Die vorliegende Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. The present invention relates to a sequencing device for sequencing at least one nucleic acid single strand. Furthermore, the present invention relates to a method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
Stand der Technik State of the art
In der US 2010/0035254 A1 ist ein Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines DNA-Einzelstrangs beschrieben. Zum Ausführen des Verfahrens wird mindestens eine Polymerase an eine Oberfläche gebunden. Dies soll so ausgeführt werden, dass der mindestens eine zu sequenzierende DNA-Einzelstrang mit einem angebundenen Primer an die Polymerase anbinden kann. Anschließend werden optisch markierte Nukleotide auf die Oberfläche mit der mindestens einen angebundenen Polymerase gegeben. Mittels eines optischen Nachweises eines an dem Primer polymerisierten Nukleotids soll es möglich sein, Rückschlüsse auf die Sequenz des DNA-Einzelstrangs zu schließen. In the US 2010/0035254 A1 a method for sequencing at least one DNA single strand is described. To carry out the method, at least one polymerase is bound to a surface. This should be carried out in such a way that the at least one DNA single strand to be sequenced can bind to the polymerase with a tethered primer. Subsequently, optically labeled nucleotides are added to the surface with the at least one attached polymerase. By means of optical detection of a nucleotide polymerized on the primer, it should be possible to draw conclusions about the sequence of the DNA single strand.
Allerdings erfordert ein Ausführen des in dem vorausgehenden Absatz beschriebenen Verfahrens die optische Markierung der an den Primer zu polymerisierenden Nukleotide. Die dazu ausgeführte Markierungsmethode kann jedoch die Enzymeigenschaften der Polymerase beeinträchtigen. Dies kann zu einer erhöhten Fehlerrate beim Ermitteln der DNA-Sequenz des DNA-Einzelstrangs führen. However, carrying out the method described in the preceding paragraph requires the optical labeling of the nucleotides to be polymerized to the primer. However, the labeling method used may affect the enzyme properties of the polymerase. This can lead to an increased error rate in determining the DNA sequence of the DNA single strand.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb, eine Möglichkeit zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs zur Verfügung zu stellen, welche keine optische Markierung der zum Polymerisieren eines Komplementärstrangs eingesetzten Nukleotide benötigt. The object of the present invention is therefore to provide a possibility for sequencing at least one nucleic acid single strand which does not require optical labeling of the nucleotides used for polymerizing a complementary strand.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Sequenziervorrichtung zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs nach Anspruch 1 und das Verfahren zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs nach Anspruch 7. This object is achieved by the sequencing device for sequencing at least one nucleic acid single strand according to claim 1 and the method for sequencing at least one nucleic acid single strand according to claim 7.
Die vorliegende Erfindung schafft Möglichkeiten zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs, wobei es ausreichend ist, lediglich ein Markermolekül an einem Ende des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs (z.B. über einen Adapterstrang) und/oder des mindestens einen Primers anzubinden. Die Anbindung kann so erfolgen, dass das mit dem Markermolekül markierte Ende des Nukleinsäureeinzelstrangs oder des Primers während einer Polymerisierung einen vergleichsweise großen Abstand zu der benachbarten Polymerase aufweist. Somit beeinträchtigt das benachbarte Markermolekül nicht die Enzymeigenschaften der polymerisierenden Polymerase. Das Markermolekül trägt somit zu keiner Steigerung der Fehlerrate bei. Eine Qualität der mittels der vorliegenden Erfindung ausführbaren Sequenzierung ist deshalb vergleichsweise hoch. Insbesondere kann mittels der vorliegenden Erfindung eine Qualität der Sequenzierung realisiert werden, welche für chemische Anwendungen ausreichend ist. The present invention provides possibilities for sequencing at least one nucleic acid single strand, it being sufficient to attach only one marker molecule at one end of the at least one nucleic acid single strand (e.g., via an adapter strand) and / or the at least one primer. The attachment may be such that the end of the nucleic acid single strand or primer labeled with the marker molecule has a comparatively large distance from the adjacent polymerase during polymerization. Thus, the adjacent marker molecule does not affect the enzymatic properties of the polymerizing polymerase. The marker molecule thus does not contribute to an increase in the error rate. A quality of the sequencing which can be carried out by means of the present invention is therefore comparatively high. In particular, by means of the present invention, a quality of the sequencing can be realized, which is sufficient for chemical applications.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Sequenziervorrichtung umfasst die Sequenziervorrichtung eine Lichtemittiereinrichtung, mittels welcher das mindestens eine Markermolekül anregbar ist. In diesem Fall ist die Detektionseinrichtung vorzugsweise für eine Detektion eines von dem mindestens einen Markermolekül emittierten Lichts als das mindestens eine variierende Signal ausgelegt. Da die leitfähige Oberfläche ein Quenchen des mindestens einen Markermoleküls bewirken kann, ist eine Intensität des mittels der Detektionseinrichtung detektierten Lichts ein Signal, anhand von welchem sich eine Vergrößerung des maximaler Abstands des mindestens einen Markermoleküls von der leitfähigen Oberfläche, und damit eine Verlängerung des durch die Polymerisation verlängerten Primers verlässlich erkennbar ist. Somit kann eine Polymerisierung eines Nukleotids während eines Zuführens eines bestimmten Nukleotidtyps an die leitfähige Oberfläche mit einer relativ geringen Fehlerrate erkannt werden. In an advantageous embodiment of the sequencing device, the sequencing device comprises a light emitting device, by means of which the at least one marker molecule can be excited. In this case, the detection device is preferably designed for detecting a light emitted by the at least one marker molecule as the at least one varying signal. Since the conductive surface may cause quenching of the at least one marker molecule, an intensity of the detected light by the detection means is a signal based on which an increase of the maximum distance of the at least one marker molecule from the conductive surface, and thus an extension of the through Polymerization of extended primer is reliably recognizable. Thus, polymerization of a nucleotide during delivery of a particular nucleotide type to the conductive surface can be detected with a relatively low error rate.
In einer vorteilhaften Weiterbildung sind mittels der Lichtemittiereinrichtung verschiedene Markermoleküle mit unterschiedlichen Emissionsspektren gleichzeitig anregbar. Bevorzugter Weise ist in diesem Fall die Detektionseinrichtung dazu ausgelegt, die von den verschiedenen Markermolekülen emittierten Photonen zu detektieren und einem bestimmten Emissionspektrum der unterschiedlichen Emissionsspektren der Markermoleküle zuzuordnen. Da die verschiedenen Markermoleküle direkt oder indirekt an unterschiedlichen Nukleinsäureeinzelsträngen angebunden sein können, kann die hier beschriebene Sequenziervorrichtung zum gleichzeitigen Sequenzieren verschiedener Nukleinsäureeinzelstränge genutzt werden. Auf diese Weise ist eine Vielzahl verschiedener Nukleinsäureeinzelstränge innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeit sequenzierbar. In an advantageous development, different marker molecules with different emission spectra can be stimulated simultaneously by means of the light emitting device. In this case, the detection device is preferably designed to detect the photons emitted by the different marker molecules and to assign them to a specific emission spectrum of the different emission spectra of the marker molecules. Since the different marker molecules can be attached directly or indirectly to different nucleic acid single strands, the sequencing device described here can be used for the simultaneous sequencing of different nucleic acid single strands. In this way, a multiplicity of different nucleic acid single strands can be sequenced within a comparatively short time.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist die Detektionseinrichtung für eine kapazitive Detektion des mindestens einen Markermoleküls ausgelegt. Damit können kostengünstige dielektrische Marker, wie insbesondere Metall-Nanopartikel, als das mindestens eine Markermolekül eingesetzt werden. In a further advantageous embodiment, the detection device is designed for a capacitive detection of the at least one marker molecule. In this way, cost-effective dielectric markers, in particular metal nanoparticles, can be used as the at least one marker molecule.
Beispielsweise kann die Detektionseinrichtung für eine Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle ausgebildet sein. In diesem Fall ist mittels der Sequenziervorrichtung eine Einzelstrangsequenzierung eines einzelnen Nukleotideinzelstrangs ausführbar. Somit kann auf eine Exprimierung eines nur in einer geringen Konzentration vorhandenen Nukleinsäureeinzelstrangs vor einer Sequenzierung bei einer derartigen Auslegung der Sequenziervorrichtung verzichtet werden. For example, the detection device can be designed for a single molecule detection of a single one of the marker molecules. In this case a single-stranded sequencing of a single nucleotide single strand can be carried out by means of the sequencing device. Thus, expression of a nucleic acid single strand present only in a low concentration prior to sequencing may be dispensed with in such a sequencing device design.
Als Alternative dazu kann die Detektionseinrichtung auch für eine gleichzeitige Detektion einer Vielzahl von Markermolekülen ausgebildet sein. Eine derartige Detektionseinrichtung kann mittels kostengünstiger Bauteile ausgebildet werden. As an alternative, the detection device can also be designed for a simultaneous detection of a plurality of marker molecules. Such a detection device can be formed by means of inexpensive components.
Die in den oberen Absätzen aufgezählten Vorteile sind auch bei einem Ausführen eines derartigen Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs gewährleistet. The advantages enumerated in the above paragraphs are also ensured in carrying out such a method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird als der mindestens eine Primer mindestens ein mit mindestens einem Metall-Nanopartikel als das mindestens eine Markermolekül markierter Primer an die mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang angebunden. Somit können zum Ausführen des Verfahrens kostengünstige Metall-Nanopartikel anstelle von Fluorophoren eingesetzt werden. In an advantageous embodiment of the method, as the at least one primer, at least one primer labeled with at least one metal nanoparticle as the at least one marker molecule is bound to the at least one nucleic acid single strand. Thus, to carry out the process, inexpensive metal nanoparticles can be used instead of fluorophores.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird als der mindestens eine Primer mindestens ein Primer mit einer ersten Nukleotidanzahl, welche kleiner als eine zweite Nukleotidanzahl mindestens eines an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang legierten Adapterstrangs ist, an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang angebunden. Wie unten genauer ausgeführt wird, kann bei einer derartigen Wahl der ersten Nukleotidanzahl und der zweiten Nukleotidanzahl bei jeder Sequenzierung eine Referenzmessung ausgeführt werden. Somit kann beispielsweise eine Fehljustage an einer zum Ausführen des Verfahrens verwendeten Vorrichtung schnell erkannt und behoben werden. In a further advantageous embodiment of the method, at least one primer having a first nucleotide number which is smaller than a second nucleotide number of at least one adapter strand alloyed to the at least one nucleic acid single strand is attached to the at least one nucleic acid single strand as the at least one primer. As will be explained in more detail below, with such a choice of the first number of nucleotides and the second number of nucleotides, a reference measurement can be carried out at each sequencing. Thus, for example, a misalignment on a device used to carry out the method can be quickly recognized and remedied.
In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens wird als der mindestens eine Primer mindestens ein Primer an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang angebunden wird, dessen Teilsequenz zusammen mit einer Teilsequenz des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs eine Restriktionssequenz für ein Restriktionsenzym ergibt. In einem nachfolgenden Verfahrensschritt kann mittels des Restriktionsenzyms ein nicht zu sequenzierender Teilstrang des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs von einem zumindest teilweise zu sequenzierenden Reststrang des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs abgetrennt werden. Die Sequenzierung des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs kann somit speziell auf die zu ermittelnden Nukleotide begrenzt werden. In a specific embodiment of the method, as the at least one primer, at least one primer is attached to the at least one single nucleic acid sequence whose partial sequence together with a partial sequence of the at least one nucleic acid single strand results in a restriction enzyme restriction sequence. In a subsequent method step, a partial strand of the at least one nucleic acid single strand which is not to be sequenced can be separated from an at least partially to be sequenced residual strand of the at least one nucleic acid single strand by means of the restriction enzyme. The sequencing of the at least one nucleic acid single strand can thus be limited specifically to the nucleotides to be determined.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird mittels einer Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle eine Einzelstrangsequenzierung ausgeführt. Das Verfahren kann somit auch ausgeführt werden, wenn lediglich eine vergleichsweise geringe Konzentration des zu sequenzierenden Nukleinsäureeinzelstrangs vorliegt. In an advantageous embodiment of the method, a single-strand sequencing is carried out by means of a single molecule detection of a single of the marker molecules. The method can thus also be carried out if only a comparatively low concentration of the nucleic acid single strand to be sequenced is present.
Als Alternative dazu kann jedoch auch eine Gruppe gleicher Nukleinsäureeinzelstränge gleichzeitig sequenziert werden. In der Regel können für eine derartige gleichzeitige Sequenzierung gleicher Nukleinsäureeinzelstränge kostengünstige Komponenten verwendet werden. Alternatively, however, a group of equal strands of nucleic acid may also be sequenced simultaneously. In general, inexpensive components can be used for such simultaneous sequencing of identical nucleic acid single strands.
In einer vorteilhaften Weiterbildung können auch verschiedene Nukleinsäureeinzelstränge mit voneinander abweichenden Sequenzen, an welchen unterschiedliche Markermoleküle direkt oder indirekt angebunden sind, gleichzeitig sequenziert werden. Somit können mehrere verschiedene Nukleinsäureeinzelstränge in einer vergleichsweise kurzen Zeit sequenziert werden. In an advantageous development, different nucleic acid single strands with divergent sequences to which different marker molecules are bound directly or indirectly can be simultaneously sequenced. Thus, several different nucleic acid strands can be sequenced in a comparatively short time.
Mittels eines Ausführens des hier beschriebenen Verfahrens kann als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenziert werden. Die Ausführbarkeit des Verfahrens ist jedoch nicht auf ein Sequenzieren mindestens eines Mikro-RNA-Strangs limitiert. By performing the method described herein, at least one strand of microRNA may be sequenced as the at least one nucleic acid single strand. However, the feasibility of the method is not limited to sequencing at least one microRNA strand.
Beschreibung der Figuren Description of the figures
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Figuren im Detail erläutert, wobei diese Figuren den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen. Es zeigen: The invention will be explained in more detail below with reference to figures, which figures are not intended to limit the scope of the invention. Show it:
1 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Sequenziervorrichtung; 1 a schematic representation of an embodiment of the sequencing device;
2 eine schematische Darstellung zum Erläutern einer ersten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs; 2 a schematic representation for explaining a first embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand;
3 eine schematische Darstellung zum Erläutern einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs; 3 a schematic representation for explaining a second embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand;
4 und 5 schematische Darstellungen zum Erläutern einer dritten und einer vierten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs; und 4 and 5 schematic diagrams for explaining a third and a fourth embodiment of the A method of sequencing at least one nucleic acid single strand; and
6a–6c schematische Darstellungen zum Erläutern einer fünften Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. 6a - 6c schematic representations for explaining a fifth embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Detailed description of the invention
1 zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Sequenziervorrichtung. 1 shows a schematic representation of an embodiment of the sequencing device.
Die in 1 schematisch dargestellte Sequenziervorrichtung ist zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs 10 geeignet. Der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 kann ein DNA-Einzelstrang, ein RNA-Einzelstrang oder ein PNA-Einzelstrang sein. Insbesondere kann als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenzierbar sein. Somit sind eine Vielzahl verschiedener Typen von Nukleinsäureeinzelsträngen 10 mittels der im Weiteren beschriebenen Sequenziervorrichtung sequenzierbar. In the 1 Sequencer shown schematically is for sequencing at least one nucleic acid single strand 10 suitable. The at least one nucleic acid single strand 10 may be a single strand of DNA, a single RNA strand or a single strand of PNA. In particular, as the at least one nucleic acid single strand 10 at least one micro RNA strand can be sequenced. Thus, a variety of different types of single nucleic acid strands 10 sequenced by means of the sequencing device described below.
Die Sequenziervorrichtung weist eine Probenhalterung 12 auf, an welcher eine leitfähige Oberfläche 14 befestigbar oder befestigt ist. Die leitfähige Oberfläche 14 ist derart funktionalisiert und/oder funktionalisierbar, dass mindestens eine Polymerase 16 an der leitfähigen Oberfläche 14 anbindbar ist. Die mindestens eine Polymerase 16 ist insbesondere so an der leitfähigen Oberfläche 14 anbindbar, dass der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit einem an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 angebundenen Primer 18 und mindestens einem an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 und/oder dem Primer 18 angebundenen Markermolekül 20 an die an der leitfähigen Oberfläche 14 angebundene Polymerase 16 anbinden kann. The sequencing device has a sample holder 12 on which a conductive surface 14 fastened or attached. The conductive surface 14 is functionalized and / or functionalized such that at least one polymerase 16 on the conductive surface 14 is attachable. The at least one polymerase 16 is especially so on the conductive surface 14 connectable to the at least one nucleic acid single strand 10 with one at the nucleic acid single strand 10 attached primer 18 and at least one of the single nucleic acid strand 10 and / or the primer 18 attached marker molecule 20 to the on the conductive surface 14 Tethered polymerase 16 can connect.
Die mindestens eine Polymerase 16 wird vorzugsweise kovalent an der leitfähigen Oberfläche 14 verankert. Die leitfähige Oberfläche 14 kann beispielsweise eine Gold-Elektrode sein. Bevorzugter Weise ist in diesem Fall die mindestens eine Polymerase 16 mittels einer Thiolbindung an die leitfähige Oberfläche 14 gebunden. Auch eine Biotin-Avidin/Streptavidin-Bindung kann zum Anbinden der mindestens einen Polymerase 16 genutzt werden. Es wird darauf hingewiesen, dass eine Vielzahl von Bindungsmöglichkeiten zum Anbinden der mindestens einen Polymerase 16 an die leitfähige Oberfläche 14 nutzbar ist. Bezüglich der verschiedenen Möglichkeiten zum Anbinden der mindestens einen Polymerase 16 an die leitfähige Oberfläche 14 wird insbesondere auf die US 2010/0035254 A1 hingewiesen. Eine Anordnung von mehreren Polymerasen 16 kann stochastisch oder durch eine Strukturierung der leitfähigen Oberfläche 14 gewählt werden. The at least one polymerase 16 is preferably covalent on the conductive surface 14 anchored. The conductive surface 14 may be, for example, a gold electrode. Preferably, in this case, the at least one polymerase 16 by means of a thiol bond to the conductive surface 14 bound. Biotin-avidin / streptavidin binding may also bind the at least one polymerase 16 be used. It should be noted that a variety of binding possibilities for attaching the at least one polymerase 16 to the conductive surface 14 is usable. Regarding the various possibilities for binding the at least one polymerase 16 to the conductive surface 14 in particular on the US 2010/0035254 A1 pointed. An arrangement of several polymerases 16 can be stochastic or by structuring the conductive surface 14 to get voted.
Als Markermoleküle 20 eignen sich organische und anorganische Marker. Beispielsweise können als Markermoleküle 20 Fluorophore eingesetzt werden. Bevorzugter Weise ist genau ein Markermolekül 20 an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 oder dem Primer 18 angebunden. Unter einer Anbindung eines Markermoleküls 20 an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 kann auch verstanden werden, dass das Markermolekül 20 an einem (vorzugsweise an dem 5-Ende) an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 legierten Adapterstrang chemisch angebunden ist. Bevorzugt wird eine Anbindposition des mindestens einen Markermoleküls 20, bei welcher während einer Polymerisierung weiterer Nukleotide an den Primer 18 ein Abstand zwischen der tätigen Polymerase 16 und dem mindestens einen Markermolekül 20 entweder zu- oder abnimmt. Vorzugsweise liegt das Markermolekül 20 an dem 5-Ende des Adapterstrangs 52/des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 oder an dem 3-Ende des Primers 18 vor. Die Einsetzbarkeit der Sequenziervorrichtung ist jedoch nicht auf die hier beschriebenen Möglichkeiten der Anbindung des mindestens einen Markermoleküls 20 beschränkt. As marker molecules 20 organic and inorganic markers are suitable. For example, as marker molecules 20 Fluorophores are used. Preferred way is exactly one marker molecule 20 at the nucleic acid single strand 10 or the primer 18 tethered. Under a binding of a marker molecule 20 at the nucleic acid single strand 10 can also be understood that the marker molecule 20 at one (preferably at the 5-end) on the single strand of nucleic acid 10 alloyed adapter strand is chemically connected. An attachment position of the at least one marker molecule is preferred 20 in which further nucleotides are added to the primer during polymerization 18 a distance between the active polymerase 16 and the at least one marker molecule 20 either increasing or decreasing. Preferably, the marker molecule is located 20 at the 5-end of the adapter string 52 / of the nucleic acid single strand 10 or at the 3-end of the primer 18 in front. However, the applicability of the sequencing device is not limited to the possibilities described here of attaching the at least one marker molecule 20 limited.
Die Sequenziervorrichtung weist auch eine Nukleotidzuführeinrichtung 22 auf, mittels welcher verschiedene Typen von Nukleotiden 24 in einer vorgebbaren Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche 14 mit der mindestens einen angebundenen Polymerase 16, dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10, dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül 20 zuführbar sind. Die Nukleotidzuführeinrichtung 22 kann insbesondere für eine mikrofluidische sequenzielle Zuführung ausgelegt sein. Dabei können die verschiedenen Nukleotide 24, wie beispielsweise Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin zum Sequenzieren eines DNA-Strangs, nacheinander und in unterschiedlichen Zeitabschnitten auf die leitfähige Oberfläche 14 zugegeben werden. Sofern ein zugegebenes Nukleotid 24 die richtige Base aufweist, kann es an dem mindestens einen Primer 18, bzw. an einen an dem mindestens einen Primer 18 neu-polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, polymerisiert werden. Nicht verwendete Nukleotide 24 können mittels einer Spüleinrichtung von der leitfähigen Oberfläche 14 entfernt werden. The sequencing device also has a nucleotide delivery device 22 on, by means of which different types of nucleotides 24 in a predeterminable order to the conductive surface 14 with the at least one attached polymerase 16 having at least one nucleic acid single strand 10 , the tailed primer 18 and the at least one attached marker molecule 20 can be fed. The nucleotide delivery device 22 may be designed in particular for a microfluidic sequential feed. In this case, the different nucleotides 24 , such as adenine, thymine, guanine and cytosine for sequencing a DNA strand, sequentially and at different times on the conductive surface 14 be added. If an added nucleotide 24 the right base, it may be on the at least one primer 18 or to one of the at least one primer 18 newly-polymerized continuation strand 26 to be polymerized. Unused nucleotides 24 can by means of a purging device from the conductive surface 14 be removed.
Mittels einer Anregungseinrichtung 28 der Sequenziervorrichtung ist ein elektrisches Wechselfeld erzeugbar, mittels welchem der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül 20 zumindest teilweise so in eine Schwingbewegung 30 versetzbar, dass ein Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche 14 und dem mindestens einen Markermolekül 20 variierbar ist. Der Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 ist unter physiologischen Bedingungen, wie beispielsweise einem pH-Wert von 7,2, ein negativ geladenes Polymer. Deshalb kann der Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 in dem erzeugten elektrischen Wechselfeld zwischen zwei Extremstellungen hin- und herbewegt werden. In einer ersten Extremstellung liegt der Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 (als positiver Pol) auf der leitfähigen Oberfläche 14. Demgegenüber ist der Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 in einer zweiten Extremstellung (als negativer Pol) näherungsweise senkrecht zu der leitfähigen Oberfläche 14 ausgerichtet. By means of an excitation device 28 The sequencing device is an alternating electric field generated by means of which the at least one nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 and the at least one attached marker molecule 20 at least partially so in a swinging motion 30 displaceable, that a distance between the conductive surface 14 and the at least one marker molecule 20 is variable. The nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 is a negatively charged polymer under physiological conditions, such as a pH of 7.2. Therefore, the single strand of nucleic acid can 10 with the attached primer 18 in the generated electrical Alternating field between two extreme positions are moved back and forth. In a first extreme position is the nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 (as a positive pole) on the conductive surface 14 , In contrast, the nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 in a second extreme position (as a negative pole) approximately perpendicular to the conductive surface 14 aligned.
Bei einem Vorliegen des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 mit dem angebundenen Primer 18 in der ersten Extremstellung ist der Abstand zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der leitfähigen Oberfläche 14 minimal, während der Abstand zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der leitfähigen Oberfläche 14 bei einem Vorliegen des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 mit dem angebundenen Primer 18 in der zweiten Extremstellung kurzzeitig maximal wird. Sofern eine Distanz zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der Polymerase 16 vergleichsweise kurz ist, ist die Schwingbewegung 30 in Phase mit dem elektrischen Wechselpol. Eine vergleichsweise große Distanz zwischen der Polymerase 16 und dem mindestens einen Markermolekül 20 bewirkt demgegenüber eine Schwingbewegung 30 außer Phase zu dem elektrischen Wechselfeld. Da eine Polymerisierung eines Nukleotids 24 an dem Primer 18, bzw. an den neu polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, eine Vergrößerung (oder Verkleinerung) der Distanz zwischen der Polymerase 16 und dem mindestens einen Markermolekül 20 bewirkt, kann durch einen Vergleich der Phase der Schwingbewegung 30 im Verhältnis zu dem elektrischen Wechselfeld auf die Polymerisierung des Nukleotids 24 rückgeschlossen werden. In the presence of the single nucleic acid strand 10 with the attached primer 18 in the first extreme position, the distance between the at least one marker molecule 20 and the conductive surface 14 minimal, while the distance between the at least one marker molecule 20 and the conductive surface 14 in the presence of the single nucleic acid strand 10 with the attached primer 18 briefly becomes maximum in the second extreme position. Provided a distance between the at least one marker molecule 20 and the polymerase 16 is comparatively short, is the swinging motion 30 in phase with the electrical pole. A comparatively large distance between the polymerase 16 and the at least one marker molecule 20 on the other hand causes a swinging motion 30 out of phase with the alternating electric field. As a polymerization of a nucleotide 24 on the primer 18 , or to the newly polymerized continuation strand 26 , an increase (or decrease) in the distance between the polymerase 16 and the at least one marker molecule 20 can be accomplished by comparing the phase of the swinging motion 30 in relation to the alternating electric field on the polymerization of the nucleotide 24 be inferred.
In der Ausführungsform der 1 umfasst die Anregungseinrichtung 28 die als erste Elektrode ausgebildete leitfähige Oberfläche 14 und eine zweite Elektrode 32, welche an einem Substrat 34 angebracht ist. Die Elektroden 14 und 32 der Anregungseinrichtung 28 können durch einen Mikrofluidik-Kanal getrennt sein. In einer alternativen Ausführungsform der Anregungseinrichtung 28 können die Elektroden auch auf einem gemeinsamen Substrat vorliegen. Optionaler Weise können die zweite Elektrode 32 und das Substrat 34 transparent/lichtdurchlässig sein. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die in 1 dargestellte Ausführung der Anregungseinrichtung 28 lediglich beispielhaft zu interpretieren ist. In the embodiment of the 1 includes the excitation device 28 the conductive surface formed as the first electrode 14 and a second electrode 32 which are attached to a substrate 34 is appropriate. The electrodes 14 and 32 the excitation device 28 can be separated by a microfluidic channel. In an alternative embodiment of the excitation device 28 For example, the electrodes may also be present on a common substrate. Optionally, the second electrode may be 32 and the substrate 34 be transparent / translucent. It is noted, however, that the in 1 illustrated embodiment of the excitation device 28 merely to be interpreted as an example.
Die Sequenziervorrichtung hat auch eine Detektionseinrichtung 36, mittels welcher mindestens ein mit dem variierenden Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche 14 und dem mindestens Markermolekül 20 variierendes Signal 38 ermittelbar ist. Das mindestens eine Signal 38 variiert vorzugsweise entsprechend der Schwingbewegung 30 in Phase oder außer Phase zu dem elektrischen Wechselfeld. Somit kann eine Auswerteeinrichtung 40 der Sequenziervorrichtung anhand eines von der Detektionseinrichtung 36 unter Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals 38 bereitgestellten Ausgabesignals 42 eine Polymerisierung eines Nukleotids 24 an den Primer 18, bzw. an den neu-polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, ermitteln/feststellen. Das Anwachsen des Primers 18, bzw. des neu polymerisierten Fortsetzungsstrangs 26, kann von der Auswerteeinrichtung 40 aufgrund einer Änderung der Phase der Signale 38 und 42 im Verhältnis zum elektrischen Wechselfeld verlässlich erkannt werden. Die Sequenziervorrichtung nutzt somit eine dynamische Messung von Strangeigenschaften/Stranglängen, wobei eine Auflösung gewährleistet ist, welche eine Detektion einer Einzelpolymerisierung eines Nukleotids 24 erlaubt. The sequencing device also has a detection device 36 by means of which at least one with the varying distance between the conductive surface 14 and the at least marker molecule 20 varying signal 38 can be determined. The at least one signal 38 preferably varies according to the swinging motion 30 in phase or out of phase with the alternating electric field. Thus, an evaluation device 40 the sequencing device based on one of the detection device 36 taking into account the at least one varying signal 38 provided output signal 42 a polymerization of a nucleotide 24 to the primer 18 , or to the newly polymerized continuation strand 26 , determine / determine. The growth of the primer 18 , or the newly polymerized continuation strand 26 , can from the evaluation device 40 due to a change in the phase of the signals 38 and 42 reliably detected in relation to the alternating electric field. The sequencing device thus uses a dynamic measurement of strand properties / strand lengths, whereby a resolution is ensured, which is a detection of a single polymerization of a nucleotide 24 allowed.
Da der Typ der gerade auf die leitfähige Oberfläche 14 zugegebenen Nukleotide 24 aufgrund der vorgebbaren Reihenfolge der Nukleotidzuführeinrichtung 22 bekannt ist, kann rückgeschlossen werden, welche Base das neu polymerisierte Nukleotid 24 trägt. Somit ist die Sequenz des Fortsetzungsstrangs 26 ermittelbar, worauf auf die komplementäre Sequenz des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 rückgeschlossen werden kann. Die Auswerteeinrichtung 40 ist zusätzlich dazu ausgelegt, eine Information 44 bezüglich des Typs des an den Primer 18, bzw. an den neu polymerisierten Fortsetzungsstrang 26, neupolymerisierten Nukleotids 24 und/oder des komplementären Nukleotids des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 auszugeben. As the type of the straight on the conductive surface 14 added nucleotides 24 due to the predeterminable order of the nucleotide delivery device 22 can be inferred, which base the newly polymerized nucleotide 24 wearing. Thus, the sequence of the continuation strand 26 ascertainable, pointing to the complementary sequence of the nucleic acid single strand 10 can be deduced. The evaluation device 40 is additionally designed to provide information 44 regarding the type of the primer 18 , or to the newly polymerized continuation strand 26 , newly polymerized nucleotide 24 and / or the complementary nucleotide of the nucleic acid single strand 10 issue.
Die Sequenziervorrichtung ermöglicht somit eine Sequenzierung mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs 10 ohne die Verwendung von markierten Nukleotiden 24. Stattdessen ist es ausreichend, wenn lediglich ein Markermolekül 20 an einem Ende des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs 10 oder an einem Ende des mindestens einen Primers 18 angebunden ist. Das in einem großen Abstand zu der benachbarten Polymerase 16 angebundene Markermolekül 20 beeinträchtigt deshalb nicht die Enzymeigenschaften der polymerisierenden Polymerase 16. Das Markermolekül 20 trägt somit zu keiner Steigerung einer Fehlerrate bei. Die von der Sequenziervorrichtung ausgeführten Sequenzierungen sind verlässlich und (nahezu) fehlerfrei. The sequencing device thus enables sequencing of at least one nucleic acid single strand 10 without the use of labeled nucleotides 24 , Instead, it is sufficient if only one marker molecule 20 at one end of the at least one nucleic acid single strand 10 or at one end of the at least one primer 18 is connected. That at a great distance to the adjacent polymerase 16 attached marker molecule 20 therefore does not interfere with the enzymatic properties of the polymerizing polymerase 16 , The marker molecule 20 thus contributes to no increase in an error rate. The sequencing performed by the sequencer is reliable and (nearly) error free.
Wie in 1 dargestellt ist, kann die Detektionseinrichtung 36 für eine Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle 20 ausgebildet sein. Als Alternative dazu kann die Detektionseinrichtung 36 jedoch auch für eine gleichzeitige Detektion einer Vielzahl von Markermolekülen 20, welche an Nukleinsäureeinzelsträngen 10 mit der gleichen Sequenz direkt oder indirekt angebunden sind, ausgebildet sein. As in 1 is shown, the detection device 36 for a single molecule detection of a single one of the marker molecules 20 be educated. Alternatively, the detection device 36 but also for simultaneous detection of a variety of marker molecules 20 which are attached to nucleic acid single strands 10 be formed with the same sequence directly or indirectly connected.
In der Ausführungsform der 1 weist die Sequenziervorrichtung zusätzlich eine Lichtemittiereinrichtung 46 auf, mit welcher mindestens ein als Markermolekül 20 eingesetzter Fluorophor anregbar ist. Ein von der Lichtemittiereinrichtung 46 emittiertes Licht 48 liegt vorzugsweise im Absorptionsspektrum des mindestens einen Markermoleküls 20. Die Detektionseinrichtung 36 ist für eine Detektion eines von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierten Lichts 38 als dem mindestens einen Signal 38 ausgelegt. Mittels eines geeignet gewählten Filters 50 kann sichergestellt werden, dass lediglich das von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierte Licht 38 von der Detektionseinrichtung 36 detektiert wird. Somit ist eine fluoreszenzhintergrundfreie Detektion ausführbar. Ein einer Intensität des Lichts 38 entsprechendes Ausgabesignal 42 kann anschließend an die Auswerteeinrichtung 40 ausgegeben werden. In the embodiment of the 1 the sequencing device additionally has a light emitting device 46 on, with which at least one as marker molecule 20 used fluorophore is excitable. One from the light emitting device 46 emitted light 48 is preferably in the absorption spectrum of the at least one marker molecule 20 , The detection device 36 is for detection of one of the at least one marker molecule 20 emitted light 38 as the at least one signal 38 designed. By means of a suitably chosen filter 50 can be ensured that only that of the at least one marker molecule 20 emitted light 38 from the detection device 36 is detected. Thus, a fluorescence background-free detection is feasible. An intensity of light 38 corresponding output signal 42 can then be sent to the evaluation device 40 be issued.
Ein vergleichsweise kleiner Abstand zwischen dem mindestens einen Markermolekül 20 und der leitfähigen Oberfläche 14 bewirkt ein Quenchen des jeweiligen als Markermolekül 20 eingesetzten Fluorophors. Somit kann die Schwingbewegung 30 mittels der Intensität des von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierten Lichts 38 verlässlich wiedergegeben werden. Damit kann bei einer optischen Auslegung der Sequenziervorrichtung eine Polymerisierung eines Nukleotids 24 anhand der sich ändernden Phasenlage der variierenden Intensität des von dem mindestens einen Markermolekül 20 emittierten Lichts 38 verlässlich erkannt werden. A comparatively small distance between the at least one marker molecule 20 and the conductive surface 14 causes a quenching of the respective marker molecule 20 used fluorophors. Thus, the swinging motion 30 by means of the intensity of the at least one marker molecule 20 emitted light 38 be reproduced reliably. Thus, in an optical design of the sequencing device, a polymerization of a nucleotide 24 based on the changing phase of the varying intensity of the at least one marker molecule 20 emitted light 38 be reliably recognized.
In einer Weiterbildung der Sequenziervorrichtung der 1 können mittels der Lichtemittiereinrichtung 46 verschiedene Markermoleküle 20 mit unterschiedlichen Emissionsspektren gleichzeitig anregbar sein. Die verschiedenen Markermoleküle können an Nukleinsäureeinzelsträngen 10 mit unterschiedlichen Sequenzen angebunden sein. Bevorzugter Weise ist die Detektionseinrichtung 36 in diesem Fall dazu ausgelegt, die von den verschiedenen Markermolekülen 20 emittierten Photonen zu detektieren und einem bestimmten Emissionsspektrum der unterschiedlichen Emissionsspektren der Markermoleküle 20 zuzuordnen. Somit kann gezielt erkannt werden, an welchem/welchen der unterschiedlichen Nukleinsäureeinzelstränge 10 ein Nukleotid 24 mit einer bestimmten Base polymerisiert wird. Mittels der hier beschriebenen Weiterbildung der Sequenziervorrichtung können deshalb unterschiedliche Nukleinsäureeinzelstränge 10 mit verschiedenen Sequenzen gleichzeitig sequenziert werden. In a further development of the sequencing device of 1 can by means of the light emitting device 46 different marker molecules 20 be stimulable simultaneously with different emission spectra. The different marker molecules can be linked to single nucleic acid strands 10 be connected with different sequences. The detection device is preferably 36 in this case, designed by the different marker molecules 20 emitted photons to detect and a certain emission spectrum of the different emission spectra of the marker molecules 20 assigned. Thus, it can be specifically recognized at which / which of the different nucleic acid single strands 10 a nucleotide 24 is polymerized with a certain base. By means of the development of the sequencing device described here, therefore, different nucleic acid single strands can be used 10 be sequenced with different sequences simultaneously.
Es wird darauf hingewiesen, dass die in der 1 wiedergegebene optische Auslegung der Sequenziervorrichtung lediglich beispielhaft zu interpretieren ist. Beispielsweise kann die Detektionseinrichtung 36 auch für eine kapazitive Detektion des mindestens einen Markermoleküls 20 ausgelegt sein. Auch anhand einer Phase einer detektierten Kapazität im Verhältnis zu dem elektrischen Wechselfeld kann auf die Phase der Schwingbewegung 30 rückgeschlossen werden. Somit sind auch bei einer derartigen Auslegung der Sequenziervorrichtung die oben schon beschriebenen Vorteile gewährleistet. It should be noted that in the 1 reproduced optical interpretation of the sequencing device is to be interpreted only as an example. For example, the detection device 36 also for a capacitive detection of the at least one marker molecule 20 be designed. Also based on a phase of a detected capacitance in relation to the alternating electric field can on the phase of the oscillatory motion 30 be inferred. Thus, even with such a design of the sequencing device, the advantages already described above are ensured.
2 zeigt eine schematische Darstellung zum Erläutern einer ersten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. 2 shows a schematic representation for explaining a first embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
In einem optionalen Verfahrensschritt kann vor der Sequenzierung des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs 10 mindestens ein Adapterstrang 52 an jeweils einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 legiert werden. Der Adapterstrang 52 kann auch als Fängerstrang (Capture Probe) bezeichnet werden. In an optional process step, prior to sequencing the at least one nucleic acid single strand 10 at least one adapter string 52 to one nucleic acid single strand each 10 be alloyed. The adapter strand 52 may also be referred to as a capture strand.
Anschließend wird der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit jeweils einem angebundenen Adapterstrang 52 und einem zu dem Adapterstrang 52 passenden Primer 18 auf eine leitfähige Oberfläche mit mindestens einer daran angebundenen Polymerase aufgebracht. Wahlweise kann mindestens ein (nicht dargestelltes) Markermolekül an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10, bzw. dem Adapterstrang 52, und/oder dem Primer 18 (chemisch) angebunden sein. Subsequently, the at least one nucleic acid single strand 10 each with a connected adapter strand 52 and one to the adapter string 52 matching primer 18 applied to a conductive surface with at least one attached polymerase. Optionally, at least one marker molecule (not shown) may be present on the nucleic acid single strand 10 , or the adapter strand 52 , and / or the primer 18 (chemically) tethered.
Ein elektrisches Wechselfeld wird an der leitfähigen Oberfläche mit der mindestens einen an der leitfähigen Oberfläche angebundenen Polymerase, an welcher der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10/dem Adapterstrang 52 angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen an dem Nukleinsäureeinzelstrang 10 und/oder dem Primer 18 angebundenen Markermolekül angebunden ist, erzeugt. Das Erzeugen des elektrischen Wechselfeldes erfolgt derart, dass mittels des elektrischen Wechselfeldes der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül zumindest teilweise so in eine Schwingbewegung versetzt wird, dass ein Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche und dem mindestens einen Markermolekül variiert wird. An alternating electrical field is single-stranded on the conductive surface with the at least one polymerase attached to the conductive surface to which the at least one nucleic acid strand is single stranded 10 with the at the nucleic acid single strand 10 / the adapter string 52 attached primer 18 and the at least one of the single nucleic acid strands 10 and / or the primer 18 tethered marker molecule is attached. The generation of the alternating electric field is effected such that by means of the alternating electric field of at least one nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 and the at least one connected marker molecule is at least partially set in a swinging motion so that a distance between the conductive Surface and the at least one marker molecule is varied.
Gleichzeitig oder zwischenzeitlich werden verschiedene Typen von Nukleotiden in einer vorgegebenen Reihenfolge an die leitfähige Oberfläche mit der einen angebundenen Polymerase, dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10, dem angebundenen Primer 18 und dem mindestens einen angebundenen Markermolekül zugeführt. Wie oben bereits ausgeführt ist, wird während des Erzeugens des elektrischen Wechselfelds mindestens ein mit dem variierenden Abstand zwischen der leitfähigen Oberfläche und dem mindestens einen Markermolekül variierendes Signal ermittelt. Anschließend wird unter Berücksichtigung des mindestens einen variierenden Signals eine Polymerisierung eine Nukleotids an den Primer 18 ermittelt und ein Typ des an dem Primer 18 polymerisierten Nukleotid und/oder des komplementären Nukleotids des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 festgelegt. Zum Erkennen des Typs des an dem Primer 18 polymerisierten Nukleotids und/oder des komplementären Nukleotids des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 wird in der Regel auch die Reihenfolge der zu verschiedenen Zeiten zugeführten verschiedenen Typen von Nukleotiden berücksichtigt. Simultaneously or in the meantime, various types of nucleotides are single stranded in a given order to the conductive surface with the one attached polymerase having at least one nucleic acid 10 , the tailed primer 18 and fed to the at least one attached marker molecule. As already explained above, at least one signal varying with the varying distance between the conductive surface and the at least one marker molecule is determined during the generation of the alternating electric field. Subsequently, taking into account the at least one varying signal, a polymerization of a nucleotide to the primer 18 determined and a type of the primer 18 polymerized nucleotide and / or the complementary nucleotide of the nucleic acid single strand 10 established. To recognize the type of the primer 18 polymerized nucleotide and / or the complementary nucleotide of the nucleic acid single strand 10 In general, the order of the different types of nucleotides supplied at different times is also taken into account.
Nach einer Sequenzierung des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 kann dieser abgelöst werden. Ein weiterer Nukleinsäureeinzelstrang 10 kann danach von der gleichen Polymerase 16 eingefangen und sequenziert werden. Somit kann eine einzelne Polymerase 16 für mehrere Sequenzierungen genutzt werden. After sequencing the nucleic acid single strand 10 this can be replaced. Another nucleic acid single strand 10 can be followed by the same polymerase 16 be captured and sequenced. Thus, a single polymerase 16 be used for multiple sequencing.
In der Ausführungsform der 2 weist der Adapterstrang 52 die gleiche Länge wie der Primer 18 auf, wobei eine Sequenz des Adapterstrangs 52 vorzugsweise einer Erkennungssequenz des Primers 18 entspricht. Die Ausführbarkeit des Verfahrens ist jedoch nicht darauf limitiert. In the embodiment of the 2 has the adapter strand 52 the same length as the primer 18 on, with a sequence of the adapter string 52 preferably a recognition sequence of the primer 18 equivalent. However, the feasibility of the method is not limited to this.
3 zeigt eine schematische Darstellung zum Erläutern einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. 3 shows a schematic representation for explaining a second embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
In der Ausführungsform der 3 wird als der mindestens eine Primer 18 mindestens ein Primer 18 mit einer ersten Nukleotidanzahl, welche kleiner als eine zweite Nukleotidanzahl des mindestens einen an dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 legierten Adapterstrangs 52 ist, an dem mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 angebunden. Da die Sequenz des an den Nukleinsäureeinzelstrang 10 angrenzenden Teilstrangs 54 des Adapterstrangs 52, für welche der Primer 18 keine komplementären Basen aufweist, bekannt ist, kann somit eine Referenzmessung ausgeführt werden. Sofern bei der Referenzmessung die bekannte Basenabfolge des Teilstrangs 54 ermittelt wird, kann davon ausgegangen werden, dass die zum Ausführen des Verfahrens eingesetzten Komponenten richtig justiert/geeicht sind. Andernfalls kann mit einer Überprüfung der Komponenten begonnen werden. Somit ist bei der Ausführungsform der 3 das Vorliegen eines Fehlers an der zum Sequenzieren des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 verwendeten Apparatur schnell erkennbar und behebbar. In the embodiment of the 3 is considered the at least one primer 18 at least one primer 18 with a first number of nucleotides smaller than a second number of nucleotides of the at least one at the at least one nucleic acid single strand 10 alloyed adapter strand 52 is at which at least one nucleic acid single strand 10 tethered. As the sequence of the to the nucleic acid single strand 10 adjacent substrand 54 of the adapter string 52 for which the primer 18 no complementary bases, it is known that a reference measurement can thus be carried out. If in the reference measurement, the known base sequence of the sub-string 54 is determined, it can be assumed that the components used to carry out the method are properly adjusted / calibrated. Otherwise, a check of the components can begin. Thus, in the embodiment of the 3 the presence of a defect in the sequence for sequencing the nucleic acid single strand 10 used equipment quickly recognizable and recoverable.
4 und 5 zeigen schematische Darstellungen zum Erläutern einer dritten und einer vierten Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. 4 and 5 10 are schematic representations for explaining a third and a fourth embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
Bei der Ausführungsform der 4 ist genau ein Markermolekül 20 an dem Adapterstrang 52 (mittels einer chemischen Bindung 55) angebunden. Vorzugsweise liegt das Markermolekül 20 an dem 5-Ende des Adapterstrangs 52 vor. In the embodiment of the 4 is exactly one marker molecule 20 on the adapter strand 52 (by means of a chemical bond 55 ). Preferably, the marker molecule is located 20 at the 5-end of the adapter string 52 in front.
Demgegenüber ist in der Ausführungsform der 5 genau ein Markermolekül 20 (mittels einer chemischen Bindung 55) an dem Primer 18 angebunden. In diesem Fall wird eine Anbindung des Markermoleküls 20 an das 3-Ende des Primers 18 bevorzugt. In contrast, in the embodiment of the 5 exactly one marker molecule 20 (by means of a chemical bond 55 ) on the primer 18 tethered. In this case, a binding of the marker molecule 20 to the 3-end of the primer 18 prefers.
Die in 4 und 5 wiedergegebenen Anbindpositionen der Markermoleküle 20 sind jedoch lediglich beispielhaft zu interpretieren. Als das mindestens eine Markermolekül 20 kann ein Fluorophor eingesetzt werden. Als Alternative dazu kann jedoch auch ein dielektrischer Marker, wie insbesondere ein Metall-Nanopartikel, als Markermolekül 20 verwendet werden. Somit kann auch eine kapazitive Messung zum Ausführen der hier beschriebenen Verfahren genutzt werden. In the 4 and 5 reproduced binding positions of the marker molecules 20 however, are to be interpreted as examples only. As the at least one marker molecule 20 a fluorophore can be used. Alternatively, however, a dielectric marker, in particular a metal nanoparticle, may also be used as marker molecule 20 be used. Thus, a capacitive measurement can be used to carry out the methods described herein.
6a–6c zeigen schematische Darstellungen zum Erläutern einer fünften Ausführungsform des Verfahrens zum Sequenzieren mindestens eines Nukleinsäureeinzelstrangs. 6a - 6c show schematic representations for explaining a fifth embodiment of the method for sequencing at least one nucleic acid single strand.
Bei der Ausführungsform der 6a–6c wird als der mindestens eine Primer 18 mindestens ein Primer 18 an den mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrang 10 angebunden, dessen Teilsequenz zusammen mit einer Teilsequenz des mindestens einen Nukleinsäureeinzelstrangs 10 eine Restriktionssequenz für ein Restriktionsenzym 56 ergibt. Mittels des jeweiligen Restriktionsenzyms 56 wird anschließend ein nicht zu sequenzierender Teilstrang 58 des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 von einem zumindest teilweise zu sequenzierenden Reststrang 60 des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 abgetrennt (vergleiche 6a und 6b). In the embodiment of the 6a - 6c is considered the at least one primer 18 at least one primer 18 to the at least one nucleic acid single strand 10 its partial sequence together with a partial sequence of the at least one nucleic acid single strand 10 a restriction enzyme for a restriction enzyme 56 results. By means of the respective restriction enzyme 56 then becomes a substring not to be sequenced 58 of the nucleic acid single strand 10 from an at least partially to be sequenced residual strand 60 of the nucleic acid single strand 10 separated (compare 6a and 6b ).
Der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit dem angebundenen Primer 18 wird anschließend auf die leitfähige Oberfläche mit der mindestens einen daran angebundenen Polymerase 16 gegeben. Somit kann der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mit einem daran angebundenen Primer 18 an die mindestens eine Polymerase 16 binden und die oben bereits ausgeführten Verfahrensschritte sind durchführbar. The at least one nucleic acid single strand 10 with the attached primer 18 is then applied to the conductive surface with the at least one attached polymerase 16 given. Thus, the at least one single nucleic acid strand 10 with a primer attached to it 18 to the at least one polymerase 16 bind and the process steps already performed above are feasible.
Die Ausführungsform der 6a bis 6c eignet sich zum schnellen Re-Sequenzieren von Abschnitten, welche stochastisch verteilt vorliegen. Das entsprechende Verfahren kann auch mit zwei Primern 18 für den Forward- und den Reverse-Strang ausgeführt werden. Limitierend ist in diesem Fall nur die Bildung von Primer-Primer-Hybridisierungen bei einer Verwendung von vielen unterschiedlichen Primern 18. The embodiment of the 6a to 6c suitable for fast re-sequencing of sections that are stochastically distributed. The corresponding procedure can also be used with two primers 18 for the forward and reverse strings. Limiting in this case is only the formation of primer-primer hybridizations when using many different primers 18 ,
Das Verfahren der 6a bis 6c eignet sich auch für eine Kombination aus Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR) und Sequenzierung ohne eine Library-Präparation für die Sequenzierung. Beispielsweise wird in einem Mikrofluidik-Kanal eine Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einem Molecular-Beacon-Primer ausgeführt. In diese Lösung wird in der Folge ein Restriktionsenzym 56 und die Polymerase 16 zugesetzt. Das an die Polymerase 16 gebundene und amplifizierte Produkt kann stochastisch auf der leitfähigen Oberfläche 14 in ausreichender Verdünnung verankert werden. The procedure of 6a to 6c Also suitable for a combination of real-time polymerase chain reaction (PCR) and sequencing without a library preparation for sequencing. For example, in a microfluidic channel, a real-time polymerase chain reaction (PCR) is performed with a molecular beacon primer. This solution is subsequently a restriction enzyme 56 and the polymerase 16 added. That to the polymerase 16 bound and amplified product may be stochastic on the conductive surface 14 be anchored in sufficient dilution.
Die oben ausgeführten Verfahren ermöglichen eine markierungsfreie Sequenzierung. Insbesondere ist eine Sequenzierung mit einer im Vergleich zu ISFET-Messungen hohen Ionenstärke ausführbar. Eine Gesamtkonzentration der Ionen kann über 500 µM liegen. Eine Konzentration von Magnesium-Ionen kann z.B. größer als 100 µM sein. Ideal sind Konzentrationen von Magnesium-Ionen und einer Taq-Polymerase zwischen 0,5 bis 5 mM. The procedures outlined above allow for label-free sequencing. In particular, sequencing with a high ionic strength compared to ISFET measurements is feasible. A total concentration of ions may be above 500 μM. A concentration of magnesium ions may e.g. greater than 100 μM. Ideally, concentrations of magnesium ions and a Taq polymerase are between 0.5 to 5 mM.
Alle mittels der 2–6c wiedergegebenen Verfahren können mittels einer Einzelmoleküldetektion eines einzigen der Markermoleküle 20 als eine Einzelstrangsequenzierung ausgeführt werden. Durch eine geeignete Wahl von Fluorophoren können auch Einzelmolekülmessungen ohne ein schnelles Bleichen des Fluorophors ausführbar sein. Als Alternative dazu kann jedoch auch eine Gruppe gleicher Nukleinsäureeinzelstränge 10 gleichzeitig mittels eines der Verfahren sequenziert werden. In einer Weiterbildung können auch verschiedenen Nukleinsäureeinzelstränge 10 mit voneinander abweichenden Sequenzen, an welchen unterschiedliche Markermoleküle (direkt oder indirekt) angebunden sind/werden, gleichzeitig mittels eines der oben beschriebenen Verfahren sequenziert werden. Auf diese Weise können verschiedene Nukleinsäureeinzelstränge 10 innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeit sequenziert werden. All by means of 2 - 6c reproduced methods can by means of a single molecule detection of a single of the marker molecules 20 are performed as a single strand sequencing. By a suitable choice of fluorophores, single molecule measurements may also be feasible without rapid bleaching of the fluorophore. Alternatively, however, a group of equal strands of nucleic acid may be used 10 be sequenced simultaneously by one of the methods. In a further development, it is also possible to use different nucleic acid single strands 10 with divergent sequences to which different marker molecules are (directly or indirectly) attached, are simultaneously sequenced by one of the methods described above. In this way, different nucleic acid strands can be used 10 be sequenced within a relatively short time.
Mittels der oben beschriebenen Verfahren können RNA-Stränge, DNA-Stränge und/oder PNA-Stränge sequenziert werden. Insbesondere kann als der mindestens eine Nukleinsäureeinzelstrang 10 mindestens ein Mikro-RNA-Strang sequenziert werden. Ein derartiger Mikro-RNA-Strang kann eine Anzahl von ungefähr 20 Nukleotiden, wie beispielsweise 21 bis 23 Nukleotide, aufweisen. Vorteilhafterweise muss ein derartiger Mikro-RNA-Strang vor seiner Sequenzierung nicht mehr mittels einer Restriktion fragmentiert werden. By means of the methods described above, RNA strands, DNA strands and / or PNA strands can be sequenced. In particular, as the at least one nucleic acid single strand 10 at least one micro RNA strand will be sequenced. Such a microRNA strand may have a number of about 20 nucleotides, such as 21 to 23 nucleotides. Advantageously, such a microRNA strand does not need to be fragmented by its restriction prior to its sequencing.
Die Länge eines sequenzierbaren Nukleinsäureeinzelstrangs 10 hängt von der gestreckt vorliegt Stranglänge/der Persistenzlänge ab. Somit sind in der Regel etwa 100 Basen mittels der oben erläuterten Verfahren verlässlich ermittelbar. Es wird darauf hingewiesen, dass zum Ausführen der oben beschriebenen Verfahren keine Thiol-Funktionalisierung des Nukleinsäureeinzelstrangs 10 notwendig ist. The length of a single stranded nucleic acid sequence that can be sequenced 10 depends on the stretched strand length / persistence length. Thus, as a rule about 100 bases can be reliably determined by means of the methods explained above. It should be noted that in carrying out the methods described above, there is no thiol functionalization of the nucleic acid single strand 10 necessary is.
Alle oben beschriebenen Verfahren ermöglichen eine sehr schnelle Sequenzierung. Es wird insbesondere darauf hingewiesen, dass zum Ausführen der oben beschriebenen Verfahren keine Zwischenschritte zum Entfernen eines Fluorophors nach einer Polymerisierung notwendig sind. All the methods described above allow very fast sequencing. It is particularly noted that no intermediate steps to remove a fluorophore after polymerization are necessary to carry out the above-described processes.
Mittels der oben ausgeführten Verfahren kann auch eine Detektion eines Strangtyps mit mehreren Polymerasen 16 ausgeführt werden, bei welcher amplifizierte Nukleinsäureeinzelstränge 10 gerichtet zu einem Sensor mikrofluidisch transportiert werden. By the methods outlined above, detection of one strand type with multiple polymerases can also be used 16 in which amplified nucleic acid single strands 10 directed to a sensor microfluidic transported.
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
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US 2010/0035254 A1 [0002, 0029] US 2010/0035254 A1 [0002, 0029]
