DE102012020496A1 - Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 and/or neurofibromatosis type 1-associated tumor from sample of a patient for treating the patient with the tumor, comprises detecting protein or its fragment in sample - Google Patents

Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 and/or neurofibromatosis type 1-associated tumor from sample of a patient for treating the patient with the tumor, comprises detecting protein or its fragment in sample

Info

Publication number
DE102012020496A1
DE102012020496A1 DE201210020496 DE102012020496A DE102012020496A1 DE 102012020496 A1 DE102012020496 A1 DE 102012020496A1 DE 201210020496 DE201210020496 DE 201210020496 DE 102012020496 A DE102012020496 A DE 102012020496A DE 102012020496 A1 DE102012020496 A1 DE 102012020496A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nf1
tumor
proteins
patient
rantes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE201210020496
Other languages
German (de)
Inventor
Nikola Holtkamp
Andreas Kurtz
Su-Jin Park
Petra Reinke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Charite Universitaetsmedizin Berlin filed Critical Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority to DE201210020496 priority Critical patent/DE102012020496A1/en
Publication of DE102012020496A1 publication Critical patent/DE102012020496A1/en
Application status is Ceased legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Abstract

Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 (NF1) and/or an NF1-associated tumor, comprises detecting at least one protein consisting of e.g. tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha ), interferon-gamma (IFN-gamma ) , epidermal growth factor receptor (EGFR), and insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) or its fragment in a sample from a patient. The presence of one of these proteins or fragments in different concentrations compared to their concentration in a reference sample indicates the presence and/or the development of a NF1 or NF1-associated tumor. Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 (NF1) and/or an NF1-associated tumor, comprises detecting at least one protein consisting of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha ), interferon-gamma (IFN-gamma ) , epidermal growth factor receptor (EGFR), insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) and human platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) or its fragment in a sample from a patient. The presence of one of these proteins or fragments in different concentrations compared to their concentration in a reference sample indicates the presence and/or the development of a NF1 or NF1-associated tumor. Independent claims are included for: (1) use of TNF-alpha , IFN-gamma , EGFR, IGFBP1 and/or RANTES specific reagents or agents for the diagnosis and/or early detection of NF1 and/or an NF1-associated tumor, where the reagents or agents are from an antibody or fragment of aptamer and spiegelmers; (2) use of IFN-gamma , TNF-alpha , EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and/or IL-6 as a serum marker or a reagent for the detection of these proteins in serum for diagnosis and/or early detection of NF1 and/or NF1-associated tumor; (3) use of a kit in the method, where the kit comprises reagents specific for the detection of the protein or its fragments, and the reagents include antibodies or their fragments; (4) use of an agent that is a modulator of one of the proteins for the preparation of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and/or NF1 associated tumor, where the patient is diagnosed according to the invitro method; and (5) use of an anti-tumor agent for the manufacture of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and/or a NF1 associated tumor, where the patient is diagnosed according to the invitro method. ACTIVITY : Cytostatic. MECHANISM OF ACTION : Neurofibromatosis type 1 inhibitor.

Description

  • Gebiet der Erfindung Field of the Invention
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose sowie Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des Zellwachstums, insbesondere krankhaftes Zellwachstum mit einer genetischen Ursache, einschließlich Störungen, die mit dem Verlust von Tumor-Suppressor-Funktionen verbunden sind. The present invention relates to methods for diagnostics and drugs for the treatment of disorders of cell growth, in particular pathological cell growth with a genetic cause, including disorders associated with the loss of tumor suppressor functions. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Diagnose, Früherkennung und Behandlung von Erkrankungen der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sowie NF1 assoziierter Tumore. In particular, the present invention relates to the diagnosis, early detection and treatment of diseases of the neurofibromatosis type 1 (NF1) and NF1-associated tumors.
  • Hintergrund der Erfindung Background of the Invention
  • Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine autosomal-dominant vererbbare Multiorganerkrankung mit unterschiedlich stark ausgeprägten Symptomen innerhalb der Haut, des Knochens und/oder des Nervensystems und der Neigung zu benignen und malignen Tumoren des Nervensystems. Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant inherited multi-organ disease with varying degrees of symptoms within the skin, bone and / or the nervous system and the tendency to benign and malignant tumors of the nervous system. NF1 basiert auf Mutationen des NF1-Gens, welches für Neurofibromin, ein Tumorsuppressorgen (negativer Regulator des Ras-Signalwegs) kodiert und auf dem Chromosom 17/g11.2 lokalisiert ist. NF1 is based on mutations of the NF1 gene, which is encoding neurofibromin, a tumor suppressor gene (negative regulator of Ras signaling pathway), and located on chromosome 17 / G11.2. Die Krankheit zeigt eine vollständige Penetranz, das heißt, dass alle Personen mit einer NF1-Mutation auch klinische Symptome entwickeln [1–4]. The disease is fully penetrant, meaning that all people with NF1 mutation develop clinical symptoms [1-4]. NF1 ist eine seltene Erkrankung mit einer Prävalenz von 30–40 Fällen pro 100000 Einwohner; NF1 is a rare disease with a prevalence of 30-40 cases per 100,000 population; ein Kind von 3000 bis 4000 Geburten ist betroffen. a child of 3000 to 4000 births is affected. Es wird geschätzt, dass 50% der Fälle durch eine Neumutation im NF-1-Gen verursacht wird. It is estimated that 50% of the cases caused by a new mutation in the NF-1 gene.
  • Die Diagnose von NF1 erfolgt bisher größtenteils mittels klinischer Diagnostik anhand von Kardialsymptomen (> 5 Cafe-au Lait-Flecken bei 95% der Patienten, kutane Tumore bei > 90% der Patienten), jedoch ist gerade bei Kinder mit wenig ausgeprägten Symptomen oder bei Patienten mit NF1-Sonderformen eine klinische Diagnosestellung oft sehr schwierig. A diagnosis of NF1 so far largely by clinical diagnosis based on Kardialsymptomen (> 5 Cafe-au-lait spots in 95% of patients, cutaneous tumors in> 90% of patients), but especially for children with little pronounced symptoms or in patients with NF1 special forms a clinical diagnosis often very difficult.
  • Eines der bezeichnensten Eigenschaften von NF1 ist die Entwicklung eines beginnenden peripheren Nervenscheidentumors, welcher an jeder beliebigen Stelle des Körpers auftreten kann. One of the most designated properties of NF1 is the development of an incipient peripheral nerve sheath tumor, which may occur at any point of the body. Während kutane Neurofibrome (cNF) zumeist sichtbar und tastbar sind, sind subkutane Neurofibrome, interne plexiform Neurofibrome (PNF) und maligne periphere Nervenscheidentumore (MPNST) zumeist schwierig zu detektieren, zu quantifizieren oder zu überwachen [4]. While cutaneous neurofibromas (CNF) are usually visible and palpable, subcutaneous neurofibromas, internal plexiform neurofibroma are (PNF), and malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST) mostly difficult to detect, quantify or monitor [4]. 4,6–10% aller Patienten mit einer NF-1 können maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) entwickeln ( 4.6 to 10% of all patients with NF-1 develop malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST) ( ). ).
  • MPNST sind die häufigste Ursache für eine verkürzte Lebensdauer von NF1 Patienten und führen zum Tod, wenn sie nicht frühzeitig entdeckt und behandelt werden. MPNST are the most common cause of a shortened life of NF1 patients and lead to death if not detected early and treated. Dieser bösartige Tumor entwickelt sich bei NF1-Patienten aus vorbestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen. This malignant tumor develops in NF1 patients from pre-existing benign plexiform neurofibromas. Die erste Form der Behandlung ist die selektive Resektion von beginnenden PNF, und die radikale operative Entfernung von MPNST [5–8]. The first form of treatment is the selective resection of early PNF, and the radical surgical removal of MPNST [5-8]. Auf Grund des invasiven Wachstumsmusters von MPNST wird häufig die komplette Entfernung des Tumors verhindert, besonders wenn dieser erst spät diagnostiziert wird. Due to the invasive growth pattern of MPNST the complete removal of the tumor is prevented frequently, especially when it is diagnosed late. Darüber hinaus können Chemo- und Radiotherapie die Wiederkehr des Tumors zwar verzögern, jedoch hat diese Behandlung nur einen geringen Effekt auf das Langzeitüberleben [7, 9]. In addition, chemotherapy and radiotherapy can delay the recurrence of the tumor while, but this treatment has little effect on the long-term survival [7, 9]. Das lebenslange Risiko einen MPNST zu entwickeln wurde bei NF1 Patienten mit 8–13% bestimmt und ist mehr als 100-mal höher in NF1 Patienten gemessen an der Normalbevölkerung. The lifetime risk of developing a MPNST was determined in NF1 patients with 8-13% and is more than 100 times higher measured in NF1 patients in the general population.
  • Darüber hinaus entwickeln viele NF1 Patienten in einem sehr jungen Alter von ungefähr 30 Jahren [10, 11] einen malignen peripheren MPNST, verglichen zu dem Durchschnittsalter von 62 Jahren nach Diagnosestellung in der Normalbevölkerung [12]. In addition, many NF1 patients develop malignant peripheral MPNST at a very young age of about 30 years [10, 11], compared to the average age of 62 years after diagnosis in the general population [12]. Da MPNST sich durch den malignen Verlauf eines vorher existierenden PNF entwickelt, steigt das Risiko von NF1 Patienten mit PNF um bis zu 50% [12, 13]. Since MPNST developed by the malignant course of a pre-existing PNF, increases the risk of NF1 patients with PNF by up to 50% [12, 13].
  • Darüber hinaus kann die Diagnosestellung sehr lange dauern, bei Kindern einige Jahre oder sogar erst im Erwachsenenalter erfolgen, je nach Wissens- und Erfahrungsstand der diagnostizierenden Ärzte (Kinderärzte, Hautärzte, Neurologen). In addition, the diagnosis may take a long time, done in children several years or even until adulthood, depending on the knowledge and experience of the doctors diagnosed (pediatricians, dermatologists, neurologists). Eine NF1-Gendiagnostik (Nachweis von Mutationen im NF1-Gen (derzeit sind über 100 verschiedene Mutationen bekannt) ist möglich, jedoch sehr kostspielig, auch ist keine 100%ige Sensitivität möglich, (siehe auch A NF1 genetic diagnosis (detection of mutations in the NF1 gene (currently more than 100 different mutations known) is possible, but very costly, not even 100% sensitivity is possible (see also ). ). Größe des Gens, multiple Mutation Sites und mehrere Pseudogene haben eine direkte molekulare Analyse des NF1-Gens zudem technisch schwierig gemacht und begrenzen so den Nutzen und die Praktikabilität der Gen-basierten diagnostischen Techniken und Behandlungsmethoden. Size of the gene mutation multiple sites and multiple pseudogenes have also made a direct molecular analysis of the NF1 gene technically difficult and thus limit the usefulness and practicality of gene-based diagnostic techniques and treatment methods.
  • Dermale und oberflächliche Neurofibrome unterliegen direkten Messungen durch optische oder Ultraschallverfahren [14], während PNF und MPNST zumeist nur nach dem Auftreten klinischer Symptome diagnostiziert werden. Dermal neurofibromas and superficial subject to direct measurements by optical or ultrasonic methods [14], while PNF and MPNST are usually diagnosed only after the appearance of clinical symptoms. Systematische Analysen der internen Tumorlast von NF1 Patienten bei Ganzkörper-Magnetresonanztomographie (MRT) weisen zudem auf einen Zusammenhang zwischen dem Risiko einen MPNST zu entwickeln und der internen PNF Tumorlast hin [15]. Systematic analysis of the internal tumor load of NF1 patients with whole-body magnetic resonance imaging (MRI) also suggest a link between the risk of developing a MPNST and internal PNF tumor burden down [15]. Weiterhin lassen sich Mithilfe von bildgebenden Verfahren wie der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) bösartige von gutartigen Tumoren unterscheiden, jedoch nicht mit 100% Spezifität. Furthermore, by using imaging techniques such as positron emission tomography (PET), however, not possible to distinguish malignant from benign tumors, with 100% specificity. Diese bildgebenden Verfahren können zwar hilfreich sein bei der Differenzierung gutartiger und bösartiger Tumore, sind aber auf Grund der hohen Kosten und der Strahlenbelastung als regelmäßige Früherkennungsmaßnahme ungeeignet. While these imaging techniques may be useful in the differentiation of benign and malignant tumors, but are not suitable as a regular early action due to the high cost and radiation exposure. Hinzu kommt, dass die Gefahr einer Tumorinduktion durch Bestrahlung bei NF1-Patienten größer ist als in der Normalbevölkerung. In addition, the risk of tumor induction by irradiation in NF1 patients is greater than in the normal population.
  • Aufgrund der schwierigen klinischen Diagnostik wäre eine Unterstützung der NF1 Diagnose durch Biomarker sinnvoll. Due to the difficult clinical diagnostics support the NF1 diagnostic biomarkers would be useful. Bisher wurde die Suche nach Ersatz-Biomarkern, um frühzeitig das Risiko für eine maligne Transformation eines Patienten identifizieren zu können auf der Grundlage der Annahme durchgeführt, dass die Überexpression von Proteinen in PNF und MPNST zu einer erhöhten systemischen Konzentration führen würden [16–19]. So far, the search was for a replacement biomarkers to early identify the risk of malignant transformation of a patient carried out based on the assumption that the overexpression of proteins in PNF and MPNST would lead to increased systemic concentration [16-19] , In In wurde beschrieben, dass in humanen MPNST-Tumoren eine erhöhte Expression von EGFR-Transkripten vorliegt. has been described that in human MPNST tumors increased expression of EGFR transcripts present. In der internationalen Anmeldung In the international application WO 2010/022166 A2 WO 2010/022166 A2 , werden verschiedene miRNAs (MicroRNA (MiRNA)) als Markerkandidaten zur Diagnose von NF1 und MPNST vorgeschlagen. Different miRNAs (microRNA (miRNA)) as a marker candidates for the diagnosis of NF1 and MPNST are proposed. Nukleinsäure basierende Nachweistechniken haben allerdings den Nachteil, dass die Aufarbeitung der Probe aufwendig ist und meist eine Biopsie erfordert sowie mRNAs und miRNAs schnellerem Abbau unterliegen was zu verfälschten Ergebnissen führen kann. However, nucleic acid-based detection techniques have the disadvantage that the processing of the sample is complex and often requires a biopsy and mRNAs and miRNAs faster susceptible to degradation which can lead to erroneous results.
  • Als eine mögliche Alternative werden Proteine als Biomarker diskutiert, deren Vorliegen in Körperflüssigkeiten einen einfacheren Nachweis erlauben würde. As a possible alternative proteins are discussed as a biomarker whose presence would allow an easier detection in body fluids. Beispielsweise wurde beschrieben, dass das Serumlevel für die Wachstumsfaktoren Midkine (MK) und dem Stammzellfaktor (SCF) signifikant in einer Kohorte von 39 NF1 Patienten erhöht vorlag, jedoch wurde keine Korrelation mit der Tumorlast zu MPNST gefunden [20]; For example, it was reported that the serum level of growth factors midkine (MK) and the stem cell factor (SCF) was significantly existed increased in a cohort of 39 NF1 patients, but no correlation was found with tumor burden to MPNST [20]; siehe auch die internationale Patentanmeldung see also International Patent Application WO 00/31541 A2 WO 00/31541 A2 , welche Midkine als Marker zur Prognose für NF1 vorschlägt. , Proposing as a marker for prognosis for NF1 which midkine.
  • Kürzlich wurde das Meloma inhibierende Aktivität/cd-rap (MIA) Protein als ein Marker für die interne Tumorlast in einer Kohorte von 42 NF1 Patienten [21] identifiziert. Recently, the inhibitory activity Meloma / cd-rap identified (MIA) protein as a marker for the internal tumor burden in a cohort of 42 patients NF1 [21]. MIA wurde bereits früher als ein Biomarker für maligne neuroektotermale Tumore postuliert [22]. MIA has previously been as a biomarker for malignant tumors neuroektotermale postulated [22]. In einer anderen Studie wurden 92 Gene, die für putativ sekretierte Proteine in Neurofibrome und MPNST kodieren, als mögliche Marker analysiert [23]. In another study, 92 genes encoding putative secreted proteins in neurofibromas and MPNST, as potential markers analyzed [23]. Nur für eines von diesen, Adrenomedullin (ADM), konnte bestätigt werden, dass es differenziell exprimiert und erhöht im Serum von NF1 Patienten vorlag. Only one of these, adrenomedullin (ADM), it could be confirmed that it differentially expressed and increased in the serum of NF1 patients present. Eine weitere noch erhöhtere Serumkonzentration wurde in einer kleinen Gruppe von MPNST Patienten gefunden (n = 5). Another even more elevated serum concentration was found in a small group of MPNST patients (n = 5).
  • Daher gibt es zwar Ansätze, die Expression von Markerproteinen zur Diagnose von Neurofibromatose Typ 1 zu nutzen, jedoch lassen sowohl die bisherigen Nukleinsäure-basierenden Verfahren wie auch die jüngsten Protein-gestützten Nachweisverfahren zur Diagnose von NF1 und assoziierten Tumoren noch keine Aussage zu, die ähnlich verlässlich wie die klinische Diagnose ist. Therefore, although there are approaches to use the expression of marker proteins for the diagnosis of neurofibromatosis type 1, but leave both the nucleic acid-based methods to date as well as the recent protein-based detection methods for diagnosis of NF1 and associated tumors no statement that is similar is reliable as clinical diagnosis. Daher besteht Bedarf an einem technisch einfach durchzuführenden, zuverlässigen und vorzugsweise kostengünstigen Verfahren zur Diagnose und Früherkennung für NF1 und NF1 assoziierter Tumore. Therefore, there is a need for a technically simple to carry out, reliable and preferably low-cost method for the diagnosis and early detection of NF1 NF1 and associated tumors.
  • Zusammenfassung der Erfindung Summary of the Invention
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der neurokutanen Tumorerkrankungen, insbesondere den Nachweis von bestimmten Biomarkern, welche charakteristisch für NF1 Erkrankungen sind. The present invention relates to the technical field of neurocutaneous tumor diseases, in particular the detection of specific biomarkers that are characteristic of NF1 diseases. Durch die vorliegende Erfindung wird ein einfaches, schnelles, zuverlässiges und kostengünstiges Verfahren zur Diagnose/Früherkennung dieser Erkrankungen bereitgestellt sowie neue Zielmoleküle als Angriffspunkte zu deren Behandlung. The present invention provides a simple, fast, reliable and cost effective method for the diagnosis / early detection of these diseases is provided as well as new target molecules as targets for their treatment.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Identifizierung von einem Set von Biomarkern in Serum, mit deren Nachweis es möglich ist NF1 und assoziierte Tumore frühzeitig zu diagnostizieren, und vorteilhafterweise zwischen der Ausprägung bzw. Vorhandensein von NF1, NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST) und plexiformen Neurofibromen (PNF) zu differenzieren und zudem die Tumorlast in NF1-Patienten zu bestimmen, was beispielweise hilfreich in der Dosierung einer Chemotherapie ist. The present invention is based on the successful identification of a set of biomarkers in serum, with their detection, it is possible to diagnose NF1 and associated tumors at an early stage, and advantageously between the expression or presence of NF1 NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST), and to differentiate plexiform neurofibromas (PNF), and also to determine the tumor burden in NF1 patients, which is useful, for example in the dosage of chemotherapy. Das erfindungsgemäße Set von Bio- bzw. Serummarker umfasst Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Faktor-BB (PDGF-BB) sowie Fragmente davon. The set of organic or serum markers of the invention comprises tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), interferon gamma (IFNgamma), epidermal growth factor receptor (EGFR), insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) and human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and fragments thereof.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP-1, RANTES und PDGF-BB oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. In particular, the present invention relates to an in vitro method for diagnosis and / or early diagnosis of neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or a NF1 associated tumor, comprising detecting at least one protein selected from the group consisting of TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP -1, RANTES and PDGF-BB, or a fragment of one of these proteins in a sample from a patient, wherein the presence of one of these proteins or fragments thereof in a different concentration compared to its concentration in a reference sample the presence and / or the development of a NF1 indicating or a NF1 associated tumor. Vorteilhafterweise werden 2, 3, 4, 5 oder alle Serummarker zum Nachweis ausgewählt. Advantageously, 2, 3, 4, 5 or all of the serum markers are selected for detection. Alternativ oder zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis weiterer, im Stand der Technik beschriebene Biomarker umfassen wie Midkine und vorzugsweise Interleukin 6 (IL-6), dass in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten erstmals als NF1-Marker im Serum validiert werden konnte. Alternatively or additionally, the inventive method can further evidence, described in the prior art as biomarkers comprise midkine and preferably interleukin 6 (IL-6), that in accordance with the invention performed experiments it could be validated as NF1 markers in the serum for the first time. Dabei weisen die vier Macker TNF-α, EGFR, IFNγ und IL-6 eine veränderte Serumkonzentration in NF1-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden auf. The four markers TNF-α, EGFR, IFNg and IL-6 have an altered serum concentration in NF1 patients as compared to healthy subjects. Die drei Marker IGFBP1, RANTES und PDGF-BB zeigen eine signifikant veränderte Konzentration in NF1-Patienten, die einen malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) oder ein plexiformes Neurofibrom (PNF) aufweisen, verglichen zu NF1-Patienten ohne MPNST oder PNF, wobei die IGFBP1 Konzentration zudem mit der Tumorlast in einem NF1-Patienten korreliert. The three markers IGFBP1, RANTES and PDGF-BB show a significantly altered concentration in NF1 patients having a malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) or a plexiform neurofibroma (PNF) which compared to NF1 patients without MPNST or PNF, wherein the IGFBP1 concentration also correlated with tumor burden in a NF1 patients.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor wobei (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; In a particularly preferred embodiment, the present invention in vitro method for diagnosis and / or early detection relates with neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or a NF1 associated tumor wherein (a) an increased concentration of TNF-alpha, IFN gamma, and / or IL- 6 and a reduced concentration of EGFR for NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); (B) an increased concentration of IGFBP1 and / or RANTES for a NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für ein plexiformes Neurofibrom (PNF) bezeichnend ist; and (c) a reduced concentration of PDGF-BB on a plexiform neurofibroma (PNF) indicative; und wobei die Referenzprobe in (a) von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt. and wherein the reference sample in (a) from a healthy subject and in (b and c) is derived from a NF1 patients.
  • Da bereits Patienten mit einer NF1 Erkrankung ohne erkennbare klinische Symptome eine veränderte Konzentration von den erfindungsgemäßen Markerproteinen im Blut oder Serum aufweisen, stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein in der Handhabung einfaches und kostengünstiges Frühdiagnoseverfahren bereit. As already patient having a disease with no apparent clinical symptoms NF1 an altered concentration of the novel marker proteins in blood or serum, the present invention provides for the first time provides a simple to use and cost effective early diagnosis method.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise mit klassischen immunologischen Material und Methoden durchgeführt werden, beispielsweise mit kommerziell erhältlichen Reagenzien, die jeweils spezifisch für die oben angegebenen Proteine sind, insbesondere mit Antikörpern, vorzugsweise monoklonalen Antikörpern oder äquivalenten Bindungsmolekülen wie Aptamere oder Spiegelmere. The inventive method can be advantageously carried out with classical immunological material and methods, for example using commercially available reagents that are specific for the above proteins, particularly with antibodies, preferably monoclonal antibodies, or equivalent binding molecules, such as aptamers or spiegelmers. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von solchen Reagenzien, insbesondere anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-EGFR, anti-IGFBP1 und/oder anti-RANTES Antikörper oder Fragmente davon sowie Aptamere und/oder Spiegelmere zur Diagnose und/oder Früherkennung einer NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor. Thus, the present invention also includes the use of such reagents, particularly anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-EGFR, anti-IGFBP1 and / or anti-RANTES antibodies or fragments thereof, as well as aptamers and / or spiegelmers for diagnosis and / or early detection a NF1 and / or an associated tumor NF1.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kits in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen. Moreover, the present invention relates to the use of a kit in the inventive method, said kit comprises reagents specific for the detection of at least one protein selected from a group consisting of IFN gamma, IL-6, TNF-alpha, EGFR, IGFBP1, RANTES and PDGF-BB, or fragments thereof, in which the reagents preferably include antibodies or fragments thereof.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES sind; The invention also relates to a kit comprising reagents that are specific for the detection of (i) IFNgamma, TNFalpha, and EGFR and / or (ii) IGFBP1 and RANTES; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6, wobei der Nachweis bevorzugt mit einem Microarray oder einem Teststreifen durchgeführt wird. and optionally for PDGF-BB and / or IL-6, wherein the detection is preferably carried out with a microarray or a test strip.
  • Basierend auf den Erkenntnissen, dass die vorstehend beschriebenen Proteine in Patienten mit NF1 und/oder einem NF1 assoziieren Tumor in veränderter Konzentration vorliegen und es sich bei den Proteinen um Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren handelt, für die bekannt ist, dass sie in der Entstehung bzw. Nährstoffversorgung von Tumoren involviert sind, stellen die erfindungsgemäßen Biomarker auch Angriffspunkte zur Therapie bzw. Prävention von NF1 assoziierten Erkrankungen oder eines NF1 assoziierten Tumors dar. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und IL-6 zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert wurde. Based on the findings that the proteins described above in NF1 patients with and / or associate a NF1 tumor in a different concentration exist and they are cytokines or growth factors in the proteins, is known for that it is in the development or nutrients are involved of tumors, biomarkers of the invention also provide targets for therapy or prevention of NF1 associated diseases or NF1 associated tumor represents Thus, the present invention relates to the use of an agent that is a modulator of one of the proteins selected from the. group consisting of TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and IL-6 wherein the patient has been diagnosed according to the method consisting for the manufacture of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or a NF1 associated tumor, preferably.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert wurde. Further, the present invention relates to the use of an anti-tumor agent for the manufacture of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or a NF1 associated tumor, wherein the patient has been diagnosed according to the inventive method.
  • Weitere Ausführungsformen und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den Beispielen hervor. Further embodiments and advantages of the present invention will become apparent from the following description and examples.
  • Legende zu den Abbildungen Key to figures
  • : Schematische Darstellung der Kandidatenauswahl und des Screening-Ablaufs. : Schematic representation of the candidate selection and screening process. Die ursprüngliche Anzahl von 115 möglichen Serummarkern für NF1 Tumore bestanden aus Proteinen, die überexprimiert in PNF oder MPNST vorliegen sowie das Tumorwachstum verstärken (n = 79) oder immunmodulatorische Zytokine sind (n = 36). The original number of 115 possible serum markers of NF1 tumors consisted of proteins overexpressed in PNF or MPNST present as well as tumor growth increase (n = 79) or immunomodulatory cytokines (n = 36). Die 115 Proteine wurden aus veröffentlichten Daten ausgewählt. The 115 proteins were selected from published data. 56 der 115 ursprünglich ausgewählten Proteine wurden in zwei Schritten gescreent, einmal zusammen mit Seren von 60 NF1-Patienten, wobei 5 Proteine mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen aufgefunden wurden. 56 of the 115 originally selected proteins were screened in two steps, once with 60 sera from NF1 patients, with 5 proteins were found with significant differences between groups. Diese 5 Proteine wurden mit 26 neuen Proteinen an insgesamt 104 NF1-Patienten untersucht. These 5 proteins were examined with 26 new proteins to 104 NF1 patients. Insgesamt wurden bei dieser Untersuchung 6 Proteine aufgefunden, die signifikante Unterschiede zur Vergleichsgruppe zeigten. Overall, in this study 6 proteins were found which showed significant differences from the control group.
  • : IL-6, IFNgamma und TNFalpha weisen signifikant erhöhte und EGFR signifikant erniedrigte Konzentrationen in Seren von NF1 Patienten auf. : IL-6, IFNgamma and TNFalpha have significantly increased and EGFR at significantly lower concentrations in sera from NF1 patients. Quantitative Proteinarray Ergebnisse von Seren von 104 NF1-Patienten (NF1 total ) verglichen zu 41 gesunden Kontrollen (Co) für (a) IL-6, (B) IFN-γ, (c) EGFR, (D) TNFα. Quantitative protein array results of sera from 104 patients NF1 (NF1 total) compared to 41 healthy controls (Co) for (a) IL-6, (B) IFN-γ, (c) EGFR, (D) TNF.alpha. Die Unterschiede sind hochsignifikant für (a) bis (d). The differences are highly significant for (a) to (d). Keiner der anderen getesteten Proteine zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. None of the other tested proteins shows a significant difference between the two groups. Statistische Unterschiede werden durch nicht-parametrische Tests (Mann-Whitney U) umfassend der Bonferroni-Methode ausgewertet. Statistical differences are evaluated by non-parametric tests (Mann-Whitney U), comprising the Bonferroni method.
  • : Seren von NF1 Patienten weisen verglichen zu Kontrollpatienten einen signifikanten Unterschied der IFNgamma- und EGFR-Konzentration auf. : Have sera from NF1 patients compared with control patients is a significant difference of IFNgamma- and EGFR concentration. Unterschiede der einzelnen Gruppen mit unterschiedlichen Tumorentitäten im Vergleich zu den Kontrollpatienten sind vorhanden, erreichen aber kein Signifikanzniveau. Differences between the three groups with different tumor entities compared to the control patients are available, but do not reach significance level.
  • : Seren von NF1 Patienten weisen verglichen zu gesunden Kontrollpatienten einen signifikanten Unterschied der IL-6- und TNFalpha-Konzentration auf. : Have sera from NF1 patients compared to healthy control patients is a significant difference in IL-6 and TNF-alpha concentration. Signifikante Unterschiede der einzelnen NF1-Gruppen mit unterschiedlichen Tumorentitäten im Vergleich zu den Kontrollpatienten sind nicht vorhanden. Significant differences between the individual NF1 groups with different tumor entities compared to the control patients are not available.
  • : Die PDGF-BB Serumkonzentration in NF1 Patienten ist verglichen zu der Kontrollgruppe grenzwertig signifikant (p = 0,052). The PDGF-BB serum concentration in NF1 patients compared to the control group of borderline significance (p = 0.052). NF1 Patienten mit PNF Tumoren haben eine geringere PDGF-BB Konzentration verglichen zu NF1 Patienten ohne PNF (p = 0,013). NF1 patients with PNF tumors have a lower concentration of PDGF-BB compared to NF1 patients without PNF (p = 0.013).
  • : IGFBP1 und RANTES weisen signifikant erhöhte Konzentrationen in dem Serum von NF1 Patienten mit einem MPNST auf. : IGFBP1 and RANTES have significantly elevated levels in the serum of NF1 patients with a MPNST. Quantitative Proteinarray Ergebnisse von 41 gesunden Kontrollen und 104 NF1-Patienten Seren unterteilt in drei Gruppen: 35 NF1-Patienten ohne PNF und ohne MPNST (cNF), 39 NF1-Patienten mit PNF aber ohne MPNST und 30 NF1-Patienten mit MPNST. Quantitative protein array results of 41 healthy controls and 104 NF1 patients sera divided into three groups: 35 NF1 patients without PNF and without MPNST (CNF), 39 NF1 patients with PNF but without MPNST and 30 NF1 patients with MPNST. (A) IGFBP1 und (B) RANTES; (A) IGFBP1 and (B) RANTES; (C) IGFBP1 Serumkonzentrationen in NF1-Patienten mit unterschiedlichen internen Tumorlasten bestimmt durch MRI-basierende Volumetrie (Nichts: 0 cm 3 , niedrig: 1–99 cm 3 ; moderat: 100–500 cm 3 ; hoch: ≥ 500 cm 3 ). (C) serum concentrations IGFBP1 in NF1 patients with different internal tumor burden determined by MRI-based volumetry (none: 0 cm 3, low: 1-99 cm 3; moderate: 100-500 cm 3; high: ≥ 500 cm 3). Statistische Unterschiede werden bei nicht-parametrischen Tests (Mann-Whitney U) getestet umfassend der Bonferroni-Methode. Statistical differences in non-parametric tests (Mann-Whitney U) fully tested the Bonferroni method.
  • : Der MPNST-Marker RANTES wird sowohl von MPNST Zellen selbst als auch von den infiltrierenden Lymphozyten produziert. The MPNST marker RANTES is produced by both MPNST cells themselves and by the infiltrating lymphocytes. Lichtmikroskopische Aufnahme eines immunhistochemisch angefärbten MPNST Paraffingewebeschnitts (Tumor ID 28044). Light micrograph of an immunohistochemically stained MPNST paraffin tissue section (tumor ID 28044). Das RANTES Protein wurde mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen anti-humanen RANTES Antikörpers (1:100, ab9679, Abcam Inc.) nachgewiesen. The RANTES protein was determined using a rabbit polyclonal anti-human RANTES antibody (1: 100, ab9679, Abcam Inc.) detected. Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper, Streptavidin Peroxidase und DAB unter Nutzung des ”Dako REALTM Detection system” (Dako REALTM Detection system, peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, code K5001, Dako, Denmark A/S) für automatisiertes Färben. After washing again, incubation with the biotinylated secondary antibodies, streptavidin peroxidase and DAB using the "Dako REALTM detection system" (Dako REALTM Detection System, peroxidase / DAB +, Rabbit / Mouse, code K5001, Dako, Denmark A / S) for automatic To dye. Schließlich erfolgte eine Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. Finally, a counter-staining of the nuclei with hematoxylin was performed.
  • : IGFBP1 wird von MPNST Tumoren exprimiert. : IGFBP1 expressed by MPNST tumors. ELISA Assay zum Nachweis von humanem IGFBP1 in Zellkulturüberständen der MPNST Zelllinien ST88-14, 1507-2, 5462, T462 T265 und STS26T: Das in das Medium sekretierte IGFBP1 wird mittels HRP-gebundenem Streptavidin nachgewiesen, wobei die gemessene Farbintensität proportional zur Menge an IGFBP1 in der Probe ist. ELISA assay for detection of human IGFBP1 in cell culture supernatants of the MPNST cell lines ST88-14, 1507-2, 5462, T462 T265 and STS26T: The secreted into the medium IGFBP1 is detected by HRP-linked streptavidin, wherein the measured color intensity proportional to the amount of IGFBP1 is in the sample. IGFBP1 Konzentrationen wurden nach 24, 36 und 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen bestimmt. IGFBP1 levels were determined after 24, 36 and 48 hours after seeding of the cells.
  • : T Lymphozyten produzieren TNFalpha und IFNgamma. T lymphocytes produce TNFalpha and IFNgamma. Phorbol Myristat Acetat(PMA)-Ionomycin-induzierte Sektretion der intrazelluläre Zytokine wurde mittels FACS Analyse an CD3+/CD4+ bzw. CD3+/CD8+ positiven T-Zellen von Kontrollpatienten (KO) und NF1 Patienten (NF1) untersucht. Phorbol myristate acetate (PMA) -Ionomycin-induced secretion of intracellular cytokines was examined by FACS analysis of CD3 + / CD4 + and CD3 + / CD8 + positive T cells from control patients (KO) and NF1 patients (NF1). Die Menge des produzierten Zytokins wurde mittels anti-TNFalpha Antikörper (A) bzw. anti-IFNgamma Antikörper (B) bestimmt. The amount of cytokine produced was measured by anti-TNFalpha antibodies (A) or anti-IFN gamma antibody (B) was determined. Es zeigte sich, das CD8+ T-Zellen von NF1-Patienten mehr TNFalpha und IFNgamma produzieren als entsprechende Vergleichszellen von nicht-NF1 Personen. It was found that CD8 + T cells from NF1 patients more TNFalpha and IFNgamma produce than corresponding control cells of non-NF1 people. Die Unterschiede waren aber nicht signifikant (TNFalpha p = 0,102 und IFNgamma p = 0,233). The differences were not significant (p = 0.102 TNFalpha and IFNgamma p = 0.233).
  • : IL-6, IFNγ, TNFα, EGFR, IGFBP1 und RANTES weisen diagnostisches Potential auf. : IL-6, IFNg, TNFa, EGFR, IGFBP1 and RANTES have diagnostic potential. ROC-Kurven hinsichtlich der Unterscheidung zwischen NF1-Gruppen und Kontrollgruppen für (A) IL-6, (B) IFNγ, (C) TNFα und (D) EGFR; ROC curves with regard to the distinction between NF1 and control groups of (A) IL-6, (B) IFN, (C) and TNF (D) EGFR; die ROC-Kurven zur Unterscheidung zwischen NF1-Patienten mit oder ohne MPNST sind in (E) für IGFBP1 und (F) für RANTES gezeigt. ROC curves for differentiating between NF1 patients with or without MPNST are shown in (E) for IGFBP1 and (F) for RANTES.
  • Tab. 1: Charakteristika der Patienten- und Kontrollkohorten. Tab. 1: characteristics of the patient and control cohorts. Angabe von Anzahl, Alter, Geschlecht und Ganzkörper MRT je Gruppe. Specifying the number, age, gender and body MRI per group.
  • Tab. 2: Überblick über die Serummarkereigenschaften bei 90%iger Sensitivität. Tab. 2: Overview of the serum marker properties at 90% sensitivity. Die Prävalenz der NF1 Marker wurde bei 0.5 gesetzt, da nur ausgewählte Personen untersucht werden wie z. The prevalence of NF1 marker was set at 0.5, as only selected persons are examined such. B. Kinder von NF1-Eltern. As children of NF1 parents. Diese haben ein 50%iges Risiko eine NF1 Mutation zu tragen. These have to wear a NF1 mutation has a 50% risk. Die Prävalenz für MPNST bei NF1 Patienten wurde auf 10% geschätzt (der geschätzte Wert bezieht sich auf erwachsene NF1 Patienten mit PNF). The prevalence of MPNST in NF1 patients was estimated at 10% (the estimated value refers to adult NF1 patients with PNF).
  • Definitionen definitions
  • Wenn nicht anders bezeichnet, werden die hierverwendeten Begriffe gemäß ihrer Definitionen, wie in dem Unless otherwise indicated, the terms used here according to their definitions, as in the , verwendet. Used.
  • Soweit nachfolgend der Kontext nicht eindeutig etwas anderes ergibt, ist bei der Verwendung von Singular-Formen bzw. Plural-Formen stets sowohl die Mehr- als auch die Einzahl umfasst. Unless hereinafter the context clearly indicates otherwise, always includes both the majority and the singular in the use of the singular forms and plural forms.
  • Der Begriff ”Patient oder NF1 Patient”, ”Erkrankter oder NF1 Erkrankter” oder ”Betroffener oder NF1 Betroffener” wird im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung in austauschbarerweise verwendet und umfasst Menschen als auch Tiere, vorzugsweise aber Menschen. The term "patient or NF1 patient", "ill patients or NF1 ill patients" or "affected or affected NF1" is used in the context of the present invention in austauschbarerweise and includes humans and animals, but preferably humans.
  • Der Begriff ”Probe” bezeichnet eine biologische Probe, die für die ex vivo oder in vitro Untersuchung verwendet wird. The term "sample" refers to a biological sample that is used for the ex vivo or in vitro investigation. Die Patienten und die Kontrollprobe können nach der Untersuchung vernichtet werden oder für weitere Untersuchung adäquat aufbewahrt werden. The patients and the control sample can be destroyed after the investigation or stored adequately for further investigation.
  • Der hier verwendetet Begriff ”Körperflüssigkeit” kann jede Flüssigkeit des Körpers darstellen, wie beispielsweise, Blut, Spuktum, Urin, Gehirn- oder Lymphflüssigkeit, Speichel, Samen, Extremente, Zellen oder Proteine und dessen Fragmente, katalytische Produkte und Vorstufen die in einer Körperflüssigkeit gelöst vorliegen und innerhalb des Körpers zirkulieren. The utilized herein, the term "body fluid" may be any fluid of the body, such as, blood, Spuktum, urine, brain or lymphatic fluid, saliva, semen, extreme duck, cells, or proteins and fragments thereof, catalytic products and precursors, the dissolved in a body fluid present and circulate within the body. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Serum. Preferably, the sample is serum.
  • Die Begriffe ”Marker”, ”Proteinmarker” oder ”Biomarker”, werden im Kontext der vorliegenden Erfindung in austauschbarer Weise verwendet und bezeichnen allgemein die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon. The terms "marker", "marker protein" or "biomarkers" used in the context of the present invention interchangeably and generally refer to proteins of the invention or fragments thereof. ”Proteine oder Fragmente davon” im Sinne der Erfindung können alle Markerproteine oder Fragmente davon, die in vivo vorkommen oder die in vitro erzeugt werden können (z. B. durch Mischen einer Probe mit einer Protease oder chemische Substanzen, wie CNBr). "Proteins or fragments thereof" in the sense of the invention, all the marker proteins or fragments thereof, which occur in vivo or can be generated in vitro (eg., By mixing a sample with a protease or chemical substances, such as CNBr).
  • Die Begriffe ”Fragment”, ”Peptid” und ”Protein” werden hier austauschbar verwendet, um ein Polymer von Aminosäureresten zu beschreiben. The terms "fragment," "peptide" and "protein" are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues. Die Begriffe beziehen sich auf Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehr Aminosäurereste ein künstliches chemisches Mimetikum einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist, sowie auch auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere. The terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residues is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymers. Wie hier verwendet, umfassen die Begriffe Aminosäureketten jeder Länge, einschließlich Volllängenproteine (dh, Antigene), wobei die Aminosäurereste über kovalente Peptidbindung gebunden sind. As used herein, the terms amino acid chains of any length, including full length proteins (ie, antigens), wherein the amino acid residues are linked by covalent peptide bond.
  • Der Begriff ”Behandlung”, ”behandeln”, ”lindern” ”bekämpfen” und Ähnliches wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in austauschbarer Weise verwendet und bedeutet, dass ein pharmakologischer Effekt und/oder physiologischer Effekt erzielt werden soll. "Treat", the term "treatment", "alleviate" combat "" and the like used in the context of the present invention interchangeably and mean that a pharmacological effect and / or physiological effect to be achieved. Dieser Effekt kann prophylaktisch sein, im Sinne dass die Ausprägung der NF1 Krankheit oder assoziierte Symptome vollständig oder teilweise unterbunden werden oder der Effekt kann therapeutischer Natur sein, so dass eine vollständige oder teilweise Genesung von einem NF1 assoziierten Tumor oder anderer NF1 assoziierten Symptome erzielt wird. This effect may be prophylactic in the sense that the expression of the NF1 disease or associated symptoms to be prevented completely or partially, or the effect may be therapeutic in nature, so that a full or partial recovery of one NF1 associated tumor or other NF1 associated symptoms is achieved.
  • ”Inhibitor” ist jede Substanz, welche eine physiologische Aktion oder Antwort verhindert oder vermindert. "Inhibitor" is any substance which prevents a physiological action or response or reduced.
  • Die Begriffe ”induzieren”, ”inhibieren”, ”erhöhen”, ”erniedrigen”, ”sinken” oder Vergleichbares, beziehen sich auf einen quantitativen Unterschied zwischen zwei Werten/Leveln/Konzentrationen und bezeichnen zumindest einen signifikanten Unterschied zwischen diesem beiden Werten/Leveln/Konzentrationen. The terms "induce", "inhibit", "increase", "decrease", "sink" or its equivalent, refer to a quantitative difference between two values ​​/ levels / concentrations and at least denote a significant difference between this two values ​​/ levels / concentrations. Zum Beispiel drückt die Bezeichnung ”wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe ...” aus, dass das der Wert/Level/Konzentration oder Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon in einer zu untersuchenden Probe statistisch signifikant unterschiedlich ist im Vergleich zu dem Wert/Level/Konzentration oder Expression des eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon zu einem gesunden bzw. nicht NF1 Patienten. For example, presses the label "wherein the presence of one of these proteins or fragments thereof in a different concentration compared to its concentration in a reference sample ..." from that of the value / level / concentration or expression of the proteins of the invention or fragments thereof in is statistically significantly different from a sample to be examined in comparison with the value / level / concentration or expression of one of the proteins of the invention or fragments thereof to a healthy or not NF1 patients.
  • Unter den Begriff ”Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein sind”, ”Reagenz, das spezifisch für ein Protein ist” bzw. ”spezifisches Reagenz oder Mittel” werden gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ”Bindungsmoleküle” bzw. ein Bindungsmolekül wie Antikörper und deren Antigen-bindende Fragmente verstanden, die spezifisch an ein Zielprotein oder Fragment davon binden. The term "reagents for the detection of at least one protein are specific," "reagent that is specific for a protein" or "specific reagent or means" according to the present invention preferably "binding molecules" and a binding molecule such as understood antibodies and their antigen-binding fragments that specifically bind to a target protein or fragment thereof. Ebenso umfasst sind aber auch äquivalente, nicht auf Antikörper beruhende Bindungsmoleküle die an die hier beschriebenen Proteine, dh Biomarker binden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hormone, Rezeptoren und deren Bindungsdomänen, Liganden, Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Moleküle, Chaperone wie Hitzeschockproteine (HSPs) sowie Zell-Zelladhäsionsmoleküle wie Mitglieder der Cadherin, Intergrin, C-type Lektin and Immunoglobulin (Ig) Superfamilien. Also included but also equivalent, not based on antibody binding molecules are such as heat shock proteins to the herein described proteins, ie biomarkers bind to, including but not limited to hormones, receptors and their binding domains, ligands, major histocompatibility complex (MHC) molecules, chaperones (HSPs) as well as cell-cell adhesion molecules such as members of the cadherin, Intergrin, C-type lectin and immunoglobulin (Ig) superfamily. Neben Protein-basierenden Bindungsmolekülen kommen auch Nukleinsäuren, beispielsweise RNA-Moleküle in Betracht, die so genannten Aptamere, die zur Bindung an biologische Moleküle dienen können und aufgrund der Affinität und Spezifität zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken eingesetzt werden können, wie dies auch mit Hilfe von Antikörper der Fall ist. In addition to protein-based binding molecules and nucleic acids are, for example, RNA molecules into account, the so-called aptamers, which can be used to bind to biological molecules and can be used due to the affinity and specificity for therapeutic or diagnostic purposes, as well as with the help of is antibodies of the case. Genauso wie Antikörper und ähnliche Bindungsmoleküle können Aptamere in vitro und/oder in silico auf ein besseres Bindungsverhalten optimiert werden. Just as antibodies and related binding molecules, aptamers in vitro and / or can be optimized in silico for a better bonding behavior. Eine bevorzugte RNA-Spezies als Bindungsmolekül werden Spiegelmere eingesetzt, die spiegelverkehrte RNA-Abschnitte und daher resistent gegen enzymatischen Abbau sind. A preferred RNA species as a binding molecule are used spiegelmers, the mirrored RNA portions and therefore are resistant to enzymatic degradation. Ansonsten kommen aufgrund der im Stand der Technik entwickelten kombinatorischen Substanzbibliotheken und Screeningverfahren grundsätzlich natürlich auch andere Molekülklassen in Betracht, die auf die Bindung eines der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Proteine selektioniert werden können. Otherwise occur due to the developed in the prior art combinatorial libraries and screening methods in principle also other classes of molecules into account, which can be selected on the binding of the proteins described in the present application. In einer Ausführungsform werden unter den vorgenannten Begriffen auch Mittel zum Nachweis der Genexpression beispielsweise der mRNA des betreffenden Proteins umfasst, dh Nukleinsäure-Sonden wie DNA oder RNA Oligonukleotide, sofern deren Nachweis zu vergleichbaren, dh im Wesentlichen identischen oder ähnlichen Ergebnissen wie der Nachweis des entsprechenden Proteins führt. In one embodiment, means for detecting the gene expression under the aforementioned terms including, for example, the mRNA of the protein, ie, nucleic acid probes such as DNA or RNA oligonucleotides, provided at comparable their detection, that is substantially identical or similar results as the detection of the corresponding protein results. Grundsätzlich werden allerdings unter den Begriffen ”Reagenz” und ”Mittel” besonders bevorzugt Bindungsmoleküle verstanden, die Nachweis des Proteins oder Fragmenten davon geeignet sind. However, in principle, the terms "reagent" and "agent" particularly preferably understood binding molecules, the detection of the protein or fragments thereof are useful.
  • Der Klarheit wegen werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung deren nachfolgenden Ausführungsformen wie auch die Beispiele im Wesentlichen anhand von Antikörpern illustriert, ohne dass dies als Einschränkung auf diese Klasse von Bindungsmolekülen verstanden wird. For clarity, are to illustrate the present invention on the basis of antibodies illustrates the following embodiments as well as the examples, in essence, without this being understood as a limitation to this class of binding molecules.
  • Der Ausdruck ”bindet spezifisch” oder ”spezifisch für den Nachweis”, wenn auf ein Protein bzw. Biomarker oder Fragmenten davon bezogen bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die bestimmend ist für das Vorhandensein des Proteins in Anwesenheit einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Wirkstoffen. The term "specifically binds" or "specific for the detection", when referring to a protein or biomarkers or fragments thereof refers to a binding reaction which is determinative of the presence of the protein in the presence of a heterogeneous population of proteins and other biological agents , Daher, unter bestimmten Immunoassay-Bedingungen, binden die näher beschriebenen Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere oder Spiegelmere an ein bestimmtes Protein und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere Markerproteine oder Fragmente davon, die in der Probe vorhanden sind. Therefore, under designated immunoassay conditions, the antibodies or fragments thereof bind described in more detail, aptamers or Spiegelmers to a particular protein and do not bind in a significant amount to other marker proteins or fragments thereof which are present in the sample. Typischerweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion mindestens dem zweifachen Hintergrundsignal oder Rauschen entsprechen, und noch typischerweise mehr als dem 10- bis 100-facher Hintergrund. Typically a specific or selective reaction will be at least equal to twice the background signal or noise and more typically more than 10 to 100 times background.
  • Der Begriff ”Konzentration” oder ”veränderte Konzentration” wird gleichbedeutend mit dem Begriff ”Wert”, ”Referenzwert”, oder ”Level” der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon bezeichnet und meint die Menge eines Proteins oder Fragment davon in einer Probe, wobei eine veränderte Konzentration signifikant ist, wenn sie eine Abweichung in Bezug auf den Referenzwert von mindestens 5%, 10%, 20% 30% 40% 50% 60% oder 70% aufweist, bevorzugt eine Abweichung von mindestens 5% verglichen zu einem Referenzwert aufweist. The term "concentration" or "altered concentration" is the same as denoted by the term "value", "reference value", or "Level" of the proteins of the invention or fragments thereof, and means the amount of a protein or fragment thereof in a sample, wherein an altered concentration is significant when it has a deviation with respect to the reference value of at least 5%, 10%, 20% 30% 40% 50% 60% or 70%, preferably a deviation of at least 5% compared to a reference value comprises.
  • ”Zytokine” sind von Zellen gebildete Substanzen, die als Vermittler die Aktivität anderer Zellen beeinflussen. "Cytokines" are formed by cells of substances that affect the activity as a mediator of other cells. Dazu gehören beispielsweise Wachstumsfaktoren. These include growth factors. Weiterhin gibt es Zytokine, die die Entzündungsreaktion hemmen und Zytokine, die die Entzündungsreaktion fördern. Furthermore, there are cytokines that inhibit the inflammatory response and cytokines that promote inflammation. Entzündungsreations-fördernde Zytokine, auch entzündliche/inflammatorische Zytokine genannt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Interferon gamma (IFNgamma), Tumornekrosefaktor apha (TNFalpha), Interleukin 6 (IL-6) und Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) die dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der der Literatur beschrieben sind; Entzündungsreations-cytokines, including inflammatory / inflammatory cytokines are mentioned in the context of the present invention, the interferon gamma (IFN gamma), tumor necrosis factor apha (TNFalpha), interleukin 6 (IL-6) and Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES ) in the literature to those skilled well known and described in detail; siehe beispielsweise in den Referenzen [51] für IFNgamma, [46, 48] für TNFalpha, [54] für IL-6 und [58] für RANTES. see for example in references [51] for IFNgamma, [46, 48] for TNFalpha, [54] for IL-6 and [58] for RANTES.
  • ”Wachtumsfaktoren” sind gemäß der vorliegenden Erfindung Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), human Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB), Der epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), kann mit EGF sowie TNFalpha interagieren. "Growth factors" according to the present invention, insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), human platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), the epidermal growth factor receptor (EGFR), can interact with EGF and TNFalpha. Diese Faktoren die dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der der Literatur beschrieben sind; These factors in the literature describes the techniques well known and extensively; siehe beispielsweise in den Referenzen [52] für IGFBP-1, [59] für PDGF-BB, und [46] für EGFR. see for example in references [52] for IGFBP-1, [59] for PDGF-BB, and [46] for EGFR.
  • ”Inhibitoren”, ”Aktivatoren”, und ”Modulatoren” von Zytokinrezeptoraktivität werden verwendet, um inhibierende, aktivierende, bzw. modulierende Moleküle zu beschreiben, die durch die Verwendung von in vitro- und in vivo-Assays für Zytokinrezeptorbindung oder Signalweiterleitung identifiziert wurden, z. "Inhibitors," "activators," and "modulators" of Zytokinrezeptoraktivität be used to describe inhibitory, activating, or modulating molecules identified by the use of in vitro and in vivo assays for Zytokinrezeptorbindung or signaling, e.g. , B., Liganden, Agonisten, Antagonisten, und deren Homologe und Mimetika. B., ligands, agonists, antagonists, and their homologs and mimetics.
  • Der Begriff ”Wirkstoff” schließt Inhibitoren und Aktivatoren ein. The term "drug" includes inhibitors and activators. Inhibitoren sind Wirkstoffe, die z. Inhibitors are agents that z. B., an Zytokinrezeptoren binden, teilweise oder vollständig die Stimulation blocken, deren Aktivierung erniedrigen, verhindern, die Aktivität verzögern, inaktivieren, desensitivieren, oder herunter regulieren, z. B. bind to cytokine receptors, block partially or completely the stimulation, decrease their activation, prevent, delay the activity, inactivate, desensitize, or down regulate, z. B., Antagonisten. B. antagonists. Aktivatoren sind Wirkstoffe, die, z. Activators are agents that, eg. B., an Zytokinrezeptoren binden, deren Aktivierung stimulieren, erhöhen, öffnen, aktivieren, erleichtern, verstärken, die Aktivität sensitivieren, oder hochregulieren, z. B. bind to cytokine receptors, stimulating the activation, increase, open, activate, facilitate, enhance, sensitize the activity, or upregulate, z. B., Agonisten. B., agonists. Modulatoren schließen Wirkstoffe ein, die z. Modulators include agents that z. B. die Wechselwirkung von Zytokinrezeptoren mit: Proteinen, die Aktivatoren oder Inhibitoren binden, Rezeptoren, einschließlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), Kinasen, etc., verändern. For example, the interaction of cytokine with: bind proteins activators or inhibitors, receptors, including G-protein coupled receptors (GPCRs), kinases, etc., change. Wirkstoffe schließen genetisch modifizierte Versionen von natürlich vorkommenden Zytokinrezeptor-Liganden ein, z. Actives include genetically modified versions of a naturally occurring cytokine receptor ligands, eg. B., mit veränderter Aktivität, sowie natürlich vorkommende und synthetische Liganden, Antagonisten, Agonisten, kleine chemische Moleküle und Ähnliches. B., with altered activity, as well as naturally occurring and synthetic ligands, antagonists, agonists, small chemical molecules and the like. Proben oder Assays, die Zytokinrezeptoren umfassen, die mit einem potentiellen Aktivator, Inhibitor oder Modulator behandelt sind, werden mit Kontrollproben ohne den Inhibitor, Aktivator, oder Modulator verglichen, um das Ausmaß der Inhibition zu bestimmen. Samples or assays that include cytokine receptors, which are treated with a potential activator, inhibitor, or modulator are compared to control samples without the inhibitor, activator, or modulator to determine the extent of inhibition. Kontrollproben (nicht mit den Inhibitoren behandelt) wird ein relativer Zytokinrezeptor-Aktivitätswert von 100% zugeordnet. Control samples (untreated with inhibitors) are assigned a relative cytokine activity value of 100%. Inhibierung eines Zytokinrezeptors ist erreicht, wenn der Zytokinrezeptor-Aktivitätswert im Vergleich zur Kontrolle ungefähr 80%, 70% 60% gegebenenfalls 50% oder 25-0% beträgt. Inhibition of a cytokine receptor is achieved when the cytokine activity value 70% 60% 50% or 25-0% is compared to the control is about 80%, if necessary. Aktivierung eines Zytokinrezeptors ist erreicht, wenn der Zytokinrezeptor-Aktivitätswert im Vergleich zur Kontrolle 110%, gegebenenfalls 150%, gegebenenfalls 200–500%, oder 1000–3000% höher ist. Activation of a cytokine receptor is achieved when the cytokine activity value in comparison to the control is 110%, optionally 150%, optionally 200-500%, or 1000-3000% higher.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung Detailed Description of the Invention
  • Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Mittel und Medikamente zur Diagnose, Prävention und Behandlung der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und zur Früherkennung bzw. Prognoseabschätzung sowie Behandlung von NF1 assoziierten Tumoren. Generally, the present invention relates to diagnostic means and medicaments for the diagnosis, prevention and treatment of neurofibromatosis type 1 (NF1), and for the early detection and estimation of prognosis and treatment of NF1 associated tumors relates.
  • Wie in den Beispielen gezeigt, wurde in Experimenten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden mittels Antikörper-basierter Microarray-Technologie 58 nach erfindungsgemäß zusammengestellten Kriterien ausgewählte Proteine, die potentiell vom Körper sekretiert werden auf ihr diagnostisches Potential bei NF1 Patienten untersucht. As shown in the examples, in experiments performed in the context of the present invention examined by antibody-based microarray technology 58 according to the present invention assembled criteria selected proteins that are potentially secreted from the body to its diagnostic potential in NF1 patients. In diesen Experimenten konnten im Blutserum von NF1 Betroffenen mehrere Proteine identifiziert werden, die im Vergleich zu nicht NF1-Erkrankten eine signifikant veränderte Serumkonzentration aufwiesen: EGFR, IFNgamma, IL-6, TNFalpha. In these experiments in the blood serum of NF1 affected more proteins were identified that had significantly altered serum concentration compared to non-NF1 patients: EGFR, IFN gamma, IL-6, TNFalpha. Bis auf EGFR zeigten diese Proteine eine erhöhte Serumkonzentration bei NF1-Patienten. Except for EGFR these proteins showed increased serum concentration in NF1 patients. Die Proteine IGFBP1 und RANTES zeigten bei NF1-Patienten mit MPNST eine signifikant höhere Serumkonzentration im Vergleich zu NF1-Patienten ohne MPNST und das Protein PDGF-BB zeigt bei NF1-Patienten mit plexiformen Neurofibromen eine signifikant niedrigere Serumkonzentration im Vergleich zu NF1-Patienten ohne plexiforme Neurofibrome. The proteins IGFBP1 and RANTES showed in NF1 patients with MPNST a significantly higher serum concentration compared to NF1 patients without MPNST and the protein PDGF-BB is in NF1 patients with plexiform neurofibromas a significantly lower serum concentration compared to NF1 patients without plexiform neurofibromas. Dementsprechend wird gemäß der vorliegenden Erfindung erstmals ein Set von Biomarkern bereitgestellt, mit deren Nachweis es möglich ist NF1 und assoziierte Tumore frühzeitig zu diagnostizieren, und vorteilhafterweise zwischen der Ausprägung bzw. Vorhandensein von NF1, NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) und plexiformen Neurofibrom (PNF) zu differenzieren und zudem die Tumorlast in NF1-Patienten zu bestimmen, was beispielweise hilfreich in der Dosierung einer Chemotherapie ist. Accordingly, a set of biomarkers is first provided according to the present invention with their detection, it is possible to diagnose NF1 and associated tumors at an early stage, and advantageously between the expression or presence of NF1 NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) and plexiform neurofibroma ( PNF) to differentiate and also to determine the tumor burden in NF1 patients, which is useful, for example in the dosage of chemotherapy. Da die vorgenannten Biomarker in Serum nachgewiesen werden, das einfach zu gewinnen und reproduzierbare Ergebnisse erlaubt, stellt die vorliegende Erfindung Serummarker zur frühzeitigen, zuverlässigen und kostengünstigen Diagnose von NF1 und NF1 assoziierter Tumore, insbesondere MPNST zu Verfügung. Since the above biomarkers are detected in serum that is easy to recover and reproducible results allowed, the present invention provides a serum marker for the early, reliable and cost effective diagnosis of NF1 NF1 and associated tumors, in particular MPNST available. Es wird davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße Verfahren große Relevanz in der klinischen Praxis erlangen wird, da besonders bei NF1-Sonderformen und Kindern mit wenigen Symptomen die Diagnosestellung bisher schwierig ist, da bisher keine Serummarker zur Diagnose von NF1 bzw. MPNST oder anderweitige, nicht-invasive und praktizierbare Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. It is assumed that the inventive method will become of great relevance in clinical practice because the diagnosis is especially important in NF1 special forms and children with few symptoms been difficult as no serum markers for the diagnosis of NF1 or MPNST or otherwise, not -invasive and practicable detection methods are available. Da eine frühzeitige Operation die derzeit einzige therapeutische Option darstellt, könnte die Überlebenschance eines MPNST Patienten (Überlebenszeit bisher 17 Monate) durch eine frühzeitige Diagnosestellung extrem verbessert werden. Since early surgery is currently the only therapeutic option, the chances of survival of a patient could MPNST (previously 17 months survival time) are extremely improved by early diagnosis.
  • Daher wird ein in vitro Verfahren bereit gestellt zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. Therefore, a provided in vitro methods for the diagnosis and / or early diagnosis of neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or a NF1 associated tumor, comprising detecting at least one protein selected from the group consisting of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), interferon gamma (IFNgamma), epidermal growth factor receptor (EGFR), insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES), and human Platelet Derived growth factor-BB (PDGF-BB) or a fragment of one of these proteins in a sample from a patient, wherein the presence of one of these proteins or fragments thereof in a different concentration compared to its concentration in a reference sample indicates the presence and / or the development of a NF1 or a NF1 associated tumor. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch den Nachweis von Interleukin 6 (IL-6). In a preferred embodiment, the inventive method also includes the detection of Interleukin 6 (IL-6).
  • So stellt die vorliegende Erfindung ein Nachweisverfahren bereit, das sich zur Früherkennung und/oder Diagnose von NF1 Störung in einem Individuum eignet. Thus, the present invention provides a detection method which is suitable for screening and / or diagnosis of NF1 disorder in an individual. In Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Auffinden der Werte der TNFalpha, IFNgamma, EGFR, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 sowie IL-6 Proteinen oder Fragmenten davon in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Individuums und des Vergleichens zu einer Referenzprobe, wobei die Anwesenheit von einer veränderten Menge der Markerproteine oder Fragmente davon als die der vorbestimmten Menge die Wahrscheinlichkeit einer Neurofibromatose Typ 1 Störung anzeigt. In embodiments of the inventive method comprises finding the values ​​of TNFalpha, IFNgamma, EGFR, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 and IL-6 proteins or fragments thereof in a body fluid sample from an individual and comparing to a reference sample, wherein the presence of the probability of neurofibromatosis type 1 fault indicating an altered amount of marker proteins or fragments thereof than the predetermined amount.
  • Die Vielseitigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt sich in den experimentellen Daten, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden. The versatility of the process according to the invention is shown in the experimental data, which were carried out in connection with the present invention. So deuten die experimentellen Daten der vorliegenden Erfindung darauf hin, dass der Grad der immunologischen Deregulation indirekt das Risiko für Tumorwachstum und maligne Transformation erhöht. Thus, the experimental data of the present invention indicate that the degree of immunological deregulation indirectly increase the risk of tumor growth and malignant transformation. Wie aus Beispiel 2 und As shown in Example 2 and ersichtlich, sind die Serumkonzentration der vier Proteine IL-6, TNFalpha, IFNgamma, EGFR zwischen NF1-Patienten und gesunden Subjekten unterschiedlich. seen, the serum concentration of four proteins IL-6, TNF-alpha, IFN gamma, EGFR between NF1 patients and healthy subjects are different. Dabei sind die Konzentration des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) signifikant geringer in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten, wobei die inflammotrischen Zytokine IFγ, TNF-α und IL-6 einen signifikant höheren Serumlevel in NF1-Patienten zeigen. The concentration of the epithelial growth factor receptor (EGFR) are significantly lower compared in NF1 patients to healthy subjects, wherein the inflammotrischen IFγ cytokines, TNF-α and IL-6 show a significantly higher serum levels in NF1 patients.
  • So kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch den Nachweis eines veränderten Wertes der TNFalpha, IFNgamma, EGFR sowie zusätzlich des IL-6 Proteins oder Fragments davon in einer Probe eines Individuums, verglichen zu Werten, die für Nicht-NF1-Betroffene charakteristisch sind, eine Aussage darüber getroffen werden, ob das zu untersuchende Individuum eine NF1 Erkrankung aufweist. Thus, with the inventive method by the detection of a changed value of the TNFalpha, IFNgamma, EGFR and additionally the IL-6 protein or fragment thereof in a sample from an individual, compared to values ​​which are characteristic of non-NF1 concerned, a statement be made as to whether the individual has to be examined a NF1 disease. Wobei ein erhöhter Wert für TNFalpha, IFNgamma und IL-6 und ein erniedrigter Wert für EGFR in einer zu untersuchenden Probe verglichen zu Referenzwerten, auf eine NF1 Erkrankung hindeutet. Wherein an increased value for TNFalpha, and IFNgamma IL-6, and a decreased value for EGFR in a sample to be tested compared to reference values, indicating a NF1 disease. In diesem Zusammenhang ist der Nachweis von mindestens zwei der erfindungsgemäßen Markerproteine besonders vorteilhaft um eine zuverlässige Aussage darüber zu erhalten ob ein Individuum eine NF1 Störung aufweist. In this context, the detection of at least two of the marker proteins of the invention is particularly advantageous to provide a reliable statement to obtain about whether an individual has a disorder NF1.
  • Kürzlich wurde in der Veröffentlichung von Recently, in the publication of gezeigt, dass NF1-Patienten Anzeichen einer chronischen Entzündung aufweisen und es wurde vermutet, dass das vermehrte Einwandern entzündlicher Zellen in die Gefäßwände bei NF1-Patienten für häufigere Gefäßverschlüsse verantwortlich ist. shown that NF1 patients have signs of chronic inflammation and it has been suggested that the increased immigration of inflammatory cells is responsible for more frequent vascular occlusion in the vessel walls in NF1 patients. In diesem Zusammenhang wurde an einer sehr kleinen Kohorte (N = 6) von NF1-Patienten gezeigt, dass der IL-6 Zytokinlevel im Blutplasma erhöht vorlag. In this context, a very small cohort (N = 6) of NF1 patients have been shown that the IL-6 Zytokinlevel was present in the blood plasma increases. Allerdings lässt die Anzahl der untersuchen Proben (n = 6) keine signifikante Aussage dieses Ergebnis zu. However, the number of samples can be examined (n = 6) to no significant statement this result. Weiterhin wurde von den Autoren in Lasater et al diese Untersuchungen im Kontext von vaskulären Störungen, die bei NF1 Patienten beobachtet werden, durchgeführt, so dass die Autoren sich auf die Untersuchung von diesbezüglich spezifischen Markern spezialisiert haben. It was also by the authors Lasater et al, these studies in the context of vascular disorders that are observed in NF1 patients performed so that the authors who specialize in investigating this regard specific markers. Zudem wurde die Probe in dem Plasma von Patienten untersucht, dass im Gegensatz zu Serum, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, der fast zellenfreie Überstand nach Zentrifugation von dem Vollblut ist. In addition, the sample was examined in the plasma of patients, in contrast to serum as used in the present invention, almost the cell-free supernatant after centrifugation of the whole blood. Dies führt dazu, dass signifikante diagnostische Konzentrationsunterschiede in einer Plasmaprobe verglichen zu einer Serumprobe vorherrschen und nicht miteinander korrelieren müssen. This leads to significant diagnostic differences in concentration in a plasma sample compared prevail in a serum sample and not have to correlate with each other. Dies wird beispielsweise dadurch deutlich, dass obwohl die Autoren neben IL-6 auch andere Zytokine wie TNFalpha, IFNgamma untersucht haben, wie aus dem Methodenteil auf Seite 869 linke Spalte, zweiter Abschnitt ersichtlich, keine Unterschiede in der Plasmakonzentration festgestellt haben, da die Autoren zu diesen Experimenten schweigen. This is for example clear that although the authors have investigated next to IL-6 and other cytokines such as TNFalpha, IFNgamma, as described on page 869 left column, second portion seen in the Methods section, have found no differences in the plasma concentration, as the authors to mention these experiments.
  • Weiterhin kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Diagnose und/oder Früherkennung der Anwesenheit eines Tumors in einem Individuum, insbesondere Tumoren des Nervensystems gestellt werden. Furthermore, it can be detected by means of the method the diagnosis and / or early detection of the presence of a tumor in an individual, particularly tumors of the nervous system. Wie in Beispiel 4 erläutert und in As discussed in Example 4 and in dargestellt, zeigen die Proteine IGFBP1 und RANTES einen signifikanten Unterschied zwischen NF1-Patienten mit MPNST und denen ohne MPNST. shown that proteins IGFBP1 and RANTES show a significant difference between patients with NF1 MPNST and those without MPNST. Dabei kann kein Unterschied für die beiden Proteine zwischen den Kontrollgruppen und den NF1-Patienten ohne MPNST (n = 74) detektiert werden ( In this case, no distinction for the two proteins between the control groups and the NF1 patients without MPNST (n = 74) are detected ( , B). , B). Interessanterweise korreliert die Konzentration von IGFBP1 mit der internen Tumorlast ( Interestingly, correlates the concentration of IGFBP1 with the internal tumor burden ( ) und der IGFBP1 Level in einer Probe mit dem Vorhandensein von MPNST ( ) And the IGFBP1 levels in a sample with the presence of MPNST ( ). ). Zusammengenommen zeigen diese Daten dass IGFBP1 ein neuer Risikomarker für maligne Transformation in NF1 Patienten ist. Taken together, these data indicate that IGFBP1 is a new risk marker for malignant transformation in NF1 patients. Darüber hinaus wird in Beispiel 3 und Moreover, in Example 3, and gezeigt, dass PDGF-BB sich als Marker für plexiforme Neurofibrome (PNF) eignet. shown that PDGF-BB is suitable as a marker for plexiform neurofibromas (PNF). Zudem zeigt PDGF-BB eine erhöhte Konzentration in NF1 Patienten mit MPNST Tumoren wie In addition, PDGF-BB shows an increased concentration in NF1 patients with tumors such MPNST ersichtlich. seen.
  • Daher umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen Nachweis in einer Blut- oder Serumprobe von dem Individuum, wobei die Menge von RANTES, PDGF-BB sowie IGFBP-1 Protein in der Probe festgestellt wird und anschließend mit einem Referenzwert verglichen, wobei ein veränderter bzw. erhöhter oder erniedrigter Wert eines, zwei oder drei der Proteine oder Fragmente davon oder einer Kombinationen von ein bis drei der Proteine oder Fragmente davon im Vergleich zu der Referenzprobe darauf hindeutet, dass das zu testende Individuum einen Tumor, der mit einer NF1 Störung assoziiert ist, aufweist. Therefore, the inventive method comprises detection in a blood or serum sample from the individual, wherein the amount of RANTES, PDGF-BB as well as IGFBP-1 protein in the sample is determined and then compared with a reference value, wherein an altered or increased or decreased value of one, two or three of the proteins or fragments thereof, or a combination of one to three of the proteins or fragments thereof compared to the reference sample suggesting that the tested individual has a tumor that is associated with a NF1 disorder.
  • Bei der Durchführung dieses Testverfahrens, ist es natürlich nicht erforderlich, dass die Probe von der zu testenden Person, gleichzeitig mit einer Probe einer Nicht-NF1 betroffenen Person bzw. einer NF1 betroffenen Person, die keine NF1-assoziierten Tumore aufweist jeweils getestet wird. In carrying out this test method, it is not necessary, of course, that the sample from the person to be tested, at the same time the person concerned with a sample of a non-NF1 and a person NF1 affected having no NF1-associated tumors is respectively tested. Stattdessen kann der Vergleich auch anhand zuvor festgelegter Werte von Personen, die nicht über eine Neurofibromatose Typ 1 Störung bzw. NF1 betroffenen Person, die keine NF1-assoziierte Tumore aufweisen, erfolgen. Instead, the comparison can also be based on pre-determined values ​​of people who do not have a neurofibromatosis type 1 disorder or NF1 subject that do not have NF1-associated tumors occur. Solche Referenzwerte können entweder von dem individuell zu behandelnden Patienten im Laufe der Therapie gewonnen werden oder sind das Ergebnis von großflächigen Studien. Such reference values ​​can be recovered from the individual patient to be treated in the course of therapy either or are the result of large-scale studies. Üblicherweise stammt ein Referenzwert aus einer so genannten gesunden Kontrollgruppe. Usually comes a reference value from a so-called healthy control group. Der Fachmann in diesem Bereich ist ohne weiteres in der Lage, geeignete Protokolle auszuwählen um so geeignete Referenzwerte erhalten zu können. The skilled person in this field will readily be able to select suitable protocols in order to get an appropriate reference values. Diesbezüglich weiß der Fachmann, dass der Spender der Referenzprobe auch ansonsten gesund ist, dh insbesondere frei von Entzündungen und anderweitiger Störungen ist, die durch unkontrolliertes Zellwachstum bedingt sind. In this regard, the expert knows that the donor of the reference sample is otherwise healthy, ie in particular is free of inflammation and otherwise disorders, which are caused by uncontrolled cell growth.
  • Wenn nicht anders angegeben, stellen die hierfür beschriebenen Ausführungsformen gleichermaßen Ausführungsformen, in denen die verwendeten TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 sowie Proteine oder Fragmente davon, Alternativen bzw. äquivalente Proteine/Peptid-Isoformen oder dessen mRNA Transkripte, dar und können anstatt der Proteine oder Fragmente davon in dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden. Unless otherwise indicated, the embodiments described for this purpose provide equally embodiments in which the TNFalpha used, IFNgamma, EGFR, IL-6, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1, and proteins or fragments thereof, alternatives, or equivalent proteins / peptide isoforms or its mRNA transcripts, and may instead constitute thereof are detected in the inventive method, the proteins or fragments. Ferner versteht sich, dass eine hier beschriebene Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bzw. deren Merkmale mit einer oder mehreren anderen hierin beschriebenen Ausführungsformen und deren Merkmalen kombiniert werden können, sofern sich die jeweiligen Ausführungsformen nicht ausschließen. It is further understood that an embodiment described herein, the present invention and the features thereof with one or more other embodiments herein described and their characteristics may be combined, provided that the respective embodiments do not exclude.
  • Wie bereits vorstehend erläutert, liegt der vorliegenden Erfindung die überraschende Beobachtung zugrunde, dass (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; As already explained above, the present invention is based on the surprising observation that (a) an increased concentration of TNF-alpha, IFN gamma, and / or IL-6 or a decreased concentration of EGFR for NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); (B) an increased concentration of IGFBP1 and / or RANTES for a NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für plexiforme Neurofibrome (PNF) bezeichnend ist; and (c) a reduced concentration of PDGF-BB for plexiform neurofibromas (PNF) is significant; und wobei die Referenzprobe in (a) und von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt. and wherein the reference sample in (a) and from a healthy subject and in (b and c) is derived from a NF1 patients.
  • Ein wesentlicher Aspekt sowie Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch das Nachweisverfahren der Erfindung bereitgestellt. An important aspect and advantage of the invention is provided by the detection method of the invention. Denn der Nachweis ob ein zu untersuchendes Individuum an einer NF1-Erkrankung leidet oder sich ein MPNST Tumor in einem frühen Stadium befindet, der aber noch keine klinischen Symptome zeigt, ermöglicht es einerseits erstmals eine verlässliche Diagnose zu stellen, was für die Beteiligten als auch Angehörigen als ein bedeutender Schritt gewertet wird, da zumeist Kinder die Betroffenen sind und schon im frühen Alter bzw. ab Geburt körperliche als auch geistige Auffälligkeiten, wie Lernschwächen oder auch veränderte Gliedmaßen aufweisen können. Because the evidence is suffering or whether to be tested individual at a NF1 disease a MPNST tumor is at an early stage, but which does not show any clinical symptoms, it allows on the one hand for the first time to provide a reliable diagnosis, which for the participants as well as members is seen as a significant step, since in most cases children are the victims and physical early age and from birth as can also have mental abnormalities, such as learning disabilities or altered limbs. Zudem kann die Frühdiagnose eines MPNST maßgeblich dafür verantwortlich sein, dass eine erfolgreiche Behandlung des NF1 assoziierten Tumors stattfinden kann und somit die Lebenserwartung eines NF1 Patienten maßgeblich erhöht, da wie vorstehend erwähnt, eine MPNST-spezifische Behandlung nur wenn es in einem sehr frühen Stadium diagnostiziert wird, erfolgsversprechend ist. In addition, the early diagnosis of MPNST may be largely responsible for that successful treatment of NF1-associated tumor can take place and thus significantly increase the life expectancy of NF1 patients, as mentioned above, a MPNST-specific treatment only if diagnosed at a very early stage is, is promising.
  • Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens begründet sich in den Nachweis der erfindungsgemäßen Marker in einer leicht zugänglichen Blutprobe, die im Gegensatz zu einer Biopsie, wie eine Tumor- oder Stanzbiopsie, routinemäßig bei einem Arztbesuch entnommen werden kann. A further advantage of the inventive method is based in the detection of the marker according to the invention in an easily accessible blood sample, in contrast to a biopsy, such as a tumor or biopsy, can be routinely taken for a visit to the doctor. Zum Anderen ist das erfindungsgemäße Verfahren, wie nachfolgend in den Beispielen noch ausführlich beschrieben, gegenüber den im Stand der Technik eingesetzten Verfahren, wie psychometrischen Verfahren, neuro-bildgebenden Verfahren oder dergleichen, deutlich vereinfacht und kostengünstig durchzuführen, wobei es den erstaunlichen Vorteil aufweist, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren zum ersten Mal die Früherkennung bzw. das Vorhandensein eines NF1 assoziierten Tumors bestimmt werden kann bevor dieser klinisch auffällig wird bzw. ohne die Entnahme einer Gewebeprobe, wodurch die Chancen zur erfolgreichen Behandlung, besonders bei einem MPNST Tumor, deutlich verbessert werden. On the other hand, the inventive method, as described below in Examples in more detail, with respect to the used in the prior art such as psychometric method, neuro-imaging techniques, or the like, greatly simplified and inexpensive to carry out, whereby it has the remarkable advantage that is using the methods of the invention for the first time the early detection or the presence of a tumor associated NF1 can be determined before it is clinically apparent, or reducing the chances for successful treatment, especially in a MPNST tumor can be significantly improved without the removal of a tissue sample, , Die Ergebnisse, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, können jedoch zur Sicherung der Diagnose mit bildgebenden Verfahren sowie einer Biopsie validiert werden. However, the results which are obtained by the method according to the invention can be validated to confirm the diagnosis with imaging and biopsy.
  • Die Proben, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, umfassen flüssige Proben, wie z. The samples used in the method of the invention include liquid samples such. B. Blut, Urin, Speichel oder Gewebeflüssigkeiten, die gegebenenfalls auch weiter fraktioniert werden können. As blood, urine, saliva, or tissue fluids, which can be fractionated, if appropriate, also on. Falls bereits Gewebeproben, wie z. If you already have tissue samples such. B. Gewebeschnitte auffälliger oder veränderter/entarteter Hautpartien oder Tumorbiopsien vorhanden sind, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch an diesen Gewebeproben durchgeführt werden. B. Tissue sections conspicuous or modified / degenerate skin or tumor biopsies are present, the inventive method can also be performed on these tissue samples. Wie in den Beispielen 5 und 6 sowie in den As in Examples 5 and 6 and in the und and gezeigt, sekretieren die Lymphozyten, welche in einen MPNST Tumor einwandern als auch die Tumorzellen selbst das RANTES Protein. shown secreting lymphocytes that migrate into a MPNST tumor and the tumor cells themselves, the RANTES protein. Bei Bedarf können die Proben in geeigneter Weise hergestellt bzw. aufbereitet werden um die Probe zu analysieren und die Konzentration der erfindungsgemäßen Marker darin zu bestimmen. If necessary, the samples may be prepared or processed in a suitable manner to analyze the sample and to determine the concentration of the markers according to the invention therein. Zur Aufbereitung der Proben können gängigen Methoden verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. For preparation of the samples commonly used methods can be used which are known to the expert. Die so erhaltenden Fraktionen einer flüssigen Probe oder durch Homogenisierung aufbereitete Gewebeproben können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. The thus-obtained fractions of a liquid sample or prepared by homogenizing tissue samples may be used in the inventive method. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Probe eine menschliche Probe, beispielsweise eine Körperflüssigkeit, wie Blut, Speichel, Urin, einer Gewebeflüssigkeit wobei die Probe aus der Gruppe bestehend aus einer Blutprobe, einer Serumprobe und einer Plasmaprobe ausgewählt ist. In a preferred embodiment of the invention, the sample is a human sample, such as a body fluid such as blood, saliva, urine, a tissue fluid in which the sample from the group is consisting selected from a blood sample, a serum sample and a plasma sample. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Serum. Preferably, the sample is serum.
  • Der Nachweis der erfindungsgemäßen Markerproteine kann mittels jedem gängigen Verfahren, dass sich zum Proteinnachweis eignet, durchgeführt werden. The detection of the marker proteins of the invention may by means of any common method that is suitable for protein detection can be performed. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt der Nachweis der Markerproteine oder Fragmente davon durch ein immunologisches Verfahren. According to the invention the detection of the marker proteins or fragments thereof takes place by an immunological method.
  • Durch die Bindung mindestens einen Antikörpers, der mindestens ein erfindungsgemäßes Markerprotein erkennt, oder wenigstens einem weiteren Antikörper, Antikörper-Chip-, Protein Chip-Microrarray, beschichteter Mikrotiterplatte oder Lateral-Flow-Vorrichtungen/immunochormatographischer Schnelltest/Teststreifen, können eine Vielzahl an Nachweisreagenzien bereitgestellt werden, die in einer Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden. By binding at least one antibody which recognizes at least one novel marker protein, or at least one further antibody, antibody chip, protein chip microarrays, coated microtiter plate or lateral flow devices / immunochormatographischer quick test / test strip, a plurality of detection reagents may be provided be used in a variety of methods. Um die Spezifität des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens zu gewährleisten, wird bevorzugt der Nachweis von mindestens einem zweiten erfindungsgemäßen Markerprotein in einer Probe untersucht. To ensure the specificity of the diagnostic method of the invention, the detection of at least one second marker protein according to the invention is preferably examined in a sample. Diese Verfahren sind dem Fachmann ausreichend bekannt, siehe beispielsweise die Veröffentlichung These methods are well known in the art, see for example the publication . ,
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße immunologische Nachweisverfahren ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus direkter ELISA, indirekter ELISA, Sandwich ELISA, Zellkultur ELISA, Durchflusszytometrie (FACS), immunochromatographischer Schnelltest und Protein-Chip Microarray. In a particularly preferred embodiment of the present invention, immunological methods according to the invention is selected from a group consisting of direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, cell culture, ELISA, flow cytometry (FACS), immunochromatographic rapid test and protein chip microarray.
  • Insbesondere immuncytochemische Verfahren, wie die Bestimmung durch die Durchflusszytometrie (FACS), die Bestimmung durch einen ”Enzyme linked Immunosorbent Assay” (ELISA) oder mit Hilfe eines Protein Chip-Microarray haben sich als besonders geeignet erwiesen. In particular, immunocytochemical methods, such as the determination by flow cytometry (FACS), the determination by a "Enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) or by using a protein chip microarray have proved to be particularly suitable. Als hervorragende Alternative ist ein Test auf einem Testträger mit möglichst geringem Volumenbedarf, z. A great alternative is a test on a test carrier with a minimum volume requirement, eg. B. auf einem Teststreifen wie dem immunochromatographischen Schnelltest auch ”Lateral Flow Assay” (LFA) genannt, zu verwenden wie beschrieben z. called, on a test strip as the immunochromatographic rapid test also "Lateral Flow Assay" (LFA) to use as described for. B. in den internationalen Patentameldungen As in the international Patentameldungen WO 2003/068398 A2 WO 2003/068398 A2 WO 2007/055712 A2 WO 2007/055712 A2 , Lateral-Flow-Geräte (LFD, Teststreifen) sind in der internationalen Anmeldung , Lateral flow device (LFD, test strips) are in the international application WO 02/059567 A2 WO 02/059567 A2 beschrieben. described.
  • Die LFA basieren auf dem gleichen Prinzip wie andere immunologische Assays (ELISA, Magnetic Bead Assays usw.), sie nützen den Effekt der Antikörper-Antigen Reaktion aus. The LFA based on the same principle as other immunological assays (ELISA, magnetic bead assays, etc.), they benefit the effect of the antibody-antigen response. Zusätzlich haben sie chromatographische Eigenschaften, da die Antikörper auf einer Membran gebunden sind. In addition, they have chromatographic properties because the antibodies are bound to a membrane. Die zu analysierende Probe (Lösung) wird durch die Kapillarkräfte über den ganzen Streifen gezogen und führt zu einem schnell sichtbaren Resultat. The sample to be analyzed (solution) is drawn by the capillary forces all over the strip and results in a fast visible result. Aus den erwähnten Gründen wird der LFA auch als Immun-Chromatographie bezeichnet. For the reasons mentioned, the LFA is also called immune chromatography. Die überschüssige Flüssigkeit mit den an der Test- bzw. Kontrolllinie nicht gebundenen Goldpartikeln strömt weiter durch das Membransystem, bis sie von einem Filterpapier aufgesaugt wird und somit einen Rückfluss verhindert. The excess liquid with the not bound to the test and control line gold particles further flows through the membrane system until it is absorbed by a filter paper and thus prevents backflow.
  • Auch der Nachweis der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon können unter Verwendung radioaktiv markierter Antigene oder Antikörper Radioimmunoassay (RIA) durchgeführt werden, beispielsweise in The detection of the proteins of the invention or fragments thereof can be performed using radioactively labeled antigen or antibody radioimmunoassay (RIA), for example in beschreiben. describe. Die Durchführung selbst kann als kompetitiver RIA oder als Immunoradiometrischer Assay (IRMA) erfolgen. The implementation itself can take place as a competitive RIA or immunoradiometric assay (IRMA).
  • Wie vorstehend erwähnt, kann der Nachweis mit Enzym-markierten Antigenen oder Antikörpern Enzyme Immunoassay (EIA) erfolgen, vgl. As mentioned above, the detection of enzyme-labeled antigens or antibodies Enzyme Immunoassay (EIA) can be done, see FIG. . , Bekannt sind Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Enzyme-Multiplied-Immunoassay-Technique (EMIT) oder auch der Nachweis mit fluorochrommarkierten Antigenen oder Antikörpern Fluoreszenzimmunoassay (FIA), vgl. Enzyme-linked immunosorbent assay are known (ELISA), enzyme-multiplied immunoassay Technique (EMIT) or with detection of the fluorochrome-labeled antigens or antibodies, fluorescence immunoassay (FIA), see FIG. . , Weitere Informationen und Protokolle sind beispielsweise in R For more information and protocols are described in R ; ; beschrieben. described. Weiterführende Informationen und Protokolle für die Durchführung verschiedener ELISA Assays sind in dem Fachmann im Bereich der Diagnostik gut bekannt, siehe beispielsweise Further information and protocols for performing various ELISA assays are well known to the skilled worker in the field of diagnostics, for example, see . ,
  • In den oben aufgeführten Verfahren wird mindestens ein Antikörper mit einem Label markiert, dies kann beispielsweise ein Enzym, wie die Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, ein fluoreszierender Farbstoff, insbesondere Fluorescein (FITC, DFTF), R-Phycoerythrin (PE), Peridinium-Chlorophyll-Protein (PerCP) und Tandem-Konjugate, wie PE-Cy5 oder PE-Texas-Rot, Gold-Kolloid oder Rodionuclide sein. In the above method, an antibody with a label is at least selected, this may be for example an enzyme such as peroxidase, in particular horseradish peroxidase, biotin, a fluorescent dye, in particular fluorescein isothiocyanate (FITC, DFTF), R-phycoerythrin (PE), Peridinium chlorophyll protein (PerCP) and tandem conjugates be like PE-Cy5 or PE-Texas Red, gold colloid or Rodionuclide. Zudem kann ein weiterer Antikörper an eine feste Phase gebunden werden. In addition, another antibody can be bound to a solid phase. Durch eine solche Kennzeichnung eines Antikörpers ist es möglich, direkt die Anwesenheit und Konzentration des markierten Antikörpers qualitativ und quantitativ zu bestimmen und darüber das daran gebundene Epitop eines der Markerproteine. By such labeling an antibody, it is possible to directly determine the presence and concentration of the labeled antibody and qualitatively and quantitatively about the epitope bound thereto one of the marker proteins.
  • Wie bereits zu Anfang erwähnt, wurden die erfindungsgemäßen Markerproteine durch einen beim Hersteller in Auftrag gegebenen ”custumized” Protein Micro-Chip Array, ein sogenannter Quantibody ® Array aufgefunden. As mentioned at the beginning, marker proteins of the invention were discovered by a commissioned from the manufacturer "custumized" Protein Micro-chip array, a so-called Quantibody ® array. Daher eignen sich Microarray-Chip Array ebenfalls sehr gut für das erfindungsgemäße Verfahren sowie zu Diagnosezwecken, da minimale Mengen an einer Blut oder Serumprobe oder Kulturüberstände von Tumorzellen oder Biopsiematerial eines Patienten verwendet werden können. Therefore, microarray chip array also are well suited for the method and for diagnostic purposes, since minimal amounts can be used in a blood or serum sample or culture supernatants of tumor cells or biopsy material of a patient. Zudem werden die Proben Daten zumeist mindestens in einer Doppelbestimmung wenn nicht sogar in einer Dreifachbestimmung ausgewertet und somit werden Fehler minimiert. In addition, the sample data are usually evaluated in at least one duplicate if not in triplicate and thus errors are minimized. Zusätzlich bietet die Protein Chip Technologie den Vorteil in Diagnostischen Labors gleichzeitig mehrere Proben von Patienten sowie von Kontrollen durchzuführen und damit auch gleichzeitig Vergleichsdaten bereitzustellen, die Aussagen über die Qualität des durchgeführten Assay einerseits zu lassen, als auch wertvolle zusätzliche Vergleichswerte zwischen den einzelnen untersuchten Patienten zu lassen. In addition, the protein provides chip technology advantage in Diagnostic laboratories perform the same number of samples from patients and controls and thus also to provide comparative data to make statements about the quality of the assay being conducted on the one hand, as well as valuable additional comparative values ​​between the patients studied to to let. Vom relevanten Zellmaterial können oft nur kleinste Mengen gewonnen werden, was den Umfang der Untersuchungsmöglichkeiten einschränkt. The relevant cell material only tiny amounts can be won often, which limits the scope of the investigation opportunities. Um eine zielgerichtete Behandlung des Patienten durchführen zu können, ist eine umfangreiche Untersuchung des Biopsiematerials jedoch unerlässlich. In order to perform a targeted treatment of the patient, an extensive examination of the biopsy material is essential however. Deswegen ist es wichtig, dass die Biopsie des Patienten zu Analysezwecken optimal genutzt wird und als Ausgang für so viele Microarray-Chips wie möglich dient. Therefore, it is important that the patient's biopsy is optimally used for analysis and serves as possible as output for so many microarray chips. Üblicherweise werden die Chips mit Mikrodispensersystemen hergestellt. Typically, the chips are made with Mikrodispensersystemen.
  • Microarrays sind in der Lage die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Moleküle in einem einzigen Experiment zu ermöglichen. Micro arrays are to enable capable of rapid and highly parallel detection of a plurality of specific binding molecules in a single experiment. Oligonukleotid- und cDNA-Microarrays, welche eine Vielzahl individueller Gene auf Filter- oder Glasoberflächen repräsentieren, sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung Oligonucleotide and cDNA microarrays, which represent a plurality of individual genes on filter or glass surfaces are well known in the art and, for example, in European Patent Application EP 2 189 791 A1 EP 2189791 A1 oder or WO 95/35505 WO 95/35505 beschrieben. described. Neben den Oligonukleotid-basierenden Microarrays gibt es auch Protein-basierte Microarrays. In addition to oligonucleotide-based microarrays, there are protein-based microarrays. Ein Vorteil gegenüber DNA-Microarrays ist die schnellere Analyse von Proben, da man auf eine Vermehrung des genetischen Materials sowie die Hybridisierung verzichten kann. One advantage over DNA microarrays is the rapid analysis of samples, because you can do without an increase in the genetic material, and hybridization. Zudem lassen Protein-Microarrays eine Analyse des tatsächlichen Proteinlevels zu. In addition, protein microarrays allow for an analysis of the actual protein levels. Die ist besonders wichtig, da mRNA- und Proteinmenge nicht immer miteinander korrelieren, und man daher aus den DNA-Microarray-Ergebnissen nicht unbedingt auf die Höhe der Proteinexpression schließen kann. This is particularly important since the mRNA and protein level does not always correlate with each other, and you therefore can not necessarily indicative of the level of protein expression from the DNA microarray results.
  • Bei Protein-Microarrays werden statt der DNA-Kopien kleine Proteinmengen auf dem Trägermaterial aufgebracht. In protein microarrays small amounts of protein are applied to the carrier material in place of the DNA copies. Diese auch Chips genannt, werden mit einer proteinhaltigen Probe, zum Beispiel einem Antikörper, inkubiert, wobei dieser dann an einige der auf dem Chip befindlichen Protein-Spots bindet. This also called chips, to be with a protein-containing sample, for example an antibody, incubated, and this then binds to some of the on-chip protein spots. Nach der Durchführung eines Waschschritts, bei dem ungebundener Antikörper entfernt wird, kann die Stärke des Signals jedes Spots und damit die Menge des dort gebundenen Antikörpers aus der Probe ermittelt werden. After performing a washing step, is removed at the unbound antibody, the strength of the signal of each spot, and thus the amount of bound antibody from the sample there can be determined. Das Signal entsteht beispielsweise durch einen weiteren Antikörper, der an einen fluoreszierenden Farbstoff gebunden ist und wiederum an den ersten Antikörper bindet. The signal is produced for example by an additional antibody that is bound to a fluorescent dye and, in turn, binds to the first antibody. Man kann die verschiedenen Protein-Microarray-Arten nach der Art der Interaktion (Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, Rezeptor-Protein oder allgemeine Protein-Protein Interaktion) unterscheiden. One can the different protein microarray species differ according to the type of interaction (antigen-antibody, enzyme-substrate, receptor protein, or general protein-protein interaction). Bei einem Sandwich Immunoassay werden Antikörper, die hochspezifisch an die zu untersuchenden Proteine binden, auf dem Trägermaterial immobilisiert. In a sandwich immunoassay, antibodies that bind highly specifically to the proteins under investigation, immobilized on the substrate. Die Ziel-Proteine werden auf das Array gegeben und binden an die zuvor immobilisierten Antikörper. The target proteins are added to the array and bind to the previously immobilized antibody. Im dritten Schritt werden die gebundenen Proteine durch markierte Antikörper identifiziert. In the third step, the bound proteins are identified by labeled antibodies. Antigen Capture Immunoassays: Wie bei der Sandwich-Methode werden spezifisch bindende Antikörper auf dem Array immobilisiert. Antigen capture immunoassays: specifically binding antibodies are immobilized on the array As with the sandwich method. Allerdings wird hier auf einen zweiten Antikörper zur Detektion verzichtet, die Proteine werden direkt mit einem Fluorophor markiert. However, it is omitted here a second antibody for detection, the proteins are directly labeled with a fluorophore. Direkte Immunoassays: Hier werden die Zielmoleküle selber immobilisiert, als Detektoren fungieren wieder mit Fluorophoren markierte Antikörper. Direct Immunoassays: Here, the target molecules are immobilized himself as detectors act again with fluorophores labeled antibodies. Es kann auch differenziert werden, ob Proteine der Probe am Array fixiert werden und dann mit einer Vielzahl von spezifischen, bekannten Testproteinen geprüft wird – oder ob die Testproteine in den Testflächen fixiert werden und dann die Reaktion mit den Probenproteinen erfolgt. It can also be differentiated according to whether proteins of the sample are fixed to the array and is then tested with a variety of specific, known test proteins - or whether the test proteins are fixed in the test areas, and then the reaction is carried out with the sample proteins. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in These techniques are known in the art and for example, beschrieben. described.
  • Die Microarrays können auf einer Vielzahl von festen Oberflächen, wie Kunststoffen (z. B. Polycarbonat), komplexe Kohlenhydrate (z. B. Agarose und Sepharose), Acrylharze (z. B. Polyacrylamid und Latexkügelchen) und Nitrocellulose erstellt werden. The microarrays can be on a variety of solid surfaces such as (eg., Polycarbonate), complex carbohydrates (eg., Agarose and sepharose), acrylic resins are created (e.g., as polyacrylamide and latex beads), and nitrocellulose polymers. Bevorzugte feste Trägermaterialien schließen Objektträger, Wafer, und positiv geladene Nylonmembran ein. Preferred solid support materials include slides, wafers, and a positively charged nylon membrane. Verfahren zur kovalenten Bindung der Antikörper an einen festen Träger sind in der Technik bekannt. A process for covalent binding of the antibodies to a solid support are known in the art. Beispiele für solche Verfahren finden sich in Examples of such methods can be found in ; ; ; ; und and . , Alternativ können auch direkt Proteine oder Peptide an einen festen Träger gebunden werden oder zusätzlich Proteine an die bereits an den festen Träger gebundene Antikörper gekoppelt werden. Alternatively, direct proteins or peptides can be bound to a solid support or additional proteins are coupled to the already bound to the solid support antibody. Diesbezügliche Techniken sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise in der The relevant techniques are well known in the art and for example in the EP 218 9791 A1 EP 218 9791 A1 oder or WO 95/35505 WO 95/35505 beschrieben. described.
  • Substanzen, die zum Nachweisen von Proteinen in einem Microarray verwendet werden können, schließen fluoreszierende Farbstoffe, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Fluorescein, Rhodamin, Tetramethyl-Rhodamin-5-(und 6)-(TRITC), Texas-Rot-, Cyanin-Farbstoffe (Cy3 und Cy5, zum Beispiel) und dergleichen sowie Enzyme, die mit kolorimetrischen Substraten, wie z. Substances which can be used for detection of proteins in a microarray include fluorescent dyes, such as fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein, rhodamine, tetramethyl-rhodamine-5- (and 6) - isothiocyanate (TRITC), Texas red, cyanine dyes (Cy3 and Cy5, for example) and the like, and enzymes with colorimetric substrates such. B. Meerrettich-Peroxidase reagieren, ein. Horseradish peroxidase react one. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen wird im Allgemeinen in der Praxis der Erfindung bevorzugt, da diese in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden können. The use of fluorescent dyes is generally preferred in the practice of the invention, as they can be detected at very low levels. Ferner erlaubt die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen den gleichzeitigen Nachweis mehrere Antigene, die mit einem einzigen Array umgesetzt werden können, da jedes Antigen mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Verbindung markiert werden kann. Further, the use of fluorescent dyes allows for the simultaneous detection of multiple antigens, which can be reacted with a single array, since each antigen can be labeled with a different fluorescent compound.
  • Mittel zum Detektieren von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Means for detecting labels are well known in the art. Daher, wo beispielsweise die Markierung eine radioaktive Markierung ist, schließen die Mittel zur Detektion einen Scintillationszähler oder fotographischen Film ein, wie bei der Autoradiographie. Therefore, for example, where the label is a radioactive label, means for detection include a scintillation counter or photographic film a, as in autoradiography. Wenn die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, kann durch Anregung des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge, die resultierende Fluoreszenz detektiert. If the label is a fluorescent label can be prepared by exciting the fluorochrome with the appropriate wavelength, the resultant detected fluorescence. Die Fluoreszenz kann visuell detektiert werden, durch fotographische Filme, durch die Verwendung eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise charge coupled devices (CCDs) oder Fotomultipliern und ähnlichem. The fluorescence may be detected visually, by means of photographic film, by the use of an electronic detector, such as charge coupled devices (CCDs) or photomultipliers and the like. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen detektiert werden durch Bereitstellung des geeigneten Substrats für das Enzym und Detektieren des resultierenden Reaktionsprodukts. Similarly, enzymatic labels may be detected by providing the appropriate substrate for the enzyme and detecting the resulting reaction product. Schließlich können einfache kolorimetrische Markierungen direkt durch Beobachtung der Farbe die mit der Markierung assoziiert ist, detektiert werden. Finally simple colorimetric labels may directly by observing the color associated with the label, can be detected. Daher erscheint in verschiedenen Dipstick-Assays konjugiertes Gold oftmals pink, wobei verschieden konjugierte Beads in der Farbe der Beads erscheinen. Thus, in various dipstick assays, conjugated gold often appears pink, with various conjugated beads appear the color of the beads.
  • Manche Assayformate benötigen keine Verwendung von markierten Komponenten. Some assay formats do not require the use of labeled components. Zum Beispiel Agglutinationsassays können verwendet werden, um die Anwesenheit von Zielantikörpern zu detektieren. For instance, agglutination assays can be used to detect the presence of target antibodies. In diesem Fall werden Antigen-beschichtete Partikel durch Proben agglutiniert, die die Zielantikörper umfassen. In this case, antigen-coated particles are agglutinated by samples comprising the target antibodies. In diesem Format braucht keiner der Komponenten markiert zu werden und das Vorhandensein des Zielantikörpers wird durch einfache visuelle Kontrolle detektiert. In this format, none of the components need be labeled and the presence of the target antibody is detected by simple visual inspection.
  • Wie vorstehend ausführlich beschrieben werden üblicherweise diagnostische Verfahren unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt und können mittels leicht zu detektierenden signalerzeugenden Wirkstoffen in Verbindung mit den besagten Antikörpern oder Fragmente davon verwendet werden. diagnostic methods using antibodies are described in detail as above usually carried out and can be used by easily detected signal-generating agents in conjunction with said antibodies or fragments thereof.
  • Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung natürlicherweise auf die Verwendung eines TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 und/oder RANTES spezifischen Reagenz oder Mittel zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, wobei das Reagenz oder Mittel vorzugsweise ausgewählt ist aus einer Gruppe von einem Antikörper oder Fragment davon, Aptamer und Spiegelmer; Therefore, the present invention extends naturally to the use of TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 and / or RANTES specific reagent or agents for diagnosis and / or early detection of NF1 and / or a NF1 associated tumor, wherein the reagent or agent is preferably selected from a group of an antibody or fragment thereof, aptamer and spiegelmer; siehe auch die vorstehende Definition des Begriffs ”Reagenz”. see also the above definition of the term "reagent". In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines anti-IL-6 und/oder PDGF-BB Antikörpers oder äquivalenten Reagenzien. In a preferred embodiment, the present invention also relates to the use of an anti-IL-6 and / or PDGF-BB antibody or equivalent reagents.
  • Naturgemäß erstreckt sich die vorliegenden Erfindung somit auch auf die Verwendung von (i) IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und/oder IL-6 als Serummarker oder (ii) einem Reagenz zum Nachweis eines dieser Proteine in Serum zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors. Naturally, the present invention thus IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and / or IL-6 also extends to the use of (i) IFN gamma, TNF-alpha, EGFR, as a serum marker or (ii) a reagent for the detection of these proteins in serum for diagnosis and / or early detection of NF1 and / or a NF1-associated tumor.
  • Gemäß der Erfindung können Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon gerichtet sind, verwendet werden um in einem Nachweisverfahren spezifisch an ein Epitop der Markerproteine zu binden. According to the invention, antibodies which are directed against the inventive proteins or fragments thereof may be used to bind in a detection method specific to an epitope of the marker proteins. Dafür eignen sich kommerziell erhältliche Antikörper, die auch in den Experimenten zu der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, welche in den unten aufgeführten Beispielen im Material und Methodenteil aufgelistet sind. In return, commercially available antibodies that were used in the experiments to the present invention, which are listed in the examples below in the Materials and Methods section are. Die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur gut beschrieben, siehe beispielsweise The production of polyclonal or monoclonal antibodies are known in the art and well described in the literature, see, for example, ; ; oder or ). ). Gemäß der Erfindung können die Antikörper auch rekombinant hergestellt werden. According to the invention, the antibodies may also be recombinantly produced. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. z. B. bekannt, A process for the production of recombinant antibodies are known to those skilled in the art (see. Eg. B. known ). ). Die Erzeugung von chimären Antikörpern ist beispielsweise beschrieben in The generation of chimeric antibodies is described, for example in WO 89/09622 WO 89/09622 . , Verfahren zur Erzeugung humanisierter Antikörper sind beispielsweise beschrieben in A method for producing humanized antibodies are described, for example in EP-A1 0 239 400 EP-A1 0239400 und and WO 90/07861 WO 90/07861 . ,
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren natürlich auch funktionelle Varianten von vollständigen Antikörpern sowie deren Fragmente oder Derivate, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Diagnostik bekannt sind und äquivalent zu den Antikörpern eine Bindung zu den Markerproteinen eingehen können. According to the present invention, the inventive method of course also includes functional variants of complete antibodies as well as fragments or derivatives thereof which are known to those skilled in the field of diagnostics and can bind to the marker proteins equivalent to the antibodies.
  • Bei dem Antigen-bindenden Fragment des monoklonalen Antikörpers kann es sich um ein einkettiges Fv-Fragment, ein F(ab')-Fragment, ein F(ab)-Fragment sowie ein F(ab') 2 -Fragment oder um ein beliebiges anderes Antigen bindendes Fragment handeln. The antigen-binding fragment of the monoclonal antibody may be a single chain Fv fragment, a F (ab ') - fragment, a F (ab) fragment and a F (ab') 2 fragment or any other act antigen binding fragment.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung oder deren korrespondierende Immunglobulinkette(n) können unter Verwendung konventioneller im Stand der Technik bekannter Verfahren weiter modifiziert werden, beispielsweise durch Deletion(en), Insertion(en), Substitution(en), Addition(en) und/oder Rekombination(en) von Aminosäuren und/oder durch beliebige andere im Stand der Technik bekannte Verfahren, entweder alleine oder in Kombination. The antibodies of the present invention or their corresponding immunoglobulin chain (s) can be conventional further modified in the prior art known methods using, for example, by deletion (s), insertion (s), substitution (s), addition (s) and / or recombination (s) of amino acids and / or by any other method known in the art, either alone or in combination. Verfahren zum Einfügen solcher Modifikationen in die DNA-Sequenz, die der Aminosäuresequenz einer Immunglobulinkette zu Grunde liegt, sind dem Fachmann wohl bekannt; A method of inserting such modifications in the DNA sequence underlying the amino acid sequence of an immunoglobulin chain basis, are well known to the skilled person; siehe beispielsweise see for example und and . , Modifikationen des erfindungsgemäßen Antikörpers schließen ein: chemische und/oder enzymatische Derivatisierungen an einer oder mehreren konstituierenden Aminosäuren, einschließlich Modifikationen der Seitenkette, Modifikationen des Rückgrats sowie N- und C-terminale Modifikationen einschließend Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung, Amidierung sowie die Anbindung von Kohlenhydrat- oder Lipidresten, Cofaktoren und dergleichen. Modifications of the antibody of the invention include chemical and / or enzymatic derivatizations at one or more constituent amino acids, including modifications of the side chain, modifications of the backbone as well as N- and C-terminal modifications including acetylation, hydroxylation, methylation, amidation, and the attachment of carbohydrate or lipid moieties, cofactors, and the like. Erfindungsgemäß können ebenfalls bi- oder multifunktionelle Moleküle zur Diagnose oder Früherkennung einer NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors verwendet werden, die eine Bindungsdomäne eines Antikörpers, eine Immunglobulinkette oder ein Bindungsfragment, die gemäß der vorliegenden Erfindung an das erfindungsgemäße Protein oder Fragment davon bindet sowie mindestens eine weitere funktionelle Domäne, umfassen. According to the invention, or multifunctional molecules for the diagnosis or early detection of NF1 and / or a NF1 associated tumor can also bi- are used, the one binding domain of an antibody, an immunoglobulin chain or a binding fragment that binds according to the present invention to the protein of the invention or fragment thereof, and at least one further functional domain comprise.
  • Der Antikörper kann mit einer markierenden Substanz bzw. Label markiert werden. The antibody can be labeled with a labeling substance or label. Dies kann ein Enzym, ein Radioisotop, ein fluoreszierender Farbstoff, Biotin, Digoxigenin oder dergleichen sein. This may be an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, biotin, digoxigenin, or the like. Das Enzym ist nicht besonders beschränkt, solange die Stabilität in dem Antikörper-bindenden Zustand erhalten bliebt sowie die Fähigkeit des Labels bzw. des daran gekoppelten Substrats eine Nachweisreaktion, wie z. The enzyme is not particularly limited as long as the stability RECOURSE obtained in the antibody-binding state, as well as the ability of the label or of the substrate coupled thereto a detection reaction, such. B. der Wiedergabe des Substrats eine bestimmte Farbe erhalten bleibt. B. playback of the substrate is maintained in a specific color. Zum Beispiel können Peroxidasen in den allgemein bekannten EIA (Enzymimmunoassay), β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Acetylcholin-Esterase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase oder dergleichen verwendet werden. For example, peroxidases can be used in the commonly known EIA (enzyme immunoassay), β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholine esterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, or the like. Darüber hinaus ist es auch möglich, ein inhibierendes Enzym, ein Coenzym oder dergleichen zu verwenden. Moreover, it is also possible to use like an inhibiting enzyme, a coenzyme or. Diese Enzyme können an den Antikörper durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung einer Maleimid-Verbindung oder eines solchen Vernetzungsmittels gebunden werden. These enzymes can be bound to the antibody by a known method using a maleimide compound or such a crosslinking agent. Wie für das Substrat ist es möglich, eine bekannte Substanz nach der Art des zu verwendenden Enzyms zu verwenden. As for the substrate, it is possible to use a known substance on the type of enzyme to be used. Zum Beispiel kann 3,3' oder 5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat, wenn Peroxidase als ein Enzym verwendet wird, oder Paranitrophenol als Substrat, wenn alkalische Phosphatase als Enzym verwendet wird, benutzt werden. For example, when peroxidase is used as an enzyme or paranitrophenol be used as a substrate when alkaline phosphatase is used as an enzyme, 3,3 'or 5,5'-tetramethylbenzidine as the substrate.
  • Solche detektierbaren Markierungen sind im Bereich von Immunoassays gut entwickelt und allgemein können die meisten Markierungen, die nützlich in solchen Verfahren sind, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Such detectable labels have been well developed in the field of immunoassays and in general most of the markers that are useful in such methods can be used in the present invention can. Daher ist eine Markierung irgendeine Zusammensetzung, die durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Methoden detektierbar ist. Thus, a label is any composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical methods. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung schließen ein, magnetische Beads (z. B., Dynabeads TM ), Fluoreszenzfarbstoffe (z. B., Fluoroeszein-Isothiocyanat, Texasrot, Rhodamin, und ähnliches), Radiomarkierungen (z. B., 3 H, 125 I, 35 S, 14 C oder 32 P), Enzyme (z. B., Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden) und kolorimetrische Markierungen wie z. Useful labels in the present invention include magnetic beads (z. B., Dynabeads ™), fluorescent dyes (e.g., B., Fluoroeszein isothiocyanate, Texas red, rhodamine, and the like), radiolabels (eg. B., 3 H, 125 I, 35 S, 14 C or 32 P), enzymes (eg. B., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and others commonly used in an ELISA), and colorimetric labels such. B. kolloidales Gold oder gefärbtes Glas oder Plastik (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.) Beads. As colloidal gold or colored glass or plastic (eg., Polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads.
  • Die Markierung kann entsprechend im Fachbereich gut bekannter Methoden direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des zu verwendenden Assays gekoppelt werden. The label may be coupled directly or indirectly to the desired component of the assay to be used according to well known methods in the art. Wie oben angezeigt, kann eine breite Vielfalt von Markierungen verwendet werden, wobei die Wahl der Markierung abhängt von der erforderlichen Sensitivität, die einfache Konjugation mit der Verbindung, Stabilitätserfordernisse, verfügbare Geräteausstattung und Entsorgungsvorkehrungen As indicated above, a wide variety of labels may be used, with the choice of label depends on the sensitivity required, ease of conjugation with the compound, stability requirements, available instrumentation, and disposal provisions
  • Nicht-radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angehängt. Non-radioactive labels are often attached by indirect means. Die Moleküle können ebenfalls direkt an die signalerzeugende Verbindung konjugiert werden, z. The molecules can also be conjugated directly to signal generating compound z. B., durch Konjugation mit einem Enzym oder fluoreszierender Verbindung. B., by conjugation with an enzyme or fluorescent compound. Eine Vielfalt von Enzymen und fluoreszierenden Verbindungen kann in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden und sind dem Fachmann gut bekannt (zur Übersicht verschiedener Markierungs- oder signalproduzierende Systeme, die verwendet werden können, siehe, z. B., A variety of enzymes and fluorescent compounds can be used in the methods of the present invention and are well known to the skilled person (for a review of various labeling or signal producing systems that can be used, see, eg. B., US Patent Nr. 4,391,904 US Pat. No. 4,391,904 ). ).
  • Daher ist die vorliegende Erfindung auch nicht auf Antikörper beschränkt. Therefore, the present invention is not limited to antibodies. Auch Agentien, die an die Markerproteine oder Fragmente davon direkt oder indirekt binden können sind Bestandteil der Erfindung. Also agents that can directly or indirectly bind to the marker proteins or fragments thereof are part of the invention. So können beispielsweise interagierende Proteine oder Peptide oder Antikörper-abgeleitete Moleküle wie Fab, Fv oder scFv Fragmente verwendet werden. For example, interacting proteins or peptides or antibody-derived molecules such as Fab, Fv or scFv fragments can be used. Die Herstellung solcher Moleküle sind beispielsweise in The production of such molecules are, for example, in oder or EP-A 0 451 EP-A 0 451 und and EP 1 100 830 B1 EP 1100830 B1 beschrieben. described. Darüber hinaus ist dem Fachmann bekannt, dass gegen die bereits bekannten Proteine IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB eine Vielzahl an kommerziell erhältlichen Antiköper gibt, die entsprechend verwendet oder modifiziert werden können. In addition, the skilled person is aware that against the already known proteins IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and PDGF-BB a variety of commercially available antibodies is that can be used in accordance with or modified.
  • Ebenfalls stellt die vorliegende Erfindung Reagenzien wie Aptamere und Spiegelmere oder ähnliches bereit, die gegen die jeweiligen Makerproteine gerichtet sind, vorzugsweise gegen IFNgamma, TNFalpha, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB, EGFR oder IL-6 oder eine Mutante, ein Fragment oder eine Variante hiervon. Also the present invention provides reagents such as aptamers and spiegelmers or the like prepared which are directed against the respective Maker proteins, preferably up to IFNgamma, TNFalpha, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB, EGFR or IL-6, or a mutant, fragment or variant hereof.
  • Aptamere sind künstliche DNA- oder RNA-Moleküle, die ein anderes Molekül, z. Aptamers are synthetic DNA or RNA molecules that another molecule, z. B. eine Nukleinsäure, ein Protein, kleine organische Verbindungen und sogar ganze Organismen, spezifisch binden können, siehe beispielsweise die europäischen Patentanmeldungen As a nucleic acid, protein, small organic compounds, and even entire organisms can specifically bind, for example, see European patent applications EP 2 467 167 A1 EP 2467167 A1 oder or EP 2 402 016 A1 EP 2402016 A1 . , Bei hoher Spezifität und Affinität sowie chemischer Stabilität weisen Aptamere im Vergleich zu Antikörpern eine niedrige Immunogenität auf. With high specificity and affinity and chemical stability have aptamers versus antibodies to a low immunogenicity. Aptamere können zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens selektiert werden, das als SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) bezeichnet wird ( Aptamers can be selected, for example, using a method that is called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) ( ; ; WO 91/19813 WO 91/19813 ). ). Daher eignen sich Aptamere als therapeutische und diagnostische Mittel, siehe beispielsweise Therefore, aptamers are useful as therapeutic and diagnostic agents, see for example . ,
  • Zu der Gruppe der künstlichen RNA- oder DNA Moleküle gehören auch die Spiegelmere. To the group of artificial RNA or DNA molecules are also spiegelmers. Diese sind spiegelverkehrte RNA-Abschnitte, die resistent gegen enzymatischen Abbau sind, siehe beispielsweise die europäische Patentanmeldungen These are mirrored RNA portions that are resistant to enzymatic degradation, for example, see European patent applications EP 2 431 377 A1 EP 2431377 A1 . , Sie besitzen damit neben der hohen Spezifität und Affinität eine längere Lebensdauer und Effizienz und können zudem sehr wirksame Inhibitoren Ihrer Zielmoleküle darstellen, zudem vereinen sie die Vorzüge von niedermolekularen Substanzen und Biopharmazeutika, siehe beispielsweise die interantionalen Anmeldungen They have so besides the high specificity and affinity for a longer service life and efficiency, and can also potent inhibitors of your targets, moreover, they combine the advantages of small molecules and biopharmaceuticals, for example, see interantionalen applications WO 2012/025251 A2 WO 2012/025251 A2 und and WO 2004/013274 WO 2004/013274 . , Aufgrund ihrer spiegelbildlichen Struktur werden Spiegelmere in Stoffwechselprozessen nicht abgebaut und binden nicht an die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Because of their mirror image configuration Spiegelmers are not degradable in metabolic processes and do not hybridize with native nucleic acids. Im Gegensatz zu einer Reihe von konventionellen Oligonukleotiden lösen Spiegelmere nicht die angeborene Immunantwort über Toll-like Rezeptoren (TLR) aus. Unlike a conventional nucleic acids, Spiegelmers do not trigger the innate immune response via toll-like receptors (TLR). Darüber hinaus zeigten sie in präklinischen Versuchsreihen ein überaus vorteilhaftes Immunogenitätsprofil. In addition, they showed an exceptionally favorable immunogenicity profile in pre-clinical testing.
  • Wie in den Beispielen dargelegt, korreliert das Vorhandensein der erfindungsgemäßen Markerproteine TNFalpha, IFNgamma und EGFR, mit einer NF1 Erkrankung (Beispiele 2 und 3, As set forth in the examples correlates the presence of the marker proteins TNFalpha, and IFNgamma EGFR according to the invention, with a NF1 disease (Examples 2 and 3, - ) oder im Falle von IGFBP1 und/oder RANTES mit dem Vorhandensein eines NF1 assoziierten Tumors, dem malignen MPNST (siehe Beispiele 4 und 6 sowie die ) Or in the case of IGFBP1 and / or RANTES to the presence of a NF1 associated tumor, malignant MPNST (see Examples 4 and 6 and the und and ). ). Zusätzlich liegt eine veränderte die Konzentration von PDGF-BB in plexiformen Neurofibromen vor (siehe Beispiel 3 sowie In addition, a change in the concentration of PDGF-BB in plexiform neurofibromas is present (see Example 3 and ). ). Ebenfalls wird eine veränderte, dh erhöhte Konzentration von PDGF-BB in NF1 Patienten sowie in NF1 Patienten mit MPNST Tumoren beobachtet (Siehe altered, ie increased concentration of PDGF-BB in NF1 patients and in NF1 patients is also with MPNST tumors observed (See ). ). Somit sind diese Proteine gewissermaßen Indikatoren für pathologische Vorgänge im Rahmen der NF1 Erkrankung in einem zu untersuchenden Patienten. Thus, these proteins are in a sense indicators of pathological processes in the context of NF1 disease in a patient to be examined.
  • Daher umfasst die vorliegende Anmeldung ebenfalls die Verwendung eines Kits in dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend aufgeführt, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen. Therefore, the present application also includes the use of a kit in the inventive process as mentioned above, wherein the kit comprises reagents specific for the detection of at least one protein selected from a group consisting of IFN gamma, IL-6, TNF-alpha, EGFR, IGFBP1 , RANTES, and PDGF-BB, or fragments thereof, in which the reagents preferably include antibodies or fragments thereof.
  • Die Verwendung solcher Kits sind für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließend forensische Analysen, diagnostische und Anwendungen sowie epidemiologische Studien an NF1 Krankheiten und deren damit verbundenen Symptomen, jedoch nicht auf diese beschränkt. The use of such kits are useful for a variety of purposes, including forensic analysis, diagnostic and applications, and epidemiological studies of NF1 disease and its associated symptoms, but not limited to these. Ein derartiges Kit würde typischerweise markierte oder unmarkierte Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere oder Ähnliches enthalten. Such a kit would typically contain labeled or unlabeled antibody, or fragments thereof, aptamers, spiegelmers, or the like.
  • Weiterhin kann das Kit auch Puffer, ein spezifisches Konjugat nebst Enzym, eine Waschlösung, eine Substratlösung zum Nachweis der Immunreaktion und/oder eine Stopplösung umfassen. Furthermore, the kit may comprise the detection of the immune response and / or a stop solution buffers, specific conjugate together with an enzyme, wash solution, a substrate solution. Die Puffer, das spezifische Konjugat nebst Enzym, die Waschlösung, die Substratslösung zum Nachweis der Enzymreaktion und die Stopplösung sind dem Fachmann bekannt. The buffers, specific conjugate together with enzyme, wash solution, substrate solution for detection of the enzyme reaction and the stop solution are known in the art. Es wäre beispielsweise ausreichend, dass das Kit Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere, spezifisch für die erfindungsgemäßen Markerproteine umfasst und erst kurz vor der Testung des biologischen Materials die Puffer und anderen Lösungen hinzugegeben werden. It would for example be sufficient that the kit antibodies or fragments thereof, aptamers, spiegelmers, specific to the present invention includes marker proteins and added just prior to testing the biological material, the buffer and other solutions. Es ist jedoch auch möglich, Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere an eine feste Phase gebunden im Kit vorzugeben. However, it is also possible to bound to a solid phase in the kit pretend antibodies or fragments thereof, aptamers, Spiegelmers®. Für den Nachweis der erfindungsgemäßen Marker müssten dann spezifische Konjugate, Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung, die Bestandteile des Kits sein können, nach einem dem Fachmann bekannten Modus zugegeben werden. would then have specific conjugates, wash solution, substrate solution and stop solution for the detection of the marker according to the invention, can be the components of the kit may be added by a known to those skilled mode.
  • Neben den Mitteln zur Durchführung der genannten erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kit weiterhin gegebenenfalls weitere geeignete Komponenten und/oder Hilfsstoffe umfassen. In addition to the means for performing the methods of the invention said kit may further comprise, if appropriate, other suitable components and / or auxiliaries. Geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe sind in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben. Suitable pharmaceutical excipients are described in Remington's Pharmaceutical Sciences.
  • Die erfindungsgemäße Konzeption ist zum Einen besonders aussagekräftig, da sie auf der Analyse definierter Biomarker in einer definierten Probe basiert, welche im direktem Zusammenhang mit einer NF1 Erkrankung stehen, wobei die Anwesenheit oder eine erhöhte Menge von TNFalpha, IFNgamma und optional IL-6 bzw. erniedrigte Menge von EGFR in einer wie oben definierten Probe bezeichnend für die Anwesenheit einer NF1 Erkrankung ist und eine erhöhte Menge an IGFBP1, RANTES und/oder erniedrigte Menge an PDGF-BB bezeichnend für die Anwesenheit eines NF1 assoziierten Tumors ist. The concept according to the invention is particularly informative on the one because it is based on the analysis of defined biomarkers in a defined sample, which are in direct connection with NF1 disease, wherein the presence or increased amount of TNFalpha, IFNgamma and optionally IL-6 and reduced amount of EGFR in a sample as defined above is indicative of the presence of a NF1 disease and an increased amount of IGFBP1, RANTES and / or reduced amount of PDGF-BB is indicative of the presence of a tumor associated NF1. Es ist bekannt, dass sich ein MPNST durch den malignen Verlauf von vorher existierenden PNF entwickelt, wodurch das Risiko von NF1 Patienten mit PNF bis zu 50% ansteigt einen MPNST Tumor zu entwickeln [12, 13]. It is known that a MPNST developed by the malignant course of pre-existing PNF, reducing the risk of NF1 patients with PNF up to 50% increases to develop a MPNST tumor [12, 13]. Somit kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Marker zum ersten Mal ein umfassendes Diagnoseverfahren bereitgestellt, mit dem es ermöglicht wird ohne invasive Verfahren von der Diagnosestellung einer NF1 Erkrankung den weiteren Verlauf der Krankheit, beispielsweise der Entstehung von PNF Tumoren zu überwachen und bei Beginn/Auftreten eines MPNST therapeutische Maßnahmen einzuleiten. Thus, with the help of the markers according to the invention a comprehensive diagnostic method is provided for the first time, with which it is possible to monitor without invasive method of diagnosis of a NF1 disease the course of the disease, for example, the formation of PNF tumors and at start / occurrence of MPNST initiate therapeutic measures.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES sind; Therefore, the present invention also relates to a kit comprising reagents that are specific for the detection of (i) IFNgamma, TNFalpha, and EGFR and / or (ii) IGFBP1 and RANTES; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6. and optionally for PDGF-BB and / or IL-6.
  • Beschreibungsgemäß wird das Kit vorzugsweise zur Diagnose und/oder der Früherkennung von einer NF1 Erkrankungen oder eines NF1 assoziierten Tumors und/oder zur Überwachung der Entwicklung der NF1 Erkrankung und die damit assoziierten klinischen Symptome verwendet. Description According to the kit is preferably used for the diagnosis and / or early detection of a disease or NF1 NF1-associated tumor and / or to monitor the development of the NF1 disease and its associated clinical symptoms. Diesbezüglich ist es durchaus möglich, dass das Kit in zwei Teilen, getrennt oder gemeinsam vertrieben wird. In this respect, it is quite possible that the kit is separated into two parts or sold together. Wobei ein Teil des Kits derart ausgestaltet ist, dass es eine NF1 Erkrankung durch Nachweis mindestens einem der erfindungsgemäßen Marker IFNgamma, TNFalpha, order EGFR umfasst und einen zweiten Teil eines Kits, derart ausgestaltet ist, dass es einen NF1 assoziierten Tumor durch Nachweis von mindestens einem der erfindungsgemäßen Marker IGFBP1 und RANTES umfasst. Wherein a part of the kit is designed such that it comprises a NF1 disease by detecting at least one of the markers IFNgamma, TNFalpha, order EGFR according to the invention and is designed in such a second part of a kit that there is a NF1 associated tumor by detecting at least one the marker IGFBP1 and RANTES invention comprises. Weiterhin könnte in einer bevorzugten Ausführungsform der erste Teil des Kits Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von IL-6 und der zweite Teil des Kits Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von PDGF-BB sind, enthalten. Furthermore, in a preferred embodiment, the first part of the kit reagents that specifically included for the detection of IL-6 and the second part of the kit reagents that are specific for the detection of PDGF-BB, could.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung eines Kits oder das Kit wie vorstehend definiert Reagenzien, die an einem Träger gebunden sind, vorzugsweise auf einem Microarray oder einem Teststreifen. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the use of a kit or kit comprising reagents as defined above, which are bound to a support, preferably on a microarray or a test strip. Beispielsweise können Antikörper oder Fragmente davon an einer festen Phase immobilisiert werden. For example, antibodies or fragments thereof may be immobilized on a solid phase.
  • Wie vorstehend erläutert sind die gängigsten diagnostischen Nachweisverfahren die FACS Analyse, die verschiedenen Arten von Protein-Chip Microarrays sowie der Streifentest/Lateral Flow Immunotest/Teststreifen. As explained above are the most common diagnostic detection methods, the FACS analysis, various types of protein chip microarrays and the test strip / Lateral Flow Immunoassay / test strip. Der Teststreifen kann beispielsweise in Serum – oder andere biologische Proben – eingetaucht und inkubiert werden. The test strip can for example, in serum - are immersed and incubated - or other biological samples. Anhand einer spezifischen biochemischen Reaktion auf dem Teststreifen nach Bildung der erfindungsgemäßen Markerprotein-Antikörperkomplexes kann dann eine spezifische Farbreaktion ausgelöst werden, mit deren Hilfe die Markerproteine detektiert werden können. Based on a specific biochemical reaction on the test strip after formation of the marker protein-antibody complex of the invention, a specific color reaction can be triggered then, with the aid of the marker proteins can be detected. In Analogerweise kann auch ein Microarray, bevorzug ein Protein Chip Microarray, wie vorstehend beschreiben, verwendet werden. be in an analogous manner may also be a microarray, a protein chip Favor microarray as described above is used.
  • Der Fachmann weiß, dass sich andere Reagenzien wie Aptamere, Spiegelmere oder Derivate dieser Nachweismoleküle ebenfalls bestens zum Nachweis der erfindungsgemäßen Marker eignen und in analogerweise verwendet werden können. The skilled worker knows that other reagents such as aptamers, Spiegelmers® or derivatives of these detection molecules also well suited for the detection of the markers of the invention and can be used in an analogous manner.
  • Die experimentellen Daten der vorliegenden Erfindung im Lichte der Erkenntnisse des Stand der Technik zeigen, dass eine permanente Entzündungsreaktion in NF1 Patienten, hervorgerufen durch die erhöhte Ras Aktivität aufgrund der NF1 Haploinsuffizienz aller Körperzellen zu den wesentlichen klinischen Manifestationen bzw. Symptomen der NF1 Erkrankung beiträgt. The experimental data of the present invention in light of the findings of the prior art is shown, that a permanent inflammatory response in NF1 patients, caused by the elevated Ras activity due to the NF1 haploinsufficiency of all body cells to essential clinical manifestations or symptoms of NF1 disease contributes. In diesem Zusammenhang ist es interessant, dass die erfindungsgemäßen Markerproteine (IFNgamma, TNFalpha) den Th1 pro-inflamatorischen Zytokinen und (IL-6 sowie TNFalpha) den Th17 Zytokinen zugeordnet werden können, wobei aus der Literatur bekannt ist, dass die Th1-Zytokin vermittelte Immunantwort eine Th2-Antwort unterbindet und hauptsächlich zu Entzündungsvorgängen führt. In this context it is interesting to note that the marker proteins of the invention (IFNgamma, TNFalpha) (TNFalpha, IL-6 as well) can be assigned to Th17 cytokines Th1 pro-inflamatorischen cytokines and, being known from the literature that the Th1 cytokine mediated immune response prevents a Th2 response and mainly leads to inflammatory processes. Der Th17-Reaktionsweg ist wichtig für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen, dabei unterdrückt IL-17 effizient Th1-Reaktionen und chronifiziert damit Entzündungsprozesse, siehe beispielsweise The Th17 pathway is important for the development of autoimmune diseases, while IL-17 suppresses Th1 responses efficiently and thus becomes chronic inflammatory processes, see for example sowie such as . , Experimentelle und epidemiologische Studien belegen, dass eine chronische Entzündung mit der Tumorgenese einhergeht und ein wichtiger Faktor für dessen Wachstum ist. show experimental and epidemiological studies have shown that chronic inflammation with tumorigenesis is associated and is an important factor for its growth. Dabei stehen zwei Signaltransduktionswege in wechselseitiger Beziehung zueinander: i) Genetisch-bedingte Auslöser welche zu einer neoplastischen Transformation führen und ein entzündliche Umgebung schaffen, ii) Tumor-infiltrierende Leukozyten sind die Initial-Regulatoren von krebsbedingter Entzündung, siehe beispielsweise In this case, there are two signal transduction pathways in a mutual relation to each other: i) genetically-related trigger which lead to neoplastic transformation and create a flammable environment, ii) Tumor-infiltrating lymphocytes are the initial regulators of cancer-related inflammation, for example, see . ,
  • Daher ist eine Blockierung/Neutralisierung der erfindungsgemäßen Markerproteine ein vielversprechender therapeutischer Ansatz für NF1 Patienten. Therefore, a blocking / neutralizing the marker proteins of the invention is a promising therapeutic approach for NF1 patients. Zudem sind die erfindungsgemäßen Marker in der Früherkennung von der malignen Umwandlung extrem nützlich, da therapeutische Eingriffe frühzeitig initiiert werden können, bevor der Tumor sich weiter entwickelt und zu streuen beginnt, so dass Metastasen entstehen. In addition, markers of the invention in the early detection of malignant transformation are extremely useful as therapeutic interventions can be initiated at an early stage, before the tumor evolves and begins to spread, so that metastases arise. Dem entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform auch die Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, PDGF-BB, IL-6 und RANTES zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Accordingly, the present invention relates in one embodiment to the use of an agent that is a modulator of one of the proteins selected from the group consisting of TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, PDGF-BB, IL-6 and RANTES for preparing a medicament in treating a patient with NF1 and / or a tumor associated NF1, preferably wherein the patient was diagnosed as described above in accordance with the inventive method.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff ”Wirkstoff” einen Modulator, wie vorstehend definiert, der sowohl ein Agonist oder Antagonist, welche als Inhibitoren oder auch als Aktivatoren wirken können, sein kann. For the purposes of the present invention, the term "active ingredient" denotes a modulator, as defined above, which can be either an agonist or antagonist which may act as inhibitors or activators. Diesbezüglich geeignete inhibierende Modulatoren bzw. Wirkstoffe schließen ein: anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-IGFBP1 anti-RANTES und/oder anti-PDGF-BB-Antikörper, anti-IL-6, Antigen-bindende Fragmente davon und lösliche Rezeptormoleküle, die spezifisch an diese Proteine binden sowie Verbindungen, die die Synthese, Freisetzung oder Wirkung auf Targetzellen der genannten Proteine verhindern und/oder inhibieren. In this regard, suitable inhibitory modulators or agents include: anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-IGFBP1 anti-RANTES and / or anti-PDGF-BB antibody, anti-IL-6, antigen-binding fragments thereof and soluble receptor molecules, which specifically bind to these proteins and compounds that prevent the synthesis, release, or action on target cells of said proteins and / or inhibit. Diese Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. These compounds are known in the art. Beispielsweise wird in For example, in ) der lösliche IFNgamma Rezeptor als ein Inhibitor für IFNgamma beschrieben, weitere Inhibitoren sind in der internationalen Anmeldung ) Of the soluble IFN gamma receptor described as an inhibitor of IFNgamma, other inhibitors are described in International Application WO 2011069141 A1 WO 2011069141 A1 oder or EP 2211905 A1 EP 2211905 A1 enthalten. contain. Für TNFalpha sind beispielsweise Thalidomid, Tenidap, Phosphodiesterase-Inhibitoren (z. B. Pentoxifyllin und Rolipram), A2b-Adenosinrezeptor-Agonisten und A2b-Adenosinrezeptor-Enhancer bekannt; TNFalpha for example, thalidomide, tenidap, phosphodiesterase inhibitors (e.g., pentoxifylline and rolipram.), A2b adenosine receptor agonists and A2b adenosine receptor enhancers known; für IGFBP1 wird Lithium Chlorid, Insulin als auch humane anti-IGFBP1 Antikörper in der Literatur beschrieben, siehe beispielsweise for IGFBP1 is lithium chloride, insulin and human anti-IGFBP1 antibodies described in the literature, see for example sowie die internationale Anmeldung and the international application WO 96/001125 WO 96/001125 . , Für RANTES sind beispielsweise TGF-β1, Staurosporin, Wortmannin, oder Pertussis Toxin bekannt, siehe beispielsweise RANTES for example, TGF-β1, Staurosporine, wortmannin, or pertussis toxin are known, see for example, . , Für PDGF-BB ist beispielsweise Lycopene in PDGF-BB Lycopene, for example, in als auch Imatinib beschrieben. as imatinib also described.
  • Es können erfindungsgemäß auch andere Entzündungsvermittler als die beschriebenen Wirkstoffe anstatt der oder zusätzlich zu diesen Wirkstoffen verwendet werden. It can be used in the invention, other inflammatory mediators than those described agents instead of or in addition to these agents. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff ”Entzündungsvermittler” auf einen Wirkstoff bzw. inhibierend-wirkenden Modulator, der die pro-entzündliche Vermittleraktivität verringert, blockiert, inhibiert, außer Kraft setzt oder stört. According to the present invention, the term "inflammatory mediator" refers to an agent or inhibitory-acting modulator which reduces the pro-inflammatory mediator activity, blocks, inhibits, or interferes sets overridden. Typische Entzündungshemmer, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Wirkstoffe ein, die die IL-1-Aktivität, -synthese oder die -Rezeptorsignalgebung verringern, blockieren, inhibieren, außer Kraft setzen oder stören, wie anti-IL-1-Antikörper, lösliches IL-1R, IL-1-Rezeptorantagonist oder andere geeignete Peptide und kleine Moleküle; Typical anti-inflammatory drugs that can be used in conjunction with the present invention include agents that, synthesis of IL-1 activity, or reduce the -Rezeptorsignalgebung, block, inhibit, abrogate or interfere with, such as anti-IL-1 antibodies, soluble IL-1R, IL-1 receptor antagonist, or other appropriate peptides and small molecules; Wirkstoffe, die die Aktivität, Synthese oder Rezeptorsignalgebung anderer pro-entzündlicher Vermittler, wie GM-CSF und Mitglieder der Zytokin-IL-8-Familie, verringern, blockieren, inhibieren, außer Kraft setzen oder stören; Drugs that reduce the activity, synthesis or receptor signaling of other pro-inflammatory mediators, such as GM-CSF and members of the cytokine IL-8 family, block, inhibit, disrupt or put aside; und Zytokine mit anti-entzündlichen Eigenschaften, wie IL-4, IL-10, IL-13 und TGFβ. and cytokines with anti-inflammatory properties, such as IL-4, IL-10, IL-13 and TGF. Zusätzlich können andere anti-entzündliche Wirkstoffe, wie der anti-rheumatische Wirkstoff Methotrexat, ggf. in Verbindung mit dem IL-12-Antagonisten und/oder dem TNF-Antagonisten verabreicht werden. In addition, other anti-inflammatory agents, can be administered if necessary in combination with the IL-12 antagonist and / or the TNF antagonist such as the anti-rheumatic agent methotrexate, can. Entzündungsvermittler und anti-entzündliche Wirkstoffe sind auch in dem Inflammatory mediators and anti-inflammatory agents are also in the US Patent Nr. 6270766 US Pat. No. 6270766 beschrieben. described.
  • Erste Versuche der Erfinder plexiforme Neurofibrome mit Imatinib (Glivec oder STI571, ein 2-Phenylaminopyrimidinderivat) zu behandeln, haben bei einigen Patienten gutes Ansprechen gezeigt. Initial trials of the inventor to treat plexiform neurofibromas with imatinib (Gleevec or STI571, a 2-Phenylaminopyrimidinderivat) have shown good response in some patients. Imatinib ist ein Inhibitor strukturell verwandter Rezeptortyrosinkinasen zu denen auch der Rezeptor, welcher ein Tyrosinkinaserezeptor ist, für PDGF (PDGFR) gehört. Imatinib is an inhibitor of structurally related receptor tyrosine kinases which also include the receptor which is a tyrosine kinase receptor, PDGF (PDGFR). PDGF-BB ein Wachstumsfaktor, der auf gliale Zellen wie zum Beispiel Schwannzellen wirkt. PDGF-BB growth factor acting on glial cells, such as Schwann cells. Nervenscheidentumore wie MPNST und Neurofibrome gehen aus Schwannzellen hervor. Nerve sheath tumors such as neurofibromas and MPNST emerge from Schwann cells. Die Blockierung des PDGF/PDGFR Systems ist daher vielversprechend zur Behandlung von Nervenscheidentumoren. The blocking of the PDGF / PDGFR system is therefore promising for the treatment of nerve sheath tumors.
  • Daher eignen sich besonders Wirkstoffe, wie vorstehend definiert sowie neutralisierende Antikörper oder Fragmente davon, die gegen IGFBP1 und RANTES und/oder PDGF-BB gerichtet sind zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines NF1 assoziierten Tumors, insbesondere eines malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) oder eines plexiformen Neurofibroms (PNF), vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Therefore, especially active ingredients, as defined above, as well as neutralizing antibodies or fragments thereof are suitable which are directed against IGFBP1 and RANTES and / or PDGF-BB for the manufacture of a medicament for treating a NF1 associated tumor, particularly a malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) or a plexiform neurofibroma (PNF), preferably wherein the patient was diagnosed as described above in accordance with the inventive method. Besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Kombination von IGFBP1 und RANTES spezifischen Wirkstoffen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines MPNST. Particularly preferred within the scope of the present invention, the use of a combination of IGFBP1 and RANTES specific active ingredients for producing a medicament for the treatment of MPNST is. Weiterhin besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung von einem PDGF-BB spezifisch inhibierenden Modulator (Antagonist) oder Wirkstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines PNF in einem NF1 Patienten oder eines PDGF-BB inhibierenden Modulators zur Behandlung eines MPNST. is further particularly preferred in the context of the present invention provides the use of a PDGF-BB specific inhibitory modulator (antagonist) or active ingredient for the manufacture of a medicament for treating a PNF NF1 in a patient or inhibiting PDGF-BB modulator for the treatment of MPNST. Wie weiterhin aus As further from ersichtlich, ist das PDGF-BB Level in NF1 Patienten im Vergleich zu gesunden Pateinten erhöht und somit eignen sich PDGF-BB Antagonisten ebenfalls zur Behandlung von NF1 assoziierten Symptomen. seen, the PDGF-BB levels in NF1 patients is increased compared to healthy Pateinten and thus PDGF-BB antagonists are also useful for the treatment of NF1-associated symptoms.
  • Da wie in den Beispielen 2 und 3 sowie den Since, as in Examples 2 and 3 and und and aufgeführt, das PDGF-BB Level in PNF erniedrigt verglichen zu NF1 Patienten ohne PNF, als auch das EGFR Level in Seren von NF1 Patienten verglichen zu nicht NF1 Betroffenen signifikant erniedrigt vorliegt, umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines PDGF-BB und/oder EGFR-spezifisch aktivierenden Modulators (Agonist) als Wirkstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines NF1 Patienten, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. listed, the PDGF-BB Level in PNF lowered compared to NF1 patients without PNF, as also compared the EGFR levels in sera from NF1 patients not NF1 affected significantly lowered present, the present invention encompasses the use of a PDGF-BB and / or EGFR-specific activating the modulator (agonist) as an active ingredient for the manufacture of a medicament for the treatment of NF1 patients, preferably wherein the patient was diagnosed as described above, according to the inventive method. Agonisten des PDGF-BB Rezeptors sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise PDGF-BB oder PDGF-Rezeptor-aktivierende Substanzen, wie Tyrosinkinaserezeptoragonisten. Agonists of the PDGF-BB receptor are known in the art and include, for example PDGF-BB or PDGF-receptor activating substances, such Tyrosinkinaserezeptoragonisten. Bevorzugt ist der Agonist derart ausgestaltet, dass er als duales Molekül verabreicht wird, wobei ein Teil des Moleküls spezifisch PNF Zellen erkennt und somit zu einer spezifischen Erhöhung von PDGF-BB in PNF Zellen führt. the agonist is preferably configured such that it is administered as a dual molecule, wherein a part of the molecule specifically recognizes PNF cells and thus leads to a specific increase of PDGF-BB in PNF cells. Obwohl bisher die Aktivierung insbesondere des EGFR Levels und/oder PDGF-BB aus bisheriger Sicht eines Fachmanns nicht wünschenswert erschien, so sind allgemein Agonisten von der vorliegenden Erfindung explizit umfasst, da erwartet werden kann, dass in naher Zukunft solche Agonisten im Sinne der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise Verwendung finden. Although so far the activation of particular EGFR levels and / or PDGF-BB did not appear from previous view of an expert desirable as agonists are generally explicitly included by the present invention, as can be expected in the near future such agonists for the purposes of the present invention be used advantageously.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung somit auch die Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffs zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Further, the present invention thus relates to the use of an anti-tumor agent for the preparation of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or a NF1 associated tumor, wherein the patient has been diagnosed as described above, according to the inventive method.
  • Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können einem Individuum prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden. The active compounds can be administered to a subject prophylactically or therapeutically. Weiterhin können alle TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe gemeinsam, gleichzeitig oder nur in einer Kombination aus einem, zwei, drei, vier oder fünf (in der gleichen oder anderen Zusammensetzungen) oder sequentiell verabreicht werden. Furthermore, all TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB-specific active ingredients can together, simultaneously or only in a combination of one, two, three, four or five (in the same or other compositions ) or be administered sequentially.
  • Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können einem Individuum auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. The active compounds of the present invention can be administered to an individual in different ways. Die Verabreichungswege schließen ein intradermale, transdermale (z. B. in Slow-Release-Polymeren), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse (einschließend Infusion und/oder Bolus-Injektion), subkutane, orale, topische, epidurale, buccale, rektale, vaginale und intranasale Wege. The routes of administration include intradermal, transdermal (eg. B. Slow release polymers), intramuscular, intraperitoneal, intravenous (including infusion and / or bolus injection), subcutaneous, oral, topical, epidural, buccal, rectal, vaginal and intranasal routes. Andere geeignete Verabreichungswege können auch verwendet werden, beispielsweise um Absorption durch epitheliale oder mucokutane Deckschichten zu erreichen. Other suitable routes of administration may also be used to achieve, for example, absorption through epithelial or mucocutaneous layers. Zur parenteralen (z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär) Verabreichung können TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung als Lösung, Suspension, Emulsion oder gefriergetrocknetes Pulver formuliert werden zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Vehikel. For parenteral (eg., Intravenous, subcutaneous, intramuscular) administration, TNF-alpha, IFN gamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB-active compounds of the present invention as a solution, suspension, emulsion or lyophilized powder can be formulated together with a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle. Beispiele für solche Vehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung und 5%-Humanserum-Albumin. Examples of such vehicles are water, saline, Ringer's solution, dextrose solution and 5% -Humanserum albumin. Liposomen und nicht-wässrige Vehikel wie fixierte Öle können auch verwendet werden. Liposomes and non-aqueous vehicles such as fixed oils can also be used. Das Vehikel oder gefriergetrocknete Pulver kann Additive enthalten, die die Isotonie (z. B. Natriumchlorid, Mannitol) oder die chemische Stabilität (z. B. Puffer und Konservierungsstoffe) aufrecht erhalten. The vehicle or lyophilized powder may contain additives that maintain isotonicity (e.g., sodium chloride, mannitol) or chemical stability obtained (z., Buffers and preservatives) upright. Die Formulierung wird mit üblicherweise verwendeten Techniken sterilisiert. The formulation is sterilized by commonly used techniques.
  • TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können auch durch Gentherapie verabreicht werden, wobei dem Patienten ein DNA-Molekül, das ein bestimmtes therapeutisches Protein oder Peptid kodiert, verabreicht wird, z. TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB-specific agents of the present invention may also be administered by gene therapy, wherein administration to the patient, a DNA molecule encoding a particular therapeutic protein or peptide, is z. B. mittels eines Vektors, der die Expression und Sekretion des bestimmten Proteins oder Peptids in therapeutischen Mengen in vivo veranlasst. Example by means of a vector which causes the expression and secretion of a particular protein or peptide in therapeutic amounts in vivo. Zusätzlich können TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen Komponenten wie Hilfsstoffen verabreicht werden, beispielsweise pharmazeutisch verträgliche oberflächenentspannende Hilfsstoffe (z. B. Glyzeride), Korrigenzien (z. B. Laktose), Träger, Verdünnungsmittel und Vehikel. In addition, TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB-specific agents of the present invention can be administered together with other components such as excipients, for example, pharmaceutically acceptable surface tension-reducing agents (such. As glycerides), corrigents (eg., lactose), carriers, diluents and vehicles. Falls gewünscht, können ebenfalls bestimmte Süßungs-, Geschmacks- oder Farbstoffe hinzugefügt werden. If desired, certain sweetening, flavoring or coloring agents may also be added.
  • Der Offenbarungsgehalt der vor- und nachstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen, damit beladene Chips und Arrays, Vektoren, Wirtszellen, Antikörper, transgene Tiere, etc. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfasst durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. The disclosure of the cited above and below documents from the prior art which is hereby incorporated by reference into this application, in particular concerning the preparation of proteins of the invention, thus laden chips and arrays, vectors, host cells, antibodies, transgenic animals, etc. These and other embodiments are disclosed and obvious to the skilled person and embraced by the description and examples of the present invention. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Werkstoffen und elektronischen Hilfsmitteln, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z. Additional references to any of the above materials and electronic tools, which can be used for the purposes of the present invention, the prior art can be found in, for. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. from public libraries on z. B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. For example, the use of electronic means. Zudem bieten sich andere öffentliche Datenbanken an wie die ”Medline”, die über das Internet zur Verfügung stehen. In addition, other public databases like the "Medline" which are available over the Internet.
  • Techniken zur Ausführung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Techniques for implementing the invention are known to those skilled in the relevant literature and can be found, for example, see ; ; ; ; ; ; Mullis et al. Mullis et al. US Pat. No. US Pat. 4,683,195 4,683,195 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; . ,
  • BEISPIELE EXAMPLES
  • Material und Methoden material and methods
  • Patienten und Serumentnahme Patients and serum collection
  • Serumproben von NF1 Patienten wurden von der Abteilung Mund-Kiefer und Gesichtschirurgie, Universitätsklinik Eppendorf, Hamburg bezogen. Serum samples from NF1 patients were obtained from the Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Eppendorf, Hamburg. Alle NF1 Patienten wurden klinisch nach den veröffentlichen Richtlinien und Kriterien diagnostiziert [31]. All NF1 patients were clinically figures published guidelines and criteria diagnosed [31]. Serumproben von gesunden Probanden wurden von dem Institut für medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin bezogen. Serum samples from healthy volunteers were obtained from the Institute for Medical Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin. Alle Seren wurden mittels IRB-bestätigten Protokollen gesammelt. All sera were collected by IRB confirmed protocols. Detaillierte Informationen zu den Patienten Kohorten sind Tabelle 1 zusammengestellt. Detailed information on the patient cohorts are shown Table 1 below. Venöses Blut (1 bis 10 ml) wurde gesammelt, innerhalb von 2 Stunden zentrifugiert und anschließend wurden die Serumproben aliquotiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Venous blood (1 to 10 ml) was collected, centrifuged within 2 hours and then the serum samples were aliquoted and stored at -80 ° C until use. Frische Aliquots wurden für jede Analyse verwendet. Fresh aliquots were used for each analysis. Tabelle 1: Charakteristika der Patientenkohorten. Table 1: Characteristics of patient cohorts.
    Figure DE102012020496A1_0002
    Tabelle 2: Überblick über die Serummarkereigenschaften bei 90%iger Sensitivität. Table 2: Overview of the serum marker properties at 90% sensitivity. A) NF1-Marker A) NF1 marker
    Analyt analyte Sensitivität sensitivity Spezifität specificity NF1 NF1 Nicht-NF1 Non-NF1
    Richtig positiv Anzahl (%) True positive Number (%) Falsch negativ Anzahl (%) False negative number (%) Falsch positiv Anzahl (%) False positive Number (%) Richtig negativ Anzahl (%) True negative number (%)
    IFNg IFNg 90,4 90.4 70,7 70.7 94 (90,4) 94 (90.4) 10 (9,6) 10 (9.6) 12 (29,3) 12 (29.3) 29 (70,7) 29 (70.7)
    EGFR EGFR 90,4 90.4 14,6 14.6 94 (90,4) 94 (90.4) 10 (9,6) 10 (9.6) 35 (85,4) 35 (85.4) 6 (14,6) 6 (14.6)
    IL-6 IL-6 90,4 90.4 51,2 51.2 94 (90,4) 94 (90.4) 10 (9,6) 10 (9.6) 20 (48,8) 20 (48.8) 21 (51,2) 21 (51.2)
    TNFa TNFa 90,4 90.4 68,3 68.3 94 (90,4) 94 (90.4) 10 (9,6) 10 (9.6) 13 (31,7) 13 (31.7) 28 (68,3) 28 (68.3)
    Gesamt N-Zahl: 145; Total N Number: 145; N-Zahl Kontrollen: 41, N-Zahl NF1 Patienten: 104 (30 mit MPNST, 39 mit plex. Neurofibrom, 35 nur mit kutanen Neurofibromen) B) MPNST Marker (nur NF1 Patienten) N-number control: 41, N number NF1 patients: 104 (30 MPNST, 39 plex neurofibroma, 35 only with cutaneous neurofibromas.) (B) MPNST marker only NF1 patients)
    Analyt analyte Sensitivität sensitivity Spezifität: specificity: MPNST MPNST Nicht-MPNST Non-MPNST
    Richtig positiv Anzahl (%) True positive Number (%) Falsch negativ Anzahl (%) False negative number (%) Falsch positiv Anzahl (%) False positive Number (%) Richtig negativ Anzahl (%) True negative number (%)
    IGFBP1 IGFBP1 90,0 90.0 50,0 50.0 27 (90,0) 27 (90.0) 3 (10,0) 3 (10.0) 37 (50,0) 37 (50.0) 37 (50,0) 37 (50.0)
    Rantes RANTES 90,0 90.0 25,7 25.7 27 (90,0) 27 (90.0) 3 (10,0) 3 (10.0) 55 (74,3) 55 (74.3) 19 (25,7) 19 (25.7)
    Aussagen zu richtig/falsch positiv und richtig/falsch negativ. Statements about true / false positive and true / false negative. Die vordere Zahl ist n, die Anzahl der Patienten. The front number n, the number of patients. Dahinter in Klammern ist die Prozentzahl der richtig/falsch positiven bzw. negativen Patienten angegeben. Behind the percentage of true / false positive and negative patients is indicated in parentheses.
  • Kandidatenmarker Auswahl Candidate marker selection
  • Das Auswählen von Kandidatenmarkern basierte auf einer manuellen Literatursuche in Veröffentlichungen und Datenbanken, welche in (i) Serum, Plasma oder Zellüberständen Proteinlevels von Patienten mit Nerventumoren oder Epitheltumoren oder Zelllinien beschreiben, und in (ii) differenzieller Genexpression zwischen den normalen peripheren Nervensystem, Neurofibromen und MPNST sowie (iii) immunmodulatorische Zytokine. The selection of candidate markers based on a manual literature search in publications and databases that describe in (i) serum, plasma or cell supernatants protein levels in patients with nerve tumors or epithelial tumors or cell lines, and differential in (ii) gene expression between normal peripheral nervous system, neurofibromas and MPNST and (iii) immunomodulatory cytokines. Die so aufgestellte Kandidatenfaktorliste basiert auf der Genontologie (GO) und den Genkarteninformationen [32, 33] weiter reduziert indem solche Faktoren, die bereits eine bekannte Funktion in der Tumorgenese wie beispielsweise Wachstumsbeschleunigung, Migration und Metastasierung, Angiogenese und Immunmodulation aufweisen, ausgewählt wurden. The thus erected candidate factor list based on the gene ontology (GO) and the Genkarteninformationen [32, 33] further reduced by such factors, which already have a known function in tumorigenesis, such as accelerated growth, migration and metastasis, angiogenesis, and immune modulation have been selected. Die abschließende Auswahl der Kandidatenfaktoren wurde anhand der Verfügbarkeit geeigneter Screening Plattformen ausgewählt. The final selection of candidate factors have been selected platforms based on the availability of appropriate screening. Von den 115 ausgewählten möglichen Serumproteinen wurde basierend auf der Verfügbarkeit von Antikörpern für eine individuell angepasste Array-Analyse eine Liste von 56 Kandidatenfaktoren zusammengestellt, die zum Screening von Serumproben ( From the selected 115 potential serum proteins was compiled based on the availability of antibodies for a customized array analysis a list of 56 candidates factors (to screen serum samples ) verwendet wurde. ) was used.
  • Serum screening serum screening
  • Individuell hergestellte humane Quantibodys ® Arrays (Raybiotech, Inc., GA, USA) wurden verwendet um die Serumproteinkonzentration zu bestimmen. Human Quantibodys ® arrays (RayBiotech, Inc., GA, USA) individually produced were used to determine the serum protein concentration. Die Analyse wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. The analysis was performed according to the manufacturer's instructions. Das Imaging wurde mittels Quantibody ® Array Testing Software (Raybiotech, Inc., GA, USA) durchgeführt. Imaging was performed by Quantibody ® Array Testing Software (RayBiotech, Inc., GA, USA). Potenzielle Markerproteine wurden zuerst bei einem Screening von 30 Proteinkandidaten unter Verwendung von 60 NF1 Seren identifiziert. Potential marker proteins were first identified in a screening of 30 candidate proteins using 60 NF1 sera. Eine weitere zweite Validierung wurde mit den 5 Proteinen, welche signifikante Unterschiede in der ersten Screening Runde aufzeigten, zusammen mit weiteren 26 Kandidatenproteinen durchgeführt. Another second validation was performed with the 5 proteins which aufzeigten significant differences in the first round of screening, together with further 26 candidate proteins. In der zweiten Runde wurden 104 NF1- und 41 Kontrollseren verwendet. In the second round 104 NF1 and 41 control sera were used. Insgesamt wurden 56 Kandidatenproteine gescreent sowie 104 NF1- und 41 Kontrollsera verwendet. A total of 56 candidate proteins were screened and used 104 NF1 and 41 control sera. Die Kandidatenproteine wurden gleichzeitig mittels multiplexer Erfassung in Dreier-Spots pro Array gescreent. The candidate proteins were screened simultaneously by means of multiplexer detection in three spots per array. Das heißt, dass alle Seren mindestens dreifach analysiert wurden. This means that all sera were analyzed at least three times. Eine Übersicht des Screenings-Verfahrens ist in An overview of the screening process is in dargestellt. shown. Serumfaktoren, welche ein signifikant unterschiedliches Level zwischen den einzelnen Gruppen aufwiesen, wurden mittels Festphasenenzymimmunoassays (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) für Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine 1 (IGFBP1), und zytometischen Kügelchen/Beads-Arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) für RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), Interferon γ (IFNγ), Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα), in einer ausgewählten Teilgruppe von Serumproben (n = 11) verifiziert. Serum factors, which had a significantly different level between the groups were further analyzed by Festphasenenzymimmunoassays (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) binding to insulin-like growth factors proteins 1 (IGFBP1) and zytometischen beads / bead arrays (CBA) (BD Bioscience , Heidelberg, Germany) (for RANTES Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), interferon γ (IFN), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNF) in a selected subset of serum samples (n = 11) verified. Die Analysen wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Analyzes were performed according to the manufacturer's instructions. Die ”Einfang”-Kügelchen (Capture beads) wurden mit einem FACS-Calibur Durchflusszytometer analysiert (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland). The "capture" beads (capture beads) were measured with a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Die Durchflusszytometriedaten wurden mittels FCAP Array Analysis Software evaluiert (Soff Flow, Inc., MN, USA). The flow cytometry data were analyzed by FCAP Array Analysis Software evaluated (Soff Flow, Inc., MN, USA).
  • Datenauswertung data analysis
  • Serumlevel der Markerkandidaten in den NF1 und Kontrollobjekten wurden mittels der Medianebene und des Quartilabstands analysiert. Serum levels of the marker candidates in the NF1 and control objects were analyzed by the median plane and the interquartile range. Um alle Daten einer normalen Verteilung zu verifizieren, wurde der Kolmogorow-Smirnow Test verwendet. To verify all data from a normal distribution, the Kolmogorov-Smirnov test was used. Ausdifferenzierte Patientengruppen wurden mittels des Mann-Whitney U Test für kontinuierliche nicht-parametrische Variablen verglichen. Differentiated groups of patients were compared using the Mann-Whitney U test for continuous non-parametric variables. Um die Aussagefähigkeit der individuellen Marker zu prüfen wurden die Receiver Operating Characteristics (ROC) der Kurven und die Fläche unter dieser Kurve (AUC) berechnet. To check the validity of the individual markers, the receiver operating characteristics (ROC) curves and the area under the curve (AUC) were calculated. Es wurde eine Bonferroni Korrektur durchgeführt. It was performed a Bonferroni correction. Die P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angenommen. P values ​​<0.05 were considered significant. Statistische Auswertungen wurden mittels SPSS Softwareversion 18 (SPSS, Inc.; IL, USA) und GraphPad Prism Software 5.0 (GraphPad Software Inc., CA, USA) durchgeführt. Statistical analyzes were performed 5.0 (GraphPad Software Inc., CA, USA) using SPSS software version 18 (SPSS, Inc .; IL, USA) and GraphPad Prism software. Detektion der Zytokinenproduktion von T-Lymphozyten mittels Cytometric Bead Array Detecting the Zytokinenproduktion of T lymphocytes by Cytometric Bead Array
    BD BD 560112 560112 Human TNF FlexSet (Bead C4) Human TNF FlexSet (Bead C4)
    BD BD 558324 558324 Human RANTES Flex Set (Bead D4) Human RANTES Flex Set (Bead D4)
    BD BD 558276 558276 Human IL-6 Flex Set (Bead A7) Human IL-6 Flex Set (Bead A7)
    BD BD 560111 560111 Human IFN-a Flex Set (Bead) Human IFN-a Flex Set (bead)
    BD BD 560005 560005 Cell Signaling Master Buffer Kit Cell Signaling Master Buffer Kit
    Die Bestimmung von TNFalpha, IL-6, IFNgamma und RANTES mit einem CBA (Cytometric Bead Array) der Firma BD Bioscience. The determination of TNFalpha, IL-6, IFN gamma, and RANTES with a CBA (Cytometric Bead Array) from BD Bioscience.
  • Das Prinzip beruht auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an sogenannte ”Einfang-Beads” und auf der zeitgleichen Detektion von Zytokinen durch das aus mit Phycoerythrin(PE)-konjugierten Antikörpern bestehende Detektions-Reagenz. The principle is based on the binding of specific antibodies to so-called "capture beads" and on the simultaneous detection of cytokines by consisting of phycoerythrin (PE) -conjugated antibodies existing detection reagent. Nach Anregung dieses Reagenz entsteht ein fluoreszierendes Signal, welches proportional zur Menge des gebundenen Zytokins ist. After excitation of this reagent, a fluorescent signal which is proportional to the amount of bound cytokine produced.
  • Zur Bestimmung der Zytokinkonzentration können 20 μL von jedem Überstand eingesetzt werden. To determine the cytokine concentration 20 l of each supernatant can be used. Je 20 μL Probe können je 4 μL der 4 Capture Beads zugegeben werden. Each 20 ul of sample can be added to each 4 4 ul of the capture beads. Die Inkubation erfolgt für 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. The incubation is carried out for 3 hours at room temperature in the dark. Anschließend werden die Ansätze mit je 400 μL Waschpuffer 5 Minuten (300 × g, Raumtemperatur) zentrifugiert und die Überstände bis auf ein Restvolumen von 100 μL abgenommen. Subsequently, the batches with 400 ul wash buffer for 5 minutes (300 x g, room temperature) and centrifuged to a residual volume of 100 .mu.l the supernatants. Die Analyse erfolgt mit dem FACSCanto von BD Bioscience und der BDTM CBA Software. The analysis is done with the FACSCanto BD Bioscience and BDTM CBA software.
  • Beispiel 1: Auffindung und Auswahl der Kandidatenmarkerproteine Example 1: Finding and selecting candidates marker proteins
  • Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine erbliche Tumorerkrankung, die durch die Entwicklung von beginnenden Nervenscheidentumoren gekennzeichnet ist, welches in 8 bis 13% der NF1 Patienten in einen peripheren malignen Nervenscheidentumor (MPNST) transformiert. Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a hereditary tumor disease, which is characterized by the development of incipient nerve sheath tumors, which in 8 to 13% of NF1 patients in a peripheral malignant nerve sheath tumor (MPNST) is transformed. MPNST sind invasive Sarkome mit extrem schlechter Prognose und ihre Entwicklung korreliert mit der internen Tumorlast in NF1-Patienten. MPNST are invasive sarcoma with extremely poor prognosis and their development is correlated with the internal tumor burden in NF1 patients. Da die Früherkennung von NF1 Patienten, die einen MPNST entwickeln, deutlich den klinischen Erfolg dieser Patienten verbessern würde, ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, Serumbiomarker für die Tumorfrüherkennung zu identifizieren und ihre Korrelation mit den Tumorarten und der internen Tumorlast zu analysieren. Since the early diagnosis of NF1 patients develop a MPNST, would significantly improve the clinical success of these patients, the goal of the present invention to identify Serumbiomarker for tumor detection and analyze their correlation with tumor types and internal tumor burden.
  • Wie vorstehend im Material und Methodenteil beschrieben wurden Antikörper Arrays verwendet um Serummarker allgemein für NF1 und spezifisch für NF1-assozierten Nervenscheidentumor zu identifizieren. Antibody arrays were as described above in the Material and Methods section used to serum markers for NF1 generally and specifically identify for NF1-associated nerve sheath tumor. Händisch ausgesuchte Daten förderten eine Liste von 115 Proteinen als potenzielle Serummarker für NF1 zu Tage. Manually selected data encouraged a list of 115 proteins as potential serum markers of NF1 to light. 79 dieser Proteine werden in PNS und MPNST exprimiert oder werden als tumorgenerische Serumfaktoren beschrieben. 79 of these proteins are expressed in PNS and MPNST or described as tumor generic serum factors.
  • Die anderen 36 Proteine sind immunmodulatorische Zytokine. The other 36 proteins are immunomodulatory cytokines. Diese wurden ausgewählt, weil es Hinweise darauf gibt, dass die systemische NF1 Haploinsuffizienz in NF1-Patienten möglicherweise zu einer Überexpression von Zytokinen führt [34, 35]. These were chosen because there is evidence that systemic NF1 haploinsufficiency in NF1 patients may lead to an overexpression of cytokines [34, 35].
  • Daher scheint der Grad der immunologischen Deregulation möglicherweise indirekt das Risiko für Tumorwachstum und maligne Transformation zu erhöhen. Therefore, the degree of immunological deregulation seems to may indirectly increase the risk of tumor growth and malignant transformation. Seren von 104 NF1-Patienten mit unterschiedlichen Tumortypen und 41 ausgesuchten Kontrollsubjekten (Tabelle 1) wurden gemeinsam analysiert und 56 von den 115 zuerst identifizierten Kandidatenproteinen wurden gescreent ( 104 sera from NF1 patients with different tumor types and 41 selected control subjects (Table 1) were analyzed together, and 56 from the first identified 115 candidate proteins were screened ( ). ). Die statistische Auswertung wurde mittels nicht-parametrischem Mann-Whitney U Test, gefolgt von einer Bonferroni-Korrektur, durchgeführt. The statistical analysis was using non-parametric Mann-Whitney U test, followed by a Bonferroni correction performed.
  • Beispiel 2: Die inflammatorischen Zytokine IFNγ, TNF-α und IL-6 zeigen signifikant erhöhte und EGFR ein erniedrigtes Serumlevel in NF1-Patienten. Example 2: The inflammatory cytokines IFN-, TNF-α and IL-6 are significantly increased EGFR and a lowered serum level in NF1 patients.
  • Wie vorstehend im Abschnitt Material und Methoden aufgeführt, werden die Serumfaktoren, welche ein signifikant unterschiedliches Level zwischen den einzelnen Gruppen aufweisen, mittels Festphasenenzymimmunoassay (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) für Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine 1 (IGFBP1), und zytrometischen Kügelchen/Beads-Arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) für RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), interferon γ (IFNγ), interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα), gemäß den Herstellerangaben in einer ausgewählten Teilgruppe von Serumproben (n = 11) verifiziert und ausgewertet. As above, materials and methods specified in section, the serum factors which have a significantly different level between the groups by means of solid phase enzyme (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) for insulin-like growth factor binding proteins 1 (IGFBP1) and zytrometischen beads / Beads array (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) for RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), interferon γ (IFN), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNF ) according to the manufacturer's instructions verified in a selected subset of serum samples (n = 11) and evaluated. Für PDGF-BB kann ebenfalls ein Festphasenenzymimmunoassa von Abcam (PDGF BB Human ELISA Kit (ab100624)) verwendet werden. PDGF-BB a Festphasenenzymimmunoassa from Abcam (PDGF BB Human ELISA Kit (ab100624)) can also be used.
  • Es lag ein signifikanter Unterschied für sechs Proteine zwischen den jeweiligen Kohorten vor. There was a significant difference for six proteins between the respective cohorts. Die Serumkonzentrationen von allen sechs Markerkandidaten waren unabhängig vom Alter und Geschlecht beobachtet worden. Serum concentrations of all six candidate markers were observed regardless of age and gender. Signifikante Unterschiede in den Serumkonzentrationen von vier Proteinen wurden in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten gefunden ( Significant differences in the serum levels of four proteins were compared in NF1 patients found to healthy subjects ( ). ). Die Konzentration des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) ist signifikant geringer in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten, wobei die inflammotrischen Zytokine IFNγ, TNF-α und IL-6 einen signifikant höheren Serumlevel in NF1-Patienten zeigen. The concentration of the epithelial growth factor receptor (EGFR) is significantly lower in NF1 patients compared to normal subjects, wherein the inflammotrischen cytokines IFN-, TNF-α and IL-6 show a significantly higher serum levels in NF1 patients.
  • Weiterhin werden die NF1 Kohorten in drei klinische Gruppen (NF1-Patienten mit (i) nur kutanten Neurofibromen (cNF), (ii) mit plexiformen Neurofibromen (PNF) und (iii) mit malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST), aufgeteilt, siehe auch Tabelle 1. Zur Identifizierung der Unterschiede zwischen gesunden Probanden und NF1 Betroffenen wird eine Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni Korrektur durchgeführt. Wenn ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen gezeigt werden kann, wird zur Differenzierung eine Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) angeschlossen, die zum einen eine Unterscheidung zwischen gesunden Probanden und NF1 Betroffenen mit unterschiedlicher Tumorentitäten, zum Anderen auch Unterschiede zwischen den verschiedenen Tumorentitäten selbst ermöglicht. Furthermore, the NF1 cohorts in three clinical groups (NF1 patients with (i) only kutanten neurofibromas (CNF), (ii) with plexiform neurofibromas (PNF), and (iii) with malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST), divided, see also Table 1. to identify the differences between healthy subjects and NF1 concerned analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni is carried out correction. If a significant difference between the two groups can be shown to differentiate a multivariate analysis of variance (MANOVA) is connected, the one to a distinction between healthy subjects and NF1 affected with different tumor entities, on the other hand allows for differences between the various tumor entities themselves.
  • Wie aus der As from the und and ersichtlich, zeigt IFNgamma, EGFR, IL-6 sowie TNFalpha zwar einen signifikanten Unterschied in NF1-Patienten verglichen zu den Kontrollpatienten jedoch keinen Unterschied in Patienten mit MPNST verglichen zu denen ohne MPNST. seen IFNgamma, EGFR, IL-6 and TNF-alpha is indeed a significant difference in NF1 patients, however, compared to the control patients no difference in patients with MPNST compared to those without MPNST.
  • Die Ergebnisse deuten ebenfalls darauf hin, dass die erhöhten Zytokinlevel in NF1-Patienten unabhängig von deren Tumorlast sind. The results also suggest that the increased Zytokinlevel in NF1 patients, regardless of their tumor burden are. Eher legen diese Daten nahe, dass eine systemische NF1-Haploinsuffizienz einen permanenten und systemischen Entzündungsreaktionstatus in NF1-Patienten hervorruft, welcher sich durch eine signifikante Erhöhung von IFNγ, TNFα und IL-6 bemerkbar macht [34]. Rather, these data suggest that systemic NF1 haploinsufficiency causes a permanent and systemic inflammatory response status in NF1 patients, which is easily perceived by a significant increase of IFNg, TNFa and IL-6 [34].
  • Beispiel 3: Die Platelet derived growth factor BB-chain (PDGF-BB) Serumkonzentration in NF1 Patienten mit einem PNF ist signifikant erniedrigt. Example 3: The platelet derived growth factor BB-chain (PDGF-BB) serum concentration in NF1 patients with PNF is significantly reduced.
  • Die Untersuchung der PDGF-BB Konzentration in Serumproben von NF1 Patienten mit PNF (n = 39), sind wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt und ausgewertet worden. The examination of the PDGF-BB concentration in serum samples from NF1 patients with PNF (n = 39), have been described, performed and evaluated as in Example 2. FIG. Wie aus der As from the ersichtlich, weisen die Werte in NF1 Patienten für PDGF-BB einen erhöhten Wert verglichen zu den gesunden Patienten auf. seen, the values ​​show in NF1 patients for PDGF-BB compared to healthy patients to an increased value. Besonders erhöhte Werte von PDGF-BB zeigen sich in NF1 Pateinten mit MPNST und ohne PNF. Particularly elevated levels of PDGF-BB show up in NF1 Pateinten with MPNST and without PNF. Zudem weisen NF1 Patienten mit PNF signifikant erniedrigte Werte von PDGF-BB verglichen zu den Kontrollpatienten, siehe Also have NF1 patients with PNF significantly reduced levels of PDGF-BB compared to the control patients, see . ,
  • Beispiel 4: IGFBP1, RANTES sind Serummarker für die Anwesenheit eines MPNST Tumors in NF1 Patienten Example 4: IGFBP1, RANTES are serum marker for the presence of a tumor MPNST in NF1 patients
  • Eine weitere Aufteilung der NF1 Kohorten in drei klinische Gruppen (NF1-Patienten mit (i) nur cNF, (ii) mit PNF und (iii) mit MPNST, siehe auch Tabelle 1, fördern zwei weitere Proteine, IGFBP1 und RANTES, welche einen signifikanten Unterschied in NF1-Patienten mit MPNST zu denen ohne MPNST aufzeigen, zu Tage. Jedoch kann kein Unterschied für diese beiden Proteine zwischen den Kontrollgruppen und den NF1-Patienten ohne MPNST (n = 74) festgestellt werden ( Another division of the NF1 cohorts in three clinical groups (NF1 patients with (i) only CNF, (ii) with PNF and (iii) with MPNST, see also Table 1, promote two other proteins, IGFBP1 and RANTES, which is a significant to which show difference in NF1 patients with MPNST without MPNST to day. However, no difference for these two proteins between the control groups and the NF1 patients can not MPNST (n = 74) are determined ( , B). , B). Volumetrische Analysen der Ganzkörper MRI Daten der NF1-Patienten deuteten auf eine Korrelation zwischen der internen Tumorlast und dem Risiko für die maligne Transformation von PNF in MPNST hin [4]. Volumetric analysis of whole-body MRI data of NF1 patients suggested a correlation between the internal tumor burden and the risk of malignant transformation of PNF in MPNST out [4]. Daher wurde versucht, die Serumkonzentration der sechs identifizierten Serumbiomarker mit der internen Tumorlast für die 87 NF1-Patienten, die zur Verfügung standen, zu korrelieren. Therefore, an attempt was made to correlate the serum concentration of the six identified Serumbiomarker with the internal tumor burden for the 87 NF1 patients who were available. Überraschenderweise zeigt die Serumkonzentration von IGFBP1, aber nicht einer der anderen fünf Marker eine Korrelation mit der der internen Tumorlast ( Surprisingly, the serum concentration is of IGFBP1, but not one of the other five markers a correlation with the (internal tumor burden ). ). Dies steht im Einklang mit dem Ergebnis, dass das IGFBP1 Serumlevel mit der Anwesenheit eines MPNST korreliert ( This is consistent with the result that the IGFBP1 serum levels correlated with the presence of MPNST ( ) und identifiziert IGFBP1 somit als potenziellen Risikomarker für maligne Transformation. ), Thus identifying IGFBP1 as a potential risk marker for malignant transformation.
  • Beispiel 5: RANTES wird von infiltrierenden Lymphozyten als auch von MPNST Tumorzellen sezerniert Example 5 RANTES is secreted by infiltrating lymphocytes and tumor cells of MPNST
  • Die Paraffinschnitte der Tumoren wurden entparaffiniert, rehydriert und gewaschen. Paraffin sections of the tumors were deparaffinized, rehydrated and washed. Es erfolgte dann eine Vorbehandlung bei einem ph-Wert von 6.1 sowie Kochen, und hiernach eine Kühlung auf Eis für 15 min. It then carried out a pre-treatment at a pH of 6.1, and cooking, and thereafter min cooling on ice for the 15th Nach einem Waschschritt wurden die Schnitte mit Peroxidase-Blocker-Lösung für 5 min behandelt und dann mit dem primären polyklonalen Kaninchen anti-Rantes (1:100, ab9679, Abcam Inc.) inkubiert. After a washing step, the sections were treated with peroxidase blocking solution for 5 min and then with the primary polyclonal rabbit anti-Rantes incubated (1 100 ab9679, Abcam Inc.). Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper, Streptavidin Peroxidase und DAB unter Nutzung des ”Dako REALTM Detection system” (Dako REALTM Detection system, peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, code K5001, Dako, Denmark A/S) für automatisiertes Färben. After washing again, incubation with the biotinylated secondary antibodies, streptavidin peroxidase and DAB using the "Dako REALTM detection system" (Dako REALTM Detection System, peroxidase / DAB +, Rabbit / Mouse, code K5001, Dako, Denmark A / S) for automatic To dye. Schließlich erfolgte eine Färbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. Finally, a staining of the nuclei with hematoxylin was performed. In In sind überwiegend Tumorzellen zu sehen. are mostly seen tumor cells. Es sind die Tumorzellen, die mittels des anti-Rantes Antikörper angefärbt wurden. There are tumor cells that have been stained by the anti-RANTES antibody. Aus Out ist ersichtlich wie die Entzündungszellen in den Tumor einwandern. can be seen as the inflammatory cells invade the tumor. Es sind hauptsächlich Entzündungszellen, die angefärbt werden können (im unteren Bereich des Bildes sind Entzündungszellen zu sehen (Pfeile), im oberen die Tumorzellen). There are mainly inflammatory cells that can be stained (in the lower part of the screen inflammatory cells can be seen (arrows) in the upper tumor cells).
  • Beispiel 6: IGFBP1 ist ein Marker für die Anwesenheit eines MPNST Tumors Example 6: IGFBP1 is a marker for the presence of a tumor MPNST
  • Zur Bestimmung der IGFBP1 Sekretion von MPNST Zelllinien in serumfreie Kulturüberstände wurden die MPNST Zelllinien ST88-14, 1507-2, S462, T462 T265 und STS26T in DMEM Glutamax-I mit 5% FBS von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kultiviert. To determine the IGFBP1 secretion of MPNST cell lines in serum-free culture supernatants of the MPNST cell lines ST88-14, 1507-2, S462 were, T462 T265 and STS26T in DMEM Glutamax-I with 5% FBS from Invitrogen (Karlsruhe, Germany) supplemented. Die MPNST Zelllinien S462, 1507.2, wurden von VF Mautner, University Hospital Eppendorf, Germany hergestellt und zur Verfügung gestellt [60]. The MPNST cell lines S462, 1507.2 have been manufactured by VF Mautner, University Hospital Eppendorf, Germany and made available [60]. Die MPNST Zelllinie STS26T wurde von GH De Vries (Hines VA Hospital, Illinois, USA) [61] zur Verfügung gestellt. The MPNST cell line STS26T was made [61] provided by GH De Vries (Hines VA Hospital, Illinois, United States). Weiterhin wurde die MPNST Zelllinie ST88-14 freundlicherweise von J. DeClue (NIH, Bethesda, USA) [62] zur Verfügung gestellt. Furthermore, the MPNST cell line ST88-14 kindly provided by J. DeClue (NIH, Bethesda, USA) [62] was made available.
  • 1 × 10 4 Zellen der jeweiligen Zelllinien werden in eine 24 Well-Platte vorgelegt. 1 × 10 4 cells of the respective cell lines are placed in a 24 well plate. Nach 24, 36 und 48 Stunden wird der Zellkulturüberstand zur weiteren Untersuchung abgenommen und bis zur weiteren Verwendung eingefroren. After 24, 36 and 48 hours the cell culture supernatant is removed for further investigation and frozen until further use. Zur Durchführung eines ELISA zum Nachweis von humanem IGFBP1 in Zellkulturüberständen, Serum oder Plasma wird das Testkit (Abcam: ab100539) verwendet, das eine mit einem Antikörper gegen IGFBP1 beschichtete Mikrotiterplatte enthält. To carry out an ELISA for the detection of human IGFBP1 in cell culture supernatants, serum or plasma, the test kit (Abcam: ab100539) is used that includes a surface coated with an antibody against IGFBP1 microtiter plate. Proben und Standards werden in die Wells pipettiert, sodass darin enthaltenes IGFBP1 fest an die Platte gebunden wird. Samples and standards are pipetted into the wells so that IGFBP1 contained therein is tightly bound to the plate. Nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Unbound material is removed by washing. Anschließend wird ein mit Biotin gekoppelter Antikörper gegen IGFBP1 zugegeben. Then, a coupled with biotin antibodies against IGFBP1 is added. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung des überschüssigen Antikörper-Enzym-Komplexes folgt die Zugabe von HRP-gebundenem Streptavidin. After a further washing step to remove excess antibody-enzyme complex, the addition of HRP-bound streptavidin follows. Nach einem letzten Waschschritt wird Substratlösung zugegeben. After a final washing, substrate solution is added. Das Substrat wird durch das gebundene Enzym umgesetzt und es kommt zu einem Farbumschlag der Lösung. The substrate is converted by the bound enzyme and there is a color change of the solution. Nach Abstoppen der Reaktion folgt die Messung der Farbintensität, die proportional zur Menge an IGFBP1 in der Probe ist. After stopping the reaction, the measurement of the color intensity which is proportional to the amount of IGFBP1 in the sample follows.
  • Wie in As in dargestellt, produzieren die untersuchten MPNST Zelllinien IGFBP1 und sezernieren dies in das Medium. shown that produce examined MPNST cell lines IGFBP1 and secrete it into the medium.
  • Beispiel 7: TNF alpha und Interferon gamma werden von T-Lymphozyten von NF1 Patienten verstärkt exprimiert. Example 7: TNF alpha and interferon gamma are expressed by T lymphocytes from NF1 patients enhanced.
  • Zur Untersuchung des erworbenen Zytokinprofils von T-Zellen können die Zellen für 6 Stunden mit 10 ng/mL Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 1 μg/mL Ionomycin (Sigma) bei 37°C und 5% CO 2 im Brutschrank stimuliert werden. For the examination of the acquired cytokine profile of T cells, the cells for 6 hours to 10 ng / mL phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) and 1 ug / mL ionomycin (Sigma) at 37 ° C and 5% CO 2 are stimulated in an incubator. PMA-Ionomycin simuliert die Stimulation des T-Zell-Rezeptor und Costimulation, wodurch sämtliche T-Zellen unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität angeregt und zur Zytokinproduktion stimuliert werden. PMA-ionomycin simulates the stimulation of the T cell receptor and co-stimulation, whereby all T-cells are excited, regardless of their receptor specificity and stimulates cytokine production. Zur intrazellulären Akkumulation der Zytokine wurde Brefeldin A (5 g/mL) zugesetzt. For intracellular accumulation of cytokines Brefeldin A (5 g / mL) was added. Die Zellen werden fixiert, anschließend mit BD Perm/WashT-Puffer permeabilisiert und dann intrazellulär mit den entsprechenden Antikörpern angefärbt. The cells are fixed, then permeabilized with BD Perm / washt buffer and then intracellularly stained with the appropriate antibodies. Die T-Zellen können mittels FACS Analyse durch das Anfärben der spezifischen Oberflächenrezeptoren CD3, CD4 und CD8 mit kommerziell erhältlichen Antikörpern identifiziert werden. The T cells may by FACS analysis by staining the specific surface receptors CD8 be identified using commercially available antibodies CD3, CD4 and. Die intrazellulären Zytokine werden mittels anti-TNFalpha (Maus anti-human TNFalpha) sowie anti-IFNgamma (Maus anti-human IFNgamma) detektiert. Intracellular cytokines are detected by anti-TNFalpha (murine anti-human TNFalpha) and anti-IFN gamma (mouse anti-human IFNgamma). Die statistische Darstellung der experimentellen Ergebnisse in The statistical representation of the experimental results in zeigt, dass durchschnittlich die CD4+ als auch CD8+ T-Lymphozyten von NF1 Patienten mehr TNFalpha produzieren verglichen zu den T Lymphozyten der Kontrollpatienten. shows that on average produce CD4 + and CD8 + T lymphocytes from NF1 patients more TNFalpha compared to T lymphocytes of control patients. Zudem zeigen die CD8+ T-Zellen von NF1 Patienten im Stimulationstest mehr IFNgamma produzierende Zellen als die CD8+ T-Zellen von Kontrollpatienten. In addition, the CD8 + T cells show of NF1 patients stimulation test more IFNgamma producing cells than CD8 + T cells from control patients.
  • Beispiel 8: IL-6, IFNγ, TNF-α und EGFR sowie IGFBP1 und RANTES eignen sich als diagnostische Marker für eine NF1 Erkrankung oder einem malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) Example 8: IL-6, IFN-, TNF-α and EGFR and IGFBP1 and RANTES are useful as diagnostic markers for a disease or NF1 a malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST)
  • Das diagnostische Potenzial der erfindungsgemäß aufgefunden Faktoren wurde mittels AUC für individuellen ROC-Kurven, wie in Material und Methodenteil beschreiben, bestimmt. The diagnostic potential of the present invention found factors was determined by AUC for individual ROC curves, as described in Material and Methods section. Die Spezifität wurde bei einer Sensitivität von 90% bestimmt (Tabelle 2, The specificity was measured at a sensitivity of 90% (Table 2, ). ). Für alle sechs Kandidaten ist die AUC statistisch signifikant (P < 0,05). AUC is statistically significant (P <0.05) for all six candidates. Die größte AUC für die NF1 Marker zeigt IFNγ (0,900), gefolgt von TNFα (0,877), IL-6 (0,834) und EGFR (0,728). The greatest AUC for the NF1 marker shows IFN- (0,900), followed by TNF (0.877), IL-6 (0.834) and EGFR (0.728). Allerdings hängen die erhöhten Level der pro-inflammatorischen Zytokine nicht von der Tumorlast ab, da diese Zytokine auch in Patienten mit anderen Tumorarten gefunden wurden [36]. However, the increased level of pro-inflammatory cytokines do not depend on tumor burden, as these cytokines were also found in patients with other tumor types [36]. Allerdings zeigen die Daten einen Anstieg des systemischen, proinflammatorischen Status in NF1-Patienten im Vergleich zu Nicht-NF1-Kontroligruppen. However, the data show an increase of systemic proinflammatory status in NF1 patients compared to non-NF1 Kontroligruppen. Dies unterstreicht die Annahme, dass ein erhöhtes Zytokinlevel in NF1 durch eine systemische NF1+/– Umgebung begünstigt bzw. hervorgerufen wird. This underlines the assumption that an increased Zytokinlevel is favored or in NF1 NF1 by systemic +/- environment caused. Ob dies durch einen Anstieg der Mastzellen und Monozyten-Aktivität oder durch eine generelle Änderung im Immunstatus dieser Patienten induziert wird, bleibt unklar [35, 37]. Whether this is induced by an increase in mast cells and monocyte activity or by a general change in the immune status of these patients remains unclear [35, 37].
  • In MPNST-Patienten war die AUC von IGFBP1 (0,770) größer als die AUC von RANTES (0,651) ( In MPNST patients AUC of IGFBP1 (0.770) is greater than the AUC of RANTES (0.651) ( ). ). RANTES ist als eines der inflammatorischen Zytokine bekannt, die zytotaktische Aktivität in Immunzellen die T-Zellen Monozyten herstellen [38]. RANTES is known as one of the inflammatory cytokines, the T-cells produce the zytotaktische activity in immune cells, monocytes [38]. RANTES ist auch dafür bekannt, in Brustkarzinomen exprimiert zu werden [39] und korreliert mit einem weiterfortgeschrittenen Stadium dieser Krankheit, welches auf eine Rolle in der Krebsentwicklung bzw. dessen Verlauf hindeutet. RANTES is also known to be expressed in breast carcinomas [39] and correlated with a more advanced stage of this disease, which suggests a role in cancer development and the course. Erhöhte Serumlevel von RANTES und IGFBP1 sind möglicherweise das Ergebnis einer erhöhten Sekretion durch eine Tumorzelle oder durch Immunzellen, in Antwort auf einen neoplastischen Prozess oder durch beide Mechanismen. Elevated serum levels of RANTES and IGFBP1 may be the result of increased secretion by a tumor cell, or by immune cells in response to a neoplastic process, or by both mechanisms.
  • IGFBP1 bindet die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs)-I und IGF-II und verstärkt ihre Halbwertszeit. IGFBP1 insulin-like growth factors bind (IGFs) -I and IGF-II and strengthened its half-life. Das Plasmalevel von IGFBP1 wird durch Hormone außerhalb der Wachstumshormonachse reguliert inklusive Insulin-Glucagon und Kortisol [40, 41]. The plasma levels of hormones IGFBP1 is outside the growth hormone axis controls, including insulin, glucagon and cortisol [40, 41]. Eine entgegengesetzte Korrelation wurde vor kurzem für die IGFBP1 Level und die Krebsentwicklung nahegelegt [42, 43]. An opposite correlation has been suggested recently for the IGFBP1 levels and the development of cancer [42, 43]. Die Beobachtungen, dass IGF-1 und Wachstumsfaktor-Rezeptoren in PNF und MPNST von NF1-Patienten exprimiert werden sowie das IGF1 Rezeptorlevel mit einem erhöhten Mitoseindex von PNF korrelieren, deutet auf eine Empfindlichkeit dieser Tumore gegen IGFBP1-regulierte Faktoren hin [10, 44]. The observations that IGF1 and growth factor receptors in PNF and MPNST of NF1 patients are expressed and correlate the IGF1 receptor level with an elevated mitotic index of PNF, suggests a sensitivity of these tumors to IGFBP1-regulated factors out [10, 44] , Zusammenfassend, lässt sich sagen, dass IGFBP1 möglicherweise den IGF-Zugang zu PNF und MPNST moduliert, allerdings sollte dieser Mechanismus erst noch weiter untersucht werden. In summary, said that IGFBP1 may modulate the IGF-access to PNF and MPNST, but this mechanism should first be investigated further.
  • Kürzlich identifizierten zwei Studien, MIA und Adrenomedullin als potenzielle NF1-Tumormarker an Kohorten von n = 42 und 32 [21, 23]. Recently identified two studies MIA and adrenomedullin as potential NF1 tumor markers in cohorts of n = 42 and 32 [21, 23]. Adrenomedullin zeigt eine Tendenz auch mit MPNST zu korrelieren, obwohl die MPNST Gruppe zu klein war um eine signifikante Aussage zu zulassen (n = 5). Adrenomedullin has a tendency to correlate with MPNST although the MPNST group was too small to permit a significant statement (n = 5). Die MIA Konzentration war entweder deutlich erhöht in NF1-Patienten mit PNF oder eine große Anzahl von Neurofibroma korrelierte mit der internen Tumorlast. The MIA concentration was significantly increased in either NF1 patients with PNF or a large number of Neurofibroma correlated with the internal tumor burden. Beide dieser Faktoren scheinen mit der Tumorlast in NF1 zu korrelieren, obwohl nicht auszuschließen ist, dass dies auch durch eine veränderte systemische Umgebung, bedingt durch die Haploinsuffizienz hervorgerufen wird. Both of these factors appear to correlate with tumor burden in NF1, although it is not ruled out that this is due also caused by a change in systemic environment by haploinsufficiency. Es wäre daher interessant näher zu untersuchen, ob eine systemtische inflammatorische Umgebung während der Früherkennung der Tumorgenese in NF1 -Patienten eine Rolle spielt. It would therefore be interesting to examine more closely whether a system diagram inflammatory environment plays a role during the early tumorigenesis in NF1 -Patients.
  • Beispiel 9: IGFBP1 und RANTES und PDGF-BB als therapeutische Targets zur Behandlung von NF1 assoziierten Tumoren Example 9: IGFBP1 and RANTES and PDGF-BB as therapeutic targets for the treatment of tumors associated NF1
  • Um die therapeutische Fähigkeit von den erfindungsgemäßen Serummarker auf das Wachstum von MPNST zu testen, können beispielsweise MPNST Zelllinien S462, ST88-14, NSF-1, verwendet werden, die in DMEM Glutamax-I mit 5% FBS von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kultiviert werden. To test the therapeutic ability of the novel serum markers on the growth of MPNST, for example MPNST cell lines S462 are ST88-14 NSF-1, used that in DMEM Glutamax-I with 5% FBS, Invitrogen (Karlsruhe, Germany) are cultivated. Als Positivkontrolle wird der inhibierende Effekt von Imatinib Mesylat auf das MPNST Wachstum verwendet, welcher wie folgt durchzuführen und in As a positive control of the inhibitory effect of imatinib mesylate to the MPNST growth is used, which perform as follows, and in beschrieben ist. is described. Imatinib Mesylat von Novartis Pharma AG (Basel, Schweiz) kann in Dimethyl Sulphoxid (DMSO) gelöst werden. Imatinib mesylate, Novartis Pharma AG (Basel, Switzerland), in dimethyl sulphoxide (DMSO) are dissolved. Zellen werden (2 × 10 3 ) in 300 μl Medium in 24 Well-Platten ausgesät um adheränt zu werden. Cells (2 × 10 3) in 300 ul medium seeded in 24 well plates to be adheränt. Imatinib wird in einer Konzentration von 2 μM und 10 μM in 100 μl einer maximal 0.1%igen DMSO Lösung verwendet. Imatinib is used in a concentration of 2 .mu.m and 10 .mu.m in 100 ul of a maximum of 0.1% DMSO aqueous solution. Die Negativkontrollen weisen ebenfalls nicht mehr als eine 0.1%ige DMSO Konzentration auf. The negative controls also have no more than a 0.1% strength DMSO concentration on. 300 μl Medium, die Imatinib oder DMSO enthaltenen Lösungen werden nach Zugabe zu den Zellen am Tag 3 und 5 gewechselt. Solutions contained 300 ul medium, imatinib or DMSO are changed upon addition to the cells on day 3 and 5. FIG. Die Zellproliferation wird am Tag 4 und Tag 7 nach Imatinab Behandlung mittels CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay von Promega (Mannheim, Deutschland) durch Messung der Absorption bei 490 nm bestimmt. Cell proliferation is determined on day 4 and day 7 after Imatinab treatment using CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay from Promega (Mannheim, Germany) by measuring the absorbance at 490 nm. Die Experimente werden mindestens als Doppelbestimmungen durchgeführt und drei Mal wiederholt. The experiments are carried out at least in duplicate and repeated three times.
  • Schlussfolgerung: Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente beinhalten die bisher größte Studie bezüglich der Anzahl von NF1-Patienten (n = 104), welche je für potenzielle Serummarker für diese seltene, genetisch bedingte, Tumorerkrankung vorgenommen wurde. Conclusion: The performed in the context of the present invention, experiments with respect to include the largest number of study of NF1 patients (n = 104), which has ever been made for potential serum markers for these rare genetic, tumor disease. Es konnten vier potenzielle Biomarker identifizieren werden, welche in der Diagnose von NF1 eingesetzt werden können und zwei weitere Marker (IGFBP1 und RANTES), die mit der Anwesenheit von MPNST korrelieren. It was possible to identify four potential biomarkers that can be used in the diagnosis of NF1 and two other markers (IGFBP1 and RANTES), which correlate with the presence of MPNST. Interessanterweise scheint IGFBP1 auch mit der internen Tumorlast zu korrelieren und deutet auf ein erhöhtes Risiko für eine maligne Transformation in NF1-Patienten hin. Interestingly, IGFBP1 appears to correlate well with the internal tumor burden and indicates an increased risk of malignant transformation in NF1 patients. Weiterhin zeigen die vorliegenden erfindungsgemäßen Daten, dass NF1-Patienten systemische pro-inflammatorische Profile aufwiesen, welche wahrscheinlich durch eine NF1-Haploinsuffizienz hervorgerufen wird. Further, the data available according to the invention that NF1 patients had systemic pro-inflammatory profile, which is probably caused by a NF1 haploinsufficiency. Serumbiomarker, die bei der Früherkennung der malignen Umwandlung helfen sind extrem nützlich, da therapeutische Eingriffe vorher initiiert werden könnten bevor der Tumor sich weiter entwickelt und Metastasen entstehen. Serumbiomarker that are helping in the early detection of malignant transformation extremely useful as therapeutic interventions could be initiated earlier before the tumor evolved and metastases arise.
  • Referenzen references
    • [1] [1] . ,
    • [2] [2] . ,
    • [3] [3] . ,
    • [4] [4] . ,
    • [5] [5] . ,
    • [6] [6] . ,
    • [7] [7] . ,
    • [8] [8th] . ,
    • [9] [9] . ,
    • [10] [10] . ,
    • [11] [11] . ,
    • [12] [12] . ,
    • [13] [13] . ,
    • [14] [14] . ,
    • [15] [15] . ,
    • [16] [16] . ,
    • [17] [17]
    • [18] [18] . ,
    • [19] [19] . ,
    • [20] [20] . ,
    • [21] [21] . ,
    • [22] [22] . ,
    • [23] [23] . ,
    • [24] [24] . ,
    • [25] [25] . ,
    • [26] [26] 1. 1.
    • [27] [27] . ,
    • [28] [28] . ,
    • [29] [29] . ,
    • [30] [30]
    • [31] [31] . ,
    • [32] [32] . ,
    • [33] [33]
    • [34] [34] . ,
    • [35] [35] . ,
    • [36] [36] . ,
    • [37] [37] . ,
    • [38] [38] . ,
    • [39] [39] . ,
    • [40] [40] . ,
    • [41] [41] . ,
    • [42] [42] . ,
    • [43] [43] . ,
    • [44] [44] . ,
    • [45] [45] . ,
    • [46] [46] . ,
    • [47] [47] . ,
    • [48] [48] . ,
    • [49] [49] . ,
    • [50] [50] . ,
    • [51] [51] . ,
    • [52] [52] . ,
    • [53] [53] . ,
    • [54] [54] . ,
    • [55] [55] . ,
    • [56] [56] . ,
    • [57] [57] . ,
    • [58] [58]
    • [59] [59]
    • [60] [60] . ,
    • [61] [61] . ,
    • [62] [62] . ,
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. This list of references cited by the applicant is generated automatically and is included solely to inform the reader. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. The list is not part of the German patent or utility model application. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen. The DPMA is not liable for any errors or omissions.
  • Zitierte Patentliteratur Cited patent literature
    • WO 2010/022166 A2 [0009] WO 2010/022166 A2 [0009]
    • WO 00/31541 A2 [0010] WO 00/31541 A2 [0010]
    • WO 2003/068398 A2 [0072] WO 2003/068398 A2 [0072]
    • WO 2007/055712 A2 [0072] WO 2007/055712 A2 [0072]
    • WO 02/059567 A2 [0072] WO 02/059567 A2 [0072]
    • EP 2189791 A1 [0078, 0080] EP 2189791 A1 [0078, 0080]
    • WO 95/35505 [0078, 0080] WO 95/35505 [0078, 0080]
    • WO 89/09622 [0087] WO 89/09622 [0087]
    • EP 0239400 A1 [0087] EP 0239400 A1 [0087]
    • WO 90/07861 [0087] WO 90/07861 [0087]
    • US 4391904 [0094] US 4391904 [0094]
    • EP 0451 A [0095] EP 0451 A [0095]
    • EP 1100830 B1 [0095] EP 1100830 B1 [0095]
    • EP 2467167 A1 [0097] EP 2467167 A1 [0097]
    • EP 2402016 A1 [0097] EP 2402016 A1 [0097]
    • WO 91/19813 [0097] WO 91/19813 [0097]
    • EP 2431377 A1 [0098] EP 2431377 A1 [0098]
    • WO 2012/025251 A2 [0098] WO 2012/025251 A2 [0098]
    • WO 004/013274 [0098] WO 004/013274 [0098]
    • WO 2011069141 A1 [0112] WO 2011069141 A1 [0112]
    • EP 2211905 A1 [0112] EP 2211905 A1 [0112]
    • WO 96/001125 [0112] WO 96/001125 [0112]
    • US 6270766 [0113] US 6270766 [0113]
    • US 4683195 [0122] US 4683195 [0122]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur Cited non-patent literature
    • Stark et al., 2002, Tumoren peripherer Nerven, Deutsches Ärzteblatt [0004] Stark et al., 2002, tumors of peripheral nerves, German doctors sheet [0004]
    • Leitlinien zur Diagnostik, A15 Neurofibromatose Typ I, D. Horn, J. Kunze, Stand: Januar 2002 [0007] Guidelines for the diagnosis, A15 neurofibromatosis type I, D. Horn, J. Kunze, as of January 2002 [0007]
    • Tabone-Eglinger et al., Sarcoma (2008), 1–7 [0009] Tabone-Eglinger et al., Sarcoma (2008), 1-7 [0009]
    • Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology, Oxford University Press, 1997, wiederaufgelegt 2003, ISBN 0 19 850673 2 [0036] Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology, Oxford University Press, 1997, reprinted 2003, ISBN 0 19 850673 2 [0036]
    • Lasater et al., Journal of Clinical Investigation 120 (2010), 859–70 [0060] Lasater et al., Journal of Clinical Investigation 120 (2010), 859-70 [0060]
    • ”Bioanalytik” (Lottspeich und Zorbas, Spektrum Verlag 1998) [0070] "Bioanalysis" (Lottspeich and Zorbas, Spektrum Verlag 1998) [0070]
    • WM Hunter in ”Handbook of Experimental Immunology, Kapitel 17, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1973 [0074] WM Hunter in "Handbook of Experimental Immunology, Chapter 17, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1973 [0074]
    • U. Göbel Wehrmed. U. Göbel Wehrmed. Mschr. 12, 354 (1979) [0075] Mschr. 12, 354 (1979) [0075]
    • B. Viel, MTA-Journal 1, 56 (1979), Grundlagen der Immunfluoreszenz [0075] B. Much MTA Journal 1, 56 (1979), Fundamentals of immunofluorescence [0075]
    • aem, Arnold M. Immunoassays. aem, Arnold M. immunoassays. 1. Auflage, München; 1. Auflage, München; Heidelberg: Elsevier, Spektrum Akademischer Verlag., 2007 [0075] Heidelberg: Elsevier, Oxford University Press, 2007 [0075].
    • David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3rd ed. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005 [0075] 3rd Elsevier Science Publishing Company ed., Amsterdam, Boston, Oxford 2005 [0075]
    • Kapitel 11 von Ausubel (Ed) Current Protocols in Molecular Biology, fünfte Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc, NY, 2002 [0075] & Chapter 11 of Ausubel (Ed) Current Protocols in Molecular Biology, Fifth Edition, John Wiley & Sons, Inc, NY, 2002 [0075]
    • MacBeath Nature Genetics 32 (2002), 526–532 [0079] MacBeath Nature Genetics 32 (2002), 526-532 [0079]
    • Bhatia et al, Anal. Bhatia et al, Anal. Biochem. Biochem. 178 (1989), 408–413 [0080] 178 (1989), 408-413 [0080]
    • Ahluwalia, et al, Biosens. Ahluwalia, et al, biosens. Bioelectron. Bioelectron. 7 (1992), 207–214 [0080] 7 (1992), 207-214 [0080]
    • Jonsson, et al, Biochem. Jonsson, et al, Biochem. J. 227 (1985), 373–378 [0080] J. 227 (1985), 373-378 [0080]
    • Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17 (1996), 2199–2207 [0080] (1996) Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17, 2199-2207 [0080]
    • Köhler G. und Milstein C. Nature 256 (1975), 495 [0087] Kohler G. and Milstein C. Nature 256 (1975), 495 [0087]
    • Galfre et al., Nature 266 (1977), 550 [0087] Galfre et al., Nature 266 (1977), 550 [0087]
    • Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001 [0087] Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001 [0087]
    • Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY [0090] Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY [0090]
    • Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1994) [0090] Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1994) [0090]
    • Harlow and Lane ”Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 [0095] Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 [0095]
    • Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818–822; Ellington and Szostak (1990) Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Bioanal. Chem. 387, 171–182 [0097] Chem. 387, 171-182 [0097]
    • Osborne et al. Osborne et al. (1997), Curr. (1997), Curr. Opin. Opin. Chem. Biol. 1, 5–9 [0097] Chem. Biol. 1, 5-9 [0097]
    • Alber et al. Alber et al. Current Immunology Reviews 3 (2007), 3–16 [0110] Current Immunology Reviews 3 (2007), 3-16 [0110]
    • Weaver et al. Weaver et al. Annu Rev Immunol 25 (2007), 821–852 [0110] Annu Rev Immunol 25 (2007), 821-852 [0110]
    • Allavena Immunol Rev. 222 (2008), 155–61 [0110] Allavena Immunol Rev. 222 (2008), 155-61 [0110]
    • Michiels, J. Biochem Cell Biol. 30 (1998), 505 [0112] Michiels, J. Biochem Cell Biol. 30 (1998), 505 [0112]
    • Lewitt et al., Journal of Endocrinology 171 (2001), R11–R15 [0112] Lewitt et al., Journal of Endocrinology 171 (2001), R11-R15 [0112]
    • Kapp et al., J Invest Dermatol. Kapp et al., J Invest Dermatol. 102 (1994), 906–14 [0112] 102 (1994), 906-14 [0112]
    • WU et al., Biochem Soc Trans. 35 (2007), 377–8 [0112] WU et al., Biochem Soc Trans. 35 (2007), 377-8 [0112]
    • Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) [0122] . Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed, ed by Sambrook, Fritsch and Maniatis. (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) [0122]
    • DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover ed., 1985) [0122] DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover ed., 1985) [0122]
    • Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed., 1984) [0122] Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed., 1984) [0122]
    • Nucleic Acid Hybridization (BD Harnes & SJ Higgins eds. 1984) [0122] Nucleic Acid Hybridization (BD Hames & SJ Higgins eds. 1984) [0122]
    • Transcription And Translation (BD Harnes & SJ Higgins eds. 1984) [0122] Transcription And Translation (BD Hames & SJ Higgins eds. 1984) [0122]
    • Culture Of Animal Cells (RI Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) [0122] Culture Of Animal Cells (RI Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) [0122]
    • Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) [0122] Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) [0122]
    • B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) [0122] B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) [0122]
    • the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY) [0122] the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY) [0122]
    • Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (JH Miller and MP Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) [0122] Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (JH Miller and MP Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) [0122]
    • Methods In Enzymology, Vols. Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) [0122] 154 and 155 (Wu et al. Eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) [0122]
    • Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I–IV (DM Weir and CC Blackwell, eds., 1986) [0122] Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (DM Weir and CC Blackwell, eds., 1986) [0122]
    • Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98–107 [0122] Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98-107 [0122]
    • Holtkamp et al., Carcinogenesis 27 (2006), 664–71 [0149] Holtkamp et al., Carcinogenesis 27 (2006), 664-71 [0149]

Claims (13)

  1. In vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. An in vitro method for the diagnosis and / or early diagnosis of neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or a NF1 associated tumor, comprising detecting at least one protein selected from the group consisting of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), interferon gamma (IFNgamma) , epidermal growth factor receptor (EGFR), insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES), and human Platelet Derived growth factor-BB (PDGF-BB) or a fragment of a these proteins in a sample from a patient, wherein the presence of one of these proteins or fragments thereof in a different concentration compared to its concentration in a reference sample indicates the presence and / or the development of a NF1 NF1 or an associated tumor.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Nachweis von Interleukin 6 (IL-6). The method of claim 1, further comprising the detection of Interleukin 6 (IL-6).
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; The method of claim 1 or 2, wherein (a) an increased concentration of TNF-alpha, IFN gamma, and / or IL-6 or a decreased concentration of EGFR for NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); (B) an increased concentration of IGFBP1 and / or RANTES for a NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für ein plexiformes Neurofibrom (PNF) bezeichnend ist; and (c) a reduced concentration of PDGF-BB on a plexiform neurofibroma (PNF) indicative; und wobei die Referenzprobe in (a) von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt. and wherein the reference sample in (a) from a healthy subject and in (b and c) is derived from a NF1 patients.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe aus der Gruppe bestehend aus einer Blutprobe, einer Serumprobe und einer Plasmaprobe ausgewählt ist. A method according to any one of claims 1 to 3, wherein the sample is selected from the group consisting selected from a blood sample, a serum sample and a plasma sample.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren ein immunologisches Nachweisverfahren umfasst. Method according to one of claims 1 to 4, wherein the method comprises an immunological detection method.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das immunologische Nachweisverfahren ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus direkter ELISA, indirekter ELISA, Sandwich ELISA, Zellkultur ELISA, Durchflusszytometrie (FACS), immunochromatographischer Schnelltest und Protein-Chip Microarray. The method of claim 5, wherein said immunological detection method is selected from a group consisting of direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, cell culture, ELISA, flow cytometry (FACS), immunochromatographic rapid test and protein chip microarray.
  7. Verwendung eines TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 und/oder RANTES spezifischen Reagenz oder Mittel zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, wobei das Reagenz oder Mittel vorzugsweise ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Antikörper oder Fragment davon, Aptamer und Spiegelmer. Use of a TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 and / or RANTES specific reagent or agents for diagnosis and / or early detection of NF1 and / or a NF1 associated tumor, wherein the reagent or agent is preferably selected from a group consisting of an antibody or fragment it, aptamer and spiegelmer.
  8. Verwendung von (i) IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und/oder IL-6 als Serummarker oder (ii) einem Reagenz zum Nachweis eines dieser Proteine in Serum zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors. Use of (i) IFN gamma, TNF-alpha, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and / or IL-6 as a serum marker or (ii) a reagent for the detection of these proteins in serum for diagnosis and / or early detection of NF1 and / or a NF1 associated tumor.
  9. Verwendung eines Kits in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen. Use of a kit in the method of any of claims 1 to 6, wherein the kit comprises reagents specific for the detection of at least one protein selected from a group consisting of IFN gamma, IL-6, TNF-alpha, EGFR, IGFBP1, RANTES and PDGF -BB or fragments thereof, in which the reagents preferably include antibodies or fragments thereof.
  10. Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES, sind; Kit reagents for the detection of (i) IFNgamma, TNFalpha, and EGFR and / or (ii) IGFBP1 and RANTES, specifically comprising; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6. and optionally for PDGF-BB and / or IL-6.
  11. Verwendung nach Anspruch 9 oder Kit nach Anspruch 10, wobei die Reagenzien an einem Träger gebunden sind, vorzugsweise auf einem Microarray oder einem Teststreifen. Use according to claim 9 or kit according to claim 10, wherein said reagents are bound to a support, preferably on a microarray or a test strip.
  12. Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und IL-6 zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 diagnostiziert wurde. Use of an agent that is a modulator of one of the proteins selected from the group consisting of TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and IL-6 for the preparation of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or NF1 associated tumor, preferably wherein the patient was diagnosed by a method according to any one of claims 1 to. 6
  13. Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffs zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 diagnostiziert wurde. Use of an anti-tumor agent for the preparation of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or a NF1 associated tumor, wherein the patient has been diagnosed according to a method according to any one of claims 1 to. 6
DE201210020496 2012-10-18 2012-10-18 Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 and/or neurofibromatosis type 1-associated tumor from sample of a patient for treating the patient with the tumor, comprises detecting protein or its fragment in sample Ceased DE102012020496A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201210020496 DE102012020496A1 (en) 2012-10-18 2012-10-18 Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 and/or neurofibromatosis type 1-associated tumor from sample of a patient for treating the patient with the tumor, comprises detecting protein or its fragment in sample

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201210020496 DE102012020496A1 (en) 2012-10-18 2012-10-18 Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 and/or neurofibromatosis type 1-associated tumor from sample of a patient for treating the patient with the tumor, comprises detecting protein or its fragment in sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102012020496A1 true DE102012020496A1 (en) 2014-04-24

Family

ID=50436709

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE201210020496 Ceased DE102012020496A1 (en) 2012-10-18 2012-10-18 Invitro diagnosis and/or early detection of neurofibromatosis type 1 and/or neurofibromatosis type 1-associated tumor from sample of a patient for treating the patient with the tumor, comprises detecting protein or its fragment in sample

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102012020496A1 (en)

Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0000451A1 (en) 1977-06-28 1979-01-24 Hotchkiss-Brandt Sogeme H.B.S. Article-retention clamp, a system for hanging, removing and overlapping application of such a clamp, and a handling device to put this clamp and system into use
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
WO1989009622A1 (en) 1988-04-15 1989-10-19 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
WO1995035505A1 (en) 1994-06-17 1995-12-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for fabricating microarrays of biological samples
WO1996001125A1 (en) 1994-07-01 1996-01-18 Pharmacia & Upjohn Ab Use of insulin and igf-i
WO2000031541A2 (en) 1998-11-20 2000-06-02 Georgetown University Method of detecting neurofibromatosis type 1
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
WO2002059567A2 (en) 2001-01-23 2002-08-01 Varian, Inc. Lateral flow testing device with on-board chemical reactant
WO2003068398A1 (en) 2002-02-12 2003-08-21 Schebo Biotech Aktiengesellschaft Sample preparation device and test device set based thereon
EP1100830B1 (en) 1998-07-28 2003-10-01 Micromet AG Heterominibodies
WO2004013274A2 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Noxxon Pharma Ag Ghrelin binding nucleic acids
WO2007055712A1 (en) 2005-10-13 2007-05-18 Kirkegaard, Leslie Immuno-gold lateral flow assay
WO2010022166A2 (en) 2008-08-19 2010-02-25 Maine Institute For Human Genetics And Health Micro rna (mirna) and neurofibromatosis type 1 : a role in diagnosis and therapy
EP2189791A2 (en) 1998-02-04 2010-05-26 Life Technologies Corporation Microarrays and uses therefor
EP2211905A1 (en) 2007-10-26 2010-08-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of caspase i-dependent cytokines in the treatment of neurodegenerative disorders
WO2011069141A2 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Interferon therapies in combination with blockade of stat3 activation
EP2402016A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Charité - Universitätsmedizin Berlin Aptamers that inhibit interaction between antibody and 1st or 2nd extracellular loop of human beta-1-adrenergic receptor
WO2012025251A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Noxxon Pharma Ag Nucleic acids for treatment of chronic complications of diabetes
EP2431377A1 (en) 2001-10-26 2012-03-21 Noxxon Pharma AG Modified L-nucleic acids
EP2467167A1 (en) 2009-08-18 2012-06-27 Baxter International Inc Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics

Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0000451A1 (en) 1977-06-28 1979-01-24 Hotchkiss-Brandt Sogeme H.B.S. Article-retention clamp, a system for hanging, removing and overlapping application of such a clamp, and a handling device to put this clamp and system into use
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4683195B1 (en) 1986-01-30 1990-11-27 Cetus Corp
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
WO1989009622A1 (en) 1988-04-15 1989-10-19 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
WO1995035505A1 (en) 1994-06-17 1995-12-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for fabricating microarrays of biological samples
WO1996001125A1 (en) 1994-07-01 1996-01-18 Pharmacia & Upjohn Ab Use of insulin and igf-i
EP2189791A2 (en) 1998-02-04 2010-05-26 Life Technologies Corporation Microarrays and uses therefor
EP1100830B1 (en) 1998-07-28 2003-10-01 Micromet AG Heterominibodies
WO2000031541A2 (en) 1998-11-20 2000-06-02 Georgetown University Method of detecting neurofibromatosis type 1
WO2002059567A2 (en) 2001-01-23 2002-08-01 Varian, Inc. Lateral flow testing device with on-board chemical reactant
EP2431377A1 (en) 2001-10-26 2012-03-21 Noxxon Pharma AG Modified L-nucleic acids
WO2003068398A1 (en) 2002-02-12 2003-08-21 Schebo Biotech Aktiengesellschaft Sample preparation device and test device set based thereon
WO2004013274A2 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Noxxon Pharma Ag Ghrelin binding nucleic acids
WO2007055712A1 (en) 2005-10-13 2007-05-18 Kirkegaard, Leslie Immuno-gold lateral flow assay
EP2211905A1 (en) 2007-10-26 2010-08-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of caspase i-dependent cytokines in the treatment of neurodegenerative disorders
WO2010022166A2 (en) 2008-08-19 2010-02-25 Maine Institute For Human Genetics And Health Micro rna (mirna) and neurofibromatosis type 1 : a role in diagnosis and therapy
EP2467167A1 (en) 2009-08-18 2012-06-27 Baxter International Inc Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
WO2011069141A2 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Interferon therapies in combination with blockade of stat3 activation
EP2402016A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Charité - Universitätsmedizin Berlin Aptamers that inhibit interaction between antibody and 1st or 2nd extracellular loop of human beta-1-adrenergic receptor
WO2012025251A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Noxxon Pharma Ag Nucleic acids for treatment of chronic complications of diabetes

Non-Patent Citations (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Bioanalytik" (Lottspeich und Zorbas, Spektrum Verlag 1998)
aem, Arnold M. Immunoassays. 1. Auflage, München; Heidelberg: Elsevier, Spektrum Akademischer Verlag., 2007
Ahluwalia, et al, Biosens. Bioelectron. 7 (1992), 207-214
Alber et al. Current Immunology Reviews 3 (2007), 3-16
Algermissen B, Hermes B, Henz BM, Müller U, Berlien HP: Laser-induced weal and flare reactions: clinical aspects and pharmacological modulation. Br J Dermatol. 2002; 146(5): 863-8
Allavena Immunol Rev. 222 (2008), 155-61
Arbiser JL, Flynn E, Barnhill RL. Analysis of vascularity of human neurofibromas. (1998) J Am Acad Dermatol. 38(6 Pt 1): 950-4
Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cherry JM, Davis AP, Dolinski K, Dwight SS, Eppig JT, Harris MA, Hill DP, Issel-Tarver L, Kasarskis A, Lewis S, Matese JC, Richardson JE, Ringwald M, Rubin GM, Sherlock G. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet. 2000; 25(1): 25-9
Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)
B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
B. Viel, MTA-Journal 1, 56 (1979), Grundlagen der Immunfluoreszenz
Baay M, Brouwer A, Pauwels P, Peeters M, Lardon F. Tumor cells and tumor-associated macrophages: secreted proteins as potential targets for therapy. Clin Dev Immunol. 2011; 2011: 565187
Bahuau M, Pelet A, Vidaud D, Lamireau T, LeBail B, Munnich A, Vidaud M, Lyonnet S, Lacombe D: GDNF as a candidate modifier in a type 1 neurofibromatosis (NF1) enteric phenotype. J Med Genet. 2001; 38(9): 638-43
Bhatia et al, Anal. Biochem. 178 (1989), 408-413
Brossier NM, Carroll SL: Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Res Bull. 2012; 88(1): 58-7
Collin C, Godbold J, Hajdu S, et al: Localized extremity soft tissue sarcoma: An analysis of factors affecting survival. J Clin Oncol 1987; 5: 601-612
Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)
Cunha KS, Barboza EP and Da Fonseca EC: Identification of growth hormone receptor in localised neurofibromas of patients with neurofibromatosis type 1. J Clin Pathol 2003; 56: 758-763. J Neurooncol. 2011; 102(1): 71-80
Datenbank PubMed, Zusammenfassung zu: HOLTKAMP, N. [u.a.]: Subclassification of nerve sheath tumors by gene expression profiling. Brain Pathol. (2004) 14 (3) 258-64 [PMID: 15446580] *
David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3rd ed. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005
DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)
Ducatman B, Scheithauer B, Piepgras D, et al: Malignant peripheral nerve sheath tumors: A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer 1986; 57: 2006-2021
Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182
Evans DG, Baser ME, McGaughran J, Sharif S, Howard E, Moran A. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet 2002; 39: 311-4
Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98-107
Ferner RE, Gutmann DH: International consensus statement on malignant peripheral nerve sheath tumors in neurofibromatosis 1. Cancer Res 2002; 62: 1573-1577
Ferner RE, Huson SM, Thomas N, Moss C, Willshaw H, Evans DG, Upadhyaya M, Towers R, Gleeson M, Steiger C, Kirby A. Guidelines for the diagnosis and management of individuals with neurofibromatosis 1. J Med Genet. 2007; 44(2): 81-8
Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17 (1996), 2199-2207
Friedman JM, Gutmann DH, Maccollin M et al: Neurofibromatosis. Phenotype, Natural History and Pathogenesis. (1999) Balltimore: the Johns Hopkins University Press, p. 110-8
Friedrich RE, Keiner D, Hagel C: Expression of insulin-like growth-factor-1 receptor (IGF-1R) in peripheral nerve sheath tumors in neurofibromatosis type 1. Anticancer Res. 2007; 27(4A): 2085-90
Galfre et al., Nature 266 (1977), 550
Geller M, Bonalumi Filho A: Neurofibromatose: clínica, genética e terapêutica. (2004) Rio de Janeiro: Guanabara Koogan
Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)
Giovannucci E: Nutrition, insulin, insulin-like growth factors and cancer. Horm Metab Res. 2003; 35(11-12): 694-704
Hamilton SJ, Friedman JM. Insights into the pathogenesis of neurofibromatosis 1 vasculopathy. Clin Genet 2000; 58(5): 341-4
Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)
Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988
Hau P, Apfel R, Wiese P, Tschertner I, Blesch A, Bogdahn U. Melanoma-inhibiting activity (MIA/CD-RAP) is expressed in a variety of malignant tumors of mainly neuroectodermal origin. Anticancer Res. 2002; 22: 577-583
Holtkamp et al., Carcinogenesis 27 (2006), 664-71
HOLTKAMP, N. [u.a.]: EGFR and erbB2 in malignant peripheral nerve sheath tumors and implications for targeted therapy. Neuro Oncol. (2008) 10 (6) 946-57 *
Hummel TR, Jessen WJ, Miller SJ, Kluwe L, Mautner VF, Wallace MR, Lázaro C, Page GP, Worley PF, Aronow BJ, Schorry EK, Ratner N. Gene expression analysis identifies potential biomarkers of neurofibromatosis type 1 including adrenomedullin. Clin Cancer Res. 2010; 16(20): 5048-57
Huson SM, Compston DA, Clark P, et al: A genetic study of von Recklinghausen neurofibromatosis in south east Wales: I. Prevalence, fitness, mutation rate, and effect of parental transmission on severity. J Med Genet. 1989; 26: 704-711
Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)
Jonsson, et al, Biochem. J. 227 (1985), 373-378
Kapitel 11 von Ausubel (Ed) Current Protocols in Molecular Biology, fünfte Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc, NY, 2002
Kapp et al., J Invest Dermatol. 102 (1994), 906-14
Karube K, Nabeshima K, Ishiguro M, Harada M, Iwasaki H: cDNA microarray analysis of cancer associated gene expression profiles in malignant peripheral nerve sheath tumours. J Clin Pathol. 2006; 59(2): 160-5
Köhler G. und Milstein C. Nature 256 (1975), 495
Kolanczyk M, Mautner V, Kossler N, Nguyen R, Kühnisch J, Zemojtel T, Jamsheer A, Wegener B, Thurisch B, Tinschert S, Holtkamp N, Park SJ, Birch P, Kendler D, Harder A, Mundlos S, Kluwe L. MIA is a potential biomarker for tumour load in neurofibromatosis type 1. BMC Med. 2011; 9: 82
Kurtz A, Martuza RL: Antiangiogenesis in neurofibromatosis 1. (2002) J Child Neurol. (8): 578-84; discussion 602-4, 646-51
Lamba M, Veinot JP, Acharya V. Vascular and valvular involvement by neurofibromatosis. Pathology 2002; 34(4): 380-3
Lasater EA, Li F, Bessler WK, Estes ML, Vemula S, Hingtgen CM, Dinauer MC, Kapur R, Conway SJ, Ingram DA Jr. Genetic and cellular evidence of vascular inflammation in neurofibromin-deficient mice and humans. J Clin Invest. 2010 Mar; 120(3): 859-70. doi: 10.1172/JCI41443
Lasater et al., Journal of Clinical Investigation 120 (2010), 859-70
Le LQ, Parada LF: Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: connecting the GAPs. Oncogene. 2007; 26(32): 4609-16
Lee PR, Cohen JE, Tendi EA, Farrer R, DE Vries GH, Becker KG, Fields RD: Transcriptional profiling in an MPNST-derived cell line and normal human Schwann cells. Neuron Glia Biol. 2004; 1(2): 135-147
Leitlinien zur Diagnostik, A15 Neurofibromatose Typ I, D. Horn, J. Kunze, Stand: Januar 2002
Lévy P, Bièche I, Leroy K, Parfait B, Wechsler J, Laurendeau I, Wolkenstein P, Vidaud M, Vidaud D: Molecular profiles of neurofibromatosis type 1-associated plexiform neurofibromas: identification of a gene expression signature of poor prognosis. Clin CancerRes. 2004; 10(11): 3763-71
Lewitt et al., Journal of Endocrinology 171 (2001), R11-R15
Luboshits G, Shina S, Kaplan O, Engelberg S, Nass D, Lifshitz-Mercer B, Chaitchik S, Keydar I, Ben-Baruch A: Elevated Expression of the CC Zytokine Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted (RANTES) in Advanced Breast Carcinoma. Cancer Research 1999; 59, 4681-4687
MacBeath Nature Genetics 32 (2002), 526-532
Mashour GA, Hernáiz P, Hartmann M, Mashour S, Zhang T, Scharf B, Felderhoff-Müse U, Sakuma S, Friedrich RE, Martuza RL, Mautner VF, Kurtz A: Circulating growth factor levels are associated with tumorigenesis in neurofibromatosis type 1. Clin. Canc. Res. 2004; 1; 10(17): 5677-83
Mautner VF, Hartmann M, Kluwe L, Friedrich RE, Fünsterer C: MRI growth patterns of plexiform neurofibromas in patients with neurofibromatosis type 1. Neuroradiology. 2006; 160-5
Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)
Michiels, J. Biochem Cell Biol. 30 (1998), 505
Miller SJ, Li H, Rizvi TA, Huang Y, Johansson G, Bowersock J, Sidani A, Vitullo J, Vogel K, Parysek LM, DeClue JE, Ratner N: Brain lipid binding protein in axon-Schwann cell interactions and peripheral nerve tumorigenesis. Mol Cell Biol. 2003; 23(6): 2213-24
Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)
Nakayama J, Terao H: Gamma interferon directly inhibits the growth of neurofibroma cells in vitro. J Dermatol. 2002; 29(9): 556-61
Nowsheen S, Aziz K, Panayiotidis MI, Georgakilas AG. Molecular markers for cancer prognosis and treatment: Have we struck gold? Cancer Lett. 2011
Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984)
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)
Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9
Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology, Oxford University Press, 1997, wiederaufgelegt 2003, ISBN 0 19 850673 2
Packer RJ, Gutmann DH, Rubenstein A, Viskochil D, Zimmerman RA, Vezina G, Small J, Korf B. Plexiform neurofibromas in NF1: toward biologic-based therapy. Neurology 2002; 28; 58(10): 1461-70
Plotkin SR, Bredella MA, Cai W, Kassarjian A, Harris GJ, Esparza S, Merker VL, Munn LL, Muzikansky A, Askenazi M, Nguyen R, Wenzel R, Mautner VF: Quantitative assessment of whole-body tumor burden in adult patients with neurofibromatosis. PLoS One 2012: 7(4): e35711
Rajaram S, Baylink DJ, Mohan S: Insulin-like growth factor-binding proteins in serum and other biological fluids: regulation and functions. Endocr Rev. 1997; 18(6): 801-31
Rasmussen SA, Yang Q, Friedman JM.: Mortality in neurofibromatosis 1: an analysis using U.S. death certificates. Am J Hum Genet. 2001; 68(5): 1110-8
Rebhan, M., Chalifa-Caspi, V., Prilusky, J., Lancet, D. GeneCards: integrating information about genes, proteins and diseases. Trends Genet. 1997; 13(4): 163
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001
Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.
Schall TJ, Bacon K, Toy KJ, Goeddel DV. Selective attraction of monocytes and T lymphocytes of the memory phenotype by cytokine RANTES. Nature 1990; 347(6294): 669-71
Stark et al., 2002, Tumoren peripherer Nerven, Deutsches Ärzteblatt
Staser K, Yang FC, Clapp DW. Pathogenesis of plexiform neurofibroma: tumorstromal/hematopoietic interactions in tumor progression. Annu Rev Pathol. 2012; 7: 469-95
Tabone-Eglinger et al., Sarcoma (2008), 1-7
the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)
Theoharides TC, Conti P: Mast cells: the Jekyll and Hyde of tumor growth. Trends Immunol. 2004; 25(5): 235-41
Thomas SL, De Vries GH: Angiogenic expression profile of normal and neurofibromindeficient human Schwann cells. Neurochem Res. 2007; 32(7): 1129-41
Tierney EP, Tulac S, Huang ST, Giudice LC: Activation of the protein kinase A pathway in human endometrial stromal cells reveals sequential categorical gene regulation. Physiol Genomics. 2003; 16(1): 47-66
Tran TT, Medline A, Bruce WR: Insulin promotion of colon tumors in rats. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Dec: 1013-5
Transcription And Translation (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984)
Tuskan RG, Tsang S, Sun Z, Baer J, Rozenblum E, Wu X, Munroe DJ, Reilly KM.: Real-time PCR analysis of candidate imprinted genes on mouse chromosome 11 shows balanced expression from the maternal and paternal chromosomes and strain-specific variation in expression levels. Epigenetics. 2008; 3(1): 43-50
U. Göbel Wehrmed. Mschr. 12, 354 (1979)
W. M. Hunter in "Handbook of Experimental Immunology, Kapitel 17, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1973
Wanebo J, Malik J, VandenBerg S, Wanebo H, Driessen N, Persing J. Malignant peripheral nerve sheath tumors: a clinicopathological study of 28 cases. Cancer 1993; 71: 1247-53
Ward BA, Gutmann DH: Neurofibromatosis 1: from lab bench to clinic. Pediatr Neurol. 2005; 32(4): 221-8
Weaver et al. Annu Rev Immunol 25 (2007), 821-852
Wolpin BM, Meyerhardt JA, Chan AT, Ng K, Chan JA, Wu K, Pollak MN, Giovannucci EL, Fuchs CS: Insulin, the insulin-like growth factor axis, and mortality in patients with nonmetastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2009; 27(2): 176-85
WU et al., Biochem Soc Trans. 35 (2007), 377-8
Yang FC, Chef S, Clegg T, Li X, Morgan T, Estwick SA, Yuan J, Khalaf W, Burgin S, Travers J, Parada LF, Ingram DA, Clapp DW: Nf1+/- mast cells induce neurofibroma like phenotypes through secreted TGF-beta signaling. Hum Mol Genet. 2006; 15(16): 2421-37
Yang FC, Ingram DA, Chef S, Hingtgen CM, Ratner N, Monk KR, Clegg T, White H, Mead L, Wenning MJ, Williams DA, Kapur R, Atkinson SJ, Clapp DW: Neurofibromindeficient Schwann cells secrete a potent migratory stimulus for Nf1+/- mast cells. J Clin Invest. 2003; 112(12): 1851-61
Yang FC, Ingram DA, Chef S, Zhu Y, Yuan J, Li X, Yang X, Knowles S, Horn W, Li Y, Zhang S, Yang Y, Vakili ST, Yu M, Burns D, Robertson K, Hutchins G, Parada LF, Clapp DW: Nf1-dependent tumors require a microenvironment containing Nf1+/-- and c-kitdependent bone marrow. Cell. 2008; 135(3): 437-48. 14
Yoshida Y, Adachi K, Yamamoto O. Local mast cell histamine and plasma histamine levels in neurofibromatosis type 1. Acta Derm Venereol. 2010 Nov; 90(6): 637-9

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pitkänen et al. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy
Jablonka et al. Reduced survival motor neuron (Smn) gene dose in mice leads to motor neuron degeneration: an animal model for spinal muscular atrophy type III
Wandinger et al. TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) as a potential response marker for interferon-beta treatment in multiple sclerosis
Schwartz et al. Reproductive factors, hormone use, estrogen receptor expression and risk of non-small-cell lung cancer in women
Di Rocco et al. Platelet-derived growth factor and its receptor expression in human oligodendrogliomas
Maes et al. Depressive and anxiety symptoms in the early puerperium are related to increased degradation of tryptophan into kynurenine, a phenomenon which is related to immune activation
Hoefnagel et al. Receptor conversion in distant breast cancer metastases
Beach et al. Unified staging system for Lewy body disorders: correlation with nigrostriatal degeneration, cognitive impairment and motor dysfunction
Boisson et al. Immunodeficiency, autoinflammation and amylopectinosis in humans with inherited HOIL-1 and LUBAC deficiency
Vasko et al. Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion
Choi et al. Microarray analyses of newborn mouse ovaries lacking Nobox
Small et al. Imaging correlates of brain function in monkeys and rats isolates a hippocampal subregion differentially vulnerable to aging
Song et al. The role of Shc and insulin-like growth factor 1 receptor in mediating the translocation of estrogen receptor α to the plasma membrane
Ono et al. Tumor-infiltrating lymphocytes are correlated with response to neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer
Welle et al. Gene expression profile of aging in human muscle
Rezaei et al. T-helper (1) cytokines increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion
Tan et al. CD40 is expressed and functional on neuronal cells
Zhu et al. Estradiol-17β regulates mouse uterine epithelial cell proliferation through insulin-like growth factor 1 signaling
Detre et al. A" quickscore" method for immunohistochemical semiquantitation: validation for oestrogen receptor in breast carcinomas.
Castro-Obregón et al. Alternative, Nonapoptotic Programmed Cell Death MEDIATION BY ARRESTIN 2, ERK2, AND Nur77
Mahdi et al. Secreted frizzled-related protein 4 reduces insulin secretion and is overexpressed in type 2 diabetes
Tang et al. Albumin stimulates interleukin-8 expression in proximal tubular epithelial cells in vitro and in vivo
Balmer et al. Elevated methyl-CpG-binding protein 2 expression is acquired during postnatal human brain development and is correlated with alternative polyadenylation
Przybyla et al. Aging alters macrophage properties in human skeletal muscle both at rest and in response to acute resistance exercise
Dennis et al. Aging alters gene expression of growth and remodeling factors in human skeletal muscle both at rest and in response to acute resistance exercise

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R002 Refusal decision in examination/registration proceedings
R003 Refusal decision now final
R003 Refusal decision now final

Effective date: 20141220