DE102012107718B4 - Calibration sample based on DNA origami - Google Patents

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Abstract

Verwendung einer Kalibrierprobe von Strukturen auf Basis von DNA-Origami, die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen, und wobei die DNA-Origami immobilisiert vorliegen, wobei die Markermoleküle Fluorophore sind zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung.Use of a calibration sample of structures based on DNA origami, which have at least two marker molecules at predetermined positions, which are spaced apart, in the DNA origami, and wherein the DNA origami are immobilized, the marker molecules being fluorophores for calibrating the three-dimensional Resolution of a measuring device.

Description

  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Kalibrierproben zur Kalibrierung bzw. Funktionsüberprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung und deren Verwendung nach Anspruch 1. Diese Kalibrierprobe weist dabei Strukturen auf Basis von DNA-Origami mit mindestens zwei Markermolekülen an vorbestimmten Positionen auf. Die mindestens zwei Markermoleküle sind dabei mit einem vorbestimmten Abstand voneinander beabstandet und die DNA-Origami liegen immobilisiert und fixiert in einem Einbettmedium, ggf. auf einem Träger, vor. Weiterhin wird ein Verfahren zur Kalibrierung zw. Funktionsüberprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung beschrieben. Schließlich wird ein Kit zum Kalibrieren einer Messeinrichtung und entsprechender Computerprogramme mit Programmcodemitteln, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert, eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird, bereitgestellt.The present invention is directed to calibration samples for the calibration or functional check of the three-dimensional resolution of a measuring device and their use according to claim 1. This calibration sample has structures based on DNA origami with at least two marker molecules at predetermined positions. The at least two marker molecules are spaced apart from one another by a predetermined distance and the DNA origami are immobilized and fixed in an embedding medium, possibly on a support. Furthermore, a method for calibration between functional testing of the three-dimensional resolution of a measuring device is described. Finally, a kit for calibrating a measuring device and corresponding computer programs with program code means, in particular stored on a machine-readable carrier, set up to carry out the method according to the invention when the computer program is carried out on a computer unit is provided.
  • Stand der TechnikState of the art
  • Eine Analyse von Proben, insbesondere der räumlichen Anordnung von Bestandteilen in dieser Probe, erfordert eine vorherige Kalibrierung bzw. Funktionsüberprüfung der Messeinrichtung, um eine zwei- und insbesondere eine dreidimensionale Auflösung zu erlauben. Eine Möglichkeit zur Kenntlichmachung der zu analysierenden Bestandteile umfasst eine Markierung der Bestandteile mit geeigneten Markermolekülen. Solche Markermoleküle umfassen sowohl solche, die optisch erkannt werden können, als auch solche, die mit anderen physikalischen Messverfahren bestimmt werden können, z. B. radioaktive Verbindungen etc.. Die Fluoreszenzmessung ist eine der Techniken, die sich gerade im Mikroskopiebereich sowohl im medizinischen als auch in biologischen Wissenschaften immer mehr in den Vordergrund schiebt. Dieses beruht unter anderem auf der Weiterentwicklung der Auflösung, z. B. durch superauflösende fluoreszenzmikroskopische Verfahren. Mit diesen superauflösenden Mikroskopietechniken ist eine Auflösung im Nanometerbereich möglich. Beispiel für solche Verfahren sind STED, (F)PALM, (d)STORM, Interferenzverfahren, SPIM, Mehrphotonenmikroskopie. Neben der hohen Auflösung erlauben solche Fluoreszenzmikroskope aber auch die Bestimmung anderer Parameter, um Informationen über die entsprechende Probe bereitzustellen. Hierzu gehört insbesondere auch die superaufgelöste räumliche Anordnung, insbesondere eine dreidimensionale Auflösung der zu analysierenden Probe.An analysis of samples, in particular the spatial arrangement of components in this sample, requires a prior calibration or functional check of the measuring device in order to allow a two-dimensional and in particular a three-dimensional resolution. One way of identifying the constituents to be analyzed involves marking the constituents with suitable marker molecules. Such marker molecules include both those that can be optically recognized and those that can be determined using other physical measurement methods, e.g. B. radioactive compounds etc. Fluorescence measurement is one of the techniques that is increasingly moving to the fore, especially in the field of microscopy in both medical and biological sciences. This is based on the further development of the resolution, e.g. B. by super-resolution fluorescence microscopic methods. With these super-resolution microscopy techniques, a resolution in the nanometer range is possible. Examples of such methods are STED, (F) PALM, (d) STORM, interference method, SPIM, multi-photon microscopy. In addition to the high resolution, such fluorescence microscopes also allow the determination of other parameters in order to provide information about the corresponding sample. This includes in particular the super-resolved spatial arrangement, in particular a three-dimensional resolution of the sample to be analyzed.
  • Weiterhin sind zur Bestimmung des Auflösungsvermögens einer Messeinrichtung z. B. eines Fluoreszenzmikroskops, Proben erforderlich, die eine definierte Anordnung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglichen. Im Falle der dreidimensionalen Mikroskopie wird dementsprechend eine Methode benötigt, die es ermöglicht, Fluoreszenzfarbstoffe in allen drei Raumrichtungen in genau definierter Weise anzuordnen. Um auch eine statistisch ausreichende Absicherung der Messungen zu erlauben, ist es notwendig, die Kalibrierung der Messeinrichtung durch Bereitstellung einer ausreichend hohen Zahl an Kalibrierproben zu erlauben. Insbesondere im superauflösenden Bereich, d. h. im Nanometerbereich, ist eine genaue Bestimmung der dreidimensionalen Auflösung erforderlich, um entsprechende Aussagen bezüglich der räumlichen Anordnung von Bestandteilen zu erlauben.Furthermore, for determining the resolving power of a measuring device, for. B. a fluorescence microscope, samples required that allow a defined arrangement of fluorescent dyes. Accordingly, in the case of three-dimensional microscopy, a method is required which enables fluorescent dyes to be arranged in all three spatial directions in a precisely defined manner. In order to allow a statistically sufficient assurance of the measurements, it is necessary to allow the calibration of the measuring device by providing a sufficiently high number of calibration samples. Especially in the super-resolution range, i.e. H. in the nanometer range, a precise determination of the three-dimensional resolution is required to allow appropriate statements regarding the spatial arrangement of components.
  • Derzeit werden zelluläre Strukturen zur Bestimmung des Auflösungsvermögens und der räumlichen Anordnung bzw. der räumlichen Parameter eingesetzt. Zelluläre Strukturen weisen aber den großen Nachteil auf, dass die Struktur nicht genau definiert ist. So wird derzeit zwar die Auflösungsgrenze dadurch bestimmt, dass die gesamte Struktur nach möglichst geringen Farbstoffabständen durchsucht wird, der kürzeste, noch auflösbare Abstand wird dann als Auflösungsgrenze definiert.Cellular structures are currently used to determine the resolving power and the spatial arrangement or spatial parameters. However, cellular structures have the major disadvantage that the structure is not precisely defined. So the resolution limit is currently determined by searching the entire structure for the smallest possible dye spacing, the shortest, still resolvable distance is then defined as the resolution limit.
  • Allerdings ist dieses Vorgehen unsystematisch und aufgrund der nicht genauen Definierbarkeit der Struktur, nicht aussagekräftig und nicht reproduzierbar, insbesondere im superauflösenden Bereich. Tatsächlich werden heutzutage in den meisten Veröffentlichungen zum Thema Fluoreszenzmikroskopie1, insbesondere im Rahmen der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in der Regel fluoreszenzmarkierte Strukturen eukaryotischer Zytoskelette, wie bspw. Mikrotubuli, Aktinfilamente oder auch Beads2 verwendet, um das Auflösungsvermögen der jeweiligen Methode nachzuweisen. Alternativ kommen Strukturen zur Anwendung, bei denen solche mit gezielter Positionierung einzelner Farbstoffmoleküle mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops verwendet werden3.However, this procedure is unsystematic and, due to the imprecise definition of the structure, it is not meaningful and cannot be reproduced, especially in the super-resolution range. In fact, most of the publications on fluorescence microscopy 1 today, especially in the context of super-resolution fluorescence microscopy, generally use fluorescence-marked structures of eukaryotic cytoskeletons, such as microtubules, actin filaments or beads 2 , in order to demonstrate the resolving power of the respective method. As an alternative, structures are used in which those with targeted positioning of individual dye molecules are used with the aid of an atomic force microscope 3 .
  • Weiterhin gibt es die Möglichkeit dreidimensionale Strukturen vor allem fluoreszenzmarkierter Proben mit Hilfe verschiedener Techniken zu untersuchen. Dabei sind im Bereich der lokalisationsbasierten Methoden Biplane2, Astigmatismus2 und das Doppel-Helix Verfahren4 zu nennen. Alle Verfahren basieren auf einer Verzerrung der Punktspreizfunktion abhängig von der Position des Emitters in z-Richtung also in der dritten Dimension. Speziell im Fall der Astigmatismus Methode kommt dabei eine Zylinderlinse im Detektionsstrahlengang zum Einsatz, die die Punktspreizfunktion von einer symmetrisch runden Form in eine asymmetrische, elliptische Form transformiert. Abhängig von der Position des Emitters ändert sich Stärke und Richtung der Verzerrung, was nach vorhergehender Kalibrierung dazu benutzt werden kann, eben die Position in z-Richtung zu bestimmen.There is also the possibility of examining three-dimensional structures, especially fluorescence-labeled samples, using various techniques. In the area of localization-based methods, Biplane 2 , Astigmatism 2 and the double helix method 4 are mentioned. All methods are based on a distortion of the point spread function depending on the position of the emitter in the z direction, ie in the third dimension. Especially in the case of the astigmatism method, a cylindrical lens is used in the detection beam path, which transforms the point spread function from a symmetrical round shape into an asymmetrical, elliptical shape. Depending on the position of the emitter, the strength and direction of the distortion change, which is used after previous calibration to determine the position in the z-direction.
  • US 2012/0166152 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Regulation der Eigenschaften von Nukleinsäurenanostrukturen. US 2012/0166152 A1 describes a method and a device for regulating the properties of nucleic acid anostructures.
  • WO 2012/058638 A2 betrifft Nukleinsäurenanostrukturen und deren Verwendung in Barcodeproben. WO 2012/058638 A2 relates to nucleic acid anostructures and their use in barcode samples.
  • Vogelsang, J. et al., ChemPhysChem, 2010, 11, 2475-2490 beschreibt Proben für die superauflösende Mikroskopie. Vogelsang, J. et al., ChemPhysChem, 2010, 11, 2475-2490 describes samples for super-resolution microscopy.
  • Steinhauer et al., Ang. Chem., 2009, 48, 8870-8873 beschreibt DNA Origami als nanoskopische Lineale zur superauflösenden Mikroskopie. Steinhauer et al., Ang. Chem., 2009, 48, 8870-8873 describes DNA origami as nanoscopic rulers for super-resolution microscopy.
  • Douglas, S.M., et al, Nature, 2009, 459, 414-418 betrifft die Selbstassemblierung von DNA in nanoskalige dreidimensionale Formen. Douglas, SM, et al, Nature, 2009, 459, 414-418 relates to the self-assembly of DNA in nanoscale three-dimensional forms.
  • Liu, W. et al, Ang. Chem., 2011, 123, 278-281 beschreibt kristalline zweidimensionale DNA Origami Arrays. Liu, W. et al, Ang. Chem., 2011, 123, 278-281 describes crystalline two-dimensional DNA origami arrays.
  • Die Nachteile dieser Systeme sind aber bereits oben ausgeführt. Es besteht daher eine Notwendigkeit geeignete Proben und Systeme bereitzustellen, die einerseits geeignet sind, das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung selbst zu bestimmen. Andererseits sollen diese Proben geeignet sein, die dreidimensionale Auflösung der Messeinrichtung zu kalibrieren.The disadvantages of these systems have already been mentioned above. There is therefore a need to provide suitable samples and systems which, on the one hand, are suitable for determining the resolution of the measuring device itself. On the other hand, these samples should be suitable for calibrating the three-dimensional resolution of the measuring device.
  • Aufgabe ist die Bereitstellung von entsprechenden Kalibrierproben, um die dreidimensionale Auflösung einer Messeinrichtung zu überprüfen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von entsprechenden Verfahren, Kits und Computerprogrammen zur Durchführung der Kalibrierung und Bestimmung der Auflösung.The task is to provide appropriate calibration samples to check the three-dimensional resolution of a measuring device. Another task is to provide appropriate methods, kits and computer programs for performing the calibration and determining the resolution.
  • Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
  • In einem ersten Aspekt ist die vorliegende Anmeldung auf die Verwendung einer Kalibrierprobe zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, mit Strukturen auf Basis von DNA-Origami die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen und wobei die DNA-Origami immobilisiert und optional fixiert in einem Einbettmedium, gegebenenfalls auf einem Träger, vorliegen nach Anspruch 1 gerichtet. Darüber hinaus wird eine Kalibrierprobe nach Anspruch 14 bereitgestellt.In a first aspect, the present application relates to the use of a calibration sample for calibrating the three-dimensional resolution of a measuring device, with structures based on DNA origami which have at least two marker molecules at predetermined positions in the DNA origami and which are spaced apart from one another the DNA origami are immobilized and optionally fixed in an embedding medium, optionally on a support, according to claim 1. In addition, a calibration sample according to claim 14 is provided.
  • Unter einer Struktur auf Basis eines DNA-Origami wird vorliegend ein DNA-Origami verstanden, gebildet aus einem Gerüst-DNA-Strang und kurzen DNA-Abschnitten, die eine vorbestimmte Struktur des Gerüststranges ausbilden. Die Struktur auf Basis eines DNA-Stranges kann weitere Komponenten umfassen, wie Farbstoffe, plasmonische Strukturen, biologische Moleküle wie Proteine, Enzyme, Nanoteilchen, und kleine Moleküle wie Biotin. Alternativ kann die Struktur auf Basis eines DNA-Origami auch lediglich aus kurzen DNA-Abschnitten aufgebaut sein5.In the present context, a structure based on a DNA origami is understood to mean a DNA origami, formed from a framework DNA strand and short DNA sections which form a predetermined structure of the framework strand. The structure based on a DNA strand can comprise further components, such as dyes, plasmonic structures, biological molecules such as proteins, enzymes, nanoparticles, and small molecules such as biotin. Alternatively, the structure based on a DNA origami can also be constructed from short DNA sections 5 .
  • Unter dem Ausdruck „kurze DNA-Abschnitte“ wird vorliegend die als „staple strands“ bezeichneten Nukleotidmoleküle verstanden, die eine Sequenz komplementär zu einem Sequenzabschnitt des Gerüst-DNA-Strangs oder eines anderen kurzen DNA-Abschnitts aufweisen. Diese kurzen DNA-Abschnitte können weiterhin dazu dienen, dem langen DNA-Strang oder einem anderen kurzen DNA-Abschnitt die vorbestimmte Struktur zu verleihen. Die Staples hybridisieren definiert durch ihre Sequenz an vorherbestimmten Stellen des Gerüst DNA-Strangs oder anderer kurzer DNA-Abschnitte. Alternativ kann es sich bei den kurzen DNA-Abschnitten um solche handeln, die in vorbestimmten Bereichen mit dem DNA-Gerüst-Strang des DNA-Origami hybridisieren.The term “short DNA sections” is understood here to mean the nucleotide molecules referred to as “staple strands”, which have a sequence complementary to a sequence section of the framework DNA strand or another short DNA section. These short sections of DNA can also serve to give the long DNA strand or another short section of DNA the predetermined structure. The staples hybridize defined by their sequence at predetermined locations on the DNA strand or other short DNA segments. Alternatively, the short DNA sections can be those which hybridize in predetermined areas with the DNA skeleton strand of the DNA origami.
  • Erfindungsgemäß können dabei in der Kalibrierprobe mindestens zwei verschiedene DNA-Origami-Strukturen vorliegen. Diese mindestens zwei verschiedenen DNA-Origami-Strukturen unterscheiden sich darin, dass die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen in der DNA-Origami-Struktur unterschiedlich voneinander beabstandet sind.According to the invention, at least two different DNA origami structures can be present in the calibration sample. These at least two different DNA origami structures differ in that the at least two marker molecules are spaced differently apart from one another at predetermined positions in the DNA origami structure.
  • Alternativ oder zusätzlich können sich diese mindestens zwei unterschiedlichen DNA-Origami-Strukturen darin unterscheiden, dass diese unterschiedliche Markermoleküle aufweisen.Alternatively or additionally, these at least two different DNA origami structures can differ in that they have different marker molecules.
  • So kann z.B. mindestens ein Paar von mindestens zwei Markermolekülen an vorbestimmten Positionen die voneinander beabstandet sind, Markermoleküle eines identischen Fluoreszenzfarbstoffes sein, während ein weiteres Paar von mindestens zwei Markermolekülen an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, durch vom ersten Markermolekül unterschiedlichen Farbstoffen ausgebildet sein, wobei diese voneinander einen anderen Abstand aufweisen als das erste Paar von Markermolekülen.For example, at least one pair of at least two marker molecules at predetermined positions which are spaced apart from one another are marker molecules of an identical fluorescent dye, while another pair of at least two marker molecules at predetermined positions which are spaced apart from one another are formed by dyes different from the first marker molecule, these being from one another have a different distance than the first pair of marker molecules.
  • Vorliegend wurde überraschend festgestellt, dass die erfindungsgemäße Verwendung der Kalibrierproben geeignet ist zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, wenn diese auf Basis einer DNA-Origami-Struktur mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, wobei diese Markermoleküle voneinander mit einem vorbekannten Abstand beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen und diese DNA-Origami immobilisiert in der Kalibrierprobe vorliegen, um die dreidimensionale Auflösung der Messeinrichtung zu bestimmen.In the present case, it was surprisingly found that the use of the calibration samples according to the invention is suitable for calibrating the three-dimensional resolution of a measuring device if it is based on a DNA origami structure at least two marker molecules at predetermined positions, these marker molecules being spaced apart from one another by a known distance, in which there are DNA origami and these DNA origami are immobilized in the calibration sample in order to determine the three-dimensional resolution of the measuring device.
  • Unter dem Ausdruck „dreidimensionale Auflösung“ wird einerseits das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung selbst verstanden. Andererseits wird unter diesem Ausdruck die semi-quantitative insbesondere quantitative Bestimmung der Beabstandung zweier Markermoleküle in X-, Y- und Z-Richtung verstanden.The term “three-dimensional resolution” is understood on the one hand to mean the resolving power of the measuring device itself. On the other hand, this expression is understood to mean the semi-quantitative, in particular quantitative, determination of the spacing of two marker molecules in the X, Y and Z directions.
  • Es wurde vorliegend festgestellt, dass bei erfindungsgemäßer Verwendung der Kalibrierproben eine sehr genaue Bestimmung der dreidimensionalen Auflösung möglich ist. Insbesondere erlauben diese Kalibrierproben eine Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung im superauflösenden Bereich, wie sie bisher unter anderem und in weiter Verbreitung durch optische Astigmatismen erreicht werden konnten, wie die oben beschriebenen zylindrischen Linsentechniken oder biplanare Bildgebung. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Kalibrierproben, die in geeigneter Art und Weise immobilisiert sind und ggf. auf einem Träger vorliegen, ist es möglich, eine dreidimensionale Kalibrierung bzw. Überprüfung der Auflösung zu erreichen, die ein einfaches und genaues Kalibrieren bzw. Überprüfen der Messeinrichtung, ggf. zum Zeitpunkt der Messung der Probe, ermöglichen. Es ist dabei besonders bevorzugt, dass die zur Bindung der DNA-Origami-Struktur mit an vorbestimmten Positionen voneinander beabstandeten Markermolekülen Elemente zur Bindung an einen Träger bevorzugt an einem Ende der Struktur vorliegen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Biotinmoleküle oder andere, dem Fachmann bekannte Moleküle mit bekannten Bindungspartnern, die entsprechend auf dem Träger angeordnet sind. Durch das Vorliegen dieser Bindungspartner an einem Ende der DNA-Origami-Struktur, die z.B. in Form einer Helix oder eines Tetraeders vorliegen können, ist es möglich, die Kalibrierprobe in gewünschter Art und Weise zur Messung durch die Messeinrichtung vorzulegen. D.h. die Kalibrierproben können vertikal, horizontal oder in einem gewünschten Winkel immobilisiert werden. Ein entsprechendes DNA-Origami kann z.B. eines sein, das ein zentrales Bündel aus zwölf Helices mit einer Länge von rund 200 Nanometer aufweist und diese an einem Ende der Struktur mehrere Biotinmoleküle haben. An diese Struktur können dann entsprechende Markermoleküle an vorbestimmten Positionen mit bekanntem Abstand positioniert werden, so dass entsprechende Kalibrierproben mit beabstandeten Markermolekülen bekannten Abstands vorliegen.It was found in the present case that when the calibration samples are used according to the invention, a very precise determination of the three-dimensional resolution is possible. In particular, these calibration samples allow the three-dimensional resolution to be calibrated in the super-resolution range, as was previously possible, among other things, and in widespread use through optical astigmatisms, such as the cylindrical lens techniques described above or biplanar imaging. When using the calibration samples according to the invention, which are immobilized in a suitable manner and possibly present on a carrier, it is possible to achieve a three-dimensional calibration or check of the resolution, which enables simple and precise calibration or checking of the measuring device, if necessary at the time of measuring the sample. It is particularly preferred that the elements for binding the DNA origami structure with marker molecules spaced apart from one another at predetermined positions are preferably present at one end of the structure for binding to a support. These are preferably biotin molecules or other molecules known to the person skilled in the art with known binding partners, which are correspondingly arranged on the support. The presence of these binding partners at one end of the DNA origami structure, which e.g. in the form of a helix or a tetrahedron, it is possible to present the calibration sample in the desired manner for measurement by the measuring device. I.e. the calibration samples can be immobilized vertically, horizontally or at a desired angle. A corresponding DNA origami can e.g. be one that has a central bundle of twelve helices with a length of around 200 nanometers and these have several biotin molecules at one end of the structure. Corresponding marker molecules can then be positioned on this structure at predetermined positions with a known distance, so that corresponding calibration samples with spaced marker molecules with a known distance are present.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wie bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Kalibrierproben, weisen die DNA-Origami, die als Kalibrierprobe eingesetzt werden, Fluorophore als Markermoleküle auf. Diese Fluorophore zeigen dabei unterschiedliche Emissionsspektren. D.h., die DNA-Origami haben Fluorophore als Markermoleküle mit Fluorophoren und unterschiedlichen Emissionsspektren, die an vorbestimmten Positionen in einem bekannten Abstand positioniert sind.In a preferred embodiment, such as when using the calibration samples according to the invention, the DNA origami which are used as the calibration sample have fluorophores as marker molecules. These fluorophores show different emission spectra. That is, the DNA origami have fluorophores as marker molecules with fluorophores and different emission spectra, which are positioned at predetermined positions at a known distance.
  • In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Struktur auf Basis der DNA-Origami um eine tetraedrische Struktur. Dabei werden an allen vier Ecken des tetraedischen Origamis Farbstoffmoleküle angebracht, im einfachsten im Folgenden beschriebenem Fall jeweils 1 Farbstoffmolekül. Jeweils 3 dieser Farbstoffmoleküle liegen dabei in einer Ebene, der dadurch definierten x-y Ebene und liefern einen Auflösungsstandard in x-y-Richtung. Der jeweils vierte Farbstoff befindet sich in der x-y Projektion innerhalb des durch die ersten 3 Farbstoffe gebildeten Dreiecks und in einem definierten Abstand von der dadurch gebildeten Ebene in z-Richtung und liefert dadurch einen Auflösungsstandard in dieser Raumrichtung.In a further embodiment, the structure based on the DNA origami is a tetrahedral structure. Dye molecules are attached to all four corners of the tetrahedral origami, in the simplest case described below, 1 dye molecule each. In each case 3 of these dye molecules lie in one plane, the x-y plane defined thereby, and provide a resolution standard in the x-y direction. The fourth dye in each case is located in the x-y projection within the triangle formed by the first 3 dyes and at a defined distance from the plane formed in the z direction and thereby provides a resolution standard in this spatial direction.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung der Kalibrierproben mit Strukturen auf Basis von DNA-Origami besitzen mehrere Hunderte an möglichen Anbindungsstellen für Fluoreszenzfarbstoffe. Jede Anbindungsstelle kann individuell besetzt werden, sowohl was Anzahl als auch Art des Farbstoffs betrifft. Somit ist es erfindungsgemäß möglich, eine genau definierte dreidimensionale Verteilung von Punktlichtquellen bzw. Fluoreszenzfarbstoffen zu generieren. Diese erlauben dann eine entsprechende Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, wie z.B. eines superauflösenden Fluoreszenzmikroskops.The use according to the invention of the calibration samples with structures based on DNA origami has several hundreds of possible connection points for fluorescent dyes. Each connection point can be filled individually, both in terms of number and type of dye. It is therefore possible according to the invention to generate a precisely defined three-dimensional distribution of point light sources or fluorescent dyes. These then allow a corresponding calibration of the three-dimensional resolution of a measuring device, e.g. of a super-resolution fluorescence microscope.
  • Diese DNA-Origami sind immobilisiert. Bevorzugt sind diese weiterhin in einem Einbettmedium fixiert wie bei der erfindungsgemäßen Kalibrierprobe nach Anspruch 14. Mögliche Einbettmedien sind übliche Einbettmedien, die mit der Fluoreszenz des Farbstoffes idealerweise nur fluoreszenzverstärkend interagieren Als geeignetes Einbettungsmedium kann z.B. ein Material aus Polyvinylalcohol und Glycerin eingesetzt werden. Alternativ kann die Kalibrierprobe einfach in Puffer oder in Zellkulturmedium vorliegen.These DNA origami are immobilized. These are preferably also fixed in an embedding medium as in the calibration sample according to the invention as claimed in claim 14. Possible embedding media are conventional embedding media which ideally only interact with the fluorescence of the dye in a fluorescence-enhancing manner. a material made of polyvinyl alcohol and glycerin can be used. Alternatively, the calibration sample can simply be present in buffer or in cell culture medium.
  • Weiterhin können die Kalibrierproben auf einem Träger angeordnet sein, insbesondere auf einem transparenten Träger, wie Glas. Dem Fachmann sind entsprechende geeignete Methoden zur Fixierung der DNA-Origami auf dem Träger bekannt. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine entsprechende Fixierung auf dem Träger mit Hilfe des Biotin/Avidin Systems, rein elektrostatisch oder anderen bekannten Systemen erfolgt.Furthermore, the calibration samples can be arranged on a carrier, in particular on a transparent carrier, such as glass. Appropriate suitable methods for fixing the DNA origami on the support are known to the person skilled in the art. According to the invention, it is preferred that a corresponding fixation on the carrier with the aid of the Biotin / Avidin Systems, purely electrostatic or other known systems.
  • Unter dem Ausdruck „DNA“, wie er vorliegend verwendet wird, werden nicht nur Stränge von Desoxynukleinsäure verstanden, sondern auch analoge Strukturen, wie Stränge von Ribonukleinsäuren, PNA, usw.The term “DNA” as used in the present context means not only strands of deoxynucleic acid, but also analogous structures, such as strands of ribonucleic acids, PNA, etc.
  • Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Kalibrierproben und der erfindungsgemäßen Kalibrierproben ist es möglich, eine definierte dreidimensionale Verteilung von Markermolekülen, insbesondere Farbstoffmolekülen, innerhalb eines beugungsbegrenzten Punktes bereitzustellen. Diese Anordnung ist im Wesentlichen nur mit Hilfe der DNA-Origami-Technik möglich. Ein weiterer Vorteil hiervon ist, dass durch parallelisierte Herstellung Millionen von Kalibrierproben hergestellt werden können. Diese Kalibrierproben eignen sich besonders als Standards für die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, sind aber auch hervorragend im Bereich der beugungsbegrenzten Mikroskopie einsetzbar. Die Möglichkeit der definierten Anordnung der Farbstoffmoleküle bei gleichzeitig superparallelisierter Herstellung ist durch keine herkömmliche Technik gegeben. Bei erfindungsgemäßen Kalibrierproben ist zudem ein hoher Grad an Skalierbarkeit von sowohl der hergestellten Proben möglich als auch der Flexibilität was die Anzahl und Art der verwendeten Farbstoffe betrifft. Durch Bereitstellen von ggf. auf Trägern vorliegenden eingebetteten Kalibrierproben ist es möglich, diese über einen längeren Zeitraum zu lagern und zu versenden, d.h. die Kalibrierproben erfordern keine vor Ort Synthese durch den Anwender. Dadurch kann eine Fehlerquelle ausgeschaltet werden.When using the calibration samples and the calibration samples according to the invention, it is possible to provide a defined three-dimensional distribution of marker molecules, in particular dye molecules, within a diffraction-limited point. This arrangement is essentially only possible with the help of the DNA origami technique. Another advantage of this is that millions of calibration samples can be produced by parallel production. These calibration samples are particularly suitable as standards for super-resolution fluorescence microscopy, but are also excellent for use in the field of diffraction-limited microscopy. The possibility of the defined arrangement of the dye molecules with simultaneous super-parallel production is not provided by any conventional technology. In the case of calibration samples according to the invention, a high degree of scalability of both the samples produced and the flexibility with regard to the number and type of dyes used is also possible. By providing embedded calibration samples, if applicable, on carriers, it is possible to store and send them over a longer period, i.e. the calibration samples do not require on-site synthesis by the user. This can eliminate a source of error.
  • Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben sind insbesondere geeignet zur Verwendung bei der Kalibrierung oder Überprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, insbesondere eines Fluoreszenzmikroskops, wie für superauflösende Fluoreszenzmikroskopie.The calibration samples according to the invention are particularly suitable for use in the calibration or checking of the three-dimensional resolution of a measuring device, in particular a fluorescence microscope, such as for super-resolution fluorescence microscopy.
  • Die Kalibierproben können, wie oben beschrieben, in einem Einbettmedium und ggf. auf einen Träger fixiert vorliegen. Dabei können die Kalibrierproben als separate Proben vorliegen. Alternativ können die Kalibrierproben auch als interne Kalibrierproben in einer zu analysierenden Probe vorliegen. D.h., es ist erfindungsgemäß möglich, die Kalibrierproben immobilisiert in der zu analysierenden Probe vorzulegen um so zur internen Kalibrierung zu dienen.As described above, the calibration samples can be present in an embedding medium and optionally fixed on a support. The calibration samples can be available as separate samples. Alternatively, the calibration samples can also be present as internal calibration samples in a sample to be analyzed. That is, it is possible according to the invention to present the calibration samples immobilized in the sample to be analyzed in order to serve for internal calibration.
  • Bei Einsatz der Kalibrierproben als interne Kalibrierproben in der zu analysierenden Probe kann ein bisher nicht bekannter Grad an Genauigkeit erreicht werden. Damit können die Dimensionen in der zu analysierenden Probe im Nanometerbreich genauer bestimmt und die Dimensionen der einzelnen Bestandteile genauer berechnet werden. Im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Techniken, z.B. unter Markierung von Aktinfilamenten etc. kann nun eine höhere Genauigkeit der Größendimensionen erreicht werden.When using the calibration samples as internal calibration samples in the sample to be analyzed, a previously unknown degree of accuracy can be achieved. This allows the dimensions in the sample to be analyzed to be determined more precisely in the nanometer range and the dimensions of the individual components to be calculated more precisely. In contrast to the techniques previously used, e.g. by marking actin filaments etc., a higher accuracy of the size dimensions can now be achieved.
  • In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Kalibrierprobe zur Kalibrierung der Messeinrichtung zur dreidimensionalen Auflösung dieser Messeinrichtung um z.B. das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung zu bestimmen oder die Dimensionen in X-, Y- und Z-Richtung zu kalibrieren.In a further aspect, the present invention is directed to the use of a calibration sample according to the invention for calibrating the measuring device for three-dimensional resolution of this measuring device by e.g. to determine the resolution of the measuring device or to calibrate the dimensions in the X, Y and Z directions.
  • Unter dem Ausdruck „Kalibrierung“ oder „Kalibrieren“ wird dabei vorliegend verstanden eine Messgröße anhand einer oder mehrerer Referenzproben zu quantifizieren oder die Eigenschaften wie die Sensitivität einer Apparatur zu bestimmen. Soweit nicht anders ausgeführt, wird hierunter auch verstanden, dass die Funktionsfähigkeit der Messeinrichtung überprüft wird, wie eine korrekte Justierung, Aberrationen, wie chromatische Aberrationen, etc, die entsprechend korrigiert werden können.The term “calibration” or “calibration” is understood here to quantify a measured variable on the basis of one or more reference samples or to determine the properties such as the sensitivity of an apparatus. Unless stated otherwise, this also means that the functionality of the measuring device is checked, such as correct adjustment, aberrations, such as chromatic aberrations, etc., which can be corrected accordingly.
  • Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben und die erfindungsgemäße Verwendung von Kalibrierproben können aber auch in anderen Messbereichen eingesetzt werden, beziehungsweise erfolgen z.B. im Bereich der Absorptionsmessung oder im Bereich der Raman-Spektroskopie. Die Einsatzmöglichkeiten hängen auch von den ausgewählten Markermolekülen ab. Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben sind insbesondere als Standards für die Messeinrichtungen, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie, wie die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie geeignet. Im Gegensatz zu den bisher im Stand der Technik beschriebenen Techniken, wie die Markierung von eukaryotischen Zytoskeletten z.B. Tubulin oder Aktinfilamente ist gerade im superauflösenden Bereich, d.h. im Nanometerbereich, eine genaue Bestimmung des Auflösungsvermögens der Messeinrichtung selbst bzw. eine Kalibrierung der Messeinrichtung auf die Größendimensionen erfindungsgemäß möglich, um genaue Aussagen zu den Größen und Abständen sowie dem Auflösungsvermögen machen zu können.The calibration samples according to the invention and the use of calibration samples according to the invention can, however, also be used in other measuring ranges, or take place e.g. in the field of absorption measurement or in the field of Raman spectroscopy. The possible uses also depend on the selected marker molecules. The calibration samples according to the invention are particularly suitable as standards for the measuring devices, in particular for fluorescence microscopy, such as super-resolution fluorescence microscopy. In contrast to the techniques previously described in the prior art, such as the labeling of eukaryotic cytoskeletons e.g. Tubulin or actin filaments is particularly in the super-resolution range, i.e. In the nanometer range, a precise determination of the resolution of the measuring device itself or a calibration of the measuring device to the size dimensions according to the invention is possible in order to be able to make precise statements about the sizes and distances as well as the resolution.
  • Die Kalibrierproben haben zudem den Vorteil, dass sie sehr beständig und lagerfähig sind. Bei den Strukturen auf DNA-Origami-Basis als Kalibrierprobe ist die definierte und vorbestimmte Struktur eine, die besonders robust ist. Eine chemische Fixierung, wie sie z.B. bei Zytoskelettproben notwendig ist, ist bei DNA-Origami-Strukturen nicht erforderlich. Als weiterer Vorteil ergibt sich dadurch, dass die Langlebigkeit der Kalibrierproben verbessert ist.The calibration samples also have the advantage that they are very stable and storable. With structures based on DNA origami as a calibration sample, the defined and predetermined structure is one that is particularly robust. A chemical fixation, e.g. is necessary for cytoskeletal samples, is not necessary for DNA origami structures. Another advantage is that the longevity of the calibration samples is improved.
  • In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Kalibrierung bzw. Überprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung nach Anspruch 7. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung einer erfindungsgemäßen Kalibrierprobe. Dieses Verfahren wird insbesondere zur Kalibrierung eines Fluoreszenzmikroskops, insbesondere zur superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Eine entsprechende dreidimensionale Auflösung ist dabei < 200 nm, insbesondere < 100 nm. Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben erlauben insbesondere Auflösungsvermögen in einem Bereich von < 50 nm, wie < 20 nm zu erzielen. In a further aspect, the present application is directed to a method for calibrating or checking the three-dimensional resolution of a measuring device according to claim 7. This method includes the use of a calibration sample according to the invention. This method is used in particular for the calibration of a fluorescence microscope, in particular for super-resolution fluorescence microscopy. A corresponding three-dimensional resolution is <200 nm, in particular <100 nm. The calibration samples according to the invention in particular allow resolving power to be achieved in a range of <50 nm, such as <20 nm.
  • In einer Ausführungsform sind die Kalibrierproben zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren derart ausgebildet, dass die Markermoleküle, insbesondere Fluorophore aufweisen, die an vorbestimmten Positionen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.In one embodiment, the calibration samples for use in the method according to the invention are designed such that the marker molecules, in particular fluorophores, are present in different numbers at predetermined positions.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren eines mit den Schritten: Bereitstellen einer Kalibrierprobe wie in den Ansprüchen definiert, Messen der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit unter vorbestimmten Anregungsleistungen zur Anregung der Markermoleküle in Form von Fluorophoren unter Berücksichtigung der räumlichen Orientierung der Markermoleküle zueinander, mit geeigneten Sensoren, Kalibrieren der Messeinrichtung auf Basis der Messung der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit mit einem Sensor, bevorzugt mit Hilfe einer Rechnereinheit.In a preferred embodiment, the method according to the invention is one with the steps of: providing a calibration sample as defined in the claims, measuring the calibration sample under predetermined conditions, in particular measuring the emitted photons per unit of time under predetermined excitation powers to excite the marker molecules in the form of fluorophores, taking into account the spatial orientation of the marker molecules to one another, with suitable sensors, calibration of the measuring device based on the measurement of the calibration sample under predetermined conditions, in particular measurement of the emitted photons per unit of time with a sensor, preferably with the aid of a computer unit.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere für die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, d.h. für Auflösungsvermögen im Nanometerbereich. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Messung bei gegebener Anregungsleistung durch eine Lichtquelle im Stande ist, das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung zu bestimmen bzw. einen hohen Grad an Genauigkeit der Dimensionierung zu erreichen, wie sie bisher nicht erreicht werden konnte oder nur unter hohem Aufwand.The methods according to the invention are particularly suitable for super-resolution fluorescence microscopy, i.e. for resolving power in the nanometer range. The method according to the invention is characterized in that the measurement at a given excitation power by a light source is able to determine the resolving power of the measuring device or to achieve a high degree of accuracy of the dimensioning, which has not hitherto been achievable or only to a high degree Expenditure.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist in einer Ausführungsform bevorzugt eines, bei dem die Kalibrierprobe in einer zu analysierenden Probe als interne Kalibrierprobe vorliegt.In one embodiment, the method according to the invention is preferably one in which the calibration sample is present as an internal calibration sample in a sample to be analyzed.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist wie ausgeführt zur Bestimmung des Auflösungsvermögens eines Fluoreszenzmikroskops geeignet. In einer Ausführungsform können dabei verschiedene Kalibrierproben unterschiedlicher Markierung eingesetzt werden. Dieses erlaubt eine einfache Bestimmung des Auflösungsvermögens aufgrund der Auflösbarkeit der farblich unterschiedlich markierten Kalibrierproben.As stated, the method according to the invention is suitable for determining the resolving power of a fluorescence microscope. In one embodiment, different calibration samples with different markings can be used. This allows a simple determination of the resolving power due to the solubility of the differently colored calibration samples.
  • Weiterhin ist es möglich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die immobilisiert vorliegenden Kalibrierproben mit dem vorbestimmten Abstand derart gemessen werden, dass die dreidimensionalen Größen der Bestandteile in der zu analysierenden Probe bestimmt werden können.Furthermore, it is possible for the method according to the invention to measure the immobilized calibration samples with the predetermined distance in such a way that the three-dimensional sizes of the constituents in the sample to be analyzed can be determined.
  • Mit entsprechender Rechnerunterstützung kann dabei einfach eine Projektion der Kalibrierprobe und entsprechend der Bestandteil der zu analysierenden Probe in den entsprechenden XY-, XZ- und YZ-Ebenen erfolgen. Ggf. ist eine Korrektur der berechneten Werte in einer der Dimensionen, z.B. in der Z-Dimension notwendig. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt uns z.B. den entsprechenden Skalierfaktor Z zu bestimmen, der notwendig ist, um die Vergrößerung durch den Brechungsindexsprung z.B. an der Deckglas-Puffer-Grenze, zu korrigieren. Ein Beispiel hierfür wird unten ausgeführt.With the appropriate computer support, the calibration sample and the component of the sample to be analyzed can be easily projected in the corresponding XY, XZ and YZ planes. Possibly. is a correction of the calculated values in one of the dimensions, e.g. necessary in the Z dimension. The method according to the invention allows us e.g. to determine the corresponding scaling factor Z, which is necessary in order to increase the magnification through the refractive index jump e.g. at the cover slip buffer limit. An example of this is given below.
  • Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den erfindungsgemäßen Kalibrierproben ist es möglich einfach sowohl Auflösungsvermögen der Messeinrichtung als auch die entsprechende Dimensionierung in XYZ-Richtung zu bestimmen, da die Länge der Kalibrierproben bekannt ist und diese Kalibrierproben weiterhin derart steif sind, dass ein Verbiegen nur um wenige Nanometer möglich ist. Somit kann einfach eine gute Bestimmung der Längen im dreidimensionalen Raum erfolgen.With the aid of the method according to the invention with the calibration samples according to the invention, it is possible to easily determine both the resolving power of the measuring device and the corresponding dimensioning in the XYZ direction, since the length of the calibration samples is known and these calibration samples are still so stiff that bending is only a few Nanometer is possible. This means that the lengths can easily be determined in three-dimensional space.
  • Weiterhin beschreibt die Anmeldung ein Kit zur Kalibrierung einer Messeinrichtung, insbesondere einer Messeinrichtung zur Messung von Fluoreszenz, umfassend eine erfindungsgemäße Kalibrierprobe.Furthermore, the application describes a kit for calibrating a measuring device, in particular a measuring device for measuring fluorescence, comprising a calibration sample according to the invention.
  • Schließlich stellt die vorliegende Anmeldung ein Computerprogramm mit Programmcodemitteln, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert, eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird, bereit.Finally, the present application provides a computer program with program code means, in particular stored on a machine-readable carrier, set up to carry out the method according to the invention when the computer program is carried out on a computer unit.
  • Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele erläutert, ohne dass sie auf diese beschränkt ist.The invention is explained with the aid of the following examples, without being restricted thereto.
  • Beispiele:Examples:
  • Die verwendete DNA-Origami Struktur besteht aus einem zentralen 12-Helix Bundle und einer Basis bestehend aus drei kürzeren 6 Helix-Bundle Strukturen. Die Länge des zentralen 12-Helix-Bundle beträgt etwa 200nm und die 3 sechs-Helix-Bundle besitzen eine Länge von etwa 20nm. Die nicht modifizierten und modifizierten kurzen DNA Abschnitte (staple strands) wurden von MWG (München, Deutschland) oder IBA (Göttingen, Deutschland) in Konzentration von 100µM erhalten und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die DNA Origami Strukturen wurden hergestellt unter Verwendung eines Verhältnis von 1:30 zwischen viralem Gerüst-DNA Strang und unmodifizierten Staples sowie einem entsprechendem Verhältnis von 1:100 zu den mit z.B. Farbstoffmolekülen markierten Staples. Zur Herstellung der Gerüst-Stränge aus viraler DNA wurden E. coli Stamm K91 mit den entsprechenden M13MP18 Phagen infiziert und nach Amplifikation wurden die Phagen-Partikel abgetrennt aufgereinigt und die Einzel-Strang-DNA extrahiert6. Die Konzentration wurde entsprechend auf 100 nmol eingestellt. Die Strukturen wurden in einem Thermocycler auf etwa 95°C erhitzt und innerhalb von 3 Tagen auf 20°C abgekühlt. Der Faltungspuffer enthält 12,5 mM MgCl2 genauso wie 5 mM Tris und 1 mM EDTA (pH 7.9 bei 20°C). In der 1a ist schematisch eine entsprechende Rocket DNA-Origami dargestellt. Die fertig „gefalteten“ Strukturen wurde von den überschüssigen Staples und den unvollständig gefalteten DNA Origami Strukturen durch Gel-Elektrophorese aufgereinigt und anschließend mit „Squeeze and Freeze“ (Biorad) Zentrifungenfiltern von den Gelrückständen getrennt.The DNA origami structure used consists of a central 12 helix bundle and a base consisting of three shorter 6 helix bundle structures. The length of the central 12 helix Bundle is about 200nm and the 3 six-helix bundles are about 20nm long. The unmodified and modified short DNA sections (staple strands) were obtained from MWG (Munich, Germany) or IBA (Göttingen, Germany) in a concentration of 100µM and used without further purification. The DNA origami structures were produced using a ratio of 1:30 between the viral framework DNA strand and unmodified staples and a corresponding ratio of 1: 100 to the staples labeled with, for example, dye molecules. To produce the framework strands from viral DNA, E. coli strain K91 was infected with the corresponding M13MP18 phages and after amplification the phage particles were separated off and the single-strand DNA extracted 6 . The concentration was adjusted accordingly to 100 nmol. The structures were heated to about 95 ° C in a thermal cycler and cooled to 20 ° C within 3 days. The folding buffer contains 12.5 mM MgCl 2 as well as 5 mM Tris and 1 mM EDTA (pH 7.9 at 20 ° C). In the 1a a corresponding Rocket DNA origami is shown schematically. The finished “folded” structures were cleaned from the excess staples and the incompletely folded DNA origami structures by gel electrophoresis and then separated from the gel residues using “squeeze and freeze” (biorad) centrifuge filters.
  • Die DNA-Origami wurden optional auf den Trägern durch ein Polymer eingedeckt, hergestellt unter Verwendung von 10 g „Mowiol 488“ (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland), 25 g Glycerin und 100 ml 0,1 Tris (pH 7,2 gepuffert). Als Träger wurden verwendet: Standard Objektträger und Deckgläser für Fluoreszenzmikroskope. Als Markermoleküle wurden verwendet: Alexa647. Die Bindung der Markermoleküle an die entsprechenden kurzen DNA-Abschnitte erfolgte gemäß bekannten Verfahren.The DNA origami were optionally covered on the supports by a polymer, produced using 10 g "Mowiol 488" (Carl Roth, Karlsruhe, Germany), 25 g glycerol and 100 ml 0.1 Tris (pH 7.2 buffered) . The slides used were: standard slides and cover glasses for fluorescence microscopes. The following were used as marker molecules: Alexa647. The marker molecules were bound to the corresponding short DNA sections in accordance with known methods.
  • DNA-Origami ImmobilisierungDNA origami immobilization
  • Zur Immobilisierung der DNA-Origami wurden verschiedene Verfahren eingesetzt. Eine chemische Immobilisierung erfolgte mittels BSA-Biotin/BSA Neutravidin Oberflächen7. Alternativ erfolgte eine Elektrostatische Immobilisierung entweder durch Beschichtung der Oberfläche mit PLL (Biochrom, Berlin, Deutschland) oder durch Zugabe von MgCl2 zu der Lösung.Various methods were used to immobilize the DNA origami. Chemical immobilization was carried out using BSA-Biotin / BSA neutravidin surfaces 7 . Alternatively, electrostatic immobilization was carried out either by coating the surface with PLL (Biochrom, Berlin, Germany) or by adding MgCl 2 to the solution.
  • Superauflösende Bildgebung in mehreren FarbenSuper-resolution imaging in multiple colors
  • Die superauflösende Mehrfarbenmikroskopie wurde auf einem inversen Olympus IX-71 Stativ durchgeführt mit TIRF (Total internal reflection) Anregung. Als Objektiv wurde ein UPlanSApo 100x NA=1,4 von Olympus verwendet. Zur Anregung wurden drei verschiedene Laser verwendet: Sapphire 488 (λ = 488 nm, Coherent, Dieburg, Deutschland), Sapphire 568 (λ = 568 nm, Coherent) and ibeam smart (λ = 639nm, Toptica Photonics, München, Deutschland). Die Lasernlinien wurden über einen triple-band Strahlenteiler (Chroma z476-488/568/647, AHF Analysentechnik) für blaue und rote Anregung und über einen single-band Strahlenteiler (Semrock, Laser BS z561, AHF) eingekoppelt. Abhängig von der Anregungswellenlänge wurde die Fluoreszenz mit einem der folgenden Filtern gefiltert: Semrock BrightLine Exciter 531/40 (blau), Semrock BrightLine HC 609/54 (gelb), Semrock RazorEdge LP 488 RS, Semrock RazorEdge LP 647 RS (beide rot, alle AHF Analysentechnik). Die Fluoreszenz wurde mit einer EMCCD Kamera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Nordirland) mit einer Integrationszeit von 8.6 ms aufgzeichnet. Die effektive Pixelgröße betrug 100 nm. Die Messungen wurden auf einer BSA-Biotin-neutravidin Oberfläche und einem Umgebungspuffer bestehend aus 50 mM TRIS pH 8.0, 10 mM NaCI, 12,5 mM MgCI2, 1% w/w Glukose, 10 % v/v enzymatisches Sauerstoffentzugssystem und 140 mM 2-mercaptoethanol.The super-resolution multicolor microscopy was carried out on an inverse Olympus IX-71 tripod with TIRF (Total internal reflection) excitation. A UPlanSApo 100x NA = 1.4 from Olympus was used as the lens. Three different lasers were used for the excitation: Sapphire 488 (λ = 488 nm, Coherent, Dieburg, Germany), Sapphire 568 (λ = 568 nm, Coherent) and ibeam smart (λ = 639nm, Toptica Photonics, Munich, Germany). The laser lines were coupled in via a triple-band beam splitter (Chroma z476-488 / 568/647, AHF analysis technology) for blue and red excitation and via a single-band beam splitter (Semrock, Laser BS z561, AHF). Depending on the excitation wavelength, the fluorescence was filtered with one of the following filters: Semrock BrightLine Exciter 531/40 (blue), Semrock BrightLine HC 609/54 (yellow), Semrock RazorEdge LP 488 RS, Semrock RazorEdge LP 647 RS (both red, all AHF analysis technology). The fluorescence was recorded with an EMCCD camera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) with an integration time of 8.6 ms. The effective pixel size was 100 nm. The measurements were carried out on a BSA-biotin-neutravidin surface and an environmental buffer consisting of 50 mM TRIS pH 8.0, 10 mM NaCl, 12.5 mM MgCl 2, 1% w / w glucose, 10% v / v Enzymatic oxygen deprivation system and 140 mM 2-mercaptoethanol.
  • Standards für die UltrahochauflösungsbildgebungStandards for ultra high resolution imaging
  • Die ultrahochauflösende Mikroskopie wurde durch schrittweises Fotobleichen und Rekonstruktion der Punktspreizfunktionen der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe durchgeführt. Dazu wurde der rote Kanal des Versuchsaufbaus wie im Abschnitt „Superauflösende Bildgebung in mehreren Farben“ verwendet. Die Integrationszeit der Kamera betrug hier 50 ms. Der verwendete Farbstoff war Atto647N in 1xPBS, darin enthalten 12,5 mM MgCI2, 1 % w/w Glukose, 10 % enzymatisches Sauerstoffentzugssystem, 2 mM Methylviologen und 2 mM Ascorbinsäure.The ultrahigh-resolution microscopy was carried out by step-by-step photo-bleaching and reconstruction of the point spread functions of the respective fluorescent dyes. For this purpose, the red channel of the experimental setup was used as in the section "Super-resolution imaging in multiple colors". The integration time of the camera was 50 ms. The dye used was Atto647N in 1xPBS, containing 12.5 mM MgCl2, 1% w / w glucose, 10% enzymatic oxygen deprivation system, 2 mM methyl viologen and 2 mM ascorbic acid.
  • Beispiel 1 Standard für 3D-superauflösende BildgebungExample 1 Standard for 3D super-resolution imaging
  • Zwei- und dreidimensionale superauflösende Bildgebung wurde durchgeführt auf einem Olympus IX-71 Stativ mit TIRF Beleuchtung unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv (Olympus UPlanSApo N 100x, NA = 1.40). Zur Beleuchtung wurde ein Single-mode Diodenlaser (λ = 644 nm, ibeam smart, Toptica Photonics, München, Deutschland) verwendet. Zusätzlich wurde ein Single-mode Diodenlaser (λ = 532 nm, MPB Communications, Montreal, Canada) oder (λ = 488 nm, ibeam smart, Toptica Photonics, München) zur Reaktivierung der Farbstoffe verwendet8. Der rote Laser wurde durch einen Clean-up Filter spektral aufgereinigt (Brightline HC 650/13, AHF Analysentechnik, Tübingen, Deutschalnd) und in das Mikroskop über einen Dual-Band Beamsplitter (z532/658 rpc, AHF Analysentechnik) eingekoppelt. Das Fluoreszenzlicht wurde spektral gefiltert durch einen Emissionsfilter (HQ 700/75 M, AHF Analysentechnik) und von einer EMCCD Kamera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Nordirland) detektiert. Die effektive Pixelgröße auf der Kamera war 100 nm. Für dreidimensionale Aufnahmen wurde eine Zylinderlinse (Thorlabs, Newton, USA) mit einer fokalen Länge von einem Meter in den Detektionsstrahlengang eingebracht1. Die Proben wurden für die Messungen auf einer BSA-Biotin-Neutravidin Oberfläche immobilisiert. Die Puffer während der Messung bestand aus PBS mit 500 mM MgCl2, 10% w/w Glucose, 10% v/v enzymatischer Sauerstoffentzug, 140 mM 2-Mercaptoethanol.Two- and three-dimensional super-resolution imaging was carried out on an Olympus IX-71 tripod with TIRF illumination using an oil immersion objective (Olympus UPlanSApo N 100x, NA = 1.40). A single-mode diode laser (λ = 644 nm, ibeam smart, Toptica Photonics, Munich, Germany) was used for the lighting. In addition, a single-mode diode laser (λ = 532 nm, MPB Communications, Montreal, Canada) or (λ = 488 nm, ibeam smart, Toptica Photonics, Munich) was used to reactivate the dyes 8 . The red laser was spectrally cleaned by a clean-up filter (Brightline HC 650/13, AHF analysis technology, Tübingen, Germany) and coupled into the microscope via a dual-band beam splitter (z532 / 658 rpc, AHF analysis technology). The fluorescent light was spectrally filtered by an emission filter (HQ 700/75 M, AHF analysis technology) and by an EMCCD camera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Northern Ireland). The effective pixel size on the camera was 100 nm. A cylindrical lens (Thorlabs, Newton, USA) with a focal length of one meter was inserted into the detection beam path for three-dimensional images 1 . The samples were immobilized on a BSA-biotin-neutravidin surface for the measurements. The buffer during the measurement consisted of PBS with 500 mM MgCl 2 , 10% w / w glucose, 10% v / v enzymatic oxygen deprivation, 140 mM 2-mercaptoethanol.
  • Zur Kalibrierung der 3D-Lokalisierung wurde ein Deckgläschen mit immobilisierten Beads (Fluospheres Invitrogen) verwendet. Die Kalibrierung wurde durchgeführt durch Bewegen des Objektivs in Schritten von 50 nm in Z-Richtung mit Hilfe eines Pifoc (Physikinstrumente, Karlsruhe, Deutschland). In jeder Position wurden die Beads mittels einer zweidimensionalen elliptischen Gauss-Funktion gefittet und daraus die Breite Wx in x-Richtung Wy in y-Richtung der PSF ebenso wie die Höhe h, der Hintergrund b und die Koordinaten des Mittelpunkts xo und yo (Figure 2a). F ( x , y ) = h * e x p ( ( x x 0 ) 2 2 * W x 2 ( y y 0 2 ) 2 * W y 2 ) + b
    Figure DE102012107718B4_0001
    A cover slip with immobilized beads (Fluospheres Invitrogen) was used to calibrate the 3D localization. The calibration was carried out by moving the objective in steps of 50 nm in the Z direction with the aid of a Pifoc (physics instruments, Karlsruhe, Germany). In each position, the beads were fitted using a two-dimensional elliptical Gauss function and the width W x in the x direction W y in the y direction of the PSF as well as the height h, the background b and the coordinates of the center xo and yo ( Figure 2a). F ( x , y ) = H * e x p ( - ( x - x 0 ) 2nd 2nd * W x 2nd - ( y - y 0 2nd ) 2nd * W y 2nd ) + b
    Figure DE102012107718B4_0001
  • Die Differenz zwischen Wx und Wy wurde gegen die Position in z aufgetragen und mit einer polynomialen Funktion gefittet (2b).The difference between W x and W y was plotted against the position in z and fitted with a polynomial function ( 2 B) .
  • Diese Funktion wurde zur Berechnung der Z-Positionen aus den gemessenen PSF herangezogen. Die Kalibrierung wurde dann getestet durch Lokalisieren eines einzelnen Beads während das Objektiv in 50 Nanometer Schritten in Z-Richtung bewegt wurde (2c).This function was used to calculate the Z positions from the measured PSF. The calibration was then tested by locating a single bead while moving the lens in 50 nanometer steps in the Z direction ( 2c ).
  • 2a zeigt die gemessenen Breiten der PSF in X- und Y-Richtung, erhalten mittels eines Beads in Abhängigkeit von der Z-Position des Objektivs. B zeigt die Differenz von Wx und Wy angepasst mittels polynomialer Funktion. 2c zeigt den Test zur Lokalisierung unter Verwendung eines Fluoreszenzbeads wobei in regulären Schritten von 50 Nanometer in Z-Richtung jeweils 30 Frames genommen wurden. 2a shows the measured widths of the PSF in the X and Y directions, obtained by means of a bead as a function of the Z position of the objective. B shows the difference between W x and W y adjusted using a polynomial function. 2c shows the test for localization using a fluorescent bead, 30 frames being taken in regular steps of 50 nanometers in the Z direction.
  • Die Analyse der 3D-Daten erfolgt mittels Spot-Finding Algorithmus. Die Spots wurden mit Hilfe einer elliptischen Gaussfunktion gefittet, wie oben beschrieben, dies ergibt die Koordinaten in X und Y genauso wie die Peakhöhe (h). Die Z-Koordinate wurde unter Verwendung der Breiten der PSF in X- und Y-Richtung genauso wie mit Hilfe der Kalibrierungskurve für (Wx - Wy) berechnet (siehe 2). Der Z-Wert für den Wx - Wy der Kalibrierungskurve gleich ist mit Wx - Wy des Spots, ergibt die Koordinate in Z.The 3D data is analyzed using a spot-finding algorithm. The spots were fitted using an elliptical Gaussian function, as described above, this gives the coordinates in X and Y as well as the peak height (h). The Z coordinate was calculated using the widths of the PSF in the X and Y directions as well as using the calibration curve for (W x - W y ) (see 2nd ). The Z value for the W x - W y of the calibration curve is equal to W x - W y of the spot, gives the coordinate in Z.
  • Zur objektiven und schnellen Auswertung der Daten aus der Messungen, also zur Bestimmung der Distanz zwischen den Markermolekülen angebracht am 3D DNA-Origami (Rocket DNA-Origami) wurde ein Algorithmus entwickelt der automatisch potentielle DNA-Origami Strukturen identifiziert und den entsprechenden Abstand zwischen den Markermolekülen bestimmt.For the objective and quick evaluation of the data from the measurements, i.e. to determine the distance between the marker molecules attached to the 3D DNA origami (Rocket DNA origami), an algorithm was developed that automatically identifies potential DNA origami structures and the corresponding distance between the marker molecules certainly.
  • Dieser Algorithmus arbeitet dabei wie folgt: Um die erhaltenen Lokalisierungen jeweils dem entsprechenden Origami zu zuordnen, wurden die erzeugten superaufgelösten Bilder zunächst durch Faltung mit einer Gauß-Funktion geglättet. In diesen Bildern konnten die einzelnen Origami-Strukturen dann per Spoterkennungsalgorithmus detektiert werden. Für jeden detektierten Spot wurden alle Lokalisierungen, die in einem definierten Bereich um die Mitte des Spots lagen, einem Cluster zugeordnet. Das größere Problem bestand nun in der darauffolgende Zuordnung der Lokalisierungen zu den beiden Teilclustern, die je einem Farbstoffmolekül entsprechen. Dafür wurde zunächst diejenige Gerade g bestimmt, welche den Parameter ε = ( | ξ i ( ξ i ) | ) ( ξ i ( ξ i ) ) 2
    Figure DE102012107718B4_0002
    maximiert, wobei ξi die Projektion der i-ten Lokalisierung auf die Gerade g bezeichnet. Um die ε-maximierende Gerade g zu finden, wurde der Richtungsvektor zunächst in 10°- und dann in 1°-Schritten in Θ und φ variiert. Die Gerade g konnte nun als gute Näherung an die Verbindungslinie zwischen den beiden Subclustern betrachtet werden. Die dieser Geraden zugehörigen ξi wurden histogrammiert und anschließend mit zwei Gauß-Funktionen gefittet, woraus die beiden Peakpositionen ξmax,1 und ξmax,2 erhalten wurden. Um nun die Lokalisierungen zu trennen, wurde einen Ebene E so definiert, dass sie zum einen senkrecht auf g liegt und zum anderen den Punkt M enthält, welcher auf g an der Stelle ξ S c h n i t t = ξ max ,1 + ξ max ,2 2
    Figure DE102012107718B4_0003
    liegt. Der Punkt M approximiert die Mitte zwischen den beiden Teilclustern, sodass E das Cluster in seine beiden Teilcluster auftrennt. Im Idealfall enthielt nun jedes Teilcluster alle Lokalisierungen von je einem Farbstoffmolekül. Der Abstand der Farbstoffmoleküle wurde nun aus dem Abstand der Schwerpunkte der beiden Teilcluster bestimmt.
    This algorithm works as follows: In order to assign the localizations obtained to the corresponding origami, the generated super-resolution images were first smoothed by convolution using a Gaussian function. The individual origami structures in these images could then be detected using a spot detection algorithm. For each detected spot, all localizations that were in a defined area around the center of the spot were assigned to a cluster. The bigger problem now was the subsequent assignment of the localizations to the two sub-clusters, each of which corresponds to a dye molecule. For this purpose, the straight line g that determined the parameter was first determined ε = ( | ξ i - ( ξ i ) | ) ( ξ i - ( ξ i ) ) 2nd
    Figure DE102012107718B4_0002
    maximized, where ξ i denotes the projection of the i-th localization onto the straight line g. In order to find the ε-maximizing line g, the direction vector was first varied in 10 ° and then in 1 ° steps in Θ and φ. The straight line g could now be seen as a good approximation to the connecting line between the two subclusters. The ξ i associated with this straight line were histogramed and then fitted with two Gauss functions, from which the two peak positions ξ max, 1 and ξ max, 2 were obtained. In order to separate the localizations, a plane E was defined so that on the one hand it is perpendicular to g and on the other hand it contains the point M, which is on g at the point ξ S c H n i t t = ξ Max ,1 + ξ Max , 2nd 2nd
    Figure DE102012107718B4_0003
    lies. The point M approximates the middle between the two partial clusters, so that E separates the cluster into its two partial clusters. Ideally, each sub-cluster now contained all the localizations of one dye molecule. The distance between the dye molecules was now determined from the distance between the centers of gravity of the two subclusters.
  • ErgebnisResult
  • Die Rocket DNA-Origami Alex A 647 Farbstoff ist schematisch in der 1a dargestellt. In den 1b bis d sind die Punktwolken für die Lokalisierung der Farbstoffe am oberen und unteren Ende der Rocket sowie ihre Projektion in XY-, XZ- und YZ-Ebene dargestellt. Einige der Rocket DNA-Origami waren im Wesentlichen vertikal während andere horizontal oder in einem Winkel zwischen 0 und 90° angeordnet waren. Um die Orientierung und die Länge der DNA-Origami zu berechnen wurde die Z-Komponente dahingehend korrigiert, dass der Berechnungsindex korrigiert wurde, der sich aus dem Unterschied zwischen dem Deckglas und dem Puffer ergibt. Dieser wurde experimentell mit 0,61 bestimmt (s. 2). Die Rocket DNA-Origami Strukturen zeigten eine Längenverteilung mit einer durchschnittlichen Länge von 180 +/- 12 Nanometer. Der vorbestimmte Abstand zwischen den beiden Farbstoffen lag bei 200 Nanometer. Es gab auch keinen Unterschied in den Abständen zwischen stehenden und liegenden Rocket DNA-Origami was die Lokalisierungsgenauigkeit, Photonenzahl und Anzahl der Lokalisierungen betrifft. Die Verteilung der räumlichen Orientierung der einzelnen DNA-Origamis sind in der 1f dargestellt.The Rocket DNA origami Alex A 647 dye is shown schematically in the 1a shown. In the 1b to d are the point clouds for the localization of the dyes at the top and bottom of the Rocket and their projection in the XY, XZ and YZ planes. Some of the Rocket DNA origami were essentially vertical, while others were horizontal or at an angle between 0 and 90 degrees. In order to calculate the orientation and the length of the DNA origami, the Z component was corrected by correcting the calculation index, which results from the difference between the cover slip and the buffer. This was determined experimentally at 0.61 (see 2nd ). The Rocket DNA origami structures showed a length distribution with an average length of 180 +/- 12 nanometers. The predetermined distance between the two dyes was 200 nanometers. There was also no difference in the distances between standing and lying Rocket DNA origami in terms of localization accuracy, number of photons and number of localizations. The distribution of the spatial orientation of the individual DNA origami is in the 1f shown.
  • Deutlich ist aus der 1e die Eignung der erfindungsgemäßen Kalibrierproben zur Kalibrierung von Messeinrichtungen zu erkennen. Dieses wird insbesondere auch aus den 1b, 1c und 1d deutlich, die darlegen, dass in allen drei Richtungen auf allen drei Ebenen eine entsprechende Bestimmung erfolgen kann. Somit wird deutlich, dass die vorliegenden Kalibrierproben eine einfache Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung erlaubt.
  1. 1. Huang, B., Wang, W., Bates, M. & Zhuang, X. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science 319, 810-813 (2008).
  2. 2. Juette, M.F. et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature methods 5, 527-529 (2008).
  3. 3. Cordes, T. et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano letters 10, 645-651 (2010).
  4. 4. Thompson, M.A., Casolari, J.M., Badieirostami, M., Brown, P.O. & Moerner, W.E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 17864-17871 (2010).
  5. 5. Wei, B., Dai, M. & Yin, P. Complex shapes self-assembled from singlestranded DNA tiles. Nature 485, 623-626 (2012).
  6. 6. Castro, C.E. et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods 8, 221-229 (2011).
  7. 7. Piestert, O. et al. A Single-Molecule Sensitive DNA Hairpin System Based on Intramolecular Electron Transfer. Nano letters 3, 979-982 (2003).
  8. 8. Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M. & Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society 127, 3801-3806 (2005).
It is clear from the 1e to recognize the suitability of the calibration samples according to the invention for the calibration of measuring devices. This is particularly evident from the 1b , 1c and 1d clearly demonstrate that a corresponding determination can be made in all three directions on all three levels. It is thus clear that the present calibration samples allow a simple calibration of the three-dimensional resolution of a measuring device.
  1. 1. Huang, B., Wang, W., Bates, M. & Zhuang, X. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science 319, 810-813 (2008) .
  2. 2nd Juette, MF et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature methods 5, 527-529 (2008) .
  3. 3rd Cordes, T. et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano letters 10, 645-651 (2010) .
  4. 4th Thompson, MA, Casolari, JM, Badieirostami, M., Brown, PO & Moerner, WE Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 17864-17871 (2010) .
  5. 5. Wei, B., Dai, M. & Yin, P. Complex shapes self-assembled from singlestranded DNA tiles. Nature 485, 623-626 (2012) .
  6. 6. Castro, CE et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods 8, 221-229 (2011) .
  7. 7. Piestert, O. et al. A Single-Molecule Sensitive DNA Hairpin System Based on Intramolecular Electron Transfer. Nano letters 3, 979-982 (2003) .
  8. 8th. Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M. & Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society 127, 3801-3806 (2005) .
  • Claims (15)

    1. Verwendung einer Kalibrierprobe von Strukturen auf Basis von DNA-Origami, die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen, und wobei die DNA-Origami immobilisiert vorliegen, wobei die Markermoleküle Fluorophore sind zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung.Use of a calibration sample of structures based on DNA origami, which have at least two marker molecules at predetermined positions, which are spaced apart, in the DNA origami, and wherein the DNA origami are immobilized, the marker molecules being fluorophores for calibrating the three-dimensional Resolution of a measuring device.
    2. Verwendung einer Kalibrierprobe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Origami weiterhin Elemente zur Bindung dieser DNA-Origami an einem Träger aufweisen, bevorzugt angeordnet an nur einem Ende der Struktur, wobei diese Elemente zur Bindung an einem Träger bevorzugt Biotin sind.Using a calibration sample after Claim 1 , characterized in that the DNA origami furthermore have elements for binding these DNA origami to a carrier, preferably arranged at only one end of the structure, these elements for binding to a carrier preferably being biotin.
    3. Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Origami Fluorophore als Markermoleküle mit unterschiedlichen Emissionsspektren an vorbestimmten Positionen aufweisen.Use of a calibration sample according to one of the preceding claims, characterized in that the DNA origami have fluorophores as marker molecules with different emission spectra at predetermined positions.
    4. Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Strukturen auf Basis von DNA-Origami eine dreidimensionale Struktur ist, bevorzugteine Tetraeder-Struktur oder eine Struktur mit zentraler Helix-Bundle und einer Basis mit kürzeren Helix-Bundle Strukturen.Use of a calibration sample according to one of the preceding claims, wherein the structure based on DNA origami is a three-dimensional structure, preferably a tetrahedral structure or a structure with a central helix bundle and a base with shorter helix bundle structures.
    5. Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung eines Fluoreszenzmikroskops für die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie.Use a calibration sample according to one of the Claims 1 to 4th for calibrating the three-dimensional resolution of a fluorescence microscope for super-resolution fluorescence microscopy.
    6. Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese als interne Kalibrierproben in einer zu analysierenden Probe vorliegt.Use of a calibration sample according to one of the preceding claims, characterized in that it is present as internal calibration samples in a sample to be analyzed.
    7. Verfahren zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kalibrierung eine Kalibrierprobe definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4 verwendet wird.Method for calibrating the three-dimensional resolution of a measuring device, characterized in that a calibration sample is defined in one of the calibration Claims 1 to 4th is used.
    8. Verfahren nach Anspruch 7 zur Kalibrierung eines Fluoreszenzmikroskops, insbesondere zur superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie.Procedure according to Claim 7 for calibrating a fluorescence microscope, especially for super-resolution fluorescence microscopy.
    9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die dreidimensionale Auflösung < 200 nm, insbesondere < 100 nm ist. Procedure according to one of the Claims 7 or 8th , the three-dimensional resolution being <200 nm, in particular <100 nm.
    10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluorophore in der Kalibrierungsprobe an den vorbestimmten Positionen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.Procedure according to one of the Claims 7 to 9 , characterized in that the fluorophores in the calibration sample are present in different numbers at the predetermined positions.
    11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 mit den Schritten: - Bereitstellen einer Kalibrierprobe definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, - Messen der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit unter vorbestimmten Anregungsleistungen zur Anregung der Markermoleküle in Form von Fluorophoren unter Berücksichtigung der räumlichen Orientierung der Markermoleküle zueinander, mit geeigneten Sensoren, - Kalibrieren der Messeinrichtung auf Basis der Messung der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit mit einem Sensor, bevorzugt mit Hilfe einer Rechnereinheit.Procedure according to one of the Claims 7 to 10th with the steps: - providing a calibration sample defined in one of the Claims 1 to 4th , - Measurement of the calibration sample under predetermined conditions, in particular measurement of the emitted photons per unit of time under predetermined excitation powers for excitation of the marker molecules in the form of fluorophores, taking into account the spatial orientation of the marker molecules to one another, with suitable sensors, - Calibration of the measuring device based on the measurement of the calibration sample under predetermined conditions, in particular measuring the emitted photons per unit of time with a sensor, preferably with the aid of a computer unit.
    12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 7 bis 11, wobei die Kalibrierprobe in einer analysierenden Probe als interne Kalibrierprobe vorliegt.Method according to one of the previous ones Claims 7 to 11 , the calibration sample being present in an analyzing sample as an internal calibration sample.
    13. Computerprogramm mit Programmcodemitteln eingerichtet zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird.Computer program with program code means set up to carry out the method according to one of the Claims 7 to 11 when the computer program is executed on a computing unit.
    14. Kalibrierprobe zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrich- tung mit Strukturen auf Basis von DNA-Origami, die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen, und wobei die Markermoleküle Fluorophore sind und wobei die DNA-Origami immobilisiert und in einem Einbettmedium fixiert vorliegen.Calibration sample for calibrating the three-dimensional resolution of a measuring device with structures based on DNA origami, which have at least two marker molecules at predetermined positions, which are spaced apart, in the DNA origami, and wherein the marker molecules are fluorophores and wherein the DNA Origami immobilized and fixed in an embedding medium.
    15. Kalibrierprobe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Markermoleküle Fluorophore sind, wobei die Fluorophore als Markermoleküle mit unterschiedlichen Emissionsspektren an vorbestimmten Positionen vorliegen.Calibration sample after Claim 14 , characterized in that the marker molecules are fluorophores, the fluorophores being present as marker molecules with different emission spectra at predetermined positions.
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