt oberhalb des Dissektatauffangbehälters oder oberhalb eines Objekts, d.h. objektivseitig eines entsprechenden Objekts, angeordnet und durch das Objekt in den Dissektatauffangbehälter gerichtet sein. Besonders praktisch kann sein, hierbei eine oder mehrere Visualisierungskameras an einem Mikroskopobjektiv anzubringen. In certain cases, however, methods can also be advantageous in which the imaging detection of the collecting surface of the dissectate collecting container is carried out using one or more visualization cameras focused or focusable independently of the microscope objective. Corresponding cameras are aligned or alignable on the collecting surface of the Dissektatauffangbehälters. Corresponding cameras can, as below with reference to the 2 and 3 explained in more detail, while the opening side of a Dissektatauffangbehälters be arranged and "look" in the Dissektatauffangbehälter. The visualization cameras can be arranged directly above the dissected collecting container or above an object, ie on the objective side of a corresponding object, and directed through the object into the dissected collecting container. It may be particularly practical to attach one or more visualization cameras to a microscope objective.

Auch eine Anordnung entsprechender Visualisierungskameras bodenseitig des Dissektatauffangbehälters kann in bestimmten Fällen sinnvoll sein, weil dies eine besonders platzsparende Anordnung ermöglicht. In diesem Fall ist der Boden des Dissektatauffangbehälters vorteilhafterweise transparent ausgebildet. Der Boden des Dissektatauffangbehälters entspricht dabei der Auffangfläche. An arrangement of corresponding visualization cameras on the bottom side of the dissecting collecting container can be useful in certain cases, because this allows a particularly space-saving arrangement. In this case, the bottom of the Dissektatauffangbehälters is advantageously transparent. The bottom of the Dissektatauffangbehälters corresponds to the collection area.

Insbesondere dann, wenn eine entsprechende Visualisierungskamera auf einer optischen Achse eines Lasers bzw. des Mikroskopobjektivs angeordnet ist, kann eine Laserschutzeinrichtung vorgesehen sein. Zumindest eine der Visualisierungskameras kann beweglich ausgebildet oder durch Steuermittel ansteuerbar sein. In particular, when a corresponding visualization camera is arranged on an optical axis of a laser or of the microscope objective, a laser protection device can be provided. At least one of the visualization cameras can be designed to be movable or can be controlled by control means.

Reicht das durch ein Mikroskopobjektiv oder durch eine Visualisierungskamera erfassbare Gesichtsfeld nicht aus, um die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters vollständig zu erfassen, kann es sich als vorteilhaft erweisen, den Dissektatauffangbehälter bzw. dessen Auffangfläche abschnittsweise abzutasten. Bei der abschnittsweisen Abtastung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters erhaltene Teilbilddaten werden zu den bereits erläuterten Bilddaten zusammengesetzt. If the field of view that can be detected by a microscope objective or by a visualization camera is insufficient to completely cover the collecting area of the dissected collecting container, it may prove advantageous to scan the dissected collecting container or its collecting area in sections. Sub-picture data obtained in the section-by-section scanning of the collecting surface of the dissecting collecting container are assembled into the already explained image data.

Besonders vorteilhaft kann hierbei sein, den Dissektatauffangbehälter zum abschnittsweisen Abtasten seiner Auffangfläche entsprechend zu verschieben. Das Mikroskopobjektiv selbst bzw. eine entsprechende Visualisierungskamera braucht also nicht beweglich ausgebildet sein sondern kann fest an einem definierten Ort angebracht und auf eine Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausgerichtet werden. Dies ermöglicht eine besonders exakte Justierung. In this case, it may be particularly advantageous to displace the dissektate collecting container accordingly for scanning its collecting surface in sections. The microscope objective itself or a corresponding visualization camera therefore does not need to be designed to be movable, but can be firmly attached to a defined location and aligned with a collecting surface of the dissected collecting container. This allows a particularly accurate adjustment.

Besonders vorteilhaft ist das erläuterte Verfahren, wenn die Erzeugung der Bilddaten in Form von Pixeldaten erfolgt und der Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten durch pixelweise Subtraktion der Pixelbilddaten durchgeführt wird. Da in entsprechenden Pixelbilddaten jeder Pixel eine definierte Lage besitzt, können auf diese Weise sehr einfach Koordinaten der entsprechenden Dissektate erhalten werden. Hierdurch kann, insbesondere bei kontaktfreien Dissektionen und Sammelprozessen, ein automatisches Wiederfinden von Dissektaten ermöglicht werden. The explained method is particularly advantageous if the generation of the image data takes place in the form of pixel data and the comparison of the image data generated at the at least two times is carried out by pixel-by-pixel subtraction of the pixel image data. Since each pixel has a defined position in corresponding pixel image data, it is thus very easy to obtain coordinates of the corresponding dissectates. As a result, automatic retrieval of dissected data can be made possible, in particular in the case of non-contact dissections and collection processes.

Wie bereits erläutert, ist besonders vorteilhaft, wenn durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten eine Anzahl von Dissektaten bestimmt wird. Dies kann, wie ebenfalls erläutert, durch ein automatisches Visualisieren und Analysieren entsprechender Dissektate im Dissektatauffangbehälter bzw. dessen Auffangfläche erfolgen, indem von der gesamten Fläche des Dissektatauffangbehälters vor oder während des Dissektionsvorgangs Bilddaten erzeugt werden. Nach einem Dissektionsvorgang werden erneut über die gesamte Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters Aufnahmen gemacht und es erfolgt ein Abgleich der Aufnahmen, um somit die Auszählung automatisieren zu können. Die Anzahl an Dissektaten im Dissektatauffangbehälter kann durch Auszählen der Pixel eines entsprechenden Abgleichs, wie zuvor erläutert, automatisch erfolgen. As already explained, it is particularly advantageous if a number of dissected data is determined by comparing the image data generated at the at least two points in time. This may, as also explained, be accomplished by automatically visualizing and analyzing appropriate dissectates in the dissectate collection container or its collection surface by generating image data from the entire surface of the dissectate collection container prior to or during the dissection process. After a dissection process, recordings are made again over the entire collecting area of the dissektate collecting container and the images are adjusted in order to be able to automate the counting. The number of dissections in the dissektate catcher can be done automatically by counting the pixels of a corresponding match, as previously explained.

In besonderer Weise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren, wenn eine Sollanzahl von Dissektaten vorgegeben wird und aus dem wenigstens einen zu dissektierenden Objekt so lange mittels des Laserstrahls Dissektate herausgetrennt werden, bis auf Grundlage der Bestimmung der Anzahl von Dissektaten festgestellt wird, dass die Sollanzahl von Dissektaten erreicht ist. Für bestimmte biochemische Verfahren, beispielsweise Enzymaktivitätsbestimmungen oder die PCR, ist eine Mindestmenge an Material erforderlich, das durch die Lasermikrodissektion gewonnen werden kann, und das beispielsweise als Mindestanzahl von Dissektaten vorgegeben wird. Die vorliegende Erfindung ermöglicht in einfacher Weise, diese Anzahl an Dissektaten zu bestimmen und ein Verfahren exakt so lange durchzuführen, bis eine entsprechende Mindestanzahl erreicht ist. Dies ermöglicht eine automatische Gewinnung von Dissektatmaterial, bei der auch eine automatische Dissektion mit entsprechender automatischer Erkennung von Zielzellen und dergleichen in einem mikroskopischen Objekt erfolgen kann. The method according to the invention is particularly suitable when a desired number of dissectates is predetermined and from which at least one object to be dissected is separated out by means of the laser beam until, on the basis of the determination of the number of dissectates, it is established that the desired number of dissected data is reached. Certain biochemical methods, such as enzyme activity determinations or PCR, require a minimum amount of material that can be obtained by laser microdissection, for example, given as a minimum number of dissections. The present invention makes it possible in a simple manner to determine this number of dissecting data and to carry out a method exactly until a corresponding minimum number has been reached. This allows automatic extraction of dissecting material, which also includes automatic dissection with appropriate automatic detection of target cells and the like can be done in a microscopic object.

Vorteilhafterweise umfasst der Vergleich bzw. die bildgebende Erfassung des wenigstens einen Dissektats die Bestimmung von Formparametern. Hierdurch kann beispielsweise eine Vollständigkeit einer Dissektion verifiziert werden. Wird beispielsweise mittels einer Sollschnittlinie ein Dissektat mit bestimmter Form vorgegeben, kann verifiziert werden, dass dieses Dissektat vollständig aus dem Objekt ausgeschnitten wurde, indem überprüft wird, ob ein Dissektat mit entsprechender Form auf der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters wiedergefunden wird. Advantageously, the comparison or the imaging detection of the at least one dissectate comprises the determination of shape parameters. In this way, for example, a completeness of a dissection can be verified. If, for example, a dissectate having a specific shape is predefined by means of a desired cutting line, it can be verified that this dissectate has been completely cut out of the object by checking whether a dissected article of the appropriate shape is found again on the collecting surface of the dissected collecting vessel.

Hierbei besteht auch die vorteilhafte Möglichkeit, anhand von Koordinaten des Dissektats im Gewebeverband, d.h. in einem Objekt, die während eines Markierens und Dissektierens gespeichert werden können, und der Koordinaten auf der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters, beispielsweise in Form eines Vorher-Nachher-Abgleichs, eine ordnungsgemäße Dissektion zu verifizieren. Dies ist beispielsweise bei Lebendzellanwendungen zur Rekultivierung dissektierter Zellen von Bedeutung, um Mindestabstände von lebenden Zellen zu gewährleisten, die für die Rekultivierung Nachbarzellen brauchen. In this case, there is also the advantageous possibility, based on coordinates of the dissected tissue in the tissue, i. in an object, which can be stored during marking and dissecting, and the coordinates on the collecting surface of the dissected collecting container, for example in the form of a before-after-adjustment, to verify a proper dissection. This is of importance, for example, in living cell applications for recultivation of dissected cells in order to ensure minimum clearances of living cells which need neighboring cells for recultivation.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist die Flexibilität des vorgeschlagenen Verfahrens. Beispielsweise kann zur Schnellauswertung (Auszählung), insbesondere bei großen Dissektaten mit guter Erkennbarkeit auch in unscharfen Bildern, ohne ein Nachfokussieren rasch bestimmt werden, ob eine ausreichende Anzahl von Dissektaten vorliegt. Bei kleinen Dissektaten (z.B. Bakterien, Chromosomen oder Einzelzellen mit beispielsweise weniger als 20 µm im Durchmesser) und bei unebenen Auffangbehältern, beispielsweise bei Deckeln der erläuterten Deckelgefäße, welche i.d.R. zwei Ebenen aufweisen, kann hingegen ein Nachfokussieren erfolgen. Dies ermöglicht eine besonders detaillierte Auswertung. Dem Anwender können softwareseitig beispielsweise die zwei erläuterten Möglichkeiten vorgeschlagen werden oder es wird je nach verwendetem Objektiv bzw. Dissektatdurchmesser und dem jeweiligen Dissektatauffangbehälter automatisch das geeignete Verfahren (mit oder ohne Nachfokussieren) ausgewählt. In einer nachgeschalteten Bildverarbeitungseinrichtung können beispielsweise farbliche Unterschiede von Dissektaten erkannt und/oder auf dieser Basis oder auf Basis der Dissektatgröße eine Einteilung nach vorgenommen werden. An essential advantage of the invention is the flexibility of the proposed method. For example, for rapid evaluation (counting), in particular in the case of large dissectates with good visibility even in blurred images, it is possible to quickly determine without refocusing whether there is a sufficient number of dissected data. For small dissected specimens (e.g., bacteria, chromosomes, or single cells of, for example, less than 20 microns in diameter) and uneven containment vessels, such as lids of the illustrated capped vessels, which are i.d.R. have two levels, however, can be done refocusing. This allows a particularly detailed evaluation. For example, the software can be used to propose the user the two explained options or, depending on the lens or dissecting diameter used and the respective dissector collecting container, the appropriate method (with or without refocusing) is automatically selected. In a downstream image processing device, for example, color differences of dissecting data can be recognized and / or a classification can be made on this basis or on the basis of the dissectate size.

Die vorliegende Erfindung und Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. The present invention and embodiments of the invention will be explained below with reference to the accompanying drawings.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Brief description of the drawings

1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann. 1 shows a laser microdissection system that can be used to carry out a method according to the invention.

2 zeigt Details eines Lasermikrodissektionssystems gemäß 1 in einer ersten Ausführungsform in schematischer Darstellung. 2 shows details of a laser microdissection system according to 1 in a first embodiment in a schematic representation.

3 zeigt Details eines Lasermikrodissektionssystems gemäß 1 in einer zweiten Ausführungsform in schematischer Darstellung. 3 shows details of a laser microdissection system according to 1 in a second embodiment in a schematic representation.

4 zeigt Bilddaten, die in einem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erhalten werden können, in schematischer Darstellung. 4 Fig. 12 schematically shows image data that can be obtained in a method according to an embodiment of the invention.

5 zeigt Bilddaten, die in einem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erhalten werden können, in schematischer Darstellung. 5 Fig. 12 schematically shows image data that can be obtained in a method according to an embodiment of the invention.

In den Figuren werden einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und nicht wiederholt erläutert. In the figures, corresponding elements are given identical reference numerals and are not explained repeatedly.

Ausführungsform(en) der Erfindung Embodiment (s) of the invention

In 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. In 1 is a laser microdissection system, which can be used to carry out a method according to the invention, shown schematically and in total with 100 designated. The laser microdissection system 100 corresponds in essential parts to that in the EP 1 276 586 B1 is disclosed, which is incorporated herein by reference.

Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem Mikroskopfuß 11 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Das Lasermikrodissektionssystem 100 ist im dargestellten Beispiel als Aufrechtsystem 100 ausgebildet, kann in gleicher Weise jedoch auch als inverses Lasermikrodissektionssystem ausgebildet sein. Die Beleuchtungseinrichtung 12 kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. The laser microdissection system 100 includes a microscope 10 , In a microscope head 11 of the microscope 10 may be a partially illustrated illumination device 12 be provided. The laser microdissection system 100 is in the example shown as an upright system 100 formed, however, may be formed in the same way as an inverse laser microdissection system. The lighting device 12 For example, it may comprise a light source (not shown) and suitable means for influencing the illumination light provided by the light source, for example filters and / or diaphragms.

Am Mikroskopfuß 11 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungs- und/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann. At the microscope head 11 For example, also a user input and / or user information unit 13 arranged, which may be formed, for example, as a touch screen, and via which the user can enter and / or read, for example, viewing and / or editing parameters.

Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Ein Objekt 51, das sich auf einem Objektträger (hier ohne Bezeichnung) auf einer Dissektatauffangeinrichtung 50 befindet, beispielsweise ein auf dem Objektträger aufgebrachter Schnitt, kann hierdurch in eine Schärfenebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Zur Durchlichtbeleuchtung der Probe und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren dient eine Kondensoreinheit 20. Furthermore, a drive knob 14 intended. This serves to operate a coarse and a fine drive for setting a height of a microscope stage 30 , An object 51 resting on a slide (here without designation) on a dissector catcher 50 For example, a cut applied to the slide may thereby be in a focus plane of an objective 41 to be brought. For transparent illumination of the sample and for setting appropriate contrast or observation method is a condenser unit 20 ,

Bei inversen Lasermikrodissektionssystemen ist die Anordnung der erläuterten Komponenten bekanntermaßen umgekehrt, d.h. die Beleuchtungseinrichtung 12 befindet sich oben, das Objektiv 41 unten. In inverse laser microdissection systems, the arrangement of the explained components is known to be reversed, ie the illumination device 12 is up, the lens 41 below.

Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist die bereits erwähnte und in den nachfolgenden Figuren näher veranschaulichte Dissektatauffangeinrichtung 50 auf, mittels derer Dissektate des Objekts 51 aufgefangen werden können. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein. The laser microdissection system 100 has the already mentioned and illustrated in more detail in the following figures Dissektatauffangseinrichtung 50 on, by means of which dissectates of the object 51 can be caught. The objective 41 is next to other lenses 42 in a nosepiece 40 attached. To protect against laser radiation, a protective hood 15 be provided.

Von dem Objekt 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang einem Beobachtungsstrahlengang a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des Beobachtungslichts gelangt in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 und kann dort bildgebend erfasst werden. From the object 51 outgoing observation light runs along an observation beam path a. In a tube unit 60 with suitable decoupling devices 61 a preferably variable portion of the observation light, for example, by 60 °, and coupled by means of an eyepiece pair 62 presented to a user. Another portion of the observation light enters a digital image acquisition unit 63 and can be captured there by imaging.

Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf das Objekt 51 fokussiert. The laser microdissection system 100 has a laser unit 70 with a laser light source 75 on. A through the laser light source 75 , which may be, for example, a UV laser light source, provided laser beam b is in a Auflichteinheit, here with a total of 76 is indicated at a first deflection mirror 71 and a second deflecting mirror 72 deflected and through the lens 41 on the object 51 focused.

Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl b auf das Objekt 51 auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Verstelleinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Verstelleinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann. In the laser microdissection system 100 may be the location where the laser beam b is on the object 51 impinges, basically be set in different ways. On the one hand, a manual adjustment 31 be provided by means of which designed as a cross table microscope stage 30 in x- and y-direction (ie here perpendicular or parallel to the paper plane) can be adjusted. In addition to the adjustment 31 can also be provided electromechanical actuating means, for example, by a control unit 82 controlled or their position by the control unit 82 can be detected.

Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere Funktionen des Lasermikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81, der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Insbesondere sind der Steuerrechner 81 und/oder die Steuereinheit 82 zur Erfassung von Bildern eingerichtet, die mittels einer digitaloptischen Erfassungseinheit 63 und/oder mittels Visualisierungskameras 91 bis 95 (siehe 2 und 3) erhalten werden können. The control unit 82 can also be any other functions of the laser microdissection system 100 control and in particular an interface to an external control computer 81 who has appropriate connections 83 be tethered. In particular, the control computer 81 and / or the control unit 82 set up for the acquisition of images by means of a digital optical detection unit 63 and / or by means of visualization cameras 91 to 95 (please refer 2 and 3 ) can be obtained.

Für die Lasermikrodissektion kann jedoch insbesondere eine Laserscaneinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserscaneinrichtung 73 kann der Laserstrahl b auch gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf das Objekt 51 fokussiert. Eine entsprechende Ablenkung mittels einer Laserscaneinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls b bzw. zur Positionierung des Objekts 51 gegenüber dem Laserstrahl b zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt. For laser microdissection, however, it is possible in particular to use a laser scanning device 73 be provided. By means of the laser scanning device 73 the laser beam b may also be opposite one between the first deflection mirror 71 and the second deflecting mirror 72 extending optical axis c are deflected. The laser beam can therefore at different positions on the second deflection mirror 72 impinge, which may be formed, for example, as a dichromatic divider, and is thus also in different positions on the object 51 focused. A corresponding deflection by means of a laser scanning device 73 is in the detail in the EP 1 276 586 B1 shown. It should be emphasized that different possibilities for deflecting a laser beam b or for positioning the object 51 can be used with respect to the laser beam b. The invention is not limited to the illustrated example.

Im dargestellten Beispiel weist die Laserscaneinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Rotationseinrichtungen 734 gedreht werden. Die Rotationseinrichtungen 734 können manuell und/oder mittels geeigneter elektromechanischer Vorrichtungen, beispielsweise mittels Schrittmotoren, in eine Drehbewegung versetzt werden und hierüber die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen 734 können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an der rechten Rotationseinrichtung 734 gezeigt). Eine hierdurch erfasste Position kann an die Steuereinheit 80 übermittelt werden. In the example shown, the laser scanning device 73 two massive glass wedge plates 731 which are inclined against the optical axis c and are rotatable independently of each other about the optical axis c. These are the wedge plates 731 with ball bearings 732 stored. Each of the wedge plates is with a gear 733 connected. The gears 733 can each by means of rotation devices 734 to be turned around. The rotation devices 734 can be rotated manually and / or by means of suitable electromechanical devices, for example by means of stepper motors in a rotary motion and the gear wheels 733 drive. The rotation devices 734 can via position providers 735 have (here only at the right rotation device 734 shown). A position detected thereby can be sent to the control unit 80 be transmitted.

In 2 ist ein Querschnitt durch den Mikroskoptisch 30 mit der darauf angebrachten Probenauffangeinrichtung 50 in einer durch die optische Achse des Beobachtungsstrahlengangs a und die x-Richtung (senkrecht zur Papierebene der 1) aufgespannten Ebene dargestellt. In 2 is a cross section through the microscope stage 30 with the sample catcher mounted thereon 50 in a through the optical axis of the observation beam path a and the x-direction (perpendicular to the plane of the paper 1 ) spanned level shown.

Der Mikroskoptisch 30 weist eine feststehende Basisplatte 34 auf, auf der eine in y-Richtung (also senkrecht zur Papierebene) verfahrbare Platte 32 angeordnet ist. Die verfahrbare Platte 32 definiert eine Tischoberfläche (ohne Bezeichnung) des Mikroskoptischs 30. Die verfahrbare Platte 32 ist gegenüber der feststehenden Basisplatte 34 mittels einer geeigneten Einrichtung, beispielsweise unter Verwendung von Lagerkugeln 33, verschiebbar. Zum wechselseitigen Verschieben der feststehenden Basisplatte 34 und der verfahrbaren Platte 32 kann die bereits erläuterte Verstelleinrichtung 31 verwendet werden. Ist hier davon die Rede, dass die feststehende Basisplatte 34 „feststeht“, bezieht sich dies nur auf ihre Position gegenüber der verfahrbaren Platte 32. Die „feststehende“ Basisplatte 34 kann auch ihrerseits – in x-Richtung – gegenüber einer weiteren Platte des Mikroskoptischs 30 verschoben und – in z-Richtung – in ihrer Höher verstellt werden. The microscope stage 30 has a fixed base plate 34 on, on the one in the y-direction (that is perpendicular to the paper plane) movable plate 32 is arranged. The movable plate 32 defines a table surface (without designation) of the microscope stage 30 , The movable plate 32 is opposite the fixed base plate 34 by means of a suitable device, for example using bearing balls 33 , movable. For moving the fixed base plate alternately 34 and the movable plate 32 can the already explained adjustment 31 be used. Here it is mentioned that the fixed base plate 34 "Fixed", this refers only to their position relative to the movable plate 32 , The "fixed" base plate 34 can in turn - in the x direction - against another plate of the microscope stage 30 moved and - in z-direction - be adjusted in their higher.

Auf der Tischoberfläche des Mikroskoptischs 30 ist ein Dissektatauffangbehälter 55 mit einer Wand 552 und einem Boden 551 angeordnet, der ggf. mit einer geeigneten Verstelleinrichtung (vgl. 3) verschoben werden kann. Der Dissektatauffangbehälter 55 kann jedoch auch manuell in einem freien Arbeitsraum 54 der Dissektatauffangeinrichtung 50 bewegt werden. Bei dem Dissektatauffangbehälter 55 kann es sich auch, wie erläutert, um einen Deckel eines bekannten Deckelgefäßes handeln, der in der Dissektatauffangeinrichtung 50 eingespannt werden kann. On the table surface of the microscope stage 30 is a dissectate collection container 55 with a wall 552 and a floor 551 arranged, if necessary, with a suitable adjusting device (see. 3 ) can be moved. The Dissektatauffangbehälter 55 However, it can also be done manually in a free workspace 54 the dissektate catcher 50 to be moved. At the dissektate catcher 55 it may also be, as explained, a lid of a known lidded vessel, which in the Dissektatauffangseinrichtung 50 can be clamped.

Der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 stellt hier die Dissektatauffangfläche 551 des Dissektatauffangbehälters 55 dar. Die Erfindung kann jedoch auch bei Dissektatauffangbehältern 55 zum Einsatz kommen, bei denen die Dissektatauffangfläche 551 des Dissektatauffangbehälters 55 nicht dessen Boden 551 entspricht. Der Einfachheit halber ist nachfolgend jedoch von einem „Boden“ 551 des Dissektatauffangbehälters 55 die Rede. The floor 551 of the dissectate catcher 55 here represents the dissectate collection area 551 of the dissectate catcher 55 However, the invention can also be used with dissectate collection containers 55 are used, in which the Dissektatauffangfläche 551 of the dissectate catcher 55 not its bottom 551 equivalent. For the sake of simplicity, however, below is a "bottom" 551 of the dissectate catcher 55 the speech.

Die Probenauffangeinrichtung 50 weist ein Trägerelement 53 auf, auf das ein Objektträger 52 aufgelegt werden kann. Das Objekt 51 ist an der Unterseite des Objektträgers 52 angebracht. Der Objektträger 52 wird vorteilhafterweise so positioniert, dass sich das Objekt 51 vollständig in dem freien Arbeitsraum 54 befindet. Eine Höhe 541 des freien Arbeitsraums 54 kann durch Verstellmittel verstellbar ausgebildet sein und/oder durch Abstandshalter (nicht gezeigt) festgelegt sein. The sample collector 50 has a carrier element 53 on top of that a slide 52 can be hung up. The object 51 is at the bottom of the slide 52 appropriate. The slide 52 is advantageously positioned so that the object 51 completely in the free working space 54 located. A height 541 of the free work space 54 may be adjustable by adjusting means and / or be defined by spacers (not shown).

Das Mikroskopobjektiv 41 ist auf der optischen Achse des Beobachtungsstrahlengangs a (hier, wie in 1, strichpunktiert dargestellt) dem Objektträger 52 zugewandt und erzeugt über eine entsprechende Linsenanordnung (ohne Bezeichnung) ein Bild des Objekts 51. Das Objekt 51 befindet sich hierzu in einer Brennebene des Mikroskopobjektivs 41. The microscope objective 41 is on the optical axis of the observation beam path a (here, as in FIG 1 , shown in phantom) to the slide 52 facing and generated via a corresponding lens assembly (no name) an image of the object 51 , The object 51 is located for this purpose in a focal plane of the microscope objective 41 ,

Ferner wird durch das Mikroskopobjektiv 41 ein wie zu 1 erläutert eingekoppelter Laserstrahl b auf das Objekt 51 fokussiert, um aus dem Objekt 51 ein entsprechendes Dissektat auszuschneiden. Der Dissektatauffangbehälter 55 ist derart unter dem Objekt 51 angeordnet, dass das Dissektat aufgrund der Schwerkraft in diesen herabfällt. Die Anzahl der Dissektatauffangbehälter 55, die, wie in der nachfolgenden 3 dargestellt, auch an einem gemeinsamen Dissektatauffangbehälterträger 56 angeordnet sein können, kann an die Erfordernisse, beispielsweise die Anzahl der zu gewinnenden Dissektate, angepasst werden. Further, through the microscope objective 41 a how to 1 explains coupled laser beam b on the object 51 focused to get out of the object 51 to cut out a corresponding dissectate. The Dissektatauffangbehälter 55 is so under the object 51 arranged that the dissectate falls down due to gravity in this. The number of dissektate receptacles 55 that, as in the following 3 shown, also on a common Dissektatauffangbehälterträger 56 can be arranged, can be adapted to the requirements, such as the number of dissectants to be won.

Im dargestellten Beispiel ist der freie Arbeitsraum 54 derart dimensioniert (vgl. Höhe 541), dass in dem freien Arbeitsraum 54 eine Visualisierungskamera 91 angeordnet werden kann. Die Visualisierungskamera 91 ist derart positioniert, dass sie vorzugsweise den gesamten Boden des Dissektatauffangbehälters 55 (vgl. Beobachtungskegel 911) erfassen kann. Ist dies, beispielsweise aus Platzgründen, nicht möglich, kann eine entsprechende Visualisierungskamera 91 den Boden des Dissektatauffangbehälters 55 auch nur teilweise erfassen, wobei vorzugsweise ein vollständiges Bild des Bodens des Dissektatauffangbehälters 55 durch Aneinanderfügen von Einzelbildern (sogenanntes Stitching) erhalten wird. Auch mehrere Visualisierungskameras 91 zur Erfassung von Teilbereichen können vorgesehen sein. Die Visualisierungskamera 91 kann beweglich ausgebildet sein, wobei entsprechende (nicht dargestellte) Stellmittel vorgesehen sein können. Die Visualisierungskamera 91 ist jedoch zumindest justierbar, um jeweils eine möglichst vollständige Erfassung des Bodens des Dissektatauffangbehälters 55 zu ermöglichen. In the example shown, the free working space 54 dimensioned in this way (compare Height 541 ) that in the free work space 54 a visualization camera 91 can be arranged. The visualization camera 91 is positioned such that it preferably covers the entire bottom of the dissectate collection container 55 (see observation cone 911 ). If this is not possible, for example for reasons of space, a corresponding visualization camera can be used 91 the bottom of the dissectate catcher 55 also only partially capture, preferably a complete image of the bottom of the Dissektatauffangbehälters 55 by joining individual images (so-called stitching) is obtained. Also several visualization cameras 91 for detecting partial areas can be provided. The visualization camera 91 can be designed to be movable, wherein corresponding (not shown) actuating means can be provided. The visualization camera 91 However, it is at least adjustable, in each case as complete as possible detection of the bottom of the Dissektatauffangbehälters 55 to enable.

Zum Weiterleiten der mittels der Visualisierungskamera 91 erhaltenen Bilder ist eine entsprechende Leitung 84 vorgesehen. Mittels der Leitung 84 können die Bilder der Visualisierungskamera 91 in jeglicher Form, die die Visualisierungskamera 91 bereitstellt, weitergeleitet werden. Beispielsweise kann die Weiterleitung in Form von Analog- und/oder Digitalsignalen und/oder mittels eines geeigneten Übertragungsprotokolls erfolgen. Beispiele für geeignete Übertragungsprotokolle bzw. -formate sind USB und/oder mJPEG. Um eine möglichst kleine Ausbildung der Visualisierungskamera 91 zu ermöglichen, kann diese nur mit minimalen Bildaufbereitungsmitteln versehen sein. Alternativ kann die Visualisierungskamera 91 eine Bildaufbereitung (z.B. Schärfung) in gewissem Umfang durchführen. To forward the by means of the visualization camera 91 pictures received is a corresponding line 84 intended. By means of the line 84 can use the images of the visualization camera 91 in any form, the visualization camera 91 provides, be forwarded. For example, the forwarding in the form of analog and / or digital signals and / or by means of a suitable transmission protocol. Examples of suitable transmission protocols or formats are USB and / or mJPEG. To minimize the training of the visualization camera 91 this can only be provided with minimal image processing means. Alternatively, the visualization camera 91 perform image processing (eg sharpening) to a certain extent.

Der Dissektatauffangbehälter 55, beispielsweise an einem entsprechenden Dissektatauffangbehälterträger 56, ist gegenüber der Visualisierungskamera 91 beweglich. Jeweils ein Dissektatauffangbehälter 55, bzw. dessen Boden, kann daher in den Erfassungskegel 911 der Visualisierungskamera 91 verschoben werden. The Dissektatauffangbehälter 55 , for example at a corresponding Dissektatauffangbehälterträger 56 , is opposite the visualization camera 91 movable. In each case a Dissektatauffangbehälter 55 , or its bottom, can therefore in the detection cone 911 the visualization camera 91 be moved.

Wie erläutert, eignet sich die vorliegende Erfindung sowohl für Aufrecht- als auch für Inverssysteme. In Ansicht A der 4 ist ein entsprechendes Inverssystem dargestellt. Dieses entspricht im Wesentlichen jenem der Hauptansicht, wobei jedoch die Anordnung des Mikroskopobjektivs 51, des Objektträgers 52 mit dem daran angebrachten Objekt 51, des Dissektatauffangbehälters 55 und der Visualisierungskamera 91 um 180° in Bezug auf die Horizontale gedreht ist. In derartigen Inverssystemen wird ein Dissektat aus dem Objekt 51 durch die Wirkung des Laserstrahls b herausgeschleudert. Der Boden des Dissektatauffangbehälters 55 ist hierbei vorzugsweise mit einer adhäsiven Beschichtung versehen, so dass ein Dissektat am Boden des Dissektatauffangbehälters 55 anhaften kann. As explained, the present invention is suitable for both upright and inverse systems. In view A of the 4 a corresponding Inverssystem is shown. This corresponds essentially to that of the main view, but the arrangement of the microscope objective 51 , the slide 52 with the attached object 51 , the dissektate catcher 55 and the visualization camera 91 rotated by 180 ° with respect to the horizontal. In such Inverssystemen is a dissectate from the object 51 ejected by the action of the laser beam b. The bottom of the Dissektatauffangbehälters 55 is here preferably provided with an adhesive coating, so that a dissectate at the bottom of Dissektatauffangbehälters 55 can adhere.

In 3 ist ein entsprechender Schnitt durch einen Mikroskoptisch 30 mit einer darauf angeordneten Probenauffangeinrichtung 50 gemäß einer weiteren Ausführungsform dargestellt. Die Schnittebene entspricht jener der 2. In 3 is a corresponding section through a microscope stage 30 with a sample catcher disposed thereon 50 shown according to another embodiment. The sectional plane corresponds to that of 2 ,

In dem dargestellten Beispiel sind an der feststehenden Basisplatte 34 zwei Halteelemente 57, von denen nur das linke Halteelement 57 mit einem Bezugszeichen versehen ist, befestigt. Die Halteelemente 57 tragen eine Kontaminationsschutzplatte 58, die zwischen dem Trägerelement 53 und dem Dissektatauffangbehälter 55, der hier zusammen mit weiteren Dissektatauffangbehältern 55 an einem Dissektatauffangbehälterträger 56 angebracht ist, feststeht. Die Kontaminationsschutzplatte 58 überspannt vorteilhafterweise die gesamte Tischoberfläche des Mikroskoptischs 30 und begrenzt damit den freien Arbeitsraum 54 nach oben. Die Kontaminationsschutzplatte 58 ist mit einem Ausschnitt 581 um die optische Achse des Beobachtungsstrahlengangs a versehen. In the example shown are on the fixed base plate 34 two retaining elements 57 of which only the left retaining element 57 is provided with a reference numeral attached. The holding elements 57 wear a contamination protection plate 58 between the carrier element 53 and the dissectate catcher 55 that comes along with more dissektate receptacles 55 on a dissektate receptacle carrier 56 is fixed. The contamination protection plate 58 advantageously spans the entire table surface of the microscope stage 30 and thus limits the free working space 54 up. The contamination protection plate 58 is with a cutout 581 provided around the optical axis of the observation beam path a.

Jeweils ein Dissektatauffangbehälter 55 des Dissektatauffangbehälterträgers 56, beispielsweise jeweils eine Vertiefung einer bekannten Mikrotiterplatte, kann unterhalb des Ausschnitts 581 angeordnet werden. Durch die Kontaminationsschutzplatte 58 wird verhindert, dass Staub oder andere Partikel aus der Umgebungsluft in die Dissektatauffangbehälter 55 fallen. Ferner wird verhindert, dass Dissektate des Objekts 51 in einen „falschen“ Dissektatauffangbehälter 55 fallen, wenn sie durch die Wirkung des Laserstrahls b aus dem Objekt 51 herausgeschleudert werden. Mit anderen Worten werden, bis auf den jeweils gewünschten Dissektatauffangbehälter 55, sämtliche anderen Dissektatauffangbehälter 55 durch die Kontaminationsschutzplatte 58 verschlossen. Dies ermöglicht die Verwendung der erläuterten Mikrotiterplatten, die eine einfache und kostengünstige Lösung zum Auffangen von Dissektaten darstellen. In each case a Dissektatauffangbehälter 55 of the dissectate container carrier 56 , For example, in each case a well of a known microtiter plate, can below the section 581 to be ordered. Through the contamination protection plate 58 Prevents dust or other particles from the ambient air from entering the dissecting receptacle 55 fall. It also prevents dissecting the object 51 in a "wrong" Dissektatauffangbehälter 55 fall, if by the action of the laser beam b from the object 51 be thrown out. In other words, with the exception of the desired dissected collecting container 55 , all other dissecting containers 55 through the contamination protection plate 58 locked. This allows the use of the illustrated microtiter plates, which are a simple and cost-effective solution for collecting dissectates.

Eine Verstellvorrichtung 59 kann mit dem Dissektatauffangbehälterträger 56 verbunden werden, wobei ein entsprechendes Eingriffselement 591 vorgesehen sein kann. Die Verstelleinrichtung 59 kann manuell bedient werden, weist vorzugsweise jedoch einen entsprechenden Motor auf, mittels dessen das Eingriffselement 591 und der daran befestigte Dissektatauffangbehälterträger 56 verfahren werden kann. Die Verstellvorrichtung 59 ist hierzu über eine entsprechende Verbindung 83 mit einem Rechner, beispielsweise dem erläuterten Steuerrechner 81, verbunden. Der Steuerrechner 81 verschiebt über die Verstelleinrichtung 59 den Dissektatauffangbehälterträger 56 derart, dass sich jeweils der gewünschte Dissektatauffangbehälter 55 unter dem Ausschnitt 581 und damit unter dem Bereich des Objekts 51 befindet, der mittels des Laserstrahls b bearbeitet wird. Nachdem jeweils ein Lasermikrodissektionsvorgang abgeschlossen ist, fällt das entsprechende Dissektat aufgrund der Schwerkraft in den Dissektatauffangbehälter 55. Der Steuerrechner 81 wird dann, falls erforderlich, einen anderen oder leeren Dissektatauffangbehälter 55 entsprechend positionieren, um damit ein oder mehrere neue Dissektate aufzufangen. An adjusting device 59 can with the Dissektatauffangbehälterträger 56 be connected, wherein a corresponding engagement element 591 can be provided. The adjusting device 59 can be operated manually, but preferably has a corresponding motor, by means of which the engagement element 591 and the dissektate receptacle carrier attached thereto 56 can be moved. The adjusting device 59 is this via a corresponding connection 83 with a computer, for example, the explained control computer 81 , connected. The control computer 81 moves over the adjustment 59 the Dissektatauffangbehälterträger 56 such that in each case the desired Dissektatauffangbehälter 55 under the neckline 581 and thus below the area of the object 51 which is processed by means of the laser beam b. After each laser microdissection procedure is completed, the corresponding dissectate falls into the dissektate catcher due to gravity 55 , The control computer 81 then, if necessary, another or empty dissecting receptacle 55 position accordingly to catch one or more new dissectates.

Auch entsprechend der in 3 gezeigten Ausführungsform können Visualisierungskameras, hier mit 92 bis 95 bezeichnet, vorgesehen sein. Auch hier kann die in der 3 dargestellte Anordnung zum Einsatz kommen, d.h. eine Visualisierungskamera kann oberhalb des Dissektatauffangbehälters 55 angebracht werden. Ferner kann vorgesehen sein, eine Visualisierungskamera 92 unterhalb eines Dissektatauffangbehälters 55 bzw. eines entsprechenden Dissektatauffangbehälterträgers 56 (mit transparentem Boden) anzubringen. Also according to the in 3 shown embodiment, visualization cameras, here with 92 to 95 designated, be provided. Again, the in the 3 shown arrangement used, ie a visualization camera can above the Dissektatauffangbehälters 55 be attached. Furthermore, it can be provided, a visualization camera 92 below a dissectate catcher 55 or a corresponding Dissektatauffangbehenträgererträgers 56 (with transparent floor) to install.

Die Visualisierungskamera 92 und auch die weiteren Visualisierungskameras 93 bis 95 der 5 sind über entsprechende Leitungen 84 (nur bei Visualisierungskamera 92 gezeigt) an den Steuerrechner 81 angebunden. The visualization camera 92 and also the other visualization cameras 93 to 95 of the 5 are via appropriate lines 84 (only with visualization camera 92 shown) to the control computer 81 tethered.

Die Anordnung der Visualisierungskamera 93 entspricht im Grundsatz der Anordnung der Visualisierungskamera 91 aus 2. Die Visualisierungskamera 93 ist im Bereich des Ausschnitts 581 der Kontaminationsschutzplatte 58 angeordnet. Es kann auch vorgesehen sein, die Visualisierungskamera 93 in der dargestellten Ausrichtung oberhalb der Kontaminationsschutzplatte 58 anzuordnen. Die Kontaminationsschutzplatte 58 kann transparent ausgebildet sein und/oder transparent ausgebildete Bereiche aufweisen. The arrangement of the visualization camera 93 corresponds in principle to the arrangement of the visualization camera 91 out 2 , The visualization camera 93 is in the area of the clipping 581 the contamination protection plate 58 arranged. It can also be provided, the visualization camera 93 in the illustrated orientation above the contamination protection plate 58 to arrange. The contamination protection plate 58 may be transparent and / or have transparent trained areas.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann auch eine Visualisierungskamera 94 in oder an einem Mikroskopobjektiv 41 angebracht werden. Die Visualisierungskamera 94 kann fest in das Mikroskopobjektiv 41 integriert und/oder, beispielsweise durch eine geeignete Aufsteckhülse 941, reversibel an dieses angebracht werden. Die Visualisierungskamera 94 ermöglicht es, bei ausreichender Transparenz des Objekts 51 den Boden des Dissektatauffangbehälters 55 durch den Objektträger 52 und das Objekt 51 hindurch zu erfassen. Ist eine ausreichende Transparenz des Objekts 51 nicht gegeben, kann der Boden des Dissektatauffangbehälters 55 dennoch erfasst werden, nämlich dann, wenn durch den Laserstrahl b und durch das Ausschneiden des entsprechenden Dissektats, ein ausreichend großes Fenster in dem Objekt 51 geschaffen wird. According to another embodiment, a visualization camera can also be used 94 in or on a microscope lens 41 be attached. The visualization camera 94 can firmly into the microscope lens 41 integrated and / or, for example by a suitable slip-on 941 , reversibly attached to this. The visualization camera 94 allows, with sufficient transparency of the object 51 the bottom of the dissectate catcher 55 through the slide 52 and the object 51 through. Is sufficient transparency of the object 51 not given, the bottom of the dissectate catcher can 55 nevertheless be detected, namely, when, by the laser beam b and by the excision of the corresponding dissect, a sufficiently large window in the object 51 is created.

Die dargestellten Ausführungsbeispiele sind nicht auf die Verwendung nur einer Visualisierungskamera 91 bis 95 beschränkt. Beispielsweise kann zu einer Überprüfung von Dissektaten in einem Dissektatauffangbehälter 55 außeraxial der optischen Achse des Beobachtungsstrahlengangs a eine Visualisierungskamera 95 vorgesehen sein, die eine Erfassung von Dissektaten in momentan nicht unterhalb des Ausschnitts 581 positionierten Dissektatauffangbehältern 55 ermöglicht. Dies ermöglicht beispielsweise eine parallele Auswertung von Lasermikrodissektionsvorgängen, bei der die Bearbeitung des Objekts 51 nicht unterbrochen werden muss und/oder einen Vorher-Nachher-Vergleich. The illustrated embodiments are not limited to the use of only one visualization camera 91 to 95 limited. For example, a review of dissectates in a dissected collection container 55 off axis of the optical axis of the observation beam path a, a visualization camera 95 be provided, the detection of dissecting currently not below the excerpt 581 positioned Dissektatauffangbehältern 55 allows. This allows, for example, a parallel evaluation of laser microdissection operations, in which the processing of the object 51 does not have to be interrupted and / or a before-after comparison.

Zu weiteren Ausgestaltungen der in den 2 und 3 dargestellten Ausführungsformen sei insbesondere auf die DE 100 18 251 C1 verwiesen, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. For further embodiments of the in the 2 and 3 illustrated embodiments may be particularly to the DE 100 18 251 C1 referenced, which is hereby incorporated by reference.

4 zeigt in den Ansichten A, B und C Bilddaten 550, die durch eine erfindungsgemäße bildgebende Erfassung eines Bodens 551 eines Dissektatauffangbehälters 55 zu wenigstens zwei Zeitpunkten erhalten werden. Hierbei zeigt Ansicht A zu einem ersten Zeitpunkt erhaltene Bilddaten 550. In den Bilddaten 550 ist der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 und dessen Wand 552 (vgl. 2) zu sehen. Der Dissektatauffangbehälter 55 wurde im dargestellten Beispiel senkrecht von oben aufgenommen. Im dargestellten Beispiel erfolgte eine Fokussierung auf den Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55. 4 shows in the views A, B and C image data 550 obtained by an inventive imaging of a soil 551 a Dissektatauffangbehälters 55 be obtained at least two times. Here, view A shows image data obtained at a first time 550 , In the picture data 550 is the ground 551 of the dissectate catcher 55 and its wall 552 (see. 2 to see). The Dissektatauffangbehälter 55 was taken vertically from above in the example shown. In the example shown, a focus was on the ground 551 of the dissectate catcher 55 ,

Die Ansicht A zeigt dabei Bilddaten 550, die vor einem Dissektionsvorgang erhalten wurden. Auf den Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 550 befinden sich daher noch keine Dissektate (in Ansicht B mit 511 bezeichnet). Wie durch gestrichelte Bereiche 553 veranschaulicht, kann die bildgebende Erfassung des Bodens 551 des Dissektatauffangbehälters 55 auch in Form einer abschnittsweisen Abtastung erfolgen. Entsprechende Teilbilddaten werden anschließend zu den Bilddaten 550 zusammengesetzt. Unterschiedliche Abschnitte 553 eines Dissektatauffangbehälters 55 bzw. dessen Boden 552 können auch unter Umfokussieren erhalten werden, insbesondere dann, wenn der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 nicht planar ist. The view A shows image data 550 that were obtained before a dissection process. On the ground 551 of the dissectate catcher 550 Therefore, there are still no dissecting (in view B with 511 designated). As by dashed areas 553 illustrates the imaging of the soil 551 of the dissectate catcher 55 also take place in the form of a section-wise scanning. Corresponding partial image data then become the image data 550 composed. Different sections 553 a Dissektatauffangbehälters 55 or its bottom 552 can also be obtained by refocusing, especially if the soil 551 of the dissectate catcher 55 is not planar.

Die Ansicht B der 4 zeigt Bilddaten 550, die erhalten wurden, nachdem drei Dissektate 511 aus einem oder mehreren Objekten 51 herausgetrennt wurden. Die Dissektate 511 weisen hier unterschiedliche Größen auf, es kann sich jedoch auch um Dissektate 511 gleicher Größe handeln. Zwischen den Ansichten A und B können auch weitere Bilddaten 550 erhalten werden, beispielsweise nach der Heraustrennung jedes einzelnen Dissektats 511. The view B of the 4 shows image data 550 that were obtained after three dissecting 511 from one or more objects 51 were cut out. The dissectates 511 have different sizes, but they can also be dissected 511 act the same size. Between the views A and B also other image data 550 obtained, for example, after the separation of each dissecting 511 ,

In Ansicht C sind abgeleitete Bilddaten 555 dargestellt, die durch einen Vergleich der Bilddaten 550 aus den Ansichten A und B erhalten wurden. Durch eine pixelweise Subtraktion der Bilddaten 550 aus den Ansichten A und B werden hierbei die Dissektate 511 gegenüber dem (subtrahierten) Hintergrund deutlich erkennbar. Wie durch unterschiedliche Schraffuren der Dissektate 511 veranschaulicht, kann bei der Erzeugung der abgeleiteten Bilddaten 555, beispielsweise in einer geeigneten Bildverarbeitungseinrichtung, auch eine Zuordnung der jeweiligen Dissektate zu bestimmten Geweben, Dissektionsvorgängen, Größenklassen, Formklassen, Farbklassen usw. erfolgen. Die Auswertung wird hierdurch zuverlässig und ermöglicht eine einfache und benutzerfreundliche Kontrolle bzw. Überwachung einer Dissektion bzw. eines Dissektionserfolgs. In view C are derived image data 555 represented by a comparison of the image data 550 obtained from views A and B. By a pixel-by-pixel subtraction of the image data 550 views A and B become dissected 511 clearly visible against the (subtracted) background. As by different hatching of the dissectates 511 can be used in the generation of the derived image data 555 For example, in a suitable image processing device, an association of the respective dissected to certain tissues, dissection processes, size classes, form classes, color classes, etc. done. The evaluation is thus reliable and allows a simple and user-friendly control or monitoring of a dissection or a Dissektionserfolgs.

In der 5 sind weitere Bilddaten 550 gezeigt, die durch eine erfindungsgemäße bildgebende Erfassung eines Bodens 551 eines Dissektatauffangbehälters 55 zu wenigstens zwei Zeitpunkten erhalten werden. In the 5 are more image data 550 shown by an inventive imaging of a soil 551 a Dissektatauffangbehälters 55 be obtained at least two times.

Bei dem Dissektatauffangbehälter 55 handelt es sich hier beispielsweise um einen Deckel eines eingangs erläuterten Deckelgefäßes; die erläuterten Grundsätze gelten jedoch auch allgemein für andere Dissektatauffangbehälter 55. At the dissektate catcher 55 This is, for example, a lid of a lidded vessel explained in the introduction; however, the principles outlined also apply generally to other dissectate collection containers 55 ,

Der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 weist hier zwei Bodenbereiche 551a und 551b auf, die an einer Grenze 554 ineinander übergehen und sich auf unterschiedlichen Höhen (also unterschiedlichen z-Ebenen) befinden. Dies kann eine Umfokussierung erforderlich machen. Wie durch hier vier gestrichelt dargestellte Bereiche 553 veranschaulicht, kann die bildgebende Erfassung des Bodens 551 des Dissektatauffangbehälters 55 auch hier in Form einer abschnittsweisen Abtastung erfolgen. Statt den gezeigten vier Bereichen 553 können beispielsweise auch neun, 16, 25, 36 usw. Bereiche 553 erfasst werden, je nach Größe des Dissektatauffangbehälters 55 und der Vergrößerung bei der bildgebenden Erfassung. The floor 551 of the dissectate catcher 55 here has two floor areas 551a and 551b on that at a border 554 merge into each other and are at different heights (ie different z-planes). This may require refocusing. As shown by four dashed lines areas 553 illustrates the imaging of the soil 551 of the dissectate catcher 55 also take place here in the form of a section scan. Instead of the four areas shown 553 can for example, nine, 16 . 25 . 36 etc. areas 553 depending on the size of the Dissektatauffangbehälters 55 and magnification in imaging.

Zur Berechnung der Dissektate im Dissektatauffangbehälter 55 nach einem Dissektionsvorgang kann auch vorgesehen sein, Unterschiede zum Zustand vor dem Dissektionsvorgang durch angepasste Kamera- und Beleuchtungseinstellungen zu beachten und ggf. „herauszurechnen“ (dies betrifft beispielsweise Farbunterschiede). Die genaue Position der Bereiche 553 (x, y und z) kann gespeichert werden und zur Erstellung eines entsprechenden zusammengesetzten Bilds wiederverwendet werden. Alternativ dazu kann auch auf eine Bestimmung und/oder Speicherung entsprechender Positionen verzichtet werden und später mit einem Bildanalyseverfahren eine Verrechnung entsprechender Bilddaten 550 erfolgen. To calculate the dissectates in the dissected collection container 55 After a dissection process, it may also be provided that differences from the state before the dissection process are taken into account by means of adapted camera and illumination settings and possibly "calculated out" (this applies, for example, to color differences). The exact location of the areas 553 (x, y and z) can be stored and reused to create a corresponding composite image. Alternatively, it is also possible to dispense with a determination and / or storage of corresponding positions and, later with an image analysis method, to offset corresponding image data 550 respectively.

Ferner kann es erforderlich sein, mehrere Einzelbilder eines Bereichs 553 anzufertigen, insbesondere wenn ein Dissektatauffangbehälter 55 mehrere Bodenbereiche 551a und 551b aufweist, die sich auf unterschiedlichen Höhen (also unterschiedlichen z-Ebenen) befinden. Furthermore, it may be necessary to have multiple frames of an area 553 to make, especially if a Dissektatauffangbehälter 55 several floor areas 551a and 551b which are at different heights (ie different z-planes).

Es kann auch vorgesehen sein, einen Größenschwellwert für die Erkennung bzw. Klassifizierung von Objekten auf dem Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 zu verwenden. Beispielsweise können hierdurch große Dissektate (z.B. das schraffiert dargestellte Dissektat 511a) von kleineren Dissektaten (Dissektate 511b und 511c) bzw. Kontaminationen in Form kleiner Partikel 556a bzw. Fasern 556b unterschieden werden. Für diese Unterscheidung kann auch eine Erkennung von Formparametern zweckmäßig sein. It may also be provided a size threshold for the detection or classification of objects on the ground 551 of the dissectate catcher 55 to use. By way of example, large dissectates (for example the dissectate hatched in FIG 511a ) of smaller dissectates (dissectates 511b and 511c ) or contaminations in the form of small particles 556a or fibers 556b be differentiated. Detection of shape parameters may also be expedient for this distinction.

Formparameter können auch zur Unterscheidung von Dissektaten 511d und 511e verwendet werden, die im dargestellten Beispiel teilweise übereinander liegen, und daher insgesamt von einer erwarteten Form (z.B. aus einer Schnittlinie für die Dissektion) abweichen. Ein A-Priori-Wissen um eine Sollform von Dissektaten ermöglicht damit eine Überprüfung eines Dissektionserfolgs. Form und Größe der Dissektate können daher vorteilhafterweise wie bei einer Mustererkennungssoftware (AVC) einstellbar sein. Entsprechendes gilt für unterschiedliche Farben, wodurch beispielsweise ebenfalls übereinanderliegende Objekte für eine Zählung berücksichtigt werden können. Objekte, die bereits vor einer Dissektion vorhanden sind, und die beispielsweise aus Fertigungsungenauigkeiten von Dissektatauffangbehältern 55, Beschriftungen usw. stammen, können durch einen Vorher-Nachher-Vergleich als falschpositive Treffer aussortiert werden. Neben der Form kann auch der Durchmesser bzw. die kürzeste Seitenkante eines Dissektats 511 zur Identifikation genutzt werden, da nicht immer sämtliche Dissektate glatt auf dem Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 aufliegen, sondern auch auf einer Schnittkante stehen können (nicht gezeigt). Somit ist die Größenselektion anhand des geringsten Durchmessers bzw. der kürzesten Schnittkante ein wichtiges Teilverfahren, um eine möglichst genaue Anzahl an Dissektaten zu ermitteln. Shape parameters can also be used to distinguish dissectates 511d and 511e are used, which are partially superimposed in the example shown, and therefore differ altogether from an expected shape (eg from a cut line for the dissection). An a priori knowledge of a desired form of dissected data thus enables a review of a dissection success. Thus, the shape and size of the dissectates may be advantageously adjustable as in pattern recognition software (AVC). The same applies to different colors, so that, for example, also superimposed objects can be taken into account for a count. Objects that are already present before a dissection, and for example, from manufacturing inaccuracies of dissektate collection containers 55 , Captions, etc., can be sorted out as false positives by a before-after comparison. In addition to the shape, the diameter or the shortest side edge of a dissectate can also be used 511 be used for identification, since not always all dissecting smooth on the floor 551 of the dissectate catcher 55 rest, but can also stand on a cutting edge (not shown). Thus, the size selection on the basis of the smallest diameter or the shortest cutting edge is an important sub-method to determine the most accurate number of dissecting data.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 98/14816 A1 [0006]
EP 1276586 B1 [0007, 0017, 0027, 0055, 0065]
EP 1317961 B1 [0030]
DE 10018251 C1 [0087]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Isenberg, G. et al .: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Vol. 107, 1976, pages 19-24 [0002]
Bancroft, JD and Gamble, M .: Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier Science, 2008, page 575, chapter "Laser Microdissection" [0003]

Claims

Method for laser microdissection in which a laser microdissection system ( 100 ) with a microscope ( 10 ), wherein from at least one object to be dissected ( 51 ) by means of a laser beam (b), which by means of a Auflichtlichteinrichtung ( 76 ) of the microscope ( 10 ) through a microscope objective ( 41 ) of the microscope ( 10 ) on the object to be dissected ( 51 ), at least one dissectate ( 511 ) is separated out and in a Dissektatauffangbehälter ( 55 ) is collected, wherein at least one collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) generating image data ( 550 ) is captured at least in sections, characterized in that the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) is acquired by imaging at least two times and that the image data ( 550 ) are compared.

Method according to Claim 1, in which the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) before and after the separation of the at least one dissectate ( 511 ) from the at least one object ( 51 ) is detected by imaging.

Method according to Claim 1 or 2, in which the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) before and after separating a plurality of dissectates from the at least one object ( 51 ) is detected by imaging.

Method according to one of the preceding claims, in which the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) a bottom of the dissectate collecting container ( 55 ) generating the image data ( 550 ) is detected by imaging.

Method according to one of the preceding claims, in which the imaging detection of the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) using the microscope objective ( 41 ) carried out in the separation of the at least one dissectate ( 511 ) from the at least one object ( 51 ) is used to focus the laser beam (b).

Method according to Claim 5, in which, for the purpose of imaging the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) a distance of the collecting surface ( 551 ) to the microscope objective ( 41 ) to a distance during the separation of the at least one dissectate ( 511 ) from the at least one object ( 51 ) is changed.

Method according to claim 5, wherein the soil ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) in imaging beyond a focus plane of the microscope objective ( 41 ) is located.

Method according to one of the preceding claims, in which the imaging detection of the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) using one or more independent of a microscope objective ( 41 ) focused or focusable visualization cameras ( 91 - 95 ) he follows.

Method according to one of the preceding claims, in which for the image-forming detection of the collecting surface ( 551 ) of the Dissektatauffangbehälters ( 55 ) is scanned in sections and partial image data ( 553 ) to the image data ( 550 ).

A method according to claim 9, wherein the dissected collecting vessel ( 55 ) for sectionally scanning its collecting surface ( 551 ) is moved.

Method according to one of the preceding claims, in which the generation of the image data ( 550 ) in the form of pixel image data and the comparison of the image data generated at the at least two points in time ( 550 ) is performed with pixel-by-pixel subtraction of the pixel image data.

Method according to one of the preceding claims, in which by comparing the image data generated at the at least two points in time ( 550 ) a number of dissections ( 511 ) is determined.

The method of claim 12, wherein a target number of dissectates ( 511 ) and from the at least one object to be dissected ( 51 ) so long by means of the laser beam (b) dissectates ( 511 ), based on the determination of the number of dissections ( 511 ) that the target number of dissected data ( 511 ) is reached.

Method according to one of the preceding claims, in which by comparing the image data generated at the at least two points in time ( 550 ) a spatial position of the at least one dissectate ( 511 ) is determined.

Method according to one of the preceding claims, in which a color of the at least one dissectate ( 511 ) is determined.

Method according to one of the preceding claims, in which several dissectates ( 511 ) from the object ( 51 ) and based on the image data ( 550 ) are divided into size classes.

Method according to one of the preceding claims, in which at least one shape parameter of the at least one dissectate ( 511 ) is determined.

The method of claim 17, wherein based on the determination of the at least one shape parameter, a match with at least one predetermined shape parameter is checked.

Method according to one of the preceding claims, wherein the laser beam (b) during the separation of the at least one dissectate (b) 511 ) from the object to be dissected ( 51 ) by means of a laser scanning device ( 73 ) in the incident light device ( 76 ) is deflected variably.

Method according to Claim 19, in which a laser scanning device ( 73 ), which are inclined against an optical axis and independently rotatable about the optical axis glass wedge plates ( 731 ) for variably deflecting the laser beam.

Laser microdissection system ( 100 ), which is set up for carrying out a method according to one of the preceding claims, and which is a microscope ( 10 ) with a Auflichteinrichtung ( 76 ) for focusing a laser beam (b) through a microscope objective ( 41 ) of the microscope ( 10 ), wherein means for separating at least one dissectate ( 511 ) from at least one object to be dissected ( 51 ) by means of the laser beam (b), means for collecting the at least one dissectate ( 511 ) in at least one dissected collecting vessel ( 55 ), Medium ( 91 - 95 ) for imaging at least one collecting surface ( 551 ) of the at least one dissektate collecting container ( 55 ) generating image data ( 550 ) at least two times, and means ( 81 . 82 ) for comparing the image data ( 550 ) generated at the at least two times are provided.