DE102011115480A1 - Substrate useful for chemiluminescence detection using enhancers or enhanced chemiluminescence reactions on carriers, comprises luminophore luminol, where e.g. enhancer concentration is optimized with respect to luminol concentration - Google Patents

Substrate useful for chemiluminescence detection using enhancers or enhanced chemiluminescence reactions on carriers, comprises luminophore luminol, where e.g. enhancer concentration is optimized with respect to luminol concentration Download PDF

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Abstract

Substrate for chemiluminescence detection using enhancers or enhanced chemiluminescence (ECL) reactions on carriers, where separated antigens are transferred on sheet-like structures, and is visualized using chemiluminescence by incubating the carrier in the substrate and exposing it in a camera-based imaging system optionally with booster function, comprises luminophore luminol, where the enhancer concentration, the enhancer-luminol ratio, the buffer system, and the hydrogen peroxide concentration are optimized with respect to the luminol concentration. An independent claim is also included for a device for chemiluminescence detection using enhancers/ECL-reactions on carriers, comprising a light-tight dark hood (1) having at least one closable opening (2) for introducing a sample table (3) into the inner space of the dark hood, where the sample table is provided with booster function, which exhibit associated light sources (6) for system validation, and is positioned within the dark hood during the detection such that the sample table is brought in operative connection with a camera (4) with cooling and lens, which is arranged in inner space of the dark hood.

Description

Die Erfindung betrifft ein Substrat und eine Vorrichtung für Chemilumineszenzdetektionen, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Enhancern/ECL-Reaktionen (Enhanced ChemiLuminescence reaction) auf Westernblots, wobei durch Elektrophorese aufgetrennte Antigene wie Proteine zunächst auf Folien und ähnliche Träger übertragen und nachfolgend mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden, indem der Träger in einem Substrat inkubiert und in einem kamerabasierten Imaging-System exponiert wird.The invention relates to a substrate and a device for chemiluminescence detection, in particular for applications using enhancers / ECL reactions (Enhanced ChemiLuminescence reaction) on Western blots, wherein separated by electrophoresis antigens such as proteins first on films and similar carriers and subsequently visible by means of chemiluminescence by incubating the support in a substrate and exposing it in a camera-based imaging system.

Zum Nachweis von Makromolekülen wie Proteinen, DNA und RNA werden in den Bereichen der Grundlagenforschung, der Pharmazie und der Medizin neben verschiedenen anderen Verfahren zunehmend Chemilumineszenzverfahren eingesetzt. Derartige Verfahren basieren auf der Überlegung, dass Moleküle unterhalb ihrer Glühtemperatur im UV-Bereich, im sichtbaren Bereich und teilweise auch im IR-Bereich Licht aussenden. Dabei werden die Moleküle nicht physikalisch – beispielsweise durch elektrische Energie, Laser, Lichtquelle oder Wärme – zur Lichtemission angeregt, sondern sie gelangen durch eine chemische Reaktion in einen angeregten Übergangszustand, bevor sie ein stabiles Endprodukt unter Abgabe von Energie in Form von Lichtquanten ausbilden. Das von der Probe emittierte Licht wird mit einem Detektor erfasst, beispielsweise mit einem kamerabasierten System. Die Lichtemissionsrate des Chemilumineszenzsubstrates steigt zu Beginn der Reaktion an und fällt nach dem Erreichen der maximalen Lichtemission aufgrund des Substratverbrauchs wieder ab. Die Effizienz einer Chemilumineszenzreaktion hängt primär von der Zusammensetzung des hierfür eingesetzten Chemilumineszenzsubstrates und den Rahmenbedingungen der Reaktion ab.For the detection of macromolecules such as proteins, DNA and RNA in the fields of basic research, pharmacy and medicine in addition to various other methods increasingly chemiluminescent methods are used. Such methods are based on the consideration that molecules emit light below their annealing temperature in the UV range, in the visible range and partly also in the IR range. The molecules are not physically excited - for example, by electrical energy, laser, light source or heat - to emit light, but they pass through a chemical reaction in an excited transition state before they form a stable end product with release of energy in the form of light quanta. The light emitted by the sample is detected by a detector, such as a camera-based system. The light emission rate of the chemiluminescent substrate increases at the beginning of the reaction and decreases again after reaching the maximum light emission due to substrate consumption. The efficiency of a chemiluminescent reaction depends primarily on the composition of the chemiluminescent substrate used for this purpose and the framework conditions of the reaction.

Die Intensität des emittierten Lichts ist direkt proportional zum chemischen Umsatz des Luminophors pro Zeiteinheit. Diese Lichtintensität ist von stoffspezifischen Eigenschaften des Luminophors abhängig, wobei die Quantenausbeute der Anzahl der emittierten Lichtquanten der reagierenden Moleküle entspricht. Die Lichtemission eines Systems kann durch Interaktion des Luminophors mit anderen organischen Molekülen stark moduliert werden, indem die Moleküle in Abhängigkeit von ihrer Struktur und den jeweiligen Reaktionsbedingungen entweder als Verstärker (sog. Enhancer) oder als Abschwächer (sog. Quencher) wirksam werden. Beim Einsatz von Enhancern wird die Chemilumineszenzreaktion als ECL-Reaktion (enhanced chemiluminescence reaction) bezeichnet, wobei durch Enhancer Verstärkungen bis zum 1.000-fachen der eigentlichen Grundreaktion erreichbar sind.The intensity of the emitted light is directly proportional to the chemical conversion of the luminophore per unit time. This light intensity is dependent on substance-specific properties of the luminophore, the quantum yield corresponding to the number of emitted light quanta of the reacting molecules. The light emission of a system can be strongly modulated by interaction of the luminophore with other organic molecules by the molecules depending on their structure and the respective reaction conditions either as an amplifier (so-called enhancer) or as an attenuator (so-called quencher) are effective. When using enhancers, the chemiluminescent reaction is referred to as ECL reaction (enhanced chemiluminescence reaction), whereby enhancers can be amplified up to 1,000 times the actual basic reaction.

Chemilumineszenzverfahren sind in zahlreichen Modifizierungen bekannt. Überwiegend werden Anwendungen auf Grundlage der Peroxidasereaktion mit Wasserstoffperoxid und Luminol und der alkalischen Phosphatase mit Dioxetan-Substraten realisiert. Vorzugsweise werden diese Enzyme kovalent mit sekundären Antikörpern gekoppelt, um die primäre Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar und nachweisbar zu machen.Chemiluminescence methods are known in numerous modifications. Predominantly, applications based on the peroxidase reaction with hydrogen peroxide and luminol and the alkaline phosphatase with dioxetane substrates are realized. Preferably, these enzymes are covalently coupled with secondary antibodies to make the primary antigen-antibody reaction visible and detectable.

Bei einer Anwendung auf Westernblots werden durch Elektrophorese aufgetrennte Proteine auf Folien (Nitrozellulose oder Polyvinylpyrrolidon) übertragen, durch spezifische Antikörper gegen bestimmte Proteine nachgewiesen und mit Hilfe der sekundären Antikörper-Enzyme-Konjugate mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Dabei wird die Folie mit einem Chemilumineszenzreagenz inkubiert und in einem Imaging-System oder auf einem Film exponiert. Eine ECL-Reaktion erfolgt nur an den Stellen des Bluts, an denen das Antigen und nachfolgend die Antikörper gebunden haben. Demzufolge erfolgt auch nur an diesen Stellen der Bluts eine Lichtemission. Die anderen Bereiche der Bluts werden bei der Blutentwicklung durch Proteine oder Detergenzien blockiert, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden. Demzufolge entspricht die Intensität des ausgesandten Lichts der Quantität des gebundenen Antikörper-Enzym-Konjugates und somit der Menge des am Blot gebundenen nachzuweisenden Antigens.When used on Western blots, proteins separated by electrophoresis are transferred to films (nitrocellulose or polyvinylpyrrolidone), detected by specific antibodies against specific proteins, and visualized by means of chemiluminescence using the secondary antibody-enzyme conjugates. The film is incubated with a chemiluminescent reagent and exposed in an imaging system or on a film. An ECL reaction occurs only at the sites of the blood to which the antigen and subsequently the antibodies have bound. Consequently, a light emission occurs only at these points of the blood. The other parts of the blood are blocked during blood development by proteins or detergents to avoid nonspecific reactions. Accordingly, the intensity of the emitted light corresponds to the quantity of the bound antibody-enzyme conjugate and thus to the amount of antigen to be detected bound to the blot.

Die Optimierung einer solchen Nachweisreaktion hat die Erfassung von möglichst geringen Antigenmengen (höchste Sensitivität) zum Ziel. So sollen beispielsweise bei einer Proteom-Analyse Proteine nachgewiesen werden, die in lediglich geringer Konzentration vorkommen. Beim Nachweis von Proteinen geringer Menge (sog. low abundant Proteins) ist zwangsläufig die Lichtintensität pro Zeiteinheit niedriger als bei Proteinen, die in einer größeren Quantität vorkommen. Demzufolge muss die Nachweisreaktion hier über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden. Das kostenintensive Detektionssystem (z. B. kamerabasierte Imaging-System) ist somit länger durch diesen Einzelnachweis blockiert bzw. die Filmexposition muss relativ undefiniert und unkontrolliert über mehrere Stunden durchgeführt werden, bis nach dem Zufallsprinzip die passende Expositionszeit gefunden wurde.The optimization of such a detection reaction aims to detect the lowest possible amounts of antigen (highest sensitivity). For example, in a proteome analysis, proteins are to be detected which occur in only a low concentration. In the case of low abundant proteins, the light intensity per unit of time is necessarily lower than for proteins that are present in a larger quantity. Consequently, the detection reaction must be carried out here over a longer period of time. The cost-intensive detection system (eg camera-based imaging system) is thus blocked by this itemization for a longer time, or the film exposure has to be carried out relatively undefined and uncontrolled over several hours until the appropriate exposure time has been found at random.

Alternativ zur Durchführung von Nachweisreaktionen über einen längeren Zeitraum ist es möglich, die Chemilumineszenzreaktion derart zu boostern, dass in kürzeren Zeitspannen mehr Licht emittiert wird. Grundsätzlich steigt die Chemilumineszenz-Emission während einer definierten Zeitspanne im Sekundenbereich zur optimalen Effizienz an und klingt in unterschiedlichen Zeiträumen entsprechend dem zunehmenden Verbrauch an Substrat wieder ab. Für eine gute Nachweisführung ist es vorteilhaft, dass die Lichtemission schnell auf Höchstwerte ansteigt und möglichst lange Zeit auf diesem Niveau maximaler Werte verbleibt.Alternatively to conducting detection reactions over an extended period of time, it is possible to boost the chemiluminescent reaction such that more light is emitted in shorter time periods. In principle, the chemiluminescence emission increases during a defined period of time in the second range for optimum efficiency and decays again in different periods in accordance with the increasing consumption of substrate. For a good verification, it is advantageous that the light emission rapidly increases to maximum values and remains as long as possible at this level of maximum values.

Zur Boosterung von Chemilumineszenzreaktionen können verschiedene Lösungsansätze genutzt werden, beispielsweise eine Optimierung der enzymatischen Nachweisreaktion durch Einstellung optimaler Reaktionsbedingungen hinsichtlich der H2O2-Konzentration, des pH-Wertes und der Pufferionen oder eine Optimierung der Zusammensetzung des CL-Substrats durch Auswahl des besten Enhancers, durch die Einstellung der günstigsten Luminophorkonzentration und des besten Enhancer-Luminophor-Verhältnisses. Unser CL-Substrat wurde in allen diesen Punkten optimiert.To boost chemiluminescent reactions, various approaches can be used, for example optimization of the enzymatic detection reaction by setting optimal reaction conditions with regard to the H 2 O 2 concentration, the pH and the buffer ions or optimizing the composition of the CL substrate by selecting the best enhancer by setting the most favorable luminophore concentration and the best enhancer-luminophore ratio. Our CL substrate has been optimized in all these points.

Weiterhin kann die Boosterung der Probe durch externe Energiezuführung realisiert werden, beispielsweise durch Lichtblitze, Bestrahlung mit energiereicher Strahlung (Radioaktivität, Röntgen, UV, IR und dergleichen) vor und/oder während der eigentlichen Messung. Dabei kann eine Boosterung der jeweiligen Probe aus einer, mehreren oder auch allen Richtungen (von unten, oben, rechts, links, hinten, vorn) erfolgen. Die Boosterung kann als konstante Energiezuführung oder auch als „Rampe” mit diskontinuierlicher Zuführung entsprechend einer Ablaufsteuerung im Zeitraum der Boosterung erfolgen.Furthermore, the boosting of the sample can be realized by external energy supply, for example by flashes of light, irradiation with high-energy radiation (radioactivity, X-ray, UV, IR and the like) before and / or during the actual measurement. In this case, a boosting of the respective sample from one, several or even all directions (from below, above, right, left, back, forward) take place. The booster can be done as a constant energy supply or as a "ramp" with discontinuous feed according to a sequence control in the period of boosting.

Als eine Variante der externen Zufuhr von Energie zur Reaktionsbeschleunigung ist die sog. Temperaturboosterung bekannt. Hierbei wird durch eine Zufuhr von Wärmeenergie die enzymatische Reaktion beschleunigt und folglich der Substratumsatz erhöht. Dadurch entstehen mehr Luminophor-Moleküle im energiereichen Übergangszustand und es werden mehr Lichtquanten emittiert. Eine solche Wärmezufuhr ist nicht unbegrenzt möglich, da alle Enzyme ein Temperaturoptimum haben, bei dessen Überschreitung die Denaturierung und Inaktivierung einsetzen. Auch die Chemilumineszenz-Substrate haben keine unbegrenzte Temperaturstabilitat. Sinnvoll ist deshalb eine definierte Erwärmung der Proben, wobei definierte Grenzwerte für das CL-Substrat und die Enzyme Peroxidase und Alkalische Phosphatase nicht überschritten werden dürfen.As a variant of the external supply of energy for reaction acceleration, the so-called temperature booster is known. In this case, the supply of heat energy accelerates the enzymatic reaction and consequently increases the conversion of the substrate. This results in more luminophore molecules in the high-energy transition state and more light quanta are emitted. Such a supply of heat is not unlimited, since all enzymes have a temperature optimum, beyond which use the denaturation and inactivation. The chemiluminescent substrates also have no unlimited temperature stability. Therefore, a defined heating of the samples is meaningful, whereby defined limit values for the CL substrate and the enzymes peroxidase and alkaline phosphatase must not be exceeded.

Unabhängig von der jeweils konkreten Ausführung besteht das Ziel einer Boosterung in der Erhöhung des Reaktionsumsatzes, es sollen also mehr Photonen pro Zeiteinheit verfügbar werden als ohne Boosterung. Für den Nachweis der erfolgenden Chemilumineszenzreaktion sind z. B. kamerabasierte Imaging-Systeme geeignet. Obwohl diesbezüglich bereits mehrere Substrate und Auswertetechniken bekannt sind, besteht weiterhin ein erheblicher Entwicklungsbedarf, der sich primär aus dem zunehmend angestrebten Nachweis von Makromolekülen in lediglich geringer Konzentration ergibt.Regardless of the particular implementation, the goal of boosting is to increase the reaction conversion, so that more photons per unit of time should be available than without boosting. For the detection of the successful chemiluminescent reaction z. B. camera-based imaging systems suitable. Although several substrates and evaluation techniques are already known in this regard, there continues to be a considerable need for development, which results primarily from the increasingly desired detection of macromolecules in only a low concentration.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine technische Lösung zu schaffen, die mit einem akzeptablen Kosten-Zeit-Aufwand einen Nachweis von Makromolekülen auch in geringer Konzentration durch die Chemilumineszenz ermöglicht. Insbesondere wird eine Anwendung mittels Temperaturerhöhung geboosterten ECL-Reaktionen angestrebt. Diese Aufgabe wird gelöst durch die Kombination eines neuartigen ECL-Substrats mit einer spezifischen kamerabasierten Auswerteeinheit. Dabei wird ein Substrat eingesetzt, dessen Basis das Luminophor Luminol ist. Optimiert wurden die Luminophorkonzentration, die Enhancerkonzentration, das Enhancer-/Luminol-Verhältnis sowie die Wasserstoffperoxid-Konzentration und das Puffersystem.Object of the present invention is to provide a technical solution that allows detection of macromolecules even at low concentration by the chemiluminescence with an acceptable cost-time overhead. In particular, an application by means of temperature increase boosted ECL reactions is sought. This object is achieved by combining a novel ECL substrate with a specific camera-based evaluation unit. In this case, a substrate is used, the basis of which is the luminophore luminol. Optimized were the luminophore concentration, the enhancer concentration, the enhancer / luminol ratio and the hydrogen peroxide concentration and the buffer system.

Chemilumineszenzdetektionen mit Peroxidase und Alkalischer Phosphatase finden in der Regel bei Raumtemperatur statt, weil man eine Schädigung der verwendeten Antikörper-Enzymkonjugate und einen thermisch-bedingten Abbau der Chemilumineszenzsubstrate bei erhöhten Expositionstemperaturen befürchtet. Untersuchungen der Anmelderin haben ergeben, dass das erfindungsgemäß vorgeschlagene ECL-Substrat eine wesentlich bessere Temperaturstabilität und ein breiteres Temperaturoptimum (bis 55°C) im Vergleich zu den bisher am Markt verfügbaren Substraten besitzt.Chemiluminescence detections with peroxidase and alkaline phosphatase usually take place at room temperature, because one fears damage to the antibody-enzyme conjugates used and a thermally-induced degradation of the chemiluminescent substrates at elevated exposure temperatures. Investigations by the Applicant have shown that the inventively proposed ECL substrate has a much better temperature stability and a wider temperature optimum (up to 55 ° C) compared to the substrates previously available on the market.

Dieses Substrat ist für durch Temperaturerhöhung geboosterte ECL-Reaktionen geeignet und ermöglicht vorzugsweise eine Boosterung von Westernblot-Nachweisen mit Peroxidase. Wirkungsgrad und Verlauf der Chemilumineszenzreaktion werden durch die chemischen Eigenschaften dieses Substrats vorteilhaft verbessert.This substrate is suitable for elevated temperature boosted ECL reactions and preferably allows boosting Western blot detections with peroxidase. The efficiency and course of the chemiluminescent reaction are advantageously improved by the chemical properties of this substrate.

Das übliche Befeuchten und Einschweißen der Blots ist bei – wie hier vorliegend – externer Wärmezuführung nicht möglich, weil sich dann schnell Luftblasen bilden würden, die ein störungsfreies Einlesen der Blots unmöglich machen. Eine Alternative ist daher das Einlegen der Westernblots in eine dünnwandige Kunststoffwanne, so dass die Blots mit Reagenz bedeckt sind. Dabei müssen die Kunststoffwanne und das Reagenz vor Einlegen bzw. Detektion der Blots auf die gewünschte Temperatur gebracht werden, damit die Chemilumineszenzreaktion bei definierten Temperaturen erfolgen kann. Die emittierten Photonen können dann z. B. mit einem kamerabasierten Imaging-System detektiert werden.The usual moistening and welding of the blots is - as here - external heat supply not possible, because then quickly bubbles would form, which make trouble-free reading of the blots impossible. An alternative is therefore to insert the Westernblots into a thin-walled plastic tub, so that the blots are covered with reagent. The plastic tub and the reagent must be brought to the desired temperature before inserting or detecting the blots, so that the chemiluminescent reaction can take place at defined temperatures. The emitted photons can then z. B. be detected with a camera-based imaging system.

Hierfür wird gemäß der Erfindung eine Vorrichtung vorgeschlagen, die eine lichtdichte Dunkelhaube mit zumindest einer verschließbaren Öffnung zum Einbringen eines Probentisches in den Innenraum der Dunkelhaube aufweist, wobei der Probentisch mit einer Boosterfunktion ausgestattet ist, zugeordnete Lichtquellen zur Systemvalidierung aufweist und während der Detektion innerhalb der Dunkelhaube derart positioniert wird, dass er mit einer ebenfalls im Innenraum der Dunkelhaube angeordneten Kamera mit Kühlung und Objektiv in Wirkverbindung bringbar ist. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen, deren technische Merkmale im Ausführungsbeispiel erläutert werden.For this purpose, a device is proposed according to the invention, which has a light-tight dark hood with at least one closable opening for introducing a sample table into the interior of the dark hood, the sample table is equipped with a booster function, having associated light sources for system validation and during detection within the Dark hood is positioned so that it can be brought into operative connection with a camera also arranged in the interior of the dark hood with cooling and lens. Advantageous embodiments are the subject of dependent claims, the technical features are explained in the embodiment.

Die Effizienz einer Chemilumineszenzreaktion (chemiluminescence yield) entspricht der Integration der Lichtintensität über einen definierten Zeitraum, also der integrierten Fläche unter der Chemilumineszenzkurve. In einem Luminometer wird die Lichtintensität zumeist pro Sekunde durch einen Photomultiplyer bestimmt. Wenn diese Messung intervallfrei über eine Gesamtmesszeit durchgeführt wird, kann durch eine Addition der Sekundenabschnitte das Integral Chemilumineszenzeffizienz in guter Annäherung erfasst werden.The efficiency of a chemiluminescence reaction corresponds to the integration of the light intensity over a defined period, ie the integrated area under the chemiluminescence curve. In a luminometer, the light intensity is usually determined per second by a photomultiplier. If this measurement is performed interval-free over a total measurement time, the addition of the second sections can be used to closely approximate the integral chemiluminescence efficiency.

Das kamerabasierte Detektionssystem basiert auf einem „charge coupled device”-Sensor, nachfolgend als CCD-Sensor bezeichnet. Der CCD-Sensor ist ein lichtempfindliches Halbleiterelement, das einfallendes Licht in Abhängigkeit von der Helligkeit in elektrische Spannungswerte umwandelt. Die Belichtungszeit ist proportional zur Anzahl der detektierten Photonen. Dies gilt unter der Voraussetzung, dass die Erfassung innerhalb des linearen Detektionsbereiches des CCD-Sensors erfolgt. Dabei besteht ein Zusammenhang zwischen den Eigenschaften des Gerätes und der Chemilumineszenzreaktion, die beide wesentlich die Nachweisempfindlichkeit und damit die Expositionszeiten des Gesamtsystems beeinflussen.The camera-based detection system is based on a "charge coupled device" sensor, hereinafter referred to as a CCD sensor. The CCD sensor is a semiconductor photosensitive element that converts incident light into electrical voltage as a function of brightness. The exposure time is proportional to the number of detected photons. This applies on condition that the detection takes place within the linear detection range of the CCD sensor. There is a correlation between the properties of the device and the chemiluminescent reaction, both of which significantly influence the detection sensitivity and thus the exposure times of the entire system.

Für die Reaktionsverläufe ist es wichtig, dass die Temperatur im Chemilumineszenzsubstrat genau erfasst wird, um eine präzise Steuerung der Wärmestrahlungsquelle zu realisieren. Die Erfassung der Substrattemperatur kann über ein mathematisches Modell auf der Basis der gemessenen Temperatur an der Oberfläche der Wärmestrahlungsquelle hochgerechnet werden. Eine wesentlich genauere und damit zu favorisierende Möglichkeit besteht in der direkten Messung mit einem Temperatursensor im ECL-Substrat. Desweitern kann beispielsweise eine Messung mit einem Infrarot-Temperatursensor erfolgen. Mit einer somit berührungslosen Messung kann die Temperatur im Chemilumineszenzsubstrat sehr exakt erfasst werden.For the course of the reaction, it is important that the temperature in the chemiluminescent substrate is accurately detected in order to realize a precise control of the heat radiation source. The detection of the substrate temperature can be extrapolated via a mathematical model on the basis of the measured temperature at the surface of the heat radiation source. A much more accurate and thus favored possibility is the direct measurement with a temperature sensor in the ECL substrate. Furthermore, for example, a measurement can be made with an infrared temperature sensor. With a contactless measurement, the temperature in the chemiluminescent substrate can be detected very accurately.

Die zu analysierende Probe wird von unten gesamtflächig mittels Wärmestrahlung auf eine, für die maximale Lichtemission optimale Temperatur erwärmt. Dabei erfolgt die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle durch μController und/oder eine externe Steuereinheit (z. B. PC).The sample to be analyzed is heated from the bottom over the entire surface by means of thermal radiation to an optimum temperature for maximum light emission. The heat radiation source is controlled by μ controllers and / or an external control unit (eg PC).

Die Wärmestrahlungsquelle kann während der Chemilumineszenz-Messung auf definierte Temperaturen geregelt oder gemäß einem abgespeicherten Temperaturprofil gesteuert oder auch diskontinuierlich aktiviert werden. Die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle erfolgt vorzugsweise spezifisch für ein jeweils bestimmtes Chemilumineszenz-Substrat, so dass die spezifischen Reaktionseigenschaften des Substrates berücksichtigt werden. Die Steuerung kann alternativ manuell oder computergestützt erfolgen. Bei manueller Steuerung werden zumindest alle wesentlichen Funktionen berücksichtigt, wie Solltemperatur, Einschalten bzw. Ausschalten der Regelung, Festlegung des Betriebsmodus, integrierte Notabschaltung bei thermischen Problemen. Bei einer computergestützten Steuerung können weitere Funktionen berücksichtigt werden. Dies sind neben den Funktionen der manuellen Steuerung beispielsweise die Regelcharakteristik, die Festlegung zum Betriebsmodus, die Definition der Temperatur-Zeit-Verläufe einer Ablaufsteuerung und Speicherung zur erneuten Benutzung, Betriebsstundenzähler, integrierte automatische Abschaltung nach einem vorgegebenen Zeitlimit oder integrierte Notabschaltung bei thermischen Problemen. Mit der Funktionalität der PC-Ansteuerung können Temperatur-Zeit-Abläufe programmiert (vom Anwender per Software erstellt) und die Boosterung über diese Funktion automatisch gesteuert werden.The heat radiation source can be regulated to defined temperatures during the chemiluminescence measurement or controlled according to a stored temperature profile or also be activated intermittently. The control of the heat radiation source is preferably carried out specifically for a particular chemiluminescent substrate, so that the specific reaction properties of the substrate are taken into account. The control can alternatively be done manually or computer-assisted. With manual control, at least all essential functions are taken into account, such as setpoint temperature, switching on or off control, definition of the operating mode, integrated emergency shutdown in the event of thermal problems. In a computerized control, additional functions can be taken into account. These are, in addition to the functions of manual control, for example, the control characteristics, the definition of the operating mode, the definition of the temperature-time histories of a sequential control and storage for reuse, hour meter, integrated automatic shutdown after a predetermined time limit or integrated emergency shutdown in case of thermal problems. With the functionality of the PC control, temperature-time sequences can be programmed (created by the user via software) and the booster can be controlled automatically via this function.

Der Verlauf einer Chemilumineszenzreaktion und damit die Anzahl der emittierten Photonen pro Zeiteinheit sind von Versuch zu Versuch nicht identisch. Dies hat mehrere Ursachen, die in der chemischen Natur der Reaktion und ihrer Rahmenbedingungen liegen. Um die Ergebnisse der Messungen miteinander vergleichen zu können, ist ein internes System der Normierung notwendig. Dabei erfolgt die Normierung vorzugsweise mit kalibrierten Photonenquellen (zum Beispiel LED's), die parallel zur Emission der Probe auch Licht emittieren. Hierbei ergeben sich funktionelle Vorteile, sofern die kalibrierten Photonenquellen mit einer ähnlichen Wellenlänge wie die Probe emittieren.The course of a chemiluminescent reaction and thus the number of photons emitted per unit time are not identical from experiment to experiment. This has several causes, which lie in the chemical nature of the reaction and its framework conditions. In order to be able to compare the results of the measurements, an internal system of standardization is necessary. The standardization is preferably carried out with calibrated photon sources (for example LEDs), which also emit light parallel to the emission of the sample. This results in functional advantages, provided that the calibrated photon sources emit at a wavelength similar to that of the sample.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung unter Hinweis auf die Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:An embodiment of the invention will be described in more detail with reference to the drawing. Show it:

1 den grundsätzlichen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung einer erfindungsgemäß ausgestalteten Chemilumineszenzdetektion 1 the basic structure of an apparatus for performing an inventively designed chemiluminescence detection

2 die gerätetechnische Ausgestaltung zur Normierung der Versuchsergebnisse in einer ersten Ausführung 2 the device-technical design for normalization of the test results in a first embodiment

3 die gerätetechnische Ausgestaltung zur Normierung der Versuchsergebnisse in einer zweiten Ausführung 3 the device technical design for normalization of the test results in a second embodiment

Die in der Zeichnung stilisiert dargestellte Vorrichtung ist für Chemilumineszenzdetektionen konzipiert, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Verstärkern/„Enhancern”, bei denen die dann als ECL-Reaktion (enhanced chemiluminescence reaction) bezeichnete Chemilumineszenzreaktion auf ein Vielfaches der an sich üblichen Grundreaktion verstärkt werden kann. Eine bevorzugte Anwendung sind Westernblots, wobei durch Elektrophorese aufgetrennte Proteine zunächst auf folienähnliche Gebilde übertragen und nachfolgend durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden. Hierfür wird das folienähnliche Gebilde in einem Substrat inkubiert und z. B. in einem kamerabasierten Imaging-System exponiert. Gemäß der Erfindung wird ein Substrat verwendet, dessen Zusammensetzung optimiert wurde. The device, stylized in the drawing, is designed for chemiluminescent detection, particularly for amplifiers, in which the chemiluminescent reaction, which is referred to as ECL (enhanced chemiluminescence reaction), can be amplified to a multiple of the basic reaction inherent in the art , A preferred application is Western blots, wherein proteins separated by electrophoresis are first transferred to foil-like structures and subsequently visualized by chemiluminescence. For this purpose, the film-like structure is incubated in a substrate and z. B. exposed in a camera-based imaging system. According to the invention, a substrate is used whose composition has been optimized.

Für die Durchführung von Chemilumineszenzdetektionen unter Verwendung eines derartigen Substrats ist eine in 1 stilisiert dargestellte Vorrichtung geeignet. Die Vorrichtung weist eine lichtdichte Dunkelhaube 1 auf, mit der sehr unterschiedliche Messzeiten realisiert werden können, in Abhängigkeit konkreter Einsatzbedingungen beispielsweise zwischen lediglich einer Sekunde und einem Zeitraum von 30 Tagen.For performing chemiluminescent detection using such a substrate, an in 1 stylized illustrated device suitable. The device has a light-tight dark hood 1 on, with the very different measurement times can be realized, depending on specific conditions of use, for example, between only one second and a period of 30 days.

An der Gehäusewand der Dunkelhaube 1 ist mindestens eine verschließbare Öffnung 2 ausgestaltet. Weiterhin umfasst die Vorrichtung einen Probentisch 3 und eine Kamera 4, die mit Kühlung und Objektiv ausgestattet ist. Probentisch 3 und Kamera 4 werden innerhalb der Dunkelhaube 1 lagefixiert abgestützt, wobei eine solche Abstützung in 1 lediglich als stilisierte Tragstruktur 5 dargestellt ist. Die Kamera 4 und/oder der Probentisch 3 können manuell oder elektromotorisch verfahren werden.On the housing wall of the dark hood 1 is at least one closable opening 2 designed. Furthermore, the device comprises a sample table 3 and a camera 4 which is equipped with cooling and lens. sample table 3 and camera 4 be inside the dark hood 1 Positioned supported, with such support in 1 merely as a stylized support structure 5 is shown. The camera 4 and / or the sample table 3 can be moved manually or by electric motor.

Der Probentisch 3, der durch die Öffnung 2 in den Innenraum der Dunkelhaube 1 ein- oder ausgefahren werden kann, ist mit einer Boosterfunktion ausgestattet und weist zugeordnete Lichtquellen 6 zur Systemvalidierung auf. Während der Detektion wird der Probentisch 3 innerhalb der Dunkelhaube 1 so positioniert, dass er mit der ebenfalls im Innenraum der Dunkelhaube 1 angeordneten Kamera 4 in Wirkverbindung bringbar ist. In Funktionslage sind Probentisch 3 und Kamera 4 – wie aus 1 ersichtlich – vorzugsweise übereinander angeordnet. Positionsänderungen und/oder parameterspezifische Einstellungen von Probentisch 3 und Kamera 4 können alternativ manuell oder computertechnisch ausgelöst werden. So kann beispielsweise die Einstellung von Blende und Fokus der Kamera 4 vom Nutzer manuell eingestellt werden oder über eine Steuerung elektromotorisch erfolgen.The sample table 3 passing through the opening 2 into the interior of the dark hood 1 can be extended or retracted, is equipped with a booster function and has associated light sources 6 for system validation. During detection, the sample table becomes 3 inside the dark hood 1 positioned so that it also with the interior of the dark hood 1 arranged camera 4 can be brought into operative connection. In functional position are sample table 3 and camera 4 - like out 1 visible - preferably arranged one above the other. Position changes and / or parameter-specific settings of sample table 3 and camera 4 can alternatively be triggered manually or by computer technology. Thus, for example, the setting of aperture and focus of the camera 4 can be set manually by the user or take place by means of a control electromotive.

Dem Probentisch 3 ist eine in der Zeichnung nicht näher dargestellte Wärmestrahlungsquelle zugeordnet. Mit der Wärmestrahlungsquelle kann die auf der Oberseite des Probentischs 3 angeordnete Probe von unten gesamtflächig mit Wärmestrahlung beaufschlagt und dadurch auf eine für maximale Lichtemission optimale Temperatur erwärmt werden. Die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle kann alternativ über einen μController oder eine externe Steuereinheit 7 erfolgen, wobei die Wirkverbindung zwischen den Baugruppen in 1 mit einem Pfeil stilisiert dargestellt ist. Dabei ergibt sich eine vorteilhafte Ausgestaltung, sofern die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle für das jeweils konkret eingesetzte Substrat zur Chemilumineszenzdetektion derart erfolgt, dass die spezifischen Reaktionseigenschaften dieses Substrats berücksichtigt werden. Die Wärmestrahlungsquelle kann alternativ auch seitlich über der Probe oder direkt über der Probe angeordnet sein. Hierfür ist beispielsweise eine Infrarot-Wärmestrahlungsquelle geeignet.The sample table 3 is associated with a not shown in the drawing heat radiation source. With the heat radiation source can be on the top of the sample table 3 arranged sample from below the entire surface subjected to thermal radiation and thereby heated to an optimum temperature for maximum light emission. The control of the heat radiation source may alternatively via a μController or an external control unit 7 take place, wherein the operative connection between the modules in 1 is shown stylized with an arrow. This results in an advantageous embodiment, provided that the control of the heat radiation source for each concretely used substrate for chemiluminescence detection is carried out such that the specific reaction properties of this substrate are taken into account. The heat radiation source may alternatively also be arranged laterally over the sample or directly above the sample. For this example, an infrared heat radiation source is suitable.

Weiterhin ist vorgesehen, dass die Temperatur im Substrat zur Chemilumineszenzdetektion erfasst wird. Dies ist möglich, indem die Temperatur über ein mathematisches Modell auf der Basis der gemessenen Temperatur an der Oberfläche der Wärmestrahlungsquelle berechnet oder alternativ direkt mittels eines Temperatursensors erfasst wird.Furthermore, it is provided that the temperature in the substrate is detected for the chemiluminescence detection. This is possible by calculating the temperature via a mathematical model on the basis of the measured temperature at the surface of the heat radiation source or, alternatively, directly by means of a temperature sensor.

Weiterhin umfasst die Vorrichtung ein internes System zur Normierung. Diese Normierung erfolgt vorzugsweise mit kalibrierten Photonenquellen, die parallel zur Emission der Probe auch Licht emittieren. 2 und 3 zeigen diesbezügliche Ausführungen unter Nutzung von LED's mit kalibrierten Photonenwerten zur Validierung des Chemilumineszenzsystems und zur Normierung der Versuchsergebnisse. Dabei ist aus 2 eine Variante mit vier LED's ersichtlich, die in zwei Gruppen 3B und 3A unterteilt sind. 3 zeigt eine Variante mit 16 LED's, die hier in vier Gruppen 3D, 3C, 3B und 3A unterteilt sind.Furthermore, the device comprises an internal system for normalization. This standardization is preferably carried out with calibrated photon sources which also emit light parallel to the emission of the sample. 2 and 3 show relevant statements using LEDs with calibrated photon values for the validation of the chemiluminescence system and for standardization of the test results. It is off 2 a variant with four LEDs can be seen, which are divided into two groups 3B and 3A. 3 shows a variant with 16 LEDs, which are here divided into four groups 3D, 3C, 3B and 3A.

Es ergeben sich funktionelle Vorteile, sofern die kalibrierten Photonenquellen jeweils mit einer ähnlichen Wellenlänge wie die Probe emittieren. Dabei können 1 bis n kalibrierte Photonenquellen zur Normierung zum Einsatz kommen. Der emittierte Photonenwert dieser Lichtquellen ist in einem weiten Bereich von x bis y Photonen pro Zeiteinheit (z. B. 100 Mio. Photonen/ms bis 1 Photon/ms) einstellbar. Die Anzahl der Photonenquellen und die kalibrierten Werte werden unter Beachtung der jeweils relevanten Einsatzbedingungen des konkreten Nutzers ausgewählt.There are functional advantages provided the calibrated photon sources each emit at a wavelength similar to that of the sample. In this case, 1 to n calibrated photon sources can be used for normalization. The emitted photon value of these light sources can be set in a wide range of x to y photons per unit of time (eg 100 million photons / ms to 1 photon / ms). The number of photon sources and the calibrated values are selected taking into account the respective relevant conditions of use of the specific user.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11
lichtdichte Dunkelhaubelightproof dark hood
22
verschließbare Öffnunglockable opening
33
Probentischsample table
44
Kamera mit Kühlung und ObjektivCamera with cooling and lens
55
Tragstruktur für Probentisch und KameraSupport structure for sample table and camera
66
Lichtquellen zur SystemvalidierungLight sources for system validation
77
μController/externe SteuereinheitμController / external control unit

Claims (10)

Substrat für Chemilumineszenzdetektionen, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Enhancern/ECL-Reaktionen auf Trägern, wobei aufgetrennte Antigene zunächst auf folienähnliche Gebilde übertragen und nachfolgend mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden, indem der Träger in einem Substrat inkubiert und in einem kamerabasierten Imaging-System mit oder ahne Boosterfunktion exponiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat auf Basis des Luminophors Luminol ausgestaltet ist und hinsichtlich der Luminolkonzentration, der Enhancerkonzentration, des Enhancer-Luminol-Verhältnises, des Puffersystems und der Wasserstoffperoxid-Konzentration optimiert wurde.A substrate for chemiluminescent detection, in particular for applications using enhancer / ECL-reactions on carriers, where separated antigens are first transferred to foil-like structures and subsequently visualized by chemiluminescence by incubating the support in a substrate and in a camera-based imaging system or without booster function, characterized in that the substrate is based on the luminophore Luminol and was optimized in terms of Luminolkonzentration, the enhancer concentration, the enhancer-luminol ratio, the buffer system and the hydrogen peroxide concentration. Vorrichtung für Chemilumineszenzdetektionen, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Enhancern/ECL-Reaktionen auf Trägern, wobei aufgetrennte Antigene zunächst auf folienähnliche Gebilde übertragen und nachfolgend mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden, indem der Träger in einem ECL-Substrat inkubiert und in einem kamerabasierten Imaging-System exponiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine lichtdichte Dunkelhaube (1) mit zumindest einer verschließbaren Öffnung (2) zum Einbringen eines Probentisches (3) in den Innenraum der Dunkelhaube (1) aufweist, wobei der Probentisch (3) mit einer Boosterfunktion ausgestattet ist, zugeordnete Lichtquellen (6) zur Systemvalidierung aufweist und während der Detektion innerhalb der Dunkelhaube (1) derart positioniert wird, dass er mit einer ebenfalls im Innenraum der Dunkelhaube (1) angeordneten Kamera (4) mit Kühlung und Objektiv in Wirkverbindung bringbar ist.Apparatus for chemiluminescent detection, in particular for applications using enhancer / ECL reactions on carriers, wherein separated antigens are first transferred to foil-like structures and subsequently visualized by chemiluminescence by incubating the support in an ECL substrate and incubating in a camera-based imaging System is exposed, characterized in that the device is a light-tight dark hood ( 1 ) with at least one closable opening ( 2 ) for introducing a sample table ( 3 ) in the interior of the dark hood ( 1 ), wherein the sample table ( 3 ) is equipped with a booster function, associated light sources ( 6 ) for system validation and during detection within the dark hood ( 1 ) is positioned in such a way that it is also located in the interior of the dark hood ( 1 ) arranged camera ( 4 ) can be brought into operative connection with cooling and lens. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Positionsänderungen und/oder parameterspezifische Einstellungen von Probentisch (3) und Kamera (4) manuell oder computertechnisch auslösbar sind.Apparatus according to claim 2, characterized in that position changes and / or parameter-specific settings of sample table ( 3 ) and camera ( 4 ) are manually or computer technically triggered. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dem Probentisch (3) eine Wärmestrahlungsquelle derart zugeordnet ist, dass die Probe von unten gesamtflächig mit Wärmestrahlung inkubiert und auf eine für maximale Lichtemission optimale Temperatur erwärmbar ist.Device according to claim 2, characterized in that the sample table ( 3 ) is assigned a heat radiation source such that the sample is incubated from the bottom of the entire surface with thermal radiation and can be heated to an optimum temperature for maximum light emission. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle mittels μController und/oder mittels einer externen Steuereinheit (7) erfolgt.Apparatus according to claim 4, characterized in that the control of the heat radiation source by μController and / or by means of an external control unit ( 7 ) he follows. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle für das jeweils konkret eingesetzte Substrat zur Chemilumineszenzdetektion derart erfolgt, dass die spezifischen Reaktionseigenschaften dieses Substrats berücksichtigt werden.Apparatus according to claim 4, characterized in that the control of the heat radiation source for each concretely used substrate for chemiluminescence detection is carried out such that the specific reaction properties of this substrate are taken into account. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Substrat zur Chemilumineszenzdetektion erfasst wird.Apparatus according to claim 2, characterized in that the temperature is detected in the substrate for chemiluminescent detection. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Substrat über ein mathematisches Modell auf der Basis der gemessenen Temperatur an der Oberfläche der Wärmestrahlungsquelle berechnet oder direkt mittels eines Temperatursensors erfasst wird.Apparatus according to claim 7, characterized in that the temperature is calculated in the substrate via a mathematical model on the basis of the measured temperature at the surface of the heat radiation source or detected directly by means of a temperature sensor. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorrichtung ein internes System zur Normierung zugeordnet ist.Apparatus according to claim 2, characterized in that the device is associated with an internal system for normalization. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Normierung mit kalibrierten Photonenquellen erfolgt, die parallel zur Emission der Probe auch Licht emittieren.Apparatus according to claim 9, characterized in that the normalization is carried out with calibrated photon sources which also emit light parallel to the emission of the sample.
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