DE102011051692A1 - Process for the sterilization of functionalized, coated surfaces containing nucleotides and / or nucleotide derivatives - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltende, beschichteten Oberflächen, bei dem a) eine funktionalisierende Beschichtung der Oberfläche im Überschuss mit Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten erfolgt, wobei die überschüssigen Nukleotide und/oder Nukleotidderivate als Opferstränge nicht aus der Beschichtung ausgewaschen werden, b) die Atmosphäre über der beschichteten Oberfläche mit Ethanol angereichert wird und c) eine Bestrahlung der beschichteten Oberfläche mit ionisierender Strahlung erfolgt.The invention relates to a method for the sterilization of functionalized, coated surfaces containing nucleotides and / or nucleotide derivatives, in which a) a functionalizing coating of the surface in excess takes place with nucleotides and / or nucleotide derivatives, wherein the excess nucleotides and / or nucleotide derivatives do not act as sacrificial strands be washed out of the coating, b) the atmosphere is enriched over the coated surface with ethanol and c) irradiation of the coated surface with ionizing radiation takes place.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten Oberflächen.The invention relates to a method for the sterilization of functionalized, coated with nucleotides and / or nucleotide derivatives, coated surfaces.
Die Immobilisierung von Nukleotiden oder Nukleotidderivate auf festen Trägermaterialien ist von großer Bedeutung für die Implantologie und viele Bereiche der Biotechnologie.The immobilization of nucleotides or nucleotide derivatives on solid support materials is of great importance for implantology and many areas of biotechnology.
Derartig behandelte Oberflächen werden insbesondere in der Implantologie als biologisch funktionalisierte Implantate sowie in der Analytik bei der Herstellung von DNA-Chips und zur Herstellung von Sensoren eingesetzt. Weiterhin sind Anwendungsfälle von mit biologisch aktiven Komponenten beschichteten Oberflächen umfasst, deren Verwendung eine Inaktivierung mikrobieller Kontaminationen durch Sterilisation der Oberfläche erfordert.Surfaces treated in this way are used in particular in implantology as biologically functionalized implants as well as in the analysis in the production of DNA chips and for the production of sensors. Furthermore, use cases of surfaces coated with biologically active components are included, the use of which requires inactivation of microbial contaminations by sterilization of the surface.
Aus der
Weiterhin geht aus der
Die Herstellung von gattungsgemäß funktionalisierten Beschichtungen von Oberflächen und insbesondere von Metalloberflächen oder Waferoberflächen ist somit im Stand der Technik eine bekannte Technologie.The production of generic functionalized coatings of surfaces and in particular of metal surfaces or wafer surfaces is thus a known technology in the prior art.
Um die erhaltenen Beschichtungen jedoch in biologischen Systemen einsetzen zu können, ist es erforderlich, durch geeignete Verfahren mögliche mikrobielle Kontaminationen zu beseitigen und somit Sterilität der beschichteten Oberflächen zu erreichen.However, in order to be able to use the resulting coatings in biological systems, it is necessary to eliminate possible microbial contaminations by suitable methods and thus to achieve sterility of the coated surfaces.
Aus dem Stand der Technik ist auch bekannt, Produkte, beziehungsweise Oberflächen mit funktionalisierenden Beschichtungen, mittels ionisierender Strahlung zu sterilisieren.It is also known from the prior art to sterilize products or surfaces with functionalizing coatings by means of ionizing radiation.
Eine für diese Anwendungsfälle bekannte Behandlungsform ist die Bestrahlung mit Gammastrahlen in festgelegten Dosen.A treatment method known for these applications is irradiation with gamma rays in defined doses.
Weiterhin ist als damit verbundenes Problem bekannt, dass die Behandlung mit ionisierender Strahlung, dabei beispielsweise Schädigungen an DNA-Molekülen (Desoxyribonukleinsäure) verursacht, die auf direkte Wechselwirkungen und indirekte Effekte zurückzuführen sind. Furthermore, as a related problem is known that the treatment with ionizing radiation, thereby causing, for example, damage to DNA molecules (deoxyribonucleic acid), which are due to direct interactions and indirect effects.
Derartige Effekte werden hauptsächlich verursacht durch die Bildung reaktiver Spezies auf Grund der Wechselwirkung der ionisierenden Strahlung mit Komponenten in der Umgebung der DNA.Such effects are mainly caused by the formation of reactive species due to the interaction of the ionizing radiation with components in the environment of the DNA.
Im Stand der Technik wird dieses Problem dadurch zu lösen versucht, dass eine geeignete Zusammensetzung der Gasatmosphäre bei der Bestrahlung gezielt eingestellt wird. Zielstellung ist es dabei, das Vorhandensein von Sauerstoff zu minimieren, da dieser bei der Bestrahlung zu reaktivem Ozon umgesetzt würde, was nachfolgend zu Schädigungen der funktionellen Beschichtung führt. Eine weitere Strategie der Minimierung der Probleme durch die Bestrahlung von DNA enthaltenden Beschichtungen besteht in einer starken Trocknung der Beschichtung vor der Bestrahlung. Unter Trocknung im Sinne der Erfindung ist im weitesten Sinne der Entzug von Wasser zu verstehen.In the prior art, this problem is attempted to be solved by suitably setting a suitable composition of the gas atmosphere during the irradiation. The aim is to minimize the presence of oxygen, as it would be converted to reactive ozone during irradiation, which subsequently leads to damage to the functional coating. Another strategy for minimizing the problems of irradiation of DNA-containing coatings is to dry the coating before irradiation. Drying in the sense of the invention is understood in the broadest sense to mean the removal of water.
Allerdings ist auch bekannt, dass die im Stand der Technik ergriffenen Maßnahmen zur Erhaltung der Biofunktionalität der bestrahlten Beschichtung häufig nicht in ausreichendem Maße wirken.However, it is also known that the measures taken in the prior art to maintain the biofunctionality of the irradiated coating often do not work sufficiently.
Insbesondere ist bekannt, dass das Ausmaß der Schädigungen von Nukleotiden oder Nukleotidderivaten über Oligonukleotide bis hin zu hochmolekularen DNA-Strukturen im Fall von partiell in anodische Oxidschichten eingebauten Einzelsträngen durch ionisierende Strahlung bei einer typischen Dosis mittels Gamma-Sterilisation zu hoch ist. Nachfolgend sollen unter Nukleotiden oder Nukleotidderivaten Verbindungen aus diesen von Oligonukleotiden bis hin zu hochmolekularen DNA-Strukturen verstanden werden.In particular, it is known that the extent of damage to nucleotides or nucleotide derivatives via oligonucleotides to high molecular weight DNA structures in the case of partially built-up in anodic oxide layers single strands by ionizing radiation at a typical dose by gamma sterilization is too high. In the following, nucleotides or nucleotide derivatives are understood as meaning compounds of these from oligonucleotides to high-molecular-weight DNA structures.
Unter Nukleotidderivaten werden beispielsweise auch Phosphotioate zur Erhöhung der Nukleasestabilität und ähnliche Substanzen verstanden.By nucleotide derivatives, for example, phosphotioates for increasing the nuclease stability and similar substances are understood.
Es ist Aufgabe der Erfindung, das Ausmaß der Schädigung von Nukleotide oder Nukleotidderivate enthaltenden Beschichtungen von Oberflächen durch eine Bestrahlung mit ionisierender Strahlung zu reduzieren und eine höhere Funktionalität der sterilisierten Oberfläche zu erreichen.It is an object of the invention to reduce the extent of damage to surface coatings containing nucleotides or nucleotide derivatives by irradiation with ionizing radiation and to achieve a higher functionality of the sterilized surface.
Die Aufgabe wird durch die Merkmale der selbstständigen Patentansprüche gelöst. Weiterbildungen sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.The object is solved by the features of the independent claims. Further developments are specified in the dependent claims.
Die Aufgabe wird insbesondere durch ein Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten Oberflächen gelöst, bei dem a) eine funktionalisierende Beschichtung der Oberfläche im Überschuss mit Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten erfolgt, wobei die überschüssigen Nukleotide und/oder Nukleotidderivate als Opferstränge nicht aus der Beschichtung ausgewaschen werden.The object is achieved in particular by a method for sterilizing functionalized, nucleotide or nucleotide derivatives, coated surfaces in which a) a functionalizing coating of the surface in excess takes place with nucleotides and / or nucleotide derivatives, wherein the excess nucleotides and / or nucleotide derivatives are not washed out as a sacrificial strand from the coating.
Unter überschüssigen Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten sind solche zu verstehen, die nicht stabil auf der zu funktionalisierenden Oberfläche immobilisiert sind. Excess nucleotides and / or nucleotide derivatives are to be understood as meaning those which are not stably immobilized on the surface to be functionalized.
In einem nächsten Verfahrensschritt b) wird die Atmosphäre über der beschichteten Oberfläche mit Ethanol, und insbesondere mit wasserfreiem Ethanol angereichert.In a next process step b), the atmosphere is enriched over the coated surface with ethanol, and in particular with anhydrous ethanol.
Es schließt sich ein Verfahrensschritt c) an, der in einer Bestrahlung der beschichteten Oberfläche mit ionisierender Strahlung besteht. This is followed by a process step c), which consists in irradiation of the coated surface with ionizing radiation.
Bevorzugt wird das Verfahren dadurch ausgebildet, dass die Bestrahlung mit Gammastrahlen mit einer Dosis von 25–30 kGray erfolgt.Preferably, the method is formed by irradiation with gamma rays at a dose of 25-30 kGray.
Eine Verbesserung der Verfahrensergebnisse kann nach einer Weiterbildung der Erfindung dadurch erreicht werden, dass vor der Bestrahlung der beschichteten Oberfläche eine Entfernung von Wasser und Sauerstoff aus der Beschichtung und der diese umgebenden Atmosphäre erfolgt.An improvement of the method results can be achieved according to a development of the invention in that before the irradiation of the coated surface, a removal of water and oxygen from the coating and the surrounding atmosphere takes place.
Vorteilhaft zu diesem Zweck ist die Entfernung von Wasser mittels Phosphorpentoxid (P2O5) sowie die Sauerstoffentfernung durch den Austausch von Luft gegen eine Schutzgasatmosphäre.Advantageous for this purpose is the removal of water by means of phosphorus pentoxide (P 2 O 5 ) and the oxygen removal by the exchange of air against a protective gas atmosphere.
Nach einer konkreten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist gemäß Verfahrensschritt b) die Anreicherung einer Argon-Schutzgasatmosphäre mit wasserfreiem Ethanol in der Konzentration von 1.500 μl auf 100 ml Volumen vorteilhaft.According to a specific embodiment of the method according to the invention, according to method step b), the enrichment of an argon protective gas atmosphere with anhydrous ethanol in the concentration of 1,500 μl to 100 ml volume is advantageous.
Das Verfahren wird ferner dadurch weitergebildet, dass die funktionalisierende Beschichtung aus einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer Titanoberfläche, beziehungsweise einer Titan enthaltenden Oberfläche ausgeführt ist, beziehungsweise dass ein Teil der Stränge partiell in anodisch gebildetes Oxid eingebaut ist.The method is further developed by the fact that the functionalizing coating is made of a layer of oligonucleotide single strands on a titanium surface, or a titanium-containing surface, or that a part of the strands is partially incorporated into anodically formed oxide.
Diese Ausgestaltung ist insbesondere für Implantate vorteilhaft ausführbar. Alternativ zu einer Beschichtung einer metallischen Oberfläche wird die funktionalisierende Beschichtung aus einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer monokristallinen Siliziumoberfläche, auch als Wafer bezeichnet, ausgeführt. Nach dieser Ausgestaltung können sterilisierte Chips zur Herstellung von Sensoren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werden.This embodiment is advantageously feasible, in particular for implants. As an alternative to a coating of a metallic surface, the functionalizing coating is made of a layer of single-oligonucleotide strands on a monocrystalline silicon surface, also referred to as a wafer. According to this embodiment, sterilized chips for the production of sensors can be produced by the method according to the invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Beschichtung führt auch zur vorteilhaften Effekten, wenn die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer Oberfläche von Calciumphosphatphasen ausgeführt ist.The method according to the invention for the treatment of a coating also leads to advantageous effects when the functionalizing coating is in the form of a layer of oligonucleotide single strands on a surface of calcium phosphate phases.
Ebenso vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Beschichtung anwendbar, wenn die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer für Biomaterialanwendungen geeigneten Polymeroberfläche ausgeführt ist.The method according to the invention for treating a coating is also advantageously applicable if the functionalizing coating is designed in the form of a layer of oligonucleotide single strands on a polymer surface suitable for biomaterial applications.
Die Konzeption der Erfindung besteht darin, dass durch die Kombination zweier Parameter eine erhebliche Verbesserung der Funktionalität der behandelten Nukleotid- und/oder Nukleotidderivatstrukturen gegeben ist. The concept of the invention is that the combination of two parameters significantly improves the functionality of the treated nucleotide and / or nucleotide derivative structures.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung erfolgt eine Erzeugung der Beschichtung mit einem Überschuss der Nukleotid- oder Nukleotidderivatstränge. According to a first aspect of the invention, the coating is formed with an excess of the nucleotide or nucleotide derivative strands.
Eine Abkehr von konventionellen Verfahren zur Herstellung von funktionalisierenden Beschichtungen auf Titan oder einer Titanlegierung besteht nun in der Vermeidung von Spülprozessen zur Entfernung überschüssiger, nicht in die anodische Oxidschicht partiell eingebauter Einzelstränge, die im Weiteren auch Opferstränge genannt werden. Die Vermeidung von Spülprozessen ist neben der angeführten Beschichtungsart auch auf andere Beschichtungen, beziehungsweise Bindungsmechanismen von Beschichtungen, übertragbar.A departure from conventional methods for the production of functionalizing coatings on titanium or a titanium alloy is now in the avoidance of rinsing processes for the removal of excess, not partially integrated into the anodic oxide single strands, which are also called sacrificial strands. The avoidance of rinsing processes, in addition to the stated type of coating, can also be applied to other coatings or binding mechanisms of coatings.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung erfolgt eine Anreicherung der Atmosphäre mit Ethanol vor der Bestrahlung mittels ionisierender Strahlung. According to a second aspect of the invention, an enrichment of the atmosphere with ethanol takes place before irradiation by means of ionizing radiation.
Diese Maßnahmen führen einzeln angewendet bereits jeweils zu einer Verminderung des Verlustes der Funktionalität der Beschichtung durch die Bestrahlung. Die Kombination dieser Maßnahmen führt überraschenderweise zu einer weiteren Verbesserung des Ergebnisses.When used individually, these measures already lead in each case to a reduction in the loss of the functionality of the coating due to the irradiation. The combination of these measures surprisingly leads to a further improvement of the result.
Besonders vorteilhaft wird das Verfahren dadurch weitergebildet, wenn die bekannten Strategien zur Vermeidung von Sauerstoff und Wasser mit den erfindungsgemäßen Maßnahmen kombiniert werden.Particularly advantageously, the method is further developed by combining the known strategies for avoiding oxygen and water with the measures according to the invention.
Die angegebenen Maßnahmen führen zu einem Erhalt der Funktionalität, insbesondere der Hybridisierungsfähigkeit der Einzelstränge einer Oligonukleotidbeschichtung von bis zu 80% der immobilisierten Ankerstränge nach einer Gamma-Sterilisation.The specified measures lead to a preservation of the functionality, in particular the hybridization ability of the single strands of a Oligonucleotide coating of up to 80% of the immobilized anchor strands after gamma sterilization.
Damit schafft die erfindungsgemäße Behandlung von funktional beschichteten Oberflächen die Voraussetzung, um entwickelte Immobilisierungsverfahren nach dem Stand der Technik effektiv zur Funktionalisierung von Implantatoberflächen oder zur Sensorfertigung einsetzen zu können.Thus, the treatment according to the invention of functionally coated surfaces provides the prerequisite for effectively using developed immobilization methods according to the prior art for the functionalization of implant surfaces or for sensor production.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile von Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispieles.Further details, features and advantages of embodiments of the invention will become apparent from the following description of an embodiment.
Zum Nachweis der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise wurden Oligonukleotideinzelstränge zur Überprüfung der Effektivität der vorgeschlagenen Maßnahmen unter identischen Bedingungen an Titansubstrate adsorbiert und durch elektrochemische Polarisation regioselektiv partiell in anodische Titanoxidschichten eingebaut und dadurch immobilisiert. To demonstrate the effectiveness of the procedure according to the invention oligonucleotide individual strands were adsorbed under identical conditions to titan substrates to verify the effectiveness of the proposed measures and regioselectively partially incorporated by electrochemical polarization in anodic titanium oxide layers and thereby immobilized.
Ein Teil der Proben mit der funktionalisierenden Beschichtung wurde nachfolgend mit Acetatpuffer gespült, um gemäß der herkömmlichen Verfahrensweise nicht in die Oxidschicht eingebaute Oligonukleotide zu desorbieren und damit von der beschichteten Oberfläche zu entfernen. Die Ergebnisse der gespülten Proben sind auf der linken Seite des Diagramms in der Figur unter der Bezeichnung mit Desorption dargestellt.A portion of the samples having the functionalizing coating were subsequently rinsed with acetate buffer to desorb and thus remove from the coated surface oligonucleotides not incorporated into the oxide layer according to the conventional procedure. The results of the rinsed samples are shown on the left side of the diagram in the figure under the designation with desorption.
Dieser Schritt der Spülung und Entfernung nicht immobilisierter Opferstränge wurde bei den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Proben nicht vorgenommen. Auf der rechten Seite sind die Ergebnisse der Proben unter der Bezeichnung ohne Desorption dargestellt.This step of rinsing and removing non-immobilized sacrificial strands was not done in the samples treated by the method of the invention. On the right side the results of the samples are shown under the designation without desorption.
Anschließend wurden die Proben in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid (P2O5) getrocknet und in einer Glovebox unter Argon-Schutzgasatmosphäre in luftdicht schließende Glasgefäße, wie Duranflaschen mit einem Volumen von 100 ml, verpackt. Subsequently, the samples were dried in a desiccator over phosphorus pentoxide (P 2 O 5 ) and packed in a glovebox under argon inert gas atmosphere in airtight closing glass containers, such as 100 ml volume of Duran bottles.
Bei einem Teil der Proben wurde im Prozess der Verpackung ein Volumen von 1.500 μl wasserfreies Ethanol zugesetzt. Die dichtverschlossenen Proben wurden mit einer für Medizinprodukte vorgeschriebenen Dosis von 25–30 kGray mit Gamma-Strahlung sterilisiert.For some of the samples, a volume of 1,500 μl of anhydrous ethanol was added during the process of packaging. The sealed samples were sterilized with gamma radiation at a dose of 25-30 kGray prescribed for medical devices.
Eine Überprüfung der Wirksamkeit der Verfahrensweise wurde dadurch vorgenommen, dass die beschichteten Proben mit einem radioaktiv markierten Komplementärstrang (CS) beziehungsweise einem Nicht-Komplementärstrang (NS) unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert und die in der Folge dieses Prozesses auf den Proben vorliegenden Mengen an CS beziehungsweise NS durch Erfassung der Radioaktivität der Proben detektiert wurden. An examination of the effectiveness of the procedure was carried out by incubating the coated samples with a radioactively labeled complementary strand (CS) or a non-complementary strand (NS) under hybridization conditions and the amounts of CS or NS present on the samples as a result of this process Detection of the radioactivity of the samples were detected.
Die Ergebnisse in der Figur zeigen, dass in keinem Fall eine wesentliche Bindung von NS erfolgte, woraus zu schlussfolgern ist, dass die detektierte Bindung von CS durch Hybridisierung und nicht durch unspezifische Wechselwirkung erfolgt.The results in the figure show that in no case substantial binding of NS took place, from which it can be concluded that the detected binding of CS occurs by hybridization and not by unspecific interaction.
Weiterhin führt die Vorgehensweise ohne Desorption und Spülung zu einer nachweisbar deutlich größeren Menge an durch Hybridisierung immobilisiertem CS.Furthermore, the procedure without desorption and rinsing leads to a detectably significantly larger amount of CS immobilized by hybridization.
Innerhalb der Gruppe der ungespülten Proben führt die Vorgehensweise in der Kopplung mit Zugabe von Ethanol zur Detektion der größten Mengen an CS. Dabei ist der Fehlerbalken vergleichsweise klein, sodass ein sehr gut reproduzierbarer Oberflächenzustand vorliegen muss.Within the group of unsprayed samples, the approach coupled with the addition of ethanol results in the detection of the highest levels of CS. The error bar is comparatively small, so that a very well reproducible surface condition must be present.
Auch bei der Vorgehensweise mit Desorption führt die Gegenwart von Ethanol zu einer Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Messwerte, wenn auch auf relativ niedrigem Niveau.Also in the desorption approach, the presence of ethanol improves the reproducibility of the readings, albeit at a relatively low level.
Die Referenzproben wurden jeweils nicht sterilisiert. Die unter den verglichenen Bedingungen optimale Kombination liegt in der Kombination von Verzicht auf die Spülung und die damit verbundene Desorption der Opferstränge mit der Anreicherung von Ethanol in der Atmosphäre vor der Bestrahlung, was mit der Angabe mit EtOH Atm in der Figur dargestellt ist.The reference samples were each not sterilized. The optimum combination under the conditions compared lies in the combination of dispensing with the rinsing and the associated desorption of the sacrificial strands with the accumulation of ethanol in the atmosphere before irradiation, which is indicated by the indication EtOH Atm in the figure.
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