DE102009034779A1 - Synthetic analogs of bacterial lipopeptides and their use for the treatment and prevention of allergic diseases - Google Patents

Synthetic analogs of bacterial lipopeptides and their use for the treatment and prevention of allergic diseases

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DE102009034779A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, von einem Sporen-Keimungs-Protein der Spezies Bacillus cereus abgeleitete Lipopepitide mit immunstimulatorischer Wirkung, Verfahren zur Herstellung von synthetischen Analoga, ihre Verwendung als Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe zahlreicher allergischer Erkrankungen, vorzugsweise von allergischem Asthma, sowie Formulierungen von entsprechenden pharmazeutischen Mitteln. The present invention relates to novel, by a spore germination protein of the species Bacillus cereus-derived Lipopepitide with immunostimulatory activity, processes for the preparation of synthetic analogues, their use as active compounds for the therapy and prophylaxis of a variety of allergic disorders, preferably allergic asthma, as well as formulations of corresponding pharmaceutical agents.
Die bisherigen Ansätze zur Behandlung allergischer Erkrankungen sind sehr zeitaufwendig und häufig von zahlreichen Nebenwirkungen begleitet. Previous approaches to treat allergic diseases are very time consuming and often accompanied by numerous side effects. Oftmals kann damit nur eine kurzfristige Linderung der Krankheitssymptome erreicht werden. Often only a short-term relief of symptoms can thus be achieved. Eine zuverlässige Möglichkeit zur wirksamen Senkung des Allergierisikos ist bisher nicht bekannt. A reliable way to effectively reduce the risk of allergy is not yet known.
Die beschriebenen Analoga bakterieller Lipopeptide weisen eine gute immunstimulatorische Wirkung auf. The analogs described bacterial lipopeptides have a good immune stimulatory effect. Durch die Aktivierung der TLR-Rezeptoren 1, 2 und 6 tragen sie zur Reifung des Immunsystems und damit zur Senkung des Allergierisikos bei. By the activation of TLR receptors 1, 2 and 6, they contribute to the maturation of the immune system and thus to reduce the risk of allergy. Im Tiermodell konnte eine deutliche Reduzierung der Empfindlichkeit gegenüber allergenen Substanzen bei gleichzeitig guter Verträglichkeit nachgewiesen werden. In animal models, a significant reduction in sensitivity to allergenic substances could be detected with good tolerability.
Die Verbindungen sollen zur Terapie und Prophylaxe allergischer Erkrankungen eingesetzt werden. The compounds to be used for Terapie and prophylaxis of allergic diseases.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue, von einem Sporen-Keimungs-Protein der Spezies Bacillus cereus abgeleitete Lipopeptide mit immunstimulatorischer Wirkung, Verfahren zur Herstellung von synthetischen Analoga, ihre Verwendung als Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe zahlreicher allergischer Erkrankungen, vorzugsweise von allergischem Asthma, sowie Formulierungen von entsprechenden pharmazeutischen Mitteln. The present invention relates to novel, by a spore germination protein of the species Bacillus cereus-derived lipopeptides with immunostimulatory activity, processes for the preparation of synthetic analogues, their use as active compounds for the therapy and prophylaxis of a variety of allergic disorders, preferably allergic asthma, as well as formulations of corresponding pharmaceutical agents.
  • Erstmals wird die Immunstimulation durch Lipoproteine aus Bakterien-Sporen sowie durch synthetische Analoga derselben auf molekularer Ebene nachgewiesen. For the first time, the immune stimulation by lipoproteins from bacterial spores, as well as synthetic analogs thereof is detected at the molecular level.
  • Stand der Technik State of the art
  • Als Allergie wird eine überschießende Abwehrreaktion des Immunsystems auf bestimmte, unter normalen Umständen harmlose Reize aus der Umwelt (Allergene) bezeichnet. As allergy an excessive defense reaction of the immune system to certain harmless under normal circumstances, environmental stimuli (allergens) is called. Die allergische Reaktion äußert sich in typischen, durch entzündliche Prozesse ausgelösten Symptomen. The allergic reaction manifests itself in typical, caused by inflammation symptoms. Es kommt zu milden bis schwerwiegenden Beeinträchtigungen an verschiedenen Organen des Körpers. There will be mild to severe impairments of various organs of the body. Je nach Krankheitsform können verschiedene Organe einzeln oder in Kombination betroffen sein. Depending on the clinical form different organs can be affected individually or in combination. Während allergische Symptome an den Schleimhäuten typischerweise eher akut auftreten, können Erkrankungen wie Asthma bronchiale oder atopische Dermatitis einen chronischen Verlauf nehmen. While allergic symptoms in the mucous membranes typically occur more acute diseases such as asthma or atopic dermatitis can take a chronic course. In der Regel entwickeln Allergiker im Laufe der Krankheit Hypersensitivitäten gegen eine wachsende Anzahl von Substanzen. Usually allergies develop over the disease hypersensitivities against a growing number of substances.
  • Die Mechanismen bei der Entstehung von Allergien entsprechen den bei der Bekämpfung von Krankheitserregern ablaufenden pathophysiologischen Vorgängen. The mechanisms involved in the development of allergies correspond to the processes involved in the fight against pathogens pathophysiological processes. Nach den immunologischen Wirkmechanismen werden mehrere Subtypen der Allergie unterschieden. After the immunological mechanisms of more subtypes of the allergy can be distinguished. Dabei versteht man heute im engeren Sinne unter Allergie oft nur die Typ-I-Allergie. One often sees today in the narrower sense from allergy only the type I allergy. Diese Form wird durch eine unangemessene Reaktion des humoralen Immunsystems, dessen eigentliche Bestimmung in der Abwehr von Parasiten besteht, verursacht und ist durch die Bildung von Allergen-spezifischen Immunglobulin-E-Antikörpern (IgE) gekennzeichnet. This form is caused by an inappropriate response the humoral immune system, the actual determination is made in the defense against parasites, and is characterized by the formation of allergen-specific immunoglobulin E antibody (IgE).
  • Kleinste Mengen eines Allergens reichen aus, um die Sensibilisierung auszulösen. Minute amounts of allergens are enough to trigger the sensitization. Dabei werden die in den Körper gelangten Allergene von dendritischen Zellen aufgenommen und prozessiert. The entered the body allergens are absorbed and processed by dendritic cells. Die somit aktivierten dendritischen Zellen präsentieren über ihre MHC-II-Oberflächenrezeptoren Bruchstücke der Allergene an naive T-Zellen, die durch CD4-Costimulation und unter dem Einfluss unter anderem des Zytokins Interleukin-4 (IL-4) zu aktivierten T H 2-Zellen reifen. The thus activated dendritic cells present on their MHC-II-surface receptors fragments of allergens to naive T-cells by CD4 costimulation and under the influence of, inter alia, of the cytokine Interleukin-4 (IL-4) to activated T H 2 cells tire. Gleichzeitig kommen naive B-Zellen in Kontakt mit dem Allergen. At the same time naive B cells come into contact with the allergen. Treffen diese aktivierten B-Zellen dann auf die Allergen-spezifisch aktivierten T H 2-Zellen, so kommt es zu einer T-Zell-B-Zell-Interaktion, infolgedessen die B-Zelle zur IgE-sezernierenden Plasma-Zelle wird und beginnt, in großen Mengen Allergen-spezifisches IgE zu bilden. If these activated B cells then on allergen-specific activated T H 2 cells, so there is a T cell-B cell interaction, as a result, the B cell to IgE-secreting plasma cell and begins to make allergen-specific IgE in large amounts.
  • Die gebildeten IgE-Antikörper liegen zum Großteil gebunden auf den Zelloberflächen von Mastzellen und basophilen Granulozyten vor. The formed IgE antibodies are bound to a large extent prior to the cell surface of mast cells and basophils. Gleichzeitig werden sie auch an antigenpräsentierende Zellen gebunden und verstärken somit die Präsentation der Allergene an das Immunsystem. At the same time they are also bound to antigen presenting cells and thus enhance the presentation of allergens to the immune system. Die IgE-Konzentration im Serum ist dagegen vergleichsweise niedrig. The IgE concentration in serum, however, is comparatively low.
  • Die Sensibilisierungsphase resultiert in einer, durch die vermehrte Anzahl von Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern repräsentierten, erhöhten Allergiebereitschaft, läuft jedoch ohne Krankheitssymptome ab. The sensitization phase results in, represented by the increased number of allergen-specific IgE antibodies, increased susceptibility to allergies, but runs without disease symptoms. Kommt es jedoch zu einem zweiten Kontakt mit dem Allergen, gegen das die Sensibilisierung erfolgt ist, wird dieses durch die IgE-Antikörper auf den Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. However, if a second contact with the allergen against which the sensitization is carried out, this is bound by the IgE antibodies on the mast cells and basophils. Die folgende Ausschüttung von Histaminen, Zytokinen, Leukotrienen ua teils toxischen Verbindungen durch die aktivierten Leukozyten führt zur weiteren Aktivierung des Immunsystems und zur Anlockung von entzündungsauslösenden Eosinophilen. The following release of histamine, cytokines, leukotrienes, inter alia, partly toxic compounds by the activated leukocytes further leads to the activation of the immune system and for attracting inflammatory triggering eosinophils. Binnen kurzem kann eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, die Erschlaffung der glatten Muskulatur sowie die Stimulierung der kutanen Nervenendigungen beobachtet werden, die die typischen allergischen Symptome bei Heuschnupfen, Bindehautentzündung, allergischem Asthma, Nahrungsmittelallergien oder auch einem anaphylaktischen Schock bedingen. Before long, an increase in vascular permeability, the relaxation of smooth muscles as well as the stimulation of cutaneous nerve endings can be observed that determine the typical allergic symptoms of hay fever, conjunctivitis, allergic asthma, food allergies or anaphylactic shock.
  • Die Bindung von Allergen an die IgE-Antikörper auf den Mastzellen forciert gleichzeitig, unter Beteiligung des Zytokines IL-4 und der Expression von CD40-Liganden, die Produktion von weiteren Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern durch die Plasma-B-Zellen. Binding of allergen to the IgE antibody on the mast cells promoted at the same time, the participation of the cytokine, IL-4 and the expression of CD40 ligand, the production of further allergen-specific IgE antibodies by the plasma B cells.
  • Neben dieser Sofortreaktion können bei den meisten Allergien, va im fortgeschrittenen Stadium, chronische Symptome auftreten. In addition to this immediate reaction, with most allergies, especially in the advanced stage, chronic symptoms. Diese werden von der Aktivierung der Allergen-spezifischen T-Zellen durch antigenpräsentierende dendritische Zellen sowie von der IL-5 vermittelten chemotaktischen Rekrutierung und Einwanderung von Eosinophilen, Basophilen und Monozyten an den Ort der allergischen Reaktion bestimmt. These are determined by the activation of allergen-specific T-cells by antigen presenting dendritic cells as well as the IL-5-mediated chemotactic recruitment and migration of eosinophils, basophils, and monocytes to the site of allergic reaction. Gleichzeitig werden weitere, besonders langlebige Mastzellen aktiviert. At the same time further, particularly durable mast cells are activated. Dieser chronische Verlauf ist von der aktuellen Präsenz des Allergens unabhängig und trägt zur Aufrechterhaltung der entzündlichen Immunreaktion bei. This chronic course is independent of the current presence of the allergen and contributes to the maintenance of the inflammatory immune response.
  • Zu den Ursachen allergischer Erkrankungen, va der stetigen Zunahme der Zahl der Betroffenen, sind bisher keine schlüssigen Erklärungen erbracht worden. Among the causes of allergic diseases, especially the steady increase in the number of people affected, no conclusive explanations have been provided so far. Eine Reihe von Faktoren ist jedoch in den näheren Fokus gerückt. A number of factors, however, moved into closer focus. Unbestritten gibt es eine genetische Disposition zu einem erhöhten Allergierisiko. Undeniably, there is a genetic predisposition to an increased risk of allergies. Auch die veränderten Umweltbedingungen mit zunehmender Umweltverschmutzung, sowie Klimaveränderungen mit den damit verbundenen Verschiebungen in Flora und Fauna kommen als Ursache in Betracht. The changing environmental conditions with increasing pollution, and climate change with the associated shifts in flora and fauna are a possible cause. Eine wichtige Rolle wird auch den veränderten Lebens- und Ernährungsgewohnheiten zugesprochen. An important role is also awarded to the changing lifestyles and eating habits. Beispielsweise finden zunehmend künstliche Zusätze in Lebensmitteln und Pflegprodukten Verwendung. For example, are increasingly artificial additives in foods and Pflegprodukten use. Neuartige Arzneimittel mit oftmals unbekannten Nebenwirkungen werden zugelassen. Novel drugs with unknown side effects often are admitted.
  • Ein wesentlicher Schritt bei der Entstehung der Allergien ist die Prägung des Immunsystems, insbesondere die Reifung bzw. Differenzierung der T H 1- und T H 2-Zellen. An essential step in the development of allergies is the coining of the immune system, particularly the maturation and differentiation of T H 1 and T H 2 cells. Für die Bildung der allergievermittelnden IgE-Antikörper sind IL-4 produzierende T H 2-Zellen notwendig, während Interferon-γ produzierende T H 1-Zellen auf die Bildung von IgE-Antikörpern hemmend wirken. IL-4 producing T are H 2 cells is essential for the formation of the allergy-promoting IgE antibody, while interferon-γ producing T H 1 cells act on the formation of IgE antibodies retardant. Für eine funktionierende Immunabwehr sind beide Zelltypen in einem ausgewogenen Verhältnis notwendig. For a functioning immune defense both cell types needed in a balanced relationship.
  • Man geht davon aus, dass das Immunsystem während der Schwangerschaft eher T H 2-lastig ist und in den ersten Lebensjahren des Kindes durch den Kontakt mit mikrobiellen Komponenten, va Bakterien, in die Richtung einer effizienten zellbasierten T H 1-Antwort gelenkt wird, die weniger mit allergischen Reaktionen assoziiert ist. It is believed that the immune system is 2-heavy during pregnancy more T H and is directed into the first years of life of the child by contact with microbial components, especially bacteria, in the direction of an efficient cell-based T H 1 response, the is less associated with allergic reactions.
  • Durch das veränderte urbane Wohnumfeld, das Leben in Kleinfamilien und die Verwendung medizinisch wirksamer und desinfizierender Substanzen schon in normalen Reinigungsmitteln, hat die Belastung durch bakterielle und parasitäre Krankheitskeime jedoch stark abgenommen. By the changed urban living environment, living in small families and the use of medically effective and disinfectant substances even in normal detergents, the burden has decreased dramatically due to bacterial and parasitic pathogens. Deshalb sieht eine große Zahl von Wissenschaftlern die Ursachen der beobachteten Zunahme allergischer Erkrankungen in der mangelnden Aktivierung des Immunsystems im Kleinkindalter („Hygienehypothese”). Therefore, a large number of scientists sees the causes of the observed increase in allergic diseases in the lack of activation of the immune system in infancy ( "hygiene hypothesis").
  • Die Möglichkeiten zur Prävention von Neusensibilisierungen sowie zur Therapie von bereits ausgeprägten Allergien sind begrenzt. The possibilities for the prevention of sensitizations and for the therapy of already pronounced allergies are limited. Neben der symptomatischen Therapie von Allergiepatienten wird einerseits die weitestgehende Vermeidung des Allergens empfohlen. In addition to the symptomatic treatment of allergic patients the most extensive avoidance of the allergen on the one hand recommended.
  • Im Rahmen der Hyposensibilisierung erfolgt dagegen die direkte Konfrontation mit abgeschwächten Dosen des betreffenden Allergens ( In the context of immunotherapy, however, the direct confrontation takes place with attenuated doses of the relevant allergen ( ; ; ; ; ; ; ). ). Dieser immuntherapeutische Ansatz ist jedoch unterschiedlich erfolgreich. However, this immunotherapeutic approach differs successful. Vor allem bei dem häufig auftretenden bronchialen Asthma ist diese Therapieform eher unwirksam. Especially in the frequently occurring bronchial asthma this therapy is rather ineffective.
  • Andere Ansätze verfolgen, aufbauend auf der „Hygienehypothese”, die Unterstützung des T H 1/T H 2-Shifts durch eine Konfrontation mit immunmodulierenden, krankheitsunabhängigen Substanzen. Pursue other approaches, building on the "hygiene hypothesis," the support of the T H 1 / T H 2 shifts by a confrontation with immunomodulatory, disease independent substances.
  • In epidemiologischen Studien konnte beispielsweise der Einfluss einer ländlichen Umgebung, speziell der Kontakt zu Tieren, auf die Verminderung des Risikos zur Ausprägung von allergischem Asthma und Heuschnupfen bei Kindern belegt werden. Epidemiological studies have, for example, the influence of a rural environment, especially the contact with animals, be assigned to the reduction of the risk to the expression of allergic asthma and hay fever in children. Eine prominente Studie zu diesem Thema ist die ALEX-Studie ( A prominent study on this subject is the ALEX study ( ). ).
  • In In WO 2001/049319 WO 2001/049319 wird die Herstellung einer wässrigen Suspension von Mikroorganismen aus Stallluft und deren Verwendung zur prophylaktischen Behandlung von Kindern mit erhöhtem Allergierisiko oder ersten Anzeichen eines Allergiesyndroms beschrieben. preparing an aqueous suspension of microorganisms from air stable and their use for the prophylactic treatment of children is described with an increased risk of allergy or first signs of allergy syndrome. WO 2006/029685 WO 2006/029685 beschreibt einen wässrigen Extrakt aus Stallstaub. describes an aqueous extract from barn dust. Im Mausmodell konnten durch die Inhalation dieses Extraktes eine deutliche Reduktion der Symptome des allergischen Asthmas und die Unterdrückung der T H 2-dominierten Immunantwort gezeigt werden ( In the mouse model, a significant reduction in the symptoms of allergic asthma and the suppression of T H 2-dominated immune response could be demonstrated by the inhalation of this extract ( ). ). Welche Substanzen aus der Vielzahl von potentiell immunstimulatorisch wirksamen Bestandteilen von Bakterien, Viren, Pilzen, Pflanzen und Tieren letztendlich den Schutzeffekt auslösen, ist jedoch bis heute nicht bekannt. eventually trigger which substances from the plurality of potentially immunostimulatory effective components of bacteria, viruses, fungi, plants and animals the protective effect, however, is not known to this day.
  • Während diese beiden Arbeiten von einer begrenzten Anzahl von Behandlungen ausgehen, weisen andere Studien auf die Notwendigkeit der lebenslangen Exposition in der ländlichen Umgebung hin, um eine effektive Prophylaxe zu ermöglichen ( While these two works come from a limited number of treatments that have other studies on the need for lifelong exposure in the countryside out to allow an effective prophylaxis ( ). ).
  • Im Vergleich zu dieser relativ unspezifischen Mikroben-Belastung verfolgen einige andere Behandlungsansätze die gezielte Stimulation der Immunantwort über die Toll-like-Rezeptoren (TLR). Compared to these relatively non-specific microbial load some other treatment approaches are targeted stimulation of the immune response via Toll-like receptors (TLR).
  • TLR sind Strukturen des angeborenen Immunsystems. TLR are structures of the innate immune system. Als auf den Zellen des Immunsystems gebundene Membranproteine dienen sie der Erkennung von funktionalen Strukturen, welche ausschließlich auf oder in Krankheitserregern vorkommen. When bound to the cells of the immune system proteins, they serve the detection of functional structures, which occur exclusively on or in pathogens. Jeder der bisher 13 (für Mammalia) bekannten Rezeptoren erkennt ein ganz spezifisches Muster einer Erregerklasse. Each of the previously known 13 (for Mammalia) receptors recognize a very specific pattern of an excitation class. So ist TLR 1 in Verbindung mit TLR 2 als Rezeptor für Zellwandbestandteile von Bakterien beschrieben. Thus TLR 1 is described in conjunction with TLR 2 as a receptor for cell wall components of bacteria. TLR 2 erkennt gram-positive Bakterien, wie z. TLR2 recognizes gram-positive bacteria such. B. Mykobakterien. B. mycobacteria. In Verbindung mit TLR 6 reagiert dieser Rezeptor auf Lipopeptide von Mykoplasmen und Zymosan aus Hefen und Pilzen. In connection with TLR 6 of this receptor responds to lipopeptides from mycoplasma and zymosan from yeasts and fungi. Weitere TLRs erfassen virale Komponenten in den Zellen (TLR 3, 7, 9), andere bakterielle Bestandteile wie z. Other TLRs detect viral components in the cells (TLR 3, 7, 9), other bacterial components such. B. Lipopolysaccharide aus der Zellmembran gram-negativer Bakterien (TLR 4) oder Flagellin (TLR 5) ( B. lipopolysaccharides from the cell membrane of gram-negative bacteria (TLR 4) or flagellin (TLR 5) ( ). ).
  • Über eine biochemische Signalkaskade wird in den TLR-Trägerzellen ein entsprechender intrazellulärer Mechanismus, meist die Expression bestimmter, der Antigen-spezifischen Abwehr von Krankheitserregern dienender Gene, ausgelöst. A biochemical signaling cascade in the TLR-carrier cells a corresponding intracellular mechanism, usually the expression of specific, antigen-specific defense against pathogens serving genes triggered. Infolgedessen wird in der ersten Stufe die unspezifische Immunantwort initiiert, der im weiteren Verlauf mit der Bildung spezifischer Antikörper die Reaktion durch das erworbene Immunsystem folgt. As a result, in the first stage the non-specific immune response is initiated following the further course of the formation of specific antibodies by the acquired immune system the reaction.
  • Dendritische Zellen, denen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Allergien beigemessen wird, tragen in der Regel alle Typen der TLR. Dendritic cells, which play an important role in the development of allergies is attached, usually wear all types of TLR. Bei ihrer Aktivierung exprimieren sie die entsprechenden MHC-Komplexe und costimulierenden Enzyme. When activated, they express the appropriate MHC complexes and costimulatory enzymes. In den Lymphknoten stimulieren sie die Reifung der Antigen-spezifischen T-Zellen. In the lymph node they stimulate the maturation of antigen-specific T cells.
  • Eine gezielte Stimulation bestimmter TLR sollte deshalb geeignet sein, die Reifung des Immunsystems zu unterstützen, um später eine angemessene Antwort des Organismus auf Fremdstoffe zu induzieren. Targeted stimulation of certain TLR should therefore be suitable to support the maturation of the immune system to induce later an adequate response of the body to foreign substances.
  • Als ein solcher Ansatz wird z. As such an approach is for. B. die Behandlung und Prophylaxe von Allergien mit spezifischen, von für den Menschen nicht pathogenen Mikroorganismen abgeleiteten DNS-Abschnitten, bevorzugt Oligonukleotiden, die mindestens eine nicht-methylierte CpG-Sequenz enthalten beschrieben. For example, the treatment and prophylaxis of allergies with specific, derived from non-pathogenic microorganisms to human DNA segments, preferably oligonucleotides described at least one non-methylated CpG sequence contained. Oftmals werden diese Wirkstoffe mit weiteren Bestandteilen wie Allergenen, Adjuvantien und viralen Komponenten kombiniert. Often these drugs are combined with other ingredients such as allergens, adjuvants and viral components. Als bakterielle Komponenten werden bei diesem Therapie-Ansatz sehr häufig Mykobakterien-Stämme beschrieben. As bacterial components very common mycobacteria strains are described in this therapeutic approach. Die hiervon abgeleiteten kurzen DNS-Sequenzen werden vom Toll-like-Rezeptor 9 der dendritschen Zellen erkannt und stimulieren die T H 1-Immunantwort bei gleichzeitiger Inhibierung der allergiekorrelierten T H 2-Reaktion ( The derived therefrom short DNA sequences are recognized by Toll-like receptor 9, the dendritic cells and stimulate T H 1 immune response, while inhibiting the allergy correlated T H 2 response ( US 2006/0217328 US 2006/0217328 , . US 2006/0251677 US 2006/0251677 , . WO 2008/014979 WO 2008/014979 , . WO 2007/095976 WO 2007/095976 ). ).
  • Drei dieser Präparate befinden sich momentan in klinischen Studien. Three of these drugs are currently in clinical trials. Die Firma Cytos verwendet bei CYT003-QbG10 eine Zusammensetzung aus einem virus-ähnlichen Partikel, einer immunstimulierenden DNS-Sequenz aus Mycobacteria-Spezies, einem nicht spezifizierten TLR-Liganden und gegebenenfalls einem Antigen, vorzugsweise einem Allergen wie z. The company Cytos used a composition comprising a virus-like particle, of an immunostimulatory DNA sequence of Mycobacteria species, an unspecified TLR ligand and optionally an antigen, preferably an allergen such at CYT003-QbG10. B. Pollenextrakt, zur Behandlung von Allergien und Asthma ( As pollen extract (used to treat allergies and asthma WO 2005/004907 WO 2005/004907 , Cytos-Pressemitteilung vom 13.01.2009). Cytos press release of 13.01.2009). Dynavax testet mit TOLAMBA ® und AIC zwei Präparate aus einer kurzen synthetischen DNS-Sequenz, die mit dem Hauptallergen des Traubenkrautes konjugiert ist, zur Behandlung des von Traubenkraut ausgelösten Heuschnupfens ( Dynavax tested with TOLAMBA ® and AIC two preparations of a short synthetic DNA sequence that is conjugated with the major allergen of grape herb, (for the treatment of the induced by ragweed hay fever WO 2006/096497 WO 2006/096497 , Dynavax-Pressemitteilungen vom 06.03.2006 und 04.10.2006) und von allergischem Asthma ( , Dynavax press releases dated 06.03.2006 and 04.10.2006) and allergic asthma ( WO 2008/073661 WO 2008/073661 ). ).
  • Vor dem Hintergrund der Hygienehypothese sowie zur Unterstützung des T H 1/T H 2-Shifts und damit zur Prophylaxe und Therapie von Allergien bieten sich auch die TLR 1, 2 und 6 an. In light of the hygiene hypothesis and to support the T H 1 / T H 2 shifts and for the prophylaxis and treatment of allergies also TLR 1, 2 and 6 offer. Die bei ihrer Aktivierung exprimierten Zytokine entsprechen eher dem für die Ausdifferenzierung der T H 1-Lymphozyten-Zellen notwendigen Muster. The expressed upon activation cytokines correspond more to the extent necessary for the differentiation of T H 1-lymphocyte cell pattern. Zudem findet man TLR 2 auch in den Epithelien der Luftröhre und der Lungenbläschen, was diesen Rezeptor vor allem für die Behandlung von allergischem Asthma qualifiziert ( In addition, one finds TLR2 in the epithelial cells of the trachea and the alveoli, what qualifies this receptor especially for the treatment of allergic asthma ( ). ).
  • Zur Stimulierung des TLR 2-Rezeptors werden oftmals ganze Mikroorganismen, Teile von Mikroorganismen oder von diesen abgeleitete Lipoproteine bzw. Lipopeptide eingesetzt ( whole microorganisms, parts of microorganisms or derived from these lipoproteins and lipopeptides are often used to stimulate the TLR2 receptor ( EP 1387167 EP 1387167 , . WO 2004/092210 WO 2004/092210 , . US 2008/0241139 US 2008/0241139 ). ). Bevorzugt werden für den Menschen nicht pathogene Bakterien-Stämme wie Borrelia spp, Escherichia spp, Heliobacter spp, Leptospira spp, Listeria spp, Mycobacterium spp, Mycoplasma spp, Pseudomonas spp, Salmonella spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, besonders bevorzugt Bacillus thuringiensis, Borrelia burgdorfei, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma fermentans, Treponema pallidium und Escherichia coli verwendet. Borrelia are preferred for humans, non-pathogenic bacterial strains, such as Borrelia spp, Escherichia spp, Helicobacter spp, Leptospira spp, Listeria spp, Mycobacterium spp, Mycoplasma spp, Pseudomonas spp, Salmonella spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, particularly preferably Bacillus thuringiensis, burgdorfei, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma fermentans, Treponema pallidium and Escherichia coli. Auch Lipopolysaccharide werden für eine selektive Immunstimulation der TLR-Rezeptoren zur Behandlung von Allergien beschrieben ( Also lipopolysaccharides are described for selective stimulation of the immune TLR receptors for the treatment of allergies ( WO 2008/059035 WO 2008/059035 , . US 2008/0119145 US 2008/0119145 ). ).
  • WO 2004/074435 WO 2004/074435 beansprucht die gezielte Beeinflussung des Differenzierungsprozesses von T-Helfer-Zellen über die TLR von dendritischen Zellen. claims the targeted modulation of the differentiation process of T-helper cells via TLR of dendritic cells. Durch die Applikation eines TLR-Agonisten, in Kombination mit synthetischen Peptiden, Nanopartikeln, virenähnlichen Partikeln oder T-Zell- oder B-Zell-Epitopen in gebundener/ungebundener Form, soll die Behandlung von Immundefekten und Allergien ermöglicht werden. By the application of a TLR agonist, in combination with synthetic peptides, nanoparticles, virus like particles or T-cell or B-cell epitopes in a bound / unbound form, the treatment of immune defects and allergies should be made possible. Als TLR-Agonisten werden Mikroben wie Viren, Bakterien, Parasiten sowie Teile oder molekulare Komponenten davon eingesetzt. As TLR agonists microbes such as viruses, bacteria, parasites as well as parts or molecular components thereof are used.
  • TLR können auch durch synthetische Verbindungen aktiviert werden. TLR can also be activated by synthetic compounds. So reagiert das TLR 1/TLR 2-Heterodimer ebenfalls auf triacylierte synthetische Lipopeptide wie die Pam 3 Cys-Derivate ( Thus, the TLR 1 / TLR2 heterodimer is also responsive to triacylated synthetic lipopeptides such as Pam 3 Cys-derivatives ( EP 0210412 EP 0210412 ). ). TLR 6/TLR 2-Heterodimere sind sensitiv für diacylierte synthetische Lipopeptide wie die Pam 2 Cys-Derivate ( TLR 6 / TLR2 heterodimers are sensitive to diacylated synthetic lipopeptides such as Pam 2 Cys-derivatives ( EP 0519327 EP 0519327 ). ).
  • Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurden bereits verschiedene, acylierte Lipopeptide enthaltende Medikamente und Impfstoffe zur Verwendung im Rahmen von immunmodulatorischen Therapien entwickelt. Based on these findings, various, acylated lipopeptides drugs and vaccines for use in the context of immunomodulatory therapies containing already developed. Typischerweise werden hierzu die Lipopeptide, bevorzugt Pam 3 Cys- und Pam 2 Cys-Derivate als TLR 2 targetierende Substanz, mit einer antigenen Komponente für B-Lymphozyten oder für cytotoxische T-Zellen sowie weiteren Hilfsstoffen kombiniert, um synergistische Effekte zu induzieren ( Typically, for this purpose the lipopeptides Pam 3 Cys and preferably Pam 2 Cys-derivatives as TLR2 targetierende substance combined with an antigenic component for B-lymphocytes or cytotoxic T-cells and other adjuvants to induce synergistic effects ( WO 2007/103322 WO 2007/103322 , . WO 2006/104389 WO 2006/104389 , . US 7,387,271 US 7,387,271 ). ). Auch Liposomen, die Lipopeptide, bevorzugt Pam 3 Cys, neben Antigenen und evtl. Zytostatika enthalten, werden für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen und Allergien beansprucht ( Also, liposomes containing lipopeptides Pam 3 Cys preferred, in addition to antigens, and possibly cytostatics, are claimed for the treatment of various diseases and allergies ( WO 2005/063201 WO 2005/063201 , . WO 2005/063288 WO 2005/063288 ). ).
  • Ebenfalls werden Konjugate aus Pam 3 Cys-Derivaten und Antigenen als Impfstoffe beschrieben. Conjugates are also described from Pam 3 Cys-derivatives and antigens as vaccines. So in so in WO 2007/078879 WO 2007/078879 eine Kombination aus einem Membran-Proteinen des Influenza-Virus und einem Pam 3 Cys-Derivat, in a combination of a membrane protein of the influenza virus and a Pam 3 Cys-derivative in WO 2007/079448 WO 2007/079448 ein lineares Tandem-Molekül aus einem B-Zell-Epitop, einem T-Zell-Epitop und Pam 3 Cys oder in a linear tandem molecule from a B-cell epitope, a T cell epitope and Pam 3 Cys or WO 2004/014956 WO 2004/014956 und and WO 2004/014957 WO 2004/014957 ein Molekül aus einem B-Zell- bzw. CTL-Epitop und einem T-Helfer-Zell-Epitop, die durch ein Pam 3 Cys-Lipopeptid miteinander verbrückt sind. a molecule from a B-cell or CTL epitope and a helper T cell epitope, which are bridged together by a Pam 3 Cys-lipopeptide.
  • Zur Behandlung von bereits ausgeprägten allergischen Erkrankungen wird im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Methoden zur Stimulation der TLR-Rezeptoren die Unterdrückung der TLR 2-vermittelten Immunreaktion und der damit verbundenen Entzündungsreaktion vorgeschlagen ( For the treatment of allergic diseases already pronounced is the suppression of TLR proposed 2-mediated immune response and the associated inflammatory response, in contrast to the previously described methods to stimulate TLR receptors ( WO 2005/039504 WO 2005/039504 , . WO 2007/047396 WO 2007/047396 , . WO 2005/115430 WO 2005/115430 , . WO 2005/067959 WO 2005/067959 ). ). In In WO 2007/098371 WO 2007/098371 wird die Linderung der Entzündungsreaktionen über den TLR 5 mittels Flagellin-Präparaten erreicht. alleviation of inflammatory reactions via the TLR 5 is achieved by means flagellin preparations. WO 2007/118901 WO 2007/118901 beschreibt die gezielte Unterdrückung der T H 2-korrelierten Immunantwort durch ein tracheales Cytotoxin oder ein Muramyl-Tetrapeptid unter Zusatz von Pam 3 Cys zur Behandlung von Allergien, Asthma und anderen T H 2-korrelierten Erkrankungen. the selective suppression of the T H describes 2-correlated immune response through a tracheal cytotoxin or a muramyl tetrapeptide with the addition of Pam 3 Cys for the treatment of allergies, asthma and other T H 2-correlated diseases.
  • Auch zur Behandlung von allergischen Erkrankungen auf der Ebene der Allergen-spezifischen Antikörper werden Pam 3 Cys-Konjugate eingesetzt. Also for the treatment of allergic diseases at the level of allergen-specific antibodies are used Pam 3 Cys-conjugates. WO 1996/12740 WO 1996/12740 beschreibt ein synthetisches lineares Konjugat aus einem Lipopeptid als Immunstimulator, einem bakteriellen T-Helfer-zell-Epitop und einem immunogenen Peptid, das an Membran-gebundenes IgE binden kann. describes a conjugate of a synthetic linear lipopeptide as an immune stimulator, a bacterial T-helper cell epitope and an immunogenic peptide that can bind to membrane-bound IgE.
  • Pharmazeutische Mittel mit einem Oligopeptid, das kovalent an ein Lipid gekoppelt ist, bevorzugt an ein Pam 2 Cys- oder Pam 3 Cys-Derivat, ohne weitere Zusätze von spezifischen Antigenen oder B-Zell- bzw. T-Zell-Epitopen, werden sehr wenig beschrieben. Pharmaceutical preparations with an oligopeptide covalently linked to a lipid, preferably on a Pam 2 Cys or Pam 3 Cys-derivative, without further additions of specific antigens or B-cell or T-cell epitopes are very little described. In den meisten Fällen wird Pam 3 Cys lediglich als stimulierendes Adjuvans in eine Mischung aus Antigenen, Epitopen und Mikroorganismen bzw. Bestandteilen von Mikroorganismen gegeben. In most cases, Pam 3 Cys is given only as a stimulating adjuvant to a mixture of antigens, epitopes and microorganisms or ingredients of microorganisms. Die kovalente Kopplung erfolgt, wenn überhaupt, dann in der Regel bei Wirkstoffen zur spezifischen Immunisierung über die Aktivierung des adaptiven Immunsystems. The covalent coupling takes place, if at all, then generally from active ingredients for specific immunization via the activation of the adaptive immune system.
  • Am nächsten kommen dieser Konstruktion noch die in The next of this construction, there are the in WO 1996/22067 WO 1996/22067 beschriebenen Konjugate mit einer Bibliothek von kurzen Bruchstücken eines CTL-Epitopes, die kovalent an ein Pam 3 Cys-Derivat gekoppelt sind und die in described conjugates with a library of short fragments of a CTL epitope covalently coupled to Pam 3 Cys, a derivative and in WO 2007/078879 WO 2007/078879 beschriebenen kovalenten Verbindungen aus einem Membran-Protein des Influenza-Virus und einem Pam 3 Cys-Derivat, zur Verwendung als Impfstoffe. covalent compounds described of a membrane protein of the influenza virus and a Pam 3 Cys-derivative for use as vaccines. Von From wird ein diacyliertes Dihydroxypropylcystein-Peptid mit einem von Mykoplasma fermentans abgeleiteten Peptid (MALP-2) für verschiedene Anwendungen in der Immunologischen Medizin beansprucht ( a diacylated Dihydroxypropylcystein peptide derived from a Mycoplasma fermentans peptide (MALP-2) for different applications in the immunological claimed medicine ( WO 1998/027110 WO 1998/027110 , . WO 1999/059610 WO 1999/059610 , . WO 2002/028887 WO 2002/028887 , . WO 2003/084568 WO 2003/084568 , . WO 2004/108145 WO 2004/108145 ). ). US 5,688,771 US 5,688,771 beschreibt die Kopplung von Peptidoglykanen mit einer lipophilen Alkyl-Kette als Immunmodulator. describes the coupling of peptidoglycans having a lipophilic alkyl chain as an immunomodulator.
  • Anwendungen solcher Verbindungen zur Therapie und Prophylaxe von allergischen Erkrankungen über die gezielte Modulation der TLR-Rezeptoren wurden bisher nicht beschrieben. Applications such compounds for the treatment and prevention of allergic diseases on the targeted modulation of TLR receptors have not been described.
  • Aufgabenstellung task
  • Allergien sind ein großes Gesundheitsproblem mit einem facettenreichen Krankheitsbild. Allergies are a major health problem with a multi-faceted disease. In den Industrieländern ist in den letzten Jahren eine eindeutige Zunahme der Häufigkeit allergischer Erkrankungen beobachtet worden. In industrialized countries in recent years a clear increase in the incidence of allergic diseases has been observed. Heute leiden über 20% der Bevölkerung in den westlichen Industrienationen an allergischen Erkrankungen (World Health Organization 2002. Prevention of Allergy and Allergic Asthma). Today, more than 20% of the population in the Western industrial nations from allergic diseases (World Health Organization 2002 Prevention of Allergy and Allergic Asthma). Allein in Europa gibt es 80 Millionen Allergiker (GA 2 LEN-Global Allergy and Asthma European Network, www.ga2len.net, 2008). In Europe alone there are 80 million allergy sufferers (GA 2 LEN Global Allergy and Asthma European Network, www.ga2len.net, 2008). Bis 2025 werden ca. 400 Millionen Menschen weltweit an allergischem Asthma leiden. By 2025, about 400 million people will suffer from allergic asthma worldwide. Besonders besorgniserregend ist die Zunahme des Anteils der betroffenen Kinder. Of particular concern is the increase in the proportion of affected children.
  • Üblicherweise werden drei Ansätze zur Behandlung allergischer Erkrankungen verfolgt: i) Verhindern von Allergenkontakt soweit möglich, ii) Verordnung von Medikamenten, die die Krankheitssymptome lindern und iii) die herkömmliche Immuntherapie, auch als Desensibilisierung bezeichnet. There are three general approaches are used to treat allergic diseases: i) avoidance of the allergen whenever possible, ii) regulation of drugs that relieve the symptoms and iii) denotes the conventional immunotherapy, also known as desensitization.
  • Die medikamentöse Symptombehandlung mit Kortisonpräparaten und Histaminhemmern ermöglicht nur eine kurzfristige Zustandsbesserung, was für die Patienten eine wiederholte Anwendung, oft sogar mehrmals täglich, bedeutet. Symptomatic medication with cortisone and antihistamines is a momentary state of improvement, what the patient repeated use, often several times a day means. Außerdem sind die herkömmlichen Wirkstoffe oft mit beträchtlichen Nebenwirkungen behaftet. In addition, the conventional active ingredients are often subject to considerable side effects. Die Desensibilisierung andererseits, ist sehr zeitaufwändig. Desensitization other hand, is very time consuming. 3–5 Jahre Behandlungsdauer mit bis zu 80 Allergeninjektionen sind für die Patienten recht unangenehm, so dass nur wenige Allergiker diese Therapieform nutzen. 3-5 years of treatment with up to 80 allergen injections are quite uncomfortable for the patient, so that only few allergy sufferers take advantage of this form of therapy.
  • Auch gibt es keine effektiven Möglichkeiten der Prophylaxe, um bereits das Risiko für eine Allergieentstehung wirksam zu senken. Also, there are no effective ways of prophylaxis to already reduce the risk of allergic responses effectively. Somit besteht ein großer Bedarf nach neuen wirkungsvollen Präventions- und Behandlungsstrategien. Thus, there is a great need for new effective prevention and treatment strategies.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue pharmazeutische Wirkstoffe zur Vorbeugung und Behandlung von allergischen Erkrankungen, bevorzugt von allergischem Asthma, zur Verfügung zu stellen, welche die genannten Nachteile der herkömmlichen Mittel umgehen. Object of the present invention is therefore to provide new pharmaceutical agents for the prevention and treatment of allergic diseases, preferred to make of allergic asthma are available which avoid the aforementioned disadvantages of the conventional means. Dabei ist der auf der „Hygienehypothese” basierende Weg über die Aktivierung und Reifung des angeborenen Immunsystems ein völlig neuer Ansatz. Here, the based on the "hygiene hypothesis" way over the activation and maturation of the innate immune system is a completely new approach.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch eine Auswahl erstmals beschriebener, von der Struktur eines Keimungs-Proteins aus den Sporen der Spezies Bacillus cereus abgeleiteter Lipopeptide, mit immunstimulatorischer Wirkung sowie deren synthetische Analoga mit der allgemeinen Struktur, wie sie in Anspruch 1 dargestellt ist. The object is achieved by a selection for the first time described by the structure of a germination-protein from the spores of the species Bacillus cereus-derived lipopeptides with immune stimulatory effect, as well as their synthetic analogues with the general structure as shown in claim. 1 Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verbindung sind in den Ansprüchen 2 bis 13 beansprucht. Preferred embodiments of this compound are claimed in claims 2 to. 13 Die Ansprüche 14 und 15 betreffen ein Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäßen Verbindungen, die Ansprüche 16 und 17 die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und die Ansprüche 18 bis 29 pharmazeutische Präparate, enthaltend die erfindungsgemäßen Verbindungen, deren Herstellung und Verwendung. The claims 14 and 15 relate to a production method for the compounds of the invention, the claims 16 and 17, the use of the compounds according to the invention and the claims 18 to 29, pharmaceutical preparations containing the inventive compounds, their preparation and use. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the description.
  • Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in einer Serie aus von einem Sporen-Keimungs-Protein der Spezies Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptiden und deren synthetischen Analoga, wobei im Hinblick auf die immunmodulatorische Wirkung dieser Verbindungen die Stereoselektivität besonders zu berücksichtigen ist. The essential feature of the present invention consists in a series of derived from a spore germination protein of the species Bacillus cereus lipopeptides, and their synthetic analogues, and in relation to the immunomodulatory effect of these compounds, the stereoselectivity is particularly taken into account. Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals die immunstimulatorische Wirkung von Bazillen-Sporen auf molekularer Ebene nachgewiesen. With the present invention, the immunostimulatory effect of bacilli spores on a molecular level is detected for the first time. Die abgeleiteten Peptide bzw. Sequenz-Motive sind bisher keinem immunologisch aktiven Epitop zugeordnet worden. The peptides or derived sequence motifs have been previously assigned to any immunologically active epitope.
  • Die Erfindung beinhaltet weiterhin die Nutzung der immunstimulatorischen Wirkung dieser Verbindungen zur Simulation einer natürlichen Umgebung zum Zweck der Reifung des Immunsystems und aufbauend darauf deren Nutzung zur Therapie und Prophylaxe zahlreicher allergischer Erkrankungen bei Mensch und Tier, vorzugsweise von allergischem Asthma. The invention also includes the use of the immunostimulatory effect of these compounds to simulate a natural environment for the purpose of maturation of the immune system and, based on their use for the treatment and prophylaxis of many allergic diseases in humans and animals, preferably of allergic asthma.
  • Detaillierte Beschreibung Detailed description
  • In genetischen Studien konnten verschiedene, die Asthma-Anfälligkeit modulierende TLR identifiziert werden. In genetic studies, various asthma susceptibility modulating TLR were identified. Damit wird eine Verbindung zwischen der mikrobiologischen Umgebung und dem angeborenen Immunsystem bei Asthmatikern postuliert. A connection between the microbiological environment and the innate immune system in asthmatics is postulated.
  • Im Rahmen der Suche nach neuen Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie von allergischen Erkrankungen, besonders bevorzugt allergischem Asthma, wurde deshalb die immunstimulierende Wirkung verschiedener synthetischer Analoga von natürlich vorkommenden Lipoproteinen als mögliche TLR-Agonisten untersucht. As part of the search for new drugs for the prophylaxis and treatment of allergic diseases, particularly preferably allergic asthma, so the immune-stimulating effect of various synthetic analogues was examined by naturally occurring lipoproteins as a possible TLR agonists.
  • Lipoproteine sind Bestandteile von gram-negativen Bakterien, gram-positiven Bakterien und Mykoplasmen. Lipoproteins are components of gram-negative bacteria, gram-positive bacteria and mycoplasmas. Sie repräsentieren zwischen 1% und 3,5% des Genoms von Bakterien. They represent between 1% and 3.5% of the genome of bacteria. Bakterielle Lipoproteine weisen keine Sequenzhomologie auf. Bacterial lipoproteins have no sequence homology. Sie sind jedoch durch die ungewöhnliche Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-propyl]-[R]-cystein am N-Terminus, an die zwei oder drei Fettsäuren gebunden sind, gekennzeichnet. They are, however, by the unusual amino acid S- [2,3-di (hydroxy) -propyl] - [R] -cysteine ​​at the N-terminus, bound to the two or three fatty acids, characterized.
  • Lipoproteine und deren synthetische Analoga sind wirksame Immunmodulatoren der frühen angeborenen Immunantwort. Lipoproteins and their synthetic analogues are potent immunomodulators of the early innate immune response. Als Adjuvantien unterstützen sie auch die effektive Reaktion des adaptiven Immunsystems. As adjuvants to support the effective response of the adaptive immune system. Sie werden von den Toll-like-Rezeptoren TLR 1, TLR 2 und TLR 6 in der Regel über die Ausbildung von Homo- oder Heterodimeren erkannt. They are recognized by the Toll-like receptors TLR 1, TLR 2 and TLR 6 usually on the training of homo- or heterodimers. Über eine interzelluläre Signalkaskade werden va die Elemente der angeborenen Immunität wie Makrophagen, polymorph-nucleäre Zellen und dendritische Zellen aktiviert, die erste Antikörper bilden. va, the elements of innate immunity, such as macrophages, polymorphonuclear cells and dendritic cells nucleäre activated via an intercellular signaling cascade form the first antibody. Im weiteren Verlauf setzt dann die spezifische Antikörperbildung ein. In the course then inserts the specific antibody formation. Die hierbei beteiligten Zytokine sind z. The cytokines involved in this case are for. B. der Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und verschiedene Interleukine (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12). As tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and various interleukins (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12). Durch dieses eher einer T H 1-dominierten Immunantwort entsprechende Zytokinmuster wird in den meisten experimentellen Modellen eine Immundeviation weg von der T H 2-Ausprägung beobachtet. By this more of a T H 1-dominated immune response corresponding cytokine an immune deviation away from the T H is observed 2 expression in the majority of experimental models.
  • Die DOLOP-Datenbank (DOLOP-A Database of Bacterial Lipoproteins. The DOLOP database (DOLOP-A Database of Bacterial lipoprotein. ) enthält eine Sammlung von bisher beschriebenen bakteriellen Lipoproteinen. ) Contains a collection of hitherto described bacterial lipoproteins. Die Aminosäure-Sequenzen der Proteine beruhen zum Großteil auf Vorhersagen, basierend auf dem aufgeklärten Genom der Spezies. The amino acid sequences of the proteins are largely based on predictions based on the enlightened genome of the species. Wenigen erfassten Lipoproteinen liegt auch eine vollständige Strukturaufklärung zugrunde. Few captured lipoproteins is based on a complete structure elucidation.
  • Aus dieser Datenbank wurden zunächst Lipoproteine von häufig auftretenden Bakterien-Spezies ausgewählt. From this database lipoproteins were initially selected from frequent bacterial species. Ausgehend von der Hygienehypothese und den bisher publizierten Arbeiten zur präventiven antiallergischen Wirksamkeit von Staubextrakten, lag der Schwerpunkt dabei auf in üblichen Konzentrationen für den gesunden Menschen nicht pathogenen Mikroorganismen, die besonders häufig in Tierställen vorkommen. Starting from the hygiene hypothesis and previously published work on preventive antiallergic efficacy of dust extracts, the focus was on in the usual concentrations for common non-pathogenic microorganisms that are particularly common in livestock barns.
  • Diese Erreger, deren Sporen und Zerfallsprodukte liegen in der Regel als aerogene Partikel vor und werden bei der Atmung in die Bronchien und das Lungengewebe aufgenommen. These pathogens, spores and decomposition products are generally as airborne particles before and are recorded in breathing in the bronchi and the lung tissue. Durch wiederholten Kontakt lernt das Immunsystem, zwischen der ubiquitären mikrobiellen Belastung und nicht pathogenen Substanzen zu unterscheiden. By repeated contact the immune system learns to distinguish between the ubiquitous microbial load and non-pathogenic substances. Dieser Reifungsprozess kann möglicherweise eine allergische Fehlregulation der Immunantwort verhindern. This maturation process may prevent an allergic dysregulation of the immune response.
  • Von den ausgewählten Lipoproteinen wurden anfangs Peptide, die die N-terminal letzten 15 Aminosäuren enthalten und später auch andere Analoga synthetisiert. Peptides were initially selected by the lipoproteins containing the N-terminal last 15 amino acids and later synthesized other analogues. Zur Simulation der Lipid-Komponenten wurden die Peptide an ihrem N-terminalen Ende kovalent an S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-N-palmitoyl-[R]-cystein (Pam 3 Cys) gekoppelt. -N-palmitoyl- [R] -cysteine (Pam 3 Cys) - To simulate the lipid components, the peptides covalently linked to S- [(2RS) -propyl bis-2,3 (palmitoyloxy)] at its N-terminal end were coupled. Dabei steht Pam 3 Cys stellvertretend für verschiedene Lipid-Komponenten, da in früheren Untersuchungen gezeigt werden konnte, dass ein Ersatz der Palmitinsäure durch ähnlich große Fettsäuren keine relevanten Aktivitätsänderungen bewirkt. Here, Pam 3 Cys is representative of various lipid components, as has been shown in previous studies that a replacement of palmitic acid by similar sized fatty acids caused no relevant activity changes. Ebenso konnte in den Untersuchungen gezeigt werden, dass die an die diacylierte Lipoaminosäure (Pam 2 Cys) gebundenen Peptide eine vergleichbare biologische Aktivität aufweisen. Could be demonstrated in the tests as well that the diacylated lipoaminoacid (Pam 2 Cys) bound peptides have a comparable biological activity.
  • In einem Assay wurde die Fähigkeit dieser synthetischen Analoga zur Stimulierung von Rezeptoren der angeborenen Immunität in Abhängigkeit von der Konzentration bestimmt. In one assay, the ability of these synthetic analogs to stimulate receptors of the innate immune function of the concentration was determined. Der Nachweis der immunstimulatorischen Aktivität der Lipopeptide erfolgte anhand der IL-8-Sekretion durch THP-1-Zellen, eine humane monozytäre Leukämie-Zelllinie. The detection of the immunostimulatory activity of the lipopeptides was carried out on the basis of IL-8 secretion by THP-1 cells, a human monocytic leukemia cell line. Die THP-1-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Lipopeptide inkubiert. The THP-1 cells were incubated with various concentrations of the respective lipopeptides. Anschließend wurde die IL-8-Konzentration in den Überständen mit ELISA bestimmt (Durchführung entsprechend Ausführungsbeispiel B). Subsequently, the IL-8 concentration in the supernatants determined by ELISA (carried out according to Example B). Tab. 1: Auswahl der getesteten häufig auftretenden bakteriellen Lipopeptide. Tab. 1: selection of the tested frequently occurring bacterial lipopeptides.
    Figure 00110001
  • Die meisten der untersuchten Lipopeptide, wie auch das synthetische Pam 3 Cys-Derivat, erreichen ihre halbmaximale Aktivität im IL-8-Assay im Konzentrationsbereich von 10 bis 100 nM ( Most of the investigated lipopeptides, as well as the synthetic Pam 3 Cys-derivative, reach their half-maximal activity in the IL-8 assay the concentration range of 10 to 100 nM ( - ). ).
  • Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das von dem Keimungs-Protein GerD der Sporen aus Bacillus cereus ATCC 10987 abgeleitete Lipopeptid sbLP 11 (SEQ ID NO 1) gegenüber den anderen untersuchten synthetischen Lipopeptiden eine bis zu 1000 fach erhöhte stimulatorische Aktivität aufweist, dh seine halbmaximale Aktivität im IL-8-Assay bereits im Konzentrationsbereich von 10 bis 50 pM erreicht ( Surprisingly, it was found that the signal derived from the germination protein GERD of spores of Bacillus cereus ATCC 10987 lipopeptide SBLP 11 (SEQ ID NO 1) with respect to the other investigated synthetic lipopeptides having an up to 1000-fold increase in stimulatory activity, ie its half-maximal activity in IL-8 assay already reached in the concentration range of 10 to 50 pM ( , . ). ).
  • Bisher konnte eine immunstimulierende Wirkung bakterieller Sporen noch nie auf der molekularen Ebene nachgewiesen werden. So far, an immune stimulatory effects of bacterial spores could never be detected at the molecular level. Zudem ist der willkürlich ausgewählte Ausschnitt des Lipoproteins bisher nicht als immunogenes Epitop bekannt. In addition, the randomly selected section of the lipoprotein is not known as an immunogenic epitope.
  • Auch in einer Kollektion von Lipopeptiden, die den Keimungs-Proteinen von Sporen verschiedener Bacillus-Spezies zugeordnet werden, zeigten die von den Bacillus cereus-Klonen abgeleiteten Lipopeptide (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2) eine überraschenderweise deutlich höhere Aktivität bei der Stimulation der IL-8-Sekretion als andere Keimungs-Proteine ( Also, in a collection of lipopeptides that are associated with the germination proteins of spores of different Bacillus species, those derived from the Bacillus cereus clones lipopeptides (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2) showed a surprisingly much higher activity in stimulating (IL-8 secretion than other proteins Sprouting , . ). ). Tab. 2: Auswahl der getesteten, von den Keimungs-Proteinen bakterieller Sporen abgeleiteten Lipopeptide: Tab. 2: selection of tested, derived from the germination of bacterial spores proteins lipopeptides:
    Figure 00120001
  • Zur Verifizierung der außergewöhnlichen immunologischen Aktivität des identifizierten Lipopeptides sGerD aus Bacillus cereus (SEQ ID NO 1) und der Übertragbarkeit dieser Wirkung auch auf andere synthetische Analoga wurden weitere Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung vorgenommen. To verify the extraordinary immunological activity of the identified sGerD lipopeptide from Bacillus cereus (SEQ ID NO 1) and the transferability of these effects to other synthetic analogues of further studies on the structure-activity relationship have been made. Tab. 3: Synthetische Analoga zur Untersuchung der Struktur-Aktivitäts-Beziehung von sGerD. Tab. 3: Synthetic analogues to study the structure-activity relationship of sGerD.
    Figure 00130001
  • Die IL-8-stimulierende Aktivität der 13 Aminosäuren enthaltenden Lipopeptid-Variante (SEQ ID NO 3) entsprach der des sGerD mit 15 Aminosäuren (SEQ ID NO 1). The IL-8-stimulating activity of the 13 amino acid-containing lipopeptide variant (SEQ ID NO 3) corresponded to that of the sGerD 15 amino acid (SEQ ID NO: 1). Eine weitere Verkürzung des Lipopeptides führte zu einer deutlichen Reduktion der immunmodulatorischen Aktivität ( A further shortening of the lipopeptide led to a significant reduction of the immunomodulatory activity ( , . ). ).
  • Im Alanin-Scan mit der von sGerD abgeleiteten Tridekapeptidsequenz (SEQ ID NO 3) als Basis, wurde durch den Austausch der Aminosäuren auf den Positionen 3, 4, und 5 der auf Pam 3 Cys folgenden Aminosäure-Sequenz, die Zytokin-Sekretion merklich reduziert ( In alanine scan with the deduced from sGerD Tridekapeptidsequenz (SEQ ID NO 3) as a base, was markedly reduced by replacing the amino acids at positions 3, 4, and 5 of the on Pam 3 Cys following amino acid sequence cytokine secretion ( , . ). ).
  • Offensichtlich stellt das Motiv EKE mit der Aufeinanderfolge entgegengesetzt geladener Aminosäuren, neben der charakteristischen Lipoaminosäure mit 2 oder 3 Fettsäuren, ein weiteres entscheidendes Strukturmerkmal für die immunstimulierende Wirkung des Lipopeptides dar. Obviously, the subject EKE with the succession of oppositely charged amino acids, in addition to the characteristic lipoaminoacid having 2 or 3 fatty acids, another key structural feature for the immunostimulating effect of the lipopeptide is.
  • Weitere Variationen zeigten, dass die Lipopeptide mit sterisch anspruchslosen, kleinen Aminosäuren wie Alanin oder Glycin an der Position 1 der auf Pam 3 Cys folgenden Aminosäure-Sequenz außergewöhnlich aktiv sind. Other variations revealed that the lipopeptides undemanding with sterically small amino acids such as alanine or glycine at position 1 of the on Pam 3 Cys following amino acid sequence are exceptionally active. Offensichtlich verbessern diese Aminosäuren die Interaktion mit der Bindungstasche des Rezeptors. Obviously, these amino acids improve the interaction with the binding site of the receptor.
  • Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden weitere Struktur-Analoga der bisher untersuchten Lipopeptide abgeleitet und hinsichtlich ihrer immunstimulatorischen Wirkung charakterisiert. Based on these findings further structural analogs of the previously investigated lipopeptides were derived and characterized for their immunostimulatory effect. Die gefundenen Strukturmotive wurden konsequent umgesetzt, um die Löslichkeit sowie die Resorbierbarkeit der Verbindungen und damit deren Bioverfügbarkeit weiter zu erhöhen. The structural motifs found were consistently implemented in order to increase the solubility and absorbability of the compounds and their bioavailability further.
  • Insgesamt zeigen die Lipopeptide mit den auf diese Weise abgeleiteten Strukturmotiven eine verstärkte Wirkung ( Overall, the lipopeptides show with the thus derived structural motifs an enhanced effect ( ). ). Die halbmaximale Aktivität im IL-8-Assay liegt für alle Verbindungen unterhalb von 0,1 nM. The half-maximum activity in the IL-8 assay is for all compounds below 0.1 nM. Als besonders wirksam erwiesen sich die beiden Lipopeptide Pam 3 Cys-AEEKEAEEK (SEQ ID NO 4) und Pam 3 Cys-GEEKEEK (SEQ ID NO 5) mit einer gegenüber der sGerD-Originalsequenz stark veränderten Aminosäure-Folge. To be particularly effective, the two lipopeptides Pam 3 Cys-proven AEEKEAEEK (SEQ ID NO 4) and Pam 3 Cys-GEEKEEK (SEQ ID NO 5) with respect to the original sequence sGerD greatly altered amino acid sequence.
  • Eine weitere Untersuchung betraf den Effekt der Palmitinsäure-Substituenten. Another covered the effect of palmitic acid substituent. Sowohl für das Pam 3 Cys-Derivat als auch für das Pam 2 Cys-Derivat des auf 13 Aminosäuren verkürzten sGerD-Lipopeptides (SEQ ID NO 3) wurden deutlich erhöhte stimulatorische Aktivitäten nachgewiesen ( Both the Pam 3 Cys-derivative as well as for the Pam 2 Cys-derivative of the truncated 13 amino acids sGerD-lipopeptide (SEQ ID NO 3) were detected significantly increased stimulatory activity ( ). ). Die Kopplung des dritten Fettsäure-Restes über eine Amid-Bindung an den N-Terminus des 2,3-Dihydroxypropylcysteins ergibt somit gegenüber dem Lipopeptid mit freiem N-Terminus keinen entscheidenden Vorteil in der immunologischen Wirksamkeit von sGerD. The coupling of the third fatty acid moiety via an amide bond to the N-terminus of the 2,3-Dihydroxypropylcysteins thus results compared to the lipopeptide with free N-terminus no decisive advantage in the immunological efficacy of sGerD.
  • Dagegen ist die immunmodulatorische Aktivität von sGerD wesentlich von der Existenz des an beiden OH-Gruppen mit einem Fettsäure-Rest veresterten 2,3-Dihydroxypropylcysteins abhängig ( In contrast, the immunomodulatory activity of sGerD is substantially dependent (of the existence of the esterified at both hydroxyl groups with a fatty acid radical 2,3-Dihydroxypropylcysteins ). ). Die nicht acylierten und die mono-N-palmitoylierten Peptide weisen keine IL-8-stimulierenden Aktivitäten auf. The non-acylated and mono-N-palmitoylated peptides have no IL-8-stimulating activities. Das gilt sowohl für die 15 Aminosäuren enthaltende Originalsequenz von sGerD (SEQ ID NO 1) als auch für die auf 13 Aminosäuren verkürzte Variante (SEQ ID NO 3). This applies both for the 15 amino acids containing the original sequence of sGerD (SEQ ID NO 1) and for the shortened 13 amino acid variant (SEQ ID NO 3).
  • Weiterhin ergab eine Untersuchung zum Einfluss der Stereoisomerie der erfindungsgemäßen Lipopeptide eine deutlich höhere immunmodulatorische Wirkung der Verbindungen, die das RR-Isomer des Dihydroxypropylcystein-Grundkörpers enthalten. Furthermore, an investigation revealed the influence of stereoisomerism of the lipopeptides according to the invention a significantly higher immunomodulatory effect of compounds which contain the RR isomer of Dihydroxypropylcystein base body.
  • Ausgehend von diesen Untersuchungen konnte überraschenderweise gefunden werden, dass sowohl die abgeleiteten Lipopeptide sGerD aus Bacillus cereus (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2) als auch weitere spezifisch modifizierte Analoga, die nicht mehr der Originalsequenz entsprechen, vorzugsweise die Verbindungen mit den Sequenzen nach SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 und SEQ ID NO 5, eine außergewöhnlich hohe immunstimulatorische Aktivität aufweisen. Based on these investigations it was surprisingly found that both the derived lipopeptides sGerD from Bacillus cereus (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2) and more specifically modified analogs that no longer correspond to the original sequence, preferably the compounds having the sequences according to SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 and SEQ ID NO 5, having an exceptionally high immunostimulatory activity. Dabei zeigen die Lipopeptide, die das RR-Isomer des Dihydroxypropylcystein-Grundkörpers enthalten, eine ganz besondere Aktivität. These show lipopeptides which contain the RR isomer of Dihydroxypropylcystein base body, a very special activity.
  • Dies überrascht um so mehr, als dass bisher die immunstimulatorische Wirkung von Bacillus-Sporen auf molekularer Ebene nicht nachgewiesen wurde. This is even more surprising than that so far has not been demonstrated at the molecular level, the immunostimulatory effect of Bacillus spores.
  • Bei dem Mikroorganismus Bacillus cereus handelt es sich ein gram-positives Bakterium, das natürlich im Erdboden, also auch im Staub vorkommt. The microorganism Bacillus cereus is a Gram-positive bacterium, of course, that occurs in the ground in the dust. Die ubiquitär vorhandenen Mengen sind für gesunde Menschen und Tiere nicht pathogen. The amounts ubiquitous are not pathogenic for healthy people and animals. In sehr hohen Konzentrationen kann das Bakterium als Lebensmittelvergifter, va in Reis und Milch, wirken. In very high concentrations, the bacterium may as Lebensmittelvergifter, especially, work in rice and milk.
  • In der Literatur finden sich einzelne Hinweise auf Impfstoffe gegen dieses Bakterium. anecdotal evidence of vaccines against this bacterium is found in the literature. Dabei müssen stets Adjuvantien eingesetzt werden, um eine ausreichende immunstimulatorische Wirkung dieses Bakteriums oder seiner Teile zu erzielen ( Here adjuvants (must always be used in order to achieve a sufficient immune stimulatory effect of this bacterium or its parts WO 2004/030608 WO 2004/030608 , . WO 2008/054892 WO 2008/054892 , . US 2003/0190322 US 2003/0190322 ). ). In einer Patentschrift wird die Verwendung von Bacillus cereus-Sporen als Transportsystem für immunogene Polynucleotid-Sequenzen beansprucht ( In one patent, the use of Bacillus cereus spores as a transport system for immunogenic polynucleotide sequences claimed ( WO 2006/087576 WO 2006/087576 ). ).
  • Die eigenständige immunmodulatorische Wirkung der Bacillus cereus-Sporen an sich, bestimmter Teile davon oder einzelner Lipopeptide aus diesen Sporen ist bisher nicht beschrieben. The independent immunomodulatory effect of Bacillus cereus spores per se, certain parts of it or individual lipopeptides from these spores has not been described. Auch wurde die Verwendung von ausgewählten kurzen Aminosäure-Sequenzen dieser Lipopeptide, die keinem speziellen Immunitäts-relevanten Epitop zugeordnet werden können, bisher nicht in Erwägung gezogen. Also, the use of selected short amino acid sequences of these lipopeptides, which may be assigned to any specific immunity relevant epitope, not previously contemplated.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde erstmals ein bis zu 25 Aminosäuren langes Peptid, das von der Aminosäure-Sequenz am N-terminalen Ende des insgesamt 25 kDalton großen Keimungs-Proteins GerD der Bacillus cereus-Sporen abgeleitet ist, ausgewählt und kovalent an ein di- oder triacyliertes Dihydroxypropylcystein (Pam 2 Cys oder Pam 3 Cys) gekoppelt, um damit eine unspezifische immunstimulatorische Wirkung bei Menschen und Tieren über einen der Toll-like-Rezeptoren TLR 1, TLR 2 oder TLR 6 zu erzielen. In the present invention, a first time up to 25 amino acid peptide that is derived from the amino acid sequence at the N-terminal end of a total of 25 kDalton large germination GERD protein of Bacillus cereus spores, selected and covalently bonded to a di- or (Pam 2 Cys or Pam 3 Cys) coupled triacylated Dihydroxypropylcystein in order to achieve a non-specific immunostimulatory effect in humans and animals via one of the Toll-like receptors, TLR-1, TLR 2 and TLR. 6 Diese Stimulation soll zum Reifung des Immunsystems beitragen und das Risiko zur Ausprägung einer manifestierten allergischen Erkrankung minimieren. This stimulation is intended to contribute to the maturation of the immune system and minimize the risk of occurrence of a manifest allergic disease.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher Verbindungen nach der Formel The present invention therefore relates to compounds according to the formula
    Figure 00160001
    sowie deren Verwendung als Immunstimulanzien zur Therapie und Prophylaxe zahlreicher allergischer Erkrankungen, vorzugsweise von allergischem Asthma. and their use as immunostimulants, for the therapy and prophylaxis of a variety of allergic disorders, preferably allergic asthma.
  • Dabei stehen R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen, Here, R1 and R2, which may be identical or different, represent a saturated or unsaturated acyl radical having 7 to 25 carbon atoms,
    R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen oder H und R3 represents a saturated or unsaturated acyl radical having 7 to 25 carbon atoms or H and
    R4 für ein aus 1 bis 25 Aminosäure-Resten bestehendes physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid. R4 represents a from 1 to 25 amino acid residues existing and physiologically acceptable in the treated species not per se immunogenic peptide.
  • Bevorzugte Ausführungsformen betreffen erfindungsgemäße Lipopeptide mit zwei oder drei gesättigten C 16 -Acyl-Substituenten für R1, R2 und gegebenenfalls R3 sowie einem Peptid entsprechend den folgenden Formeln (II)–(IX). Preferred embodiments relate to the lipopeptides according to the invention with two or three saturated C 16 acyl substituents for R1, R2 and optionally R3 and a peptide corresponding to the following formulas (II) - (IX).
  • SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 1
    Figure 00160002
  • SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 3
    Figure 00170001
  • SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 4
    Figure 00170002
  • SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 5
    Figure 00170003
  • Die Definition der Verbindungen nach den Formeln (I) bis (IX) schließt alle pharmazeutisch akzeptablen Salze, Stereoisomeren, Stereoisomeren-Gemische und Prodrug-Verbindungen der erfindungsgemäßen Lipopeptide ein. The definition of the compounds according to the formulas (I) to (IX) include all pharmaceutically acceptable salts, stereoisomers, stereoisomeric mixtures and prodrug compounds of the lipopeptides according to the invention.
  • Zusätzlich zum Nachweis der immunstimulatorischen Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Lipopeptide über die in vitro-Stimulierung der IL-8-Sekretion wurden ihre vollständige Allergieprotektive Wirkung sowie die physiologische Verträglichkeit im standardisierten Tiermodell des allergischen Asthmas belegt. In addition to detecting the immunostimulatory activity of the lipopeptides according to the invention on the in vitro stimulation of IL-8 secretion their full Allergieprotektive effect as well as the physiological compatibility in standard animal model of allergic asthma were occupied.
  • In den immunologischen und zellbiologischen Funktionsuntersuchungen (Ausführungsbeispiele C und D) konnte gezeigt werden, dass durch die Inhalation der erfindungsgemäßen Lipopeptide sowohl die Asthma-bedingten Symptome, die Entzündungsreaktion als auch die allergene Sensibilisierung bis nahezu auf das Niveau nicht sensibilisierter Mäuse (entsprechende Werte sind in In the immunological and cell biological function studies (Embodiments C and D) showed that by the inhalation of the lipopeptides according to the invention both the asthma-related symptoms, the inflammatory response and the allergenic sensitization to the level of non-sensitized mice (respective values ​​are up nearly beschrieben) zurückgedrängt werden konnten. ) Could be pushed back described. Die T H 1-stimulierte Immunantwort wurde dabei nur unwesentlich verstärkt. The T H 1-stimulated immune response was thereby strengthened only marginally. Einschränkende Nebenwirkungen wurden im Mausmodell nicht beobachtet. Limiting side effects were not observed in the mouse model.
  • Eine besondere Wirksamkeit zeigten die erfindungsgemäßen Lipopeptide unmittelbar auf das Lungengewebe. A particular effectiveness showed lipopeptides according to the invention directly to the lung tissue. Die Konzentration der Allergen-spezifischen Antikörper war in der Lungenflüssigkeit deutlich höher als im Serum. The concentration of allergen-specific antibodies in serum was significantly higher than in the lung fluid. Dies legt die Inhalation als besonders wirksame Applikationsform der erfindungsgemäßen Lipopeptide nahe. This sets the inhalation close as particularly effective form of administration of the lipopeptides according to the invention.
  • Diese überraschenden Erkenntnisse über die herausragende immunmodulatorische Aktivität der erfindungsgemäßen Lipopeptide und deren Wirksamkeit bei der Therapie und Prophylaxe allergischer Erkrankungen, bevorzugt von allergischem Asthma, erschließen völlig neue Möglichkeiten für deren Anwendung als Wirkstoffe zur Behandlung von und Impfung gegen Allergien. These surprising findings about the outstanding immunomodulatory activity of the lipopeptides of the invention and their efficacy in the treatment and prevention of allergic diseases, preferably of allergic asthma, open up completely new possibilities for their use as agents for the treatment of and vaccination against allergies.
  • Das Wirkspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst aufgrund des unspezifischen Immunisierungsansatzes über die TLR-Rezeptoren die gesamte Breite der bekannten allergischen Erkrankungen, insbesondere Allergien und Hypersensitivitäten gegen Umweltstoffe und Lebensmittel, die sich durch Symptome an den Schleimhäuten (allergische Rhinitis, Mundschleimhautschwellungen, Konjunktivitis), den Atemwegen (Asthma bronchiale), der Haut (atopische Dermatitis, Neurodermitis, Kontaktekzem, Urtikaria), im Gastrointestinaltrakt (Erbrechen, Durchfälle) oder als akuter Notfall (anaphylaktischer Schock) äußern. The spectrum of action of the compounds according to the invention comprises, due to the nonspecific immunization approach through the TLR receptors, the entire width of the known allergic diseases, especially allergies and hypersensitivities to environmental and food materials that are characterized by symptoms of the mucous membranes (allergic rhinitis, oral mucosa swelling, conjunctivitis), the respiratory system express (asthma), skin (atopic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, urticaria), gastrointestinal tract (vomiting, diarrhea) or as acute emergency (anaphylactic shock).
  • Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von allergischen Reaktionen der Atemwege, insbesondere allergischem Asthma und allergischer Rhinitis, die ua durch Hausstaub und Pollen verursacht werden. Particularly effective compounds of this invention in the treatment of allergic airway responses, in particular allergic asthma and allergic rhinitis, which are, inter alia, caused by house dust and pollen.
  • Typische medizinische Indikationen sind beispielsweise die Prophylaxe bei Individuen mit eindeutiger genetischer Disposition sowie die Behandlung von Menschen und Tieren bei ersten Symptomen einer aufkommenden Hypersensitiviät. Typical medical indications include the prophylaxis in individuals with a clear genetic disposition and the treatment of humans and animals at the first symptoms of an emerging Hypersensitiviät.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von synthetischen Lipopeptiden nach Formel (I), die erfindungsgemäß als Immunstimulanzien zur Therapie und Prophylaxe von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden können. Another object of the invention is the preparation of synthetic lipopeptides according to formula (I) which can be used according to the invention as an immune stimulant for the treatment and prophylaxis of allergic diseases.
  • Ein möglicher Weg ist die konvergente Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei die ungewöhnliche Aminosäure Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-Dhc-OH) in Lösung oder in Festphasensynthese mit einem an einem Synthese-Harz aufgebauten Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft wird. One possible way is the convergent synthesis of the compounds of the invention, wherein the unusual amino acid Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] -cysteine ​​(Fmoc-Dhc-OH) is linked in solution or in solid phase synthesis with a built at a synthetic resin side-chain protected peptide. Diese Vorstufe kann an den Hydroxygruppen bisacyliert werden. This precursor can be bisacyliert on the hydroxy groups. Nach der Fmoc-Abspaltung von weiteren Seitenketten-Schutzgruppen wird die Zielverbindung vom Harz getrennt. After Fmoc deprotection of other side-chain protecting groups, the target compound is separated from the resin. Bei der Synthese des Pam 3 Cys-Derivates erfolgt vor der Abspaltung noch die Acylierung der freigesetzten Aminogruppe. In the synthesis of Pam 3 Cys-derivative acylation of the liberated amino group still takes place prior to cleavage.
  • Bei einer weiteren Herstellungsvariante wird die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen mit dem Baustein Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2R)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-RR-Dhc-OH) durchgeführt. In a further process variant of the synthesis of the compounds of the invention with the block Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- is [2,3-di (hydroxy) - (2R) -propyl] - [R] -cysteine ​​(Fmoc-RR-Dhc-OH) carried out. Dabei wird die Zielverbindung als stereochemisch definiertes Derivat erhalten, welches aus L-Aminosäuren, aus der modifizierten Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-[2R]-propyl]-[R]-cystein sowie aus zwei oder drei Acyl-Resten aufgebaut ist. The target compound is obtained as stereochemically defined derivative which [2,3-di (hydroxy) - [2R] propyl] - L-amino acids from the modified amino acid S- [R] -cysteine ​​and two or three acyl radicals, is constructed.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen synthetischen Lipopeptide nach Formel (I) zur Herstellung pharmazeutischer Präparate für die Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit Allergien in Zusammenhang stehen. Another object of the invention is the use of synthetic lipopeptides according to the invention according to formula (I) for the manufacture of pharmaceutical preparations for the treatment and prevention of diseases of humans and animals which are associated with allergies in context. Diese immunmodulatorisch wirksamen Zusammensetzungen, enthaltend wenigstens ein erfindungsgemäßes synthetisches Lipopeptid nach Formel (I), enthalten weiterhin mindestens ein oder kein die immunologische Wirkung verstärkendes Adjuvans, mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Träger sowie mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoff. This immunomodulatory effective compositions comprising at least one inventive synthetic lipopeptide of formula (I), further comprise at least one or no immunological effect-enhancing adjuvant, at least one or no non-toxic, inert, pharmaceutically acceptable carrier and at least one or no non-toxic , inert, pharmaceutically suitable auxiliary and / or additive.
  • Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen. Pharmaceutically acceptable materials are known for use in the pharmaceutical and food technology and in adjacent areas materials, in particular those listed in relevant pharmacopoeia whose properties do not preclude a physiological application.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches Lipopeptid nach Formel (I), können beispielsweise als Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Pflaster, Injektabilia, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotionen, Puder oder Sprays formuliert sein, vorzugsweise als Suspension oder Lösung zur intranasalen Inhalation. The pharmaceutical agents according to the invention containing at least one inventive synthetic lipopeptide of formula (I), for example, as tablets, dragees, capsules, pills, granules, suppositories, plasters, injectables, solutions, suspensions, emulsions, pastes, ointments, gels, creams, lotions, powders or sprays be formulated, preferably as a suspension or solution for nasal inhalation.
  • Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren. The production of the pharmaceutical preparations according to the invention is carried out in a customary manner by the person skilled in known processes.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren, die mit Allergien in Zusammenhang stehen. The invention also relates to methods for the treatment and prevention of diseases in humans and animals which are associated with allergy related. Hierzu verabreicht man einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine immunstimulatorisch wirkende Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches Lipopeptid nach Formel (I). For this purpose, administered to a person or animal who or in need of such treatment an immunostimulatory effective amount of a pharmaceutical preparation according to the invention containing at least one inventive synthetic lipopeptide of formula (I). Der Wirkstoff oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann lokal oder systemisch, oral oder parenteral (insbesondere mucosal, transdermal, durch Injektion) verabreicht werden, vorzugsweise intrapulmonal oder intranasal. The active ingredient or the pharmaceutical preparation of the invention can locally or systemically, orally, or parenterally (especially mucosal, transdermal, by injection) may be administered, preferably intrapulmonary or intranasal.
  • Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind. For details about particularly preferred embodiments as well as further features and advantages of the invention will become apparent from the following description of exemplary embodiments in conjunction with the dependent claims, the features mentioned above and below are still claimed in each case and in any combination with each other to be explained individual characteristics.
  • Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. The exemplary embodiments are merely illustrative and the scope of the invention do not limit.
  • Abbildungen pictures
  • Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von Bakterien abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration (sbLP 1–7). Immunostimulatory activity of synthetic, derived from bacterial lipopeptides, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells as a function of the concentration (SBLP 1-7).
  • Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von Bakterien abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration (sbLP 8–14). Immunostimulatory activity of synthetic, derived from bacterial lipopeptides, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells as a function of the concentration (SBLP 8-14).
  • Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von Bakterien abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration (sbLP 15–21). Immunostimulatory activity of synthetic, derived from bacterial lipopeptides, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells as a function of the concentration (SBLP 15-21).
  • Immunstimulierende Aktivität des synthetischen, vom Sporen-Keimungs-Protein GerD der Spezies Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD (sbLP 11) im Vergleich zum Pam 3 Cys-SK 4 , gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration. Immunostimulatory activity of the synthetic, from spore germination protein GERD of the species Bacillus cereus-derived lipopeptide sGerD (SBLP 11) compared to the Pam 3 Cys-SK 4, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells in response to concentration.
  • Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von den Keimungs-Proteinen verschiedener Bacillus-Spezies abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen bei einer Konzentration von 1 nM. Immunostimulatory activity of synthetic, derived from the germination proteins of different Bacillus species lipopeptides, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells at a concentration of 1 nM.
  • Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von den Keimungs-Proteinen GerD verschiedener Bacillus-Spezies abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration. Immunostimulatory activity of synthetic, different from the germination proteins GERD Bacillus species derived lipopeptides, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells depending on the concentration.
  • Immunstimulierende Aktivität verkürzter Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen bei einer Konzentration von 1 nM. Immunostimulatory activity shortened structure of the analogues derived from Bacillus cereus sGerD lipopeptide, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells at a concentration of 1 nM.
  • Immunstimulierende Aktivität verkürzter Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration. Immunostimulatory activity shortened structure of the analogues derived from Bacillus cereus sGerD lipopeptide, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells depending on the concentration.
  • Immunstimulierende Aktivität von im Alanin-Scan modifizierten Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen bei einer Konzentration von 1 nM. Immunostimulatory activity of modified at the alanine scan structural analogs of a Bacillus cereus sGerD lipopeptide, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells at a concentration of 1 nM.
  • Immunstimulierende Aktivität von im Alanin-Scan modifizierten Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration. Immunostimulatory activity of modified at the alanine scan structural analogs of a Bacillus cereus sGerD lipopeptide, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells depending on the concentration.
  • Immunstimulierende Aktivität von entsprechend der abgeleiteten Motive modifizierten Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration. Immunostimulatory activity of the derived motifs corresponding to the modified structural analogs of a Bacillus cereus sGerD lipopeptide, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells depending on the concentration.
  • Immunstimulierende Aktivität der Pam 2 Cys- und Pam 3 -Cys-Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen bei einer Konzentration von 1 nM. Immunostimulatory activity of Pam 2 Cys and Pam 3 -Cys-structure analogues of the Bacillus cereus-derived lipopeptide sGerD as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells at a concentration of 1 nM.
  • Immunstimulierende Aktivität 2,3-Dihydroxypropylcystein-freier Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen bei einer Konzentration von 10 μM bzw. 1 nM. Immunostimulatory activity of 2,3-Dihydroxypropylcystein-free structural analogs of a Bacillus cereus sGerD lipopeptide, as measured by IL-8 secretion by THP-1 cells at a concentration of 10 uM and 1 nM.
  • Behandlungsprotokoll zum Asthma- und Sensibilisierungsmodell in der BALB/c-Labormaus. Treatment protocol for asthma and sensitization model in BALB / c laboratory mouse.
  • Atmungs-Hyperreagibilität der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Respiratory hyperreactivity of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • Modulation der eosinophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Modulation of eosinophils in the bronchoalveolar lavage of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • Modulation der Lymphozyten in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Modulation of lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • Modulation der neutrophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Modulation of neutrophils in the bronchoalveolar lavage of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • Anzahl der Makrophagen in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Number of macrophages in bronchoalveolar lavage of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • IgE-Konzentration in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. IgE concentration in bronchoalveolar lavage of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • IgE-Konzentration im Serum der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. IgE concentration in the serum of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • IgG1-Konzentration in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. IgG1 concentration in the bronchoalveolar lavage of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • IgG1-Konzentration im Serum der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. IgG1 concentration in the serum of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • IgG2a-Konzentration in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. IgG2a concentration in bronchoalveolar lavage of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • IgG2a-Konzentration im Serum der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. IgG2a concentration in the serum of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • Modulation der Interleukin-5-Produktion durch die Milz-Zellen der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Modulation of the interleukin-5 production by spleen cells of sensitized laboratory mice after treatment with various doses of the lipopeptide LPM compared to the control groups.
  • Ausführungsbeispiele embodiments
  • Beispiel A – Herstellung der synthetischen bakteriellen Lipopeptide Pam 2 Cys-AQEKEAKSELDYD und Pam 3 Cys-AQEKEAKSELDYD Example A - Preparation of the synthetic bacterial lipopeptides Pam 2 Cys-AQEKEAKSELDYD and Pam 3 Cys-AQEKEAKSELDYD
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird die allgemeine Methodik zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipopeptide mit den Methoden der Festphasensynthese beschrieben. In this embodiment, the general methodology for the production of the lipopeptides according to the invention is described using the methods of solid phase synthesis. Strukturmodifikationen können durch das Auslassen einzelner Syntheseschritte bzw. das Hinzufügen von dem erfahrenen Synthesechemiker bekannten Schritten vorgenommen werden. Structural modifications can be made by omitting individual synthesis steps or adding the experienced synthetic chemists known steps.
  • Wird bei der Synthese der außergewöhnlichen Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Dhc) der racemische Synthesebaustein RS-2,3-Epoxy-1-propanol verwendet, erhält man ein Diastereomeren-Gemisch der Zielverbindung. Is [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - in the synthesis of unusual amino acid S- [R] -cysteine ​​(Dhc) of the racemic synthon RS-2,3-epoxy-1-propanol used one obtains a diastereomeric mixture of the target compound. Durch Einsatz des Enantiomers R-2,3-Epoxy-1-propanol wird das immunmodulatorisch aktivere RR-Stereoisomer von Dhc erhalten. By using the R-enantiomer of 2,3-epoxy-1-propanol, the immunomodulatory more active RR stereoisomer of Dhc is obtained.
  • Die Synthese der Peptide erfolgt nach klassischen, literaturbekannten Methoden in Lösung oder in einem automatisierten Verfahren an der festen Phase. The synthesis of the peptides is carried out by classical methods known in the literature or in solution in an automated process on the solid phase. Die Verfahrenschritte für die Synthese an fester Phase sind für nahezu alle Aminosäure-Sequenzen gleich. The process steps for the synthesis on a solid phase are the same for almost all amino acid sequences. Aus diesem Grund wird in dem Beispiel lediglich der prinzipielle Syntheseablauf beschrieben, ohne auf Besonderheiten einzelner Peptide einzugehen. For this reason, only the principal synthesis procedure is described, without considering characteristics of individual peptides in the example.
  • a) Synthese des Peptides AQEKEAKSELDYD mit automatisierter Festphasensynthese a) Synthesis of the peptide AQEKEAKSELDYD with automated solid phase synthesis
  • Das Peptid AQEKEAKSELDYD wird an einem Syntheseroboter ausgehend von einem mit Fmoc-L-Asp beladenen Synthese-Harz nach der Fmoc-Peptidsynthese-Methode aufgebaut. The peptide AQEKEAKSELDYD is built up on a synthetic robot from a loaded with Fmoc-L-Asp synthetic resin after Fmoc peptide synthesis method. Dazu wird das beladene Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (8 mg; 7 μmol) in einen Reaktor eingewogen. For this purpose, the loaded trityl chloride-polystyrene resin (8 mg; 7 .mu.mol) was weighed into a reactor. Die Aminosäuren werden in einer 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung (0,5 M in N,N-Dimethylformamid) zu 0,5 M Lösungen gelöst. The amino acids are dissolved in a solution of 1-hydroxybenzotriazole (0.5 M in N, N-dimethylformamide) to 0.5 M solutions. Anschließend werden die befüllten Reaktoren und Vials auf die vorgesehenen Positionen des Syntheseroboters gestellt. Subsequently, the filled reactors, and vials are put to the intended positions of the synthesis robot.
  • Im ersten Schritt erfolgt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe nach dem in Tab. 4 dargestellten Programmablauf. In the first step the program sequence shown in Figure 4, the removal of the Fmoc protecting group is carried out after the in Tab.. Tab. 4: Zyklus zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe. Tab. 4: cycle for removal of the Fmoc protecting group.
    Syntheseschritt synthesis step Reagenzien reagents Volumina [μL] Volumes [ul] Dauer [min] Duration [min]
    Start Harz quellen swell starting resin N,N-Dimethylformamid N, N-dimethylformamide 800 800 2 2
    1. Deblockierung 1. deblocking 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 30% piperidine in N, N-dimethylformamide 200 200 5 5
    2. Waschen 2. Wash N,N-Dimethylformamid N, N-dimethylformamide 300 300 1 1
    3. Deblockierung 3. deblocking 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 30% piperidine in N, N-dimethylformamide 200 200 10 10
    4. Waschen, 7× 4. Washing, 7 × N,N-Dimethylformamid N, N-dimethylformamide 300 300 1 1
  • Anschließend wird das entsprechende Peptid auf dem Harz aufgebaut. Subsequently, the corresponding peptide is built on the resin.
  • Dies erfolgt durch die schrittweise Verknüpfung der jeweiligen Aminosäuren. This is done by the progressive combination of the respective amino acids. Unmittelbar nach jeder Kupplung wird die N-Fmoc-Schutzgruppe der soeben gekoppelten Aminosäure abgespalten, um die Anbindung der nächsten Aminosäure an der freigewordenen Aminogruppe zu ermöglichen. Immediately after each coupling, the N-Fmoc protecting group of the coupled amino acid is cleaved just to allow the connection of the next amino acid to the liberated amino group.
  • Der Programmablauf des Syntheseroboters ist in der folgenden Tabelle dargestellt. The program flow of the synthesis robot is shown in the following table. Tab. 5: Zyklus zur Synthese der Peptide. Tab. 5: cycle for the synthesis of peptides.
    Syntheseschritt synthesis step Reagenzien reagents Volumina [μL] Volumes [ul] Dauer [min] Duration [min]
    1. Kupplung 1. clutch 3 MN,N'-Diisopropylcarbodiimid in N,N-Dimethylformamid, Aminosäure-Lösung 3 MN, N'-diisopropylcarbodiimide in N, N-dimethylformamide, amino acid solution 25 100 25 100 120 120
    2. Waschen, 3× 2. Wash 3 × N,N-Dimethylformamid N, N-dimethylformamide 200 200 1 1
    3. Deblockierung 3. deblocking 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 30% piperidine in N, N-dimethylformamide 200 200 5 5
    4. Waschen, 3× 4. Wash 3 × N,N-Dimethylformamid N, N-dimethylformamide 300 300 1 1
    5. Deblockierung 5. deblocking 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 30% piperidine in N, N-dimethylformamide 200 200 10 10
    6. Waschen, 7× 6. Washing, 7 × N,N-Dimethylformamid N, N-dimethylformamide 300 300 1 1
    7. weiter bei Schritt 1. 7. Continue with step first
  • b) Synthese des N,N'-Bis(fluorenylmethoxycarbonyl)-[R]-cystin-bis-tert.-butylesters (Fmoc-Cys-OtBu) 2 b) Synthesis of N, N'-bis (fluorenylmethoxycarbonyl) - [R] -cystin-bis-tert-butyl ester (Fmoc-Cys-OtBu) 2
  • L-Cystin-bis-tert.-butylester (5,5 g; 13 mmol) und Fmoc-N-hydroxysuccinimidylester (7,04 g; 21 mmol) werden in Tetrahydrofuran (15 mL) gelöst. L-cystine-bis-tert-butyl ester (5.5 g; 13 mmol) dissolved in tetrahydrofuran (15 mL) and Fmoc-N-hydroxysuccinimidyl ester (21 mmol, 7.04 g). Unter Rühren wird N-Ethylmorpholin (3,83 g; 4,2 mL; 30 mmol) in Tetrahydrofuran (7,5 mL) dazugeben. With stirring, N-ethylmorpholine (3.83 g; 4.2 mL; 30 mmol) in tetrahydrofuran (7.5 mL) to give.
  • Die Reaktionslösung wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Hilfe des Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft. The reaction solution is stirred for 3 h at room temperature and then evaporated using the rotary evaporator to dryness. Der Rückstand wird in Ethylacetat (100 mL) gelöst und im Scheidetrichter mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 3 × 80 mL) sowie Wasser (3 × 80 mL) gewaschen. The residue is dissolved in ethyl acetate (100 mL) in a separatory funnel and washed with potassium hydrogen sulphate solution (5%; 3 x 80 mL) and water (3 x 80 mL). Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer eingedampft und als Rückstand ein Öl erhalten. After drying with sodium sulfate, the organic phase is evaporated on a rotary evaporator and the residue obtained as an oil.
  • Dieser Rückstand wird in Dichlormethan/Methanol (1:4; 385 mL) mit Hilfe eines Ultraschallbades gelöst und umkristallisiert (18 h; –20°C). This residue is dissolved in dichloromethane / methanol (1: 4; 385 mL) with the aid of an ultrasonic bath, and recrystallized (18 h; 20 ° C). Der erhaltene farblose Niederschlag wird über eine Filternutsche abfiltriert, mit tert.-Butylalkohol/2-Propanol (1:1; 2 × 100 mL) gewaschen und im Vakuum getrocknet. The colorless precipitate is filtered off through a suction filter, with tert-butyl alcohol / 2-propanol (1: 1; 2 x 100 mL) and dried in vacuo.
    Ausbeute (Fmoc-Cys-OtBu) 2 : 7,48 g (72%); Yield (Fmoc-Cys-OtBu) 2: 7.48 g (72%); [M+H] + : 797 [M + H] +: 797
  • c) Synthese des Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-tert.-butylesters (Fmoc-RS-Dhc-OtBu) c) Synthesis of Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] -cysteine-tert-butyl ester (Fmoc-Dhc-RS-OtBu)
  • Das (Fmoc-Cys-OtBu) 2 (4,96 g; 6,2 mmol) wird in Dichlormethan (39 mL) gelöst. The (Fmoc-Cys-OtBu) 2 (4.96 g; 6.2 mmol) is dissolved in dichloromethane (39 mL). Anschließend werden Zink (2,84 g; 43,4 mmol) sowie eine Lösung (20,7 mL) aus Methanol, Salzsäure (32%) und Schwefelsäure (98%) (100:7:1) unter starkem Rühren zugeben. Then zinc (2.84 g; 43.4 mmol) and a solution (20.7 mL) of methanol, hydrochloric acid (32%) and sulfuric acid (98%) (100: 1: 7) adding with vigorous stirring.
  • Nach 15 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird RS-2,3-Epoxy-1-propanol (45,9 g; 41,3 mL; 62 mmol) zu dem Reaktionsgemisch geben. After 15 min reaction time at room temperature is RS-2,3-epoxy-1-propanol (45.9 g; 41.3 mL; 62 mmol) to give the reaction mixture. Das Ganze wird im Ölbad (5 h; 40°C) weiter gerührt. The whole is in the oil bath (5 h; 40 ° C) stirred further. Anschließend wird die Lösung am Rotationsverdampfer auf das halbe Volumen eingedampft, mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 5,2 mL) versetzt und 16 h bei –2°C aufbewahrt. The solution is then evaporated on a rotary evaporator to half volume, washed with potassium hydrogen sulphate solution (5%; 5.2 ml) and kept for 16 hours at -2 ° C.
  • Das Produkt wird mit Dichlormethan (3 × 50 mL) extrahiert. The product is extracted with dichloromethane (3 x 50 mL). Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft. After drying with sodium sulfate, the organic phase is evaporated on a rotary evaporator to dryness.
    Ausbeute (Fmoc-RS-Dhc-OtBu): 5,67 g (96%); Yield (Fmoc-Dhc-RS-OtBu): 5.67 g (96%); [M + H] + : 474 [M + H] +: 474
  • In analoger Weise wird das RR-Stereoisomer von Fmoc-Dhc-OtBu unter Einsatz von R-2,3-Epoxy-1-propanol erhalten. In an analogous way, the RR stereoisomer of Fmoc-Dhc-OtBu using R-2,3-epoxy-1-propanol is obtained.
  • d) Synthese des Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteins (Fmoc-RS-Dhc-OH) d) Synthesis of Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] -cysteine ​​(Fmoc-RS-Dhc-OH)
  • Fmoc-RS-Dhc-OtBu (5,67 g; 12 mmol) wird in Trifluoressigsäure (99%; 142 mL) gelöst und das Reaktionsgemisch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Fmoc-Dhc-RS-OtBu (5.67 g; 12 mmol) is dissolved in trifluoroacetic acid (99%; 142 mL) and the reaction mixture stirred for 1 h at room temperature.
  • Die Lösung wird anschließend am Rotationsverdampfer eingedampft, mit N-Hexan (50 mL) und Diethylether (30 mL) versetzt und wieder am Rotationsverdampfer eingedampft. The solution is then evaporated on a rotary evaporator, with N-hexane was added (50 mL) and diethyl ether (30 mL) and again evaporated on a rotary evaporator. Der zähflüssige, ölige Rückstand wird anschließend in tert.-Butylalkohol/Wasser (80%; 100 mL) gelöst und lyophilisiert (64 h). The viscous, oily residue is then dissolved in tert-butyl alcohol / water (80%; 100 mL) and lyophilized (64 h).
    Ausbeute (Fmoc-RS-Dhc-OH): 3,03 g (60%); Yield (Fmoc-RS-Dhc-OH): 3.03 g (60%); [M+H] + : 418 [M + H] +: 418
  • e) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD e) Synthesis of Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD
  • Ein mit dem Seitenketten-geschützten Peptid AQEKEAKSELDYD beladenes Synthese-Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. A loaded with the side-chain protected peptide synthesis AQEKEAKSELDYD resin (5.22 .mu.mol) is reacted with N, N-dimethylformamide (100 uL) was added and 5 min in a reactor is allowed to swell.
  • Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente), Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (15 mg in 100 μl einer 0,5 M 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung in N,N-Dimethylformamid; 36,6 μmol; 7 Equivalente) und Diisopropylcarbodiimid-Lösung (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. After filtering off the N, N-dimethylformamide supernatant N, N-diisopropylethylamine (12.2 uL, 36.6 .mu.mol; 3 M in N, N-dimethylformamide 7 equivalents), Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2, 3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] -cysteine ​​(15 mg in 100 ul of a 0.5 M solution of 1-hydroxybenzotriazole in N, N-dimethylformamide; 36.6 .mu.mol; 7 equivalents) pipetted to the resin and diisopropylcarbodiimide solution (7 equivalents of 3 M in N, N-dimethylformamide; 12.2 ul;; 36.6 .mu.mol).
  • Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. The resin suspension is then incubated for 2 h at 37 ° C in a heating block. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen. Thereafter, the resin washed with N, N-dimethylformamide washed (3 x 600 uL) and dichloromethane (3 x 600 uL).
  • f) Veresterung von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD mit Palmitinsäure f) esterification of Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD with palmitic acid
  • Das mit Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD beladene Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. The with Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD loaded resin (5.22 .mu.mol) is (N, N-dimethylformamide 100 .mu.l ) was added and 5 min in a reactor allowed to swell.
  • Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1; 104 μL; 104 μmol; 20 Equivalente) und Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Nach 5 min wird 4-Dimethylaminopyridin (1 M in N,N-Dimethylformamid; 30 μL; 30 μmol; 5,7 Equivalente) zugeben. After filtering off the N, N-dimethylformamide supernatant N, N-diisopropylethylamine (3 M in N, N-dimethylformamide; 24.4 uL, 73.2 .mu.mol, 14 equivalents), palmitic acid (1M in N, N- dimethylformamide / dichloromethane (1: 1; 104 uL, 104 .mu.mol, 20 equivalents) and diisopropylcarbodiimide (3 M in N, N-dimethylformamide; 24.4 uL, 73.2 .mu.mol, 14 equivalents) were pipetted to the resin After 5 min. is (1 M in N, N-dimethylformamide, 5.7 equiv; 30 ul;; 30 .mu.mol) of 4-dimethylaminopyridine to admit.
  • Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. The resin suspension is then incubated for 2 h at 37 ° C in a heating block. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen. Thereafter, the resin washed with N, N-dimethylformamide washed (3 x 600 uL) and dichloromethane (3 x 600 uL). Die Veresterung wird ein weiteres Mal unter den gleichen Versuchsbedingungen wiederholt. The esterification is repeated once more under the same experimental conditions.
  • g) Abspaltung der Fmoc- sowie der Seitenketten-Schutzgruppen g) Elimination of the Fmoc and side-chain protecting groups
  • Das mit Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD beladene Harz (5,22 μmol) wird mit Dichlormethan (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. The with Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD loaded resin (5.22 .mu.mol) is added to dichloromethane (100 uL), and 5 min in a reactor allowed to swell.
  • Nach dem Abfiltrieren des Dichlormethan-Überstandes wird Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zum Harz pipettiert und die Mischung 10 min bei Raumtemperatur belassen. After filtering off the dichloromethane supernatant piperidine (30% in N, N-dimethylformamide; 200 ul) was pipetted to the resin and the mixture left for 10 min at room temperature. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) gewaschen. Thereafter, the resin washed with N, N-dimethylformamide washed (3 x 600 uL). Anschließend wird nochmals Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zu dem Harz pipettiert und die Suspension 20 min bei Raumtemperatur belassen. (200 ul 30% in N, N-dimethylformamide) was pipetted to the resin and the suspension left for 20 min at room temperature piperidine is subsequently again. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL), Dichlormethan (3 × 600 μL) und Diethylether (4 × 600 μL) gewaschen. Thereafter (ul 4 x 600), the resin washed with N, N-dimethylformamide (3 x 600 uL), dichloromethane (3 x 600 uL) and diethyl ether.
  • Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit Hilfe des Ninhydrin-Testes kontrolliert. Completion of the reaction is controlled by means of the ninhydrin test.
  • h) Abspaltung des Lipopeptides S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD vom Synthese-Harz h) cleavage of the lipopeptide S- [2,3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD from the synthesis resin
  • Die Abspaltlösung Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser (92,5:5:2,5; 300 μL) wird zu dem Harz (2,6 μmol) pipettiert und die Suspension 2 h bei Raumtemperatur belassen. The cleavage solution trifluoroacetic acid / triisopropylsilane / water (92.5: 5: 2.5, 300 ul) is pipetted to the resin (2.6 .mu.mol), leaving the suspension for 2 h at room temperature. Anschließend wird die Abspaltlösung mit Druckluft in ein Reagenzglas filtriert. Subsequently, the cleavage solution is filtered with compressed air in a test tube. Nachfolgend werden weitere 200 μL Abspaltlösung zu dem Harz pipettiert und die Suspension nochmals 30 min bei Raumtemperatur belassen. Subsequently, another 200 ul cleavage solution are pipetted to the resin and 30 min at room temperature, leaving the suspension again.
  • Nach erneuter Filtration der Abspaltlösung mit Druckluft wird das Harz mit Dichlormethan (200 μL) gewaschen. After renewed filtration, the cleavage solution with compressed air, the resin with dichloromethane (200 uL) is washed. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft. The filtrate and washings are combined and concentrated on a rotary evaporator. Der Rückstand wird mit Diethylether (3 × 300 μL) digeriert und anschließend zentrifugiert. The residue is digested with diethyl ether (3 x 300 uL) and then centrifuged. Das Sediment wird in tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1; 2 ml) aufgenommen und gefriergetrocknet (18 h). The sediment is in tert-butyl alcohol / water (4: 1; 2 ml) was added and freeze-dried (18 h).
    Ausbeute (Pam 2 -(2RS)-Dhc-AQEKEAKSELDYD): 5,6 mg (98%); Yield (Pam 2 - (2RS) -Dhc-AQEKEAKSELDYD): 5.6 mg (98%);
    M: 2180; M: 2180; [M+2H] 2+ : 1091; [M + 2H] 2+ 1091; [M+3H] 3+ : 728 [M + 3H] 3+: 728
  • i) Acylierung von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD mit Palmitinsäure i) acylation of S- [2,3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD with palmitic acid
  • Das mit S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-AQEKEAKSELDYD beladene Harz (5 mg; 2,6 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. The with S- [2,3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propyl] - [R] cysteinyl-AQEKEAKSELDYD loaded resin (5 mg, 2.6 .mu.mol) is reacted with N, N-dimethylformamide (100 uL) was added and 5 min in a reactor allowed to swell.
  • Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1; 36,6 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente) und Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. After filtering off the N, N-dimethylformamide supernatant N, N-diisopropylethylamine (3 M in N, N-dimethylformamide; 12.2 uL, 36.6 .mu.mol, 14 equivalents), palmitic acid (1M in N, N- dimethylformamide / dichloromethane (1: 1; 36.6 uL, 36.6 .mu.mol, 14 equivalents) and diisopropylcarbodiimide (3 M in N, N-dimethylformamide; 12.2 uL, 36.6 .mu.mol, 14 equivalents) were pipetted to the resin ,
  • Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. The resin suspension is then incubated for 2 h at 37 ° C in a heating block. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen. Thereafter, the resin washed with N, N-dimethylformamide washed (3 x 600 uL) and dichloromethane (3 x 600 uL).
  • Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt nach dem unter h) beschriebenen Verfahren. The cleavage of the product from the resin is carried out according to the process described under h).
    Ausbeute (Pam 3 -(2RS)-Dhc-AQEKEAKSELDYD): 5,6 mg (89%); Yield (Pam 3 - (2RS) -Dhc-AQEKEAKSELDYD): 5.6 mg (89%);
    M: 2418; M: 2418; [M+2H] 2+ : 1210; [M + 2H] 2+: 1210; [M+3H] 3+ : 807 [M + 3H] 3+: 807
  • Beispiel B – Bestimmung der immunstimulierenden Aktivität synthetischer bakterieller Lipopeptide anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen Example B - Determination of the immunostimulating activity of synthetic bacterial lipopeptides on the basis of IL-8 secretion by THP-1 cells
  • Die Charakterisierung der immunstimulatorischen Aktivität von Lipopeptiden erfolgte anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen, eine humane monozytäre Leukämie-Zelllinie (DSMZ Braunschweig, No. ACC 15). Characterization of the immunostimulatory activity of lipopeptides was carried out on the basis of IL-8 secretion by THP-1 cells, a human monocytic leukemia cell line (DSMZ Braunschweig, No. ACC 15). Die THP-1-Zellen wurden bei 37°C in RPMI 1640-Zellkulturmedium mit 10% fetal bovine serum (PAN Biotech) in einer mit 5% CO 2 angereicherten Atmosphäre kultiviert. The THP-1 cells were cultured at 37 ° C in RPMI 1640 cell culture medium with 10% fetal bovine serum (PAN Biotech) in a 5% CO 2 enriched atmosphere.
  • Zur Durchführung der Bestimmungen wurden je 180 μL (5 × 10 4 Zellen) in die Wells einer Mikrotiterplatte gegeben. To carry out the determinations per 180 ul (5 x 10 4 cells) were added to the wells of a microtiter plate. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden die Zellsuspensionen mit den Lipopeptid-Lösungen versetzt. After 1 h incubation at 37 ° C, the cell suspensions were mixed with the lipopeptide solutions.
  • Dazu wurde zunächst eine 1 mM Lipopeptid-Stammlösung in DMSO hergestellt. For that, a 1 mM lipopeptide stock in DMSO was prepared. Diese wurde 1:20 mit tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1, v/v) und anschließend 1:500 mit dem Zellkulturmedium weiter verdünnt. This was 1:20 with tert-butyl alcohol / water (4: 1, v / v) followed by 1: 500 diluted further with the cell culture medium. Die abschließende Verdünnung zu der im Test gewünschten Endkonzentration erfolgte durch die Wahl des zu der Zellsuspension zugegebenen Volumens dieser 100 nM Lipopeptid-Lösung. The final dilution to the desired final concentration in the assay was carried out lipopeptide solution by the choice of the added to the cell suspension volume of 100 nM. Als Kontrolle wurde eine Lipopeptid-freie Lösung, die dieselben Mengen an DMSO und tert.-Butylalkohol enthält, mitgeführt. As a control, a lipopeptide-free solution containing the same amounts of DMSO and tert-butyl alcohol was contains entrained.
  • Nach 5 h Inkubation der Lipopeptide mit der Zellsuspension wurden die Zellkulturüberstände abgenommen und bis zur Messung bei –80°C eingefroren. After 5 h incubation the lipopeptides with the cell suspension, the cell culture supernatants were collected and frozen until measurement at -80 ° C.
  • Die Bestimmung der IL-8-Konzentration erfolgte in einem Sandwich-ELISA nach dem Prinzip eines nicht-kompetitiven Assays. The determination of IL-8 concentration was carried out in a sandwich ELISA according to the principle of a non-competitive assays. Der ELISA wurde in Mikrotiterplatten mit einem maximalen Volumen von 300 μL pro Well bei Raumtemperatur durchgeführt (Nunc-Immuno TM 96MicroWell TM Plates/MaxiSorp TM ). The ELISA was performed in microtiter plates with a maximum volume of 300 ul per well at room temperature (Nunc-Immuno TM TM 96MicroWell Plates / MaxiSorp TM). Je Platte wurden zwei IL-8-Lösungen bekannter Konzentration (Recombinant Human Interleukin-8-Standard/Sigma/Produkt-Nr. I 1645) als interner Standard mitgeführt. Each plate has two IL-8 solutions of known concentration were (Recombinant Human Interleukin-8 Standard / Sigma / product no. I 1645) carried as an internal standard.
  • a) Beschichtung der Mikrotiterplatte mit humanem anti-IL-8-Antikörper a) coating the microtiter plate with human anti-IL-8 antibodies
  • Die Mikrotiterplatten wurden mit einem Antikörper gegen humanes IL-8 beschichtet. The microtiter plates were coated with an antibody against human IL-8. Dieses sogenannte „Coating” beruht auf einer unspezifischen hydrophoben, nicht kovalenten, Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial der Mikrotiterplatte und dem Antikörper. This so-called "Coating" is based on a non-specific hydrophobic, non-covalent, interaction between the carrier material of the microtiter plate and the antibody.
  • Dazu wurde eine Lösung des primären Antikörpers (human anti-IL-8-Antikörper/Konz. 0,5 mg/mL/BD Biosciences Pharmingen/Produkt-Nr. 554716) mit PBS-Puffer (pH 7,2/Gibco TM Invitrogen Corporation/Produkt-Nr. 14200-067) auf 1 μg/mL verdünnt. Thereto, a solution of the primary antibody was (human anti-IL-8 antibody / conc. 0.5 mg / mL / BD Biosciences Pharmingen / product no. 554716) (with PBS buffer pH 7.2 / Gibco Invitrogen Corporation TM / product no. 14200-067) diluted to 1 ug / mL. In jedes Well der Mikrotiterplatte wurden 100 μL dieser Lösung pipettiert. In each well of the microtiter plate 100 microliters of this solution were pipetted. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte mit einem Deckel versehen und 16 h bei Raumtemperatur inkubiert. Subsequently, the microtiter plate was provided with a lid and incubated for 16 h at room temperature.
  • b) Waschschritt b) wash step
  • Nach der Inkubation wurden die restlichen freien Antikörper durch Waschen entfernt. After incubation, the residual free antibodies were removed by washing.
  • Dazu wurde die Platte 3 mal mit 250 μL Waschpuffer (50 mM Tris (pH 8,0) + 0,2% Tween 20 in Reinstwasser) je Well gewaschen, wobei die Waschlösungen nach jeweils 30 s Verweilzeit durch Dekantieren und Ausklopfen der Platte entfernt wurden. For this purpose, the plate was washed 3 times with 250 L wash buffer (50 mM Tris (pH) + 0.2% Tween 20 in ultrapure water 8.0) per well washed, the washings were removed by decanting and tapping the plate after each 30 sec dwell time ,
  • c) Blockierschritt c) blocking step
  • Um spätere unerwünschte Adsorptionen von Bestandteilen aus der Testsubstanz zu vermeiden, wurden evtl. unbeschichtete Flächen in den Mikrotiterplatten mit BSA-Lösung (Bovine Albumin/Sigma/Produkt-Nr. A7906) abgesättigt. In order to avoid later undesirable adsorption of constituents from the test substance, possibly uncoated surfaces were saturated (Bovine albumin / Sigma / product number A7906.) In the microtiter plate with BSA-solution.
  • Dazu wurden 200 μL des Blockierungspuffers (4%ige BSA-Lösung in 9 Teilen Reinstwasser und einem Teil PBS-Puffer pH 7,2) in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettiert und die Platten 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. For this purpose, 200 .mu.l of blocking buffer was pipetted (4% BSA solution in ultrapure water and 9 parts of a portion of PBS buffer pH 7.2) in each well of the microtiter plate and the plates incubated for 60 min at room temperature.
  • d) Waschschritt d) washing step
  • Der überschüssige Blockierungspuffer wurde entsprechend Schritt b) entfernt. The excess blocking buffer was removed according to step b).
  • e) Zugabe der Zellkulturüberstände e) adding the cell culture supernatants
  • Anschließend wurden die Zellkulturüberstände in die beschichtete Mikrotiterplatte, in deren Wells die immobilisierten Antikörper das Interleukin-8 aus der antigenhaltigen Probe spezifisch binden, gegeben. Subsequently, the cell culture supernatants were added to the coated microtiter plate, the immobilized antibodies specifically bind to the wells, the interleukin-8 from the antigen-containing sample.
  • Dazu wurden 50 μL Blockierungspufferpuffer je Well vorgelegt, je 50 μL der zu untersuchenden Probe zugeben und das Ganze 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. For this purpose, buffer 50 L of blocking buffer per well were initially charged, add 50 .mu.l of the sample to be examined and incubated for 90 min at room temperature. Jede Probe wurde in einer Dreifachbestimmung untersucht. Each sample was tested in one experiment in triplicate.
  • f) Waschschritt f) washing step
  • Nach der Antigen-Antikörper-Reaktion wurde ungebundenes Probenmaterial entsprechend Schritt b) aus der Mikrotiterplatte entfernt. After the antigen-antibody reaction, unbound sample material according to step b) was removed from the microtiter plate.
  • g) Inkubation mit Sekundärantikörper g) incubation with secondary antibodies
  • Anschließend wurde ein biotinylierter Sekundärantikörper in die Wells gegeben, der gegen eine andere Determinante des Interleukins-8 gerichtet ist und an diese bindet. Then a biotinylated secondary antibody in the wells was given, which is directed against another determinant of interleukin-8 and binds to them.
  • Die Lösung des sekundären Antikörpers (Biotin mouse anti-human IL-8-Antikörper/Konz. 0,5 mg/mL/BD Biosciences Pharmingen/Produkt-Nr. 554718) wurde dazu mit Blockierungspuffer auf eine Konzentration von 1 μg/mL verdünnt. The solution of the secondary antibody (Biotin mouse anti-human IL-8 antibody / conc. 0.5 mg / mL / BD Biosciences Pharmingen / product no 554,718th) was diluted with blocking buffer to a concentration of 1 ug / mL. Pro Well wurden 100 μL dieser Lösung pipettiert und die Mikrotiterplatte 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Per well 100 ul of this solution was pipetted and incubated the microtiter plate for 60 minutes at room temperature.
  • h) Waschschritt h) Wash step
  • Nach der Reaktion wurden die überschüssigen Antikörper entsprechend Schritt b) aus der Mikrotiterplatte entfernt. After the reaction, the excess antibody in accordance with step b) were removed from the microtiter plate.
  • i) Inkubation mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase i) incubation with streptavidin-horseradish peroxidase
  • Zuletzt erfolgte die Zugabe des mit Meerrettichperoxidase konjugierten Streptavidins, das an die Biotinmoleküle des sekundären Antikörpers bindet. Last by addition of the horseradish peroxidase conjugated streptavidin, which binds to the biotin molecules of the secondary antibody.
  • Dazu wurde die Streptavidin-HRP-Lösung (Streptavidin-HRP (Horseradish Peroxidase)/Konz. 1,25 mg/mL/PIERCE ENDOGEN/Produkt-Nr. 21126) mit Blockierungspuffer auf 0,25 μg/mL verdünnt. For this, the streptavidin-HRP solution (streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) / conc. 1.25 mg / mL / PIERCE ENDOGEN / product no. 21126) diluted with blocking buffer to 0.25 ug / mL. Je 100 μL dieser Lösung wurden in die Wells pipettiert und das Ganze 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. 100 .mu.l of this solution were pipetted into the wells and incubated for 60 min at room temperature.
  • j) Waschschritt j) washing step
  • Nach der Reaktion wurde das überschüssige Enzym entsprechend Schritt b) entfernt. After the reaction, the excess enzyme according to step b) has been removed.
  • k) Zugabe der Substratlösung 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin k) adding the substrate solution of 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • Das als Substrat zugegebene 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin wird von der an die biotinylierten Sekundärantikörper gebundenen Peroxidase zu einem blauen Endprodukt umgesetzt. The added as substrate 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is converted by the bound to the biotinylated secondary antibodies peroxidase to a blue final product.
  • Dazu wurden 100 μL der Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/Sigma/Produkt-Nr. T0440) pro Well pipettiert und die Mikrotiterplatte 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. For this purpose, 100 .mu.l of the substrate solution (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine / Sigma / product no. T0440) was pipetted per well and the microtiter plate incubated 5 min at room temperature in the dark. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 M Schwefelsäure beendet. The reaction was terminated by addition of 1 M sulfuric acid. Dies führte zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. This resulted in a color change from blue to yellow.
  • l) Detektion l) Detection
  • Die optische Dichte der Lösung wurde bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader Spectra MAX 340 (Molecular Devices) gemessen. The optical density of the solution was measured at 450 nm with a microplate reader Spectra MAX 340 (Molecular Devices). Die IL-8-Konzentration wurde aus der Kalibrierkurve ermittelt. The IL-8 concentration was determined from the calibration curve.
  • Beispiel C – Nachweis der Allergie-protektiven Potenz der erfindungsgemäßen Lipopeptide im standardisierten Tiermodell – Methoden Example C - Detection of allergy-protective potency of the lipopeptides according to the invention in standard animal model - Methods
  • Die vollständige Allergie-protektive Potenz, Aktivität und Wirkung der erfindungsgemäßen Lipopeptide wurde durch immunologische und zellbiologische Funktionsuntersuchungen im standardisierten Tiermodell der Maus in vivo bestimmt. The complete allergy-protective potency, activity and effect of the lipopeptides according to the invention was determined by immunological and cell biological function studies in the standardized mouse model in vivo.
  • Im folgenden werden zunächst die Methoden zur Sensibilisierung und Induktion von allergischem Asthma bei Mäusen, zur Behandlung mit den Lipopeptid-Lösungen und zur Analyse der allergischen und entzündlichen Reaktionen beschrieben. In the following the methods for the sensitization and induction of allergic asthma in mice for treatment with the lipopeptide solutions and for analysis of the allergic and inflammatory reactions are described first.
  • Das Behandlungsprotokoll mit dem zeitlichen Ablauf des Modellversuches ist in The treatment protocol with the timing of the model experiment is in graphisch dargestellt. shown graphically.
  • a) Sensibilisierung und Induktion von allergischem Asthma bei Mäusen mit Ovalbumin (OVA) a) sensitization and induction of allergic asthma in mice with ovalbumin (OVA)
  • Die Versuchstiere, sieben Wochen alte weibliche Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c (Charles River, Sulzfeld), wurden 14 Tage an die Umgebung gewöhnt. The test animals seven week old female mice of the inbred strain BALB / c (Charles River, Sulzfeld), 14 days became accustomed to the environment. Sie hatten nach Belieben Zugriff auf Wasser und Nahrung. They had freely access to water and food.
  • Die Sensibilisierung der Mäuse erfolgte durch zweimalige intraperitoneale Injektion eines Gemisches von 20 μg Ovalbumin (Grade V/Sigma) und 2,2 mg Aluminiumhydroxid (ImjectAlum/Pierce) in einem Gesamtvolumen von 200 μL PBS-Puffer. The sensitization of the mice was performed by twofold intraperitoneal injection of a mixture of 20 ug ovalbumin (Grade V / Sigma) and 2.2 mg aluminum hydroxide (ImjectAlum / Pierce) in a total volume of 200 ul of PBS buffer. Aluminiumhydroxid wurde als Adjuvans verwendet, da von diesem bekannt ist, dass es T H 2-stimulierte Immunantworten auslöst, die durch die Produktion der Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 und von Antikörpern des Isotyps IgE und IgG1 (entsprechend IgG4 beim Menschen) charakterisiert sind. Aluminum hydroxide was used as adjuvant since it is known from this that it triggers T H 2-stimulated immune responses, characterized by the production of the cytokines IL-4, IL-5 and IL-13 and antibodies of isotype IgE and IgG1 (corresponding IgG4 are characterized in humans).
  • Um anschließend eine allergische Reaktion in der Lunge der Mäuse hervorzurufen, also das akute allergische Asthma auszulösen, wurden die Mäuse am Tag 28 und Tag 38 jeweils für 20 min mit einem Aerosol einer 1%igen Ovalbumin-Lösung behandelt. Then to cause an allergic reaction in the lungs of the mice, so trigger the acute allergic asthma, the mice on day 28 and day 38 were respectively treated for 20 min with an aerosol of a 1% ovalbumin solution. Hierzu wurden die Mäuse in eine 11 L-Plexiglas-Kammer gesetzt, an die ein Pari-Boy-Turbo Aerosol Generator der Firma Pari angeschlossen war. For this, the mice were placed in a 11 L Plexiglas chamber to which a Pari-Boy turbo aerosol generator from Pari was connected.
  • Nach der zweiten Applikation des OVA-Aerosols konnten bei den Mäusen einige Tage lang die Symptome des akuten allergischen Asthmas diagnostiziert werden: After the second application of OVA-aerosol, the symptoms of acute allergic asthma could be diagnosed for several days in the mice:
    • 1) verstärkte Reaktion gegen Methacholin (bronchiale Hyperreaktivität) 1) increased response to methacholine (bronchial hyperreactivity)
    • 2) verstärkte Infiltration von eosinophilen Granulozyten und Lymphozyten in das Atemwegslumen 2) increased infiltration of eosinophils and lymphocytes in the airway lumen
    • 3) Produktion von Ovalbumin-spezifischen Antikörpern der Isotypen IgE und IgG1 3) production of ovalbumin-specific antibodies of isotypes IgE and IgG1
    • 4) Produktion von Interleukin-5 nach in vitro Restimulierung der Milz-Zell-Lymphozyten mit Ovalbumin 4) production of interleukin-5 following in vitro restimulation of spleen cell lymphocytes with ovalbumin
  • b) Messung der bronchialen Hyperreaktivität b) Measurement of bronchial hyperreactivity
  • Ein entscheidender diagnostischer Parameter, um eine allergisch asthmatische Erkrankung sicher zu diagnostizieren, ist die bronchiale Hyperreaktivität. A decisive diagnostic parameter to diagnose an allergic asthmatic disease sure is the bronchial hyperreactivity. Hierbei handelt es sich um eine Überempfindlichkeit der glatten Muskulatur der Bronchien gegen unspezifische Reizungen. This is a hypersensitivity of the bronchial smooth muscle to nonspecific irritation. Zur Diagnose beim Menschen werden geringe Konzentrationen Histamin appliziert. For diagnosis in humans, low levels of histamine are applied. Anschließend wird der Atemwegswiderstand gemessen. Thereafter, the airway resistance is measured. Asthmatische Personen zeigen eine von der Histaminkonzentration abhängige stärkere Bronchokonstriktion und damit einen höheren Atemwegswiderstand als gesunde Personen. Asthmatic people may be dependent on the concentration of histamine bronchoconstriction stronger and thus a higher airway resistance than healthy people.
  • Zur Provokation bei Mäusen verwendet man anstelle von Histamin Methacholin, da die Bronchien von Mäusen nicht auf Histamin reagieren. To provocation in mice using in place of histamine methacholine, as the bronchi of mice do not respond to histamine. Die Mäuse werden in einen Ganzkörper-Plethysmographen (Buxco Electronics), durch dessen Kammern ein kontinuierlicher Luftstrom fließt, gesetzt. The mice are placed in a whole body plethysmograph (Buxco Electronics) through the chambers of a continuous air stream flows. Aus den durch die Atmung bedingten Druckänderungen wird für jeden Atemzyklus der sogenannte Penh-Wert berechnet, der mit dem Atemwegswiderstand korreliert. From the caused by the respiration pressure changes of the so-called Penh value is calculated for each breath cycle, which correlates with the airway resistance. Bei hyperreaktiven Mäusen erhöht sich der Atemwegswiderstand mit der Methacholin-Konzentration, was sich durch die Erhöhung des Penh-Wertes ausdrückt. In hyperreactive mice, the airway resistance increased with the methacholine concentration, which is expressed by the increase of Penh value.
  • Die Messung der bronchialen Hyperreaktivität erfolgte 24 Stunden nach der letzten OVA-Aerosol Exposition. The measurement of the bronchial hyperreactivity carried out 24 hours after the last OVA aerosol exposure. Für die Messung wurden die Mäuse nach einer Gewöhnungszeit von 10 min im Plethysmographen 7 min lang mit PBS-Aerosol in Kontakt gebracht. For the measurement, the mice were sacrificed after a habituation period of 10 min min brought into contact with PBS aerosol in the plethysmograph. 7 Anschließend erfolgte jeweils für 7 min die Exposition mit aufsteigenden Methacholin-Konzentrationen (6 mg/mL, 12 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL/Sigma). was then carried out in each case for 7 min exposure with increasing concentrations of methacholine (6 mg / mL, 12 mg / mL, 25 mg / mL, 50 mg / mL / Sigma). Der Penh-Wert wurde kontinuierlich gemessen und über Perioden von 30 s gemittelt. The Penh value was continuously measured and averaged over periods of 30 s. Der höchste Penh-Mittelwert einer Konzentrationsstufe wurde dann gegen die Methacholin-Konzentration aufgetragen. The highest average Penh-one concentration was then plotted versus the methacholine concentration. Die Fläche unter dieser Dosis-Wirkungs-Kurve ist umso größer, je stärker die Mäuse auf Methacholin reagieren, sie korreliert also mit der Hyperreagibilität der Tiere. The area under the dose-response curve is the greater, the more the mice respond to methacholine, so they correlated with the hyperreactivity of the animals.
  • c) Untersuchung der zellulären Zusammensetzung der bronchoalveolären Lavage (BAL) c) Investigation of the cellular composition of the bronchoalveolar lavage (BAL)
  • Die bei gesunden Probanden bzw. unbehandelten Mäusen im Lungengewebe und im Lumen der Atemwege vorgefundenen Leukozyten sind fast ausschließlich Makrophagen. The found in healthy subjects and untreated mice in lung tissue and in the lumen of the airway leukocytes are almost exclusively macrophages. Andere Leukozyten-Typen sind in der Regel nicht nachweisbar. Other leukocyte types are not detectable in the rule. Im Zusammenhang mit allergischem Asthma kommt es aus noch nicht ganz geklärten Ursachen zur massiven Infiltration der Atemwege durch eosinophile Granulozyten und im geringeren Maße durch Lymphozyten und Neutrophile. In connection with allergic asthma it comes from is not entirely clear reasons for the massive infiltration of the airways by eosinophils and to a lesser extent by lymphocytes and neutrophils.
  • Um die Zusammensetzung des Leukozyten-Infiltrats in den Atemwegen zu untersuchen, wurden die Mäuse drei Tage nach der letzten OVA-Aerosol Exposition getötet. In order to investigate the composition of leukocyte infiltration in the respiratory tract, the mice were sacrificed three days after the last OVA aerosol exposure. Die Trachea wurde freigelegt und das Lumen der Atemwege über eine 24G Venen-Verweilkanüle zweimal mit jeweils 1 ml isotonischem Puffer gewaschen (bronchoalveoläre Lavage). The trachea was exposed and the lumen of the respiratory tract was washed with a 24G indwelling vein twice with 1 ml of isotonic buffer (bronchoalveolar lavage). Die Gesamtzahl der Leukozyten, die auf diese Weise aus der Lunge herausgespült wurden, wurde mittels Neubauer Zählkammer mikroskopisch ausgezählt. The total number of leukocytes, which were flushed out in this way from the lungs was counted microscopically using a Neubauer counting chamber.
  • Anschließend wurden die Leukozyten mit einer Zyto-Zentrifuge der Firma Shandon auf Objektträger zentrifugiert und mit dem HAEME-Schnellfärbungs-Kit der Firma Labor + Technik Eberhard Lehmann, wie in der Produktbeilage beschrieben, angefärbt. Subsequently, the leukocytes were centrifuged at a cyto-centrifuge Shandon on slides and stained with the HAEME Quick Dye kit from Labor + Technik Eberhard Lehmann, as described in the product insert. Nach erfolgter Färbung wurden 300 Zellen auf dem Objektträger mikroskopisch ausgezählt und nach den gängigen Kriterien in die unterschiedlichen Leukozyten-Subpopulationen eingeteilt. After staining 300 cells were counted under the microscope on the slide and classified according to the established criteria in the different leukocyte subpopulations.
  • d) Messung von OVA-spezifischen Antikörpern des Isotyps IgE, IgG1 und IgG2a d) Measurement of OVA-specific antibodies of isotype IgE, IgG1 and IgG2a
  • Die Sensibilisierung gegen ein. Sensitization to one. Allergen kann durch die Bestimmung von Allergen-spezifischen Antikörpern der Klassen IgG1, IgG2a und IgE gemessen werden, zu deren Quantifizierung ein Labor-internes Standard-Serum verwendet wird. allergen can be measured by the determination of allergen-specific antibodies of the classes IgG1, IgG2a and IgE to their quantification a laboratory internal standard serum is used. Im verwendeten murinen Allergiemodell korreliert der Anstieg des spezifischen Immunglobulin-Titers jedoch auch mit dem Anstieg der Gesamt-Immunglobulin-Konzentration, wie bereits in der Literatur gezeigt wurde. As used murine allergy model, however, the increase in the specific immunoglobulin titer correlated with the increase in total immunoglobulin concentration was shown already in the literature. Daher wurden zur Beschreibung des Sensibilisierungs-Grades die Gesamt-Immunglobulin Titer mittels kommerziell erhältlichen „Sandwich”-ELISA Testsystemen quantifiziert. Therefore, the total immunoglobulin titer to describe the degree of sensitization were quantified by commercially available "sandwich" ELISA test systems. Für die Messung von IgE wurde ein optEIA Testsystem der Firma BD Biosciences eingesetzt. For the measurement of IgE a OptElA test system from BD Biosciences was used. Für die Bestimmung von IgG1 und IgG2a wurden Testsysteme der Firma Bethyl-Laborstories verwendet. For the determination of IgG1 and IgG2a test systems from Bethyl-Laboratories were used. Die Testdurchführung richtete sich nach den Herstellerangaben. The test procedure was directed by the manufacturer.
  • Zur Bestimmung der Antikörper im Serum der Mäuse wurde den Mäusen zwei Tagen nach der letzten Applikation von OVA-Aerosol Blut aus der Schwanzvene entnommen. For the determination of antibodies in the serum of the mice, the mice were taken after the last application of OVA aerosol blood from the tail vein of two days. Nach dem Gerinnen des Bluts wurde das Serum durch Zentrifugation gewonnen. After coagulation of the blood, serum was obtained by centrifugation. Zur Bestimmung der Antikörper in der BAL-Flüssigkeit der Mäuse wurde diese wie oben beschrieben gewonnen. To determine the antibody in the BAL fluid of mice it has been obtained as described above.
  • Zur Quantifizierung wurde auf jeder ELISA-Platte eine Verdünnungsreihe eines Standard-Serums mit bekannten IgG1-, IgG2a- bzw. IgE-Konzentrationen mitgeführt. For quantification, a dilution series of a standard serum with known IgG1, IgG2a and IgE concentrations was carried on each ELISA plate. Durch den Vergleich der Messwerte für die unbekannten Proben mit denen des Standards, kann die Konzentration in den Serum- und BAL-Proben berechnet werden. By comparing the measured values ​​for the unknown samples with those of the standard, the concentration in the serum and BAL samples can be calculated.
  • e) Messung der in vitro IL-5 Produktion von Milz-Zellen nach Restimulation mit OVA e) Measurement of in vitro IL-5 production by spleen cells after restimulation with OVA
  • Die Eosinophilie in den Atemwegen, als Folge der allergischen Sensibilisierung, ist von der Sekretion von T H 2-Typ-Zytokinen, speziell IL-5, durch die Lymphozyten abhängig. Eosinophilia in the airways, as a result of allergic sensitization is dependent upon the secretion of T H 2 type cytokines, especially IL-5, by the lymphocytes. Somit korreliert die Ausschüttung von IL-5 mit der Intensität der eosinophilen Atemwegsinflammation. Thus, the secretion of IL-5 correlates with the intensity of eosinophilic airway inflammation. In den Atemwegen gesunder Tiere wird kein IL-5 produziert. In the respiratory tract of healthy animals no IL-5 is produced.
  • Um die Fähigkeit der Milz-Zellen zur Produktion des Zytokines IL-5 zu bestimmen, wurden die Mäuse drei Tage nach der letzten OVA-Aerosol Exposition getötet und die Milz entnommen. To determine the ability of spleen cells to produce the cytokine, IL-5, the mice were sacrificed three days after the last exposure to OVA aerosol and removed the spleen. Durch mechanische Zerkleinerung wurde daraus eine Zellsuspension erzeugt und die Erythrozyten wurden aufgelöst. from a cell suspension was produced by mechanical comminution and the erythrocytes were dissolved. Die Milz-Zellen wurden dann in einem Zellkulturmedium (RPMI-1640 mit 10% fetal calf serum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin/alle Biochrom) inkubiert (Zelldichte of 5 × 10 6 Zellen pro mL Medium). The spleen cells were then incubated in a cell culture medium (RPMI-1640 with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 ug / mL streptomycin / all Biochrom) and incubated (cell density of 5 x 10 6 cells per ml of medium).
  • Zur Stimulation der spezifischen Zytokin-Produktion wurde OVA bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/mL zugegeben. For the specific cytokine production stimulation OVA was added to a final concentration of 50 ug / mL were added. Nach 48 h Inkubation wurden die Überstände entnommen und die IL-5-Konzentration mit einem optEIA-Kit (BD Biosciences) entsprechend der Produktbeschreibung bestimmt. After 48 h incubation the supernatants were removed and the IL-5 concentration with an OptEIA kit (BD Biosciences) determined according to the product description.
  • f) Behandlung von Mäusen mit Lipopeptid-Lösungen über die Atemwege f) Treatment of mice with lipopeptide solutions via the respiratory tract
  • Die Lipopeptide wurden in DMSO zu einer 5 mg/mL enthaltenden Stammlösung gelöst und anschließend mit PBS-Puffer auf die benötigten Konzentrationen (0,1 mg/mL, 0,4 mg/mL, 1 mg/mL) verdünnt. The lipopeptides were dissolved containing a 5 mg / mL stock solution in DMSO and then with PBS buffer to the required concentrations (0.1 mg / mL, 0.4 mg / mL, 1 mg / mL).
  • Um einen Dosis-abhängigen Effekt der immunstimulatorischen Wirkung zu erfassen, wurden Gruppen gebildet, die mit unterschiedlichen Dosen des Lipopeptides (5 μg, 20 μg, 50 μg) behandelt wurden. To detect a dose-dependent effect of the immunostimulatory effect, groups were formed, with different doses of the lipopeptide (5 micrograms, 20 micrograms, 50 micrograms) were treated. Pro Konzentrationsstufe wurden 5 Tiere behandelt. 5 animals were treated per concentration level. Eine Kontrollgruppe (5 Tiere) wurde mit einer Lipopeptid-freien DMSO-Lösung (4%ig in PBS-Puffer), eine weitere (5 Tiere) mit reinem PBS-Puffer anstelle des Lipopeptides behandelt. A control group (5 animals) was mixed with a lipopeptide free DMSO solution (5 animals) treated (4% in PBS buffer), another with pure PBS buffer in place of the lipopeptide.
  • Die erfindungsgemäßen Lipopeptide wurden den Mäusen intranasal in gelöster Form appliziert. The lipopeptides of the invention were administered to the mice intranasally in dissolved form. Hierzu wurden die Tiere mit einem Gemisch aus Ketamin und Rompun narkotisiert. For this, the animals were anesthetized with a mixture of ketamine and Rompun. Anschließend wurden je 50 μL Lösung pro Tier intranasal appliziert. Then each 50 L of solution per animal intranasally were applied.
  • Die Behandlungen erfolgten parallel zur Sensibilisierung mit OVA, insgesamt 14 mal zu den im Behandlungsschema ( Treatments were parallel to sensitization with OVA, a total of 14 times (to the treatment regimen ) spezifizierten Zeitpunkten. ) Specified time points.
  • g) Statistische Auswertung g) Statistical analysis
  • Die Ergebnisse der Versuche wurden mit Hilfe der Methoden der robusten Statistik ausgewertet. The test results were evaluated using the methods of robust statistics. Die Signifikanz der erzielten Effekte wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test geprüft. The significance of the effects achieved has been tested with the Mann-Whitney U test. In den Diagrammen wurden die Einzelwerte sowie der Median dargestellt: In the diagrams, the individual values ​​and the median were represented:
  • Beispiel D – Nachweis der Allergie-protektiven Potenz der erfindungsgemäßen Lipopeptide im standardisierten Tiermodell – Ergebnisse Example D - Evidence of allergy-protective power of the lipopeptides according to the invention in the standardized animal model - Results
  • Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Lipopeptide bei der Behandlung allergischer Erkrankungen zu zeigen, wurden diese im standardisierten Mausmodell für allergisches Asthma mit den im Ausführungsbeispiel C beschriebenen Methoden getestet. To demonstrate the effectiveness of the lipopeptides according to the invention in the treatment of allergic diseases, they were tested in the standard mouse model of allergic asthma with those described in the embodiment C methods. Beispielhaft für die erfindungsgemäßen Lipopeptide werden hier die Effekte einer Behandlung mit RR-Pam 3 Cys-AQEKEAKSELDYD (LPM, SEQ ID NO 3) dargestellt. Illustrative of the invention lipopeptides the effects of treatment with RR-Pam 3 Cys-AQEKEAKSELDYD (LPM, SEQ ID NO 3) is shown here.
  • a) Asthma-Symptome a) asthma symptoms
  • Der am weitesten gehende Versuch zum Nachweis der biologischen Wirkung der erfindungsgemäßen Lipopeptide ist die Untersuchung der durch das OVA-Aerosol ausgelösten Asthma-Symptome, speziell der bronchialen Hyperreaktivität. The most extensive test to demonstrate the biological effect of the lipopeptides according to the invention is the study of the induced by OVA aerosol asthma symptoms, especially of bronchial hyperreactivity.
  • zeigt, dass die allergiebedingte Empfindlichkeit der Atemwege bei den asthmatischen Mäusen durch die parallel zur OVA-Sensibilisierung erfolgte Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Lipopeptid stark abgesenkt werden konnte. shows that the allergy-induced airway hyperresponsiveness in asthmatic mice by the OVA sensitization were parallel treatment could be greatly reduced with the inventive lipopeptide. Der größte Effekt konnte bei einer Lipopeptid-Dosis von 5 μg erzielt werden. The greatest effect was achieved at a lipopeptide dose of 5 micrograms.
  • Dieses Ergebnis weist daraufhin, dass das Lipopeptid schon in niedriger Konzentration äußerst wirksam zur Prävention und Behandlung von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden kann. This result indicates that the lipopeptide can be used even in low concentration is extremely effective for the prevention and treatment of allergic diseases. Zu hohe Dosierungen schränken den Erfolg durch zusätzliche Reizungen der Atemwege geringfügig ein. At high doses limit the success of additional respiratory tract irritation a little. Jedoch ist auch bei 50 μg Lipopeptid noch eine deutliche Verminderung der Asthma-Symptome gegenüber der Kontrollgruppe erkennbar. However, a significant reduction in asthma symptoms compared to the control group is still recognizable even at 50 micrograms lipopeptide.
  • b) Entzündung in den Bronchien und Leukozyten b) inflammation in the bronchi and leukocytes
  • Bei asthmatischen Mäusen reflektieren eosinophile Granulozyten in den Bronchien, zusätzlich zur bronchialen Hyperreaktivität, den Zustand einer Atemwegsinflammation. In asthmatic mice reflect eosinophils in the bronchial tubes, in addition to the bronchial hyperreactivity, the state of airway inflammation. Bei sensibilisierten Mäusen nimmt ihre Anzahl stark zu, während sie bei gesunden Mäusen in den Atemwegen nicht nachweisbar sind. In sensitized mice their number is increasing rapidly as they are undetectable in healthy mice in the airways.
  • belegt, dass durch die Behandlung der Mäuse mit dem erfindungsgemäßen Lipopeptid die Zahl der in die Lungenflüssigkeit infiltrierenden eosinophilen Granulozyten stark reduziert werden kann. shows that the number of infiltrating into the lung fluid eosinophils can be greatly reduced by treating the mice with the novel lipopeptide. Bei allen Applikations-Dosen sind diese nur noch geringfügig in der BAL zu finden. In all application doses they are only slightly found in the BAL.
  • In Folge der Sensibilisierung wurden auch einige Lymphozyten, die bei gesunden, nicht sensibilisierten Mäusen ebenfalls nicht nachweisbar sind, in die Atemwege infiltriert. As a result of sensitization some lymphocytes, which are also not detectable in healthy, non-sensitized mice, infiltrated into the airways were. Durch die Behandlung mit den Lipopeptid-Lösungen war ein leichter Rückgang der ausgeschütteten Zellen dieses Leukozyten-Typs erkennbar ( By the treatment with the lipopeptide solutions a slight decrease of the distributed cells of this leukocyte type was detectable ( ). ).
  • Dagegen sind durch die Lipopeptid-Behandlung vermehrt neutrophile Granulozyten als Teil der angeborenen schnellen Immunabwehr in den Atemwegen nachweisbar. In contrast, increased neutrophils can be detected as part of the innate immune fast in the airways through the lipopeptide treatment. Auf die Behandlung mit PBS oder der DMSO-Kontroll-Lösung reagierten die Neutrophilen der sensibilisierten Mäuse nicht ( neutrophil the sensitized mice responded to treatment with PBS or the DMSO control solution ( ). ).
  • Makrophagen, die einerseits Fremderreger beseitigen und andererseits durch die Antigenpräsentation auch die adaptive Immunantwort in Gang setzen, sind bei gesunden Tieren der einzige stets nachweisbare Leukozyten-Subtyp. Macrophages, on the one hand eliminate extraneous agents and set the other by the antigen presentation and adaptive immune response in healthy animals in motion the only always detectable leukocyte subtype. Ihre Anzahl ist in Folge der Sensibilisierung nur unwesentlich erhöht. Their number increased only slightly as a result of sensitization. Zwischen den mit den Lipopeptid-Lösungen behandelten Tieren und den Kontrollgruppen war kein signifikanter Unterschied nachweisbar ( Between the treated with the lipopeptide solutions animals and the control groups, no significant difference was detectable ( ). ).
  • c) allergische Sensibilisierung c) allergic sensitization
  • Die Asthma-Symptome bei den Mäusen wurden durch die Sensibilisierung mit einem Allergen ausgelöst, was zu einer Bildung Allergen-spezifischer IgE-Antikörper führt. The asthma symptoms in the mice were triggered by sensitization to an allergen, resulting in formation of allergen-specific IgE antibodies.
  • und and zeigen, dass die Intensität der Sensibilisierung als Vorstufe der akuten allergischen Erkrankung, durch die erfindungsgemäßen Lipopeptide beeinflusst werden kann. show that the intensity of awareness as a precursor of acute allergic disease, can be influenced by the novel lipopeptides. Die Konzentration der IgE Antikörper in der BAL konnte durch die Lipopeptid-Behandlung stark reduziert werden. The concentration of the IgE antibody in the BAL could be greatly reduced by the lipopeptide treatment. Der größte Effekt wurde wieder für die niedrigste Lipopeptid-Dosis beobachtet. The greatest effect was observed again for the lowest lipopeptide dose. Auf den IgE-Spiegel im Serum hat die Behandlung dagegen nur einen geringen Effekt. The IgE levels in the serum treatment, however, has little effect.
  • Offensichtlich wirken die angewandten Lipopeptid-Lösungen vorzugsweise lokal. Obviously the applied lipopeptide solutions preferably act locally. Dies legt die Inhalation der erfindungsgemäßen Lipopeptide als wirksamste Applikationsform nahe. This sets the inhalation of the lipopeptides according to the invention close as the most effective form of administration.
  • Ein signifikanter Einfluss der Lipopeptid-Behandlung auf die Ausschüttung der IgG1-Antikörper als Teil der T H 2-stimulierten Immunantwort konnte sowohl im Serum als auch in der BAL nicht festgestellt werden ( A significant influence of the lipopeptide treatment on the distribution of the IgG1 antibody as part of the T H 2-stimulated immune response could not be determined both in serum and in BAL ( , . ). ).
  • Der Einfluss auf die IgG2a-Antikörper als Teil der T H 1-stimulierten Immunantwort war in der BAL und im Serum vergleichbar ( The effect on IgG2a antibody as part of the T H 1-stimulated immune response was comparable (in the BAL and serum , . ). ). Die durch die Lipopeptide bewirkte geringfügig erhöhte Ausschüttung konnte erwartet werden, da hiermit bakterielle Komponenten simuliert werden. The lipopeptides caused by the slightly increased secretion could be expected since hereby bacterial components are simulated.
  • d) IL-5 Produktion durch die Milz-Zellen (in vitro) d) IL-5 production (by spleen cells in vitro)
  • Die Ausschüttung der Eosinophilia in das Lumen der Atemwege als Folge der allergischen Sensibilisierung ist von der Sekretion von T H 2-Typ-Zytokinen, speziell IL-5, durch die Lymphozyten abhängig. The distribution of eosinophilia in the lumen of the respiratory tract as a result of allergic sensitization is dependent on the secretion of T H 2 type cytokines, especially IL-5, by the lymphocytes. Die Ausschüttung von IL-5 korreliert damit mit der Intensität der eosinophilen Entzündungsreaktion. The secretion of IL-5 thus correlated with the intensity of eosinophilic inflammation. Die Immunzellen von nicht sensibilisierten Tieren schütten kein IL-5 aus. The immune cells of non-sensitized animals pour out no IL-fifth
  • Wie auch bei der Sekretion der Eosinophilia in die Lungenflüssigkeit konnte die IL-5 Produktion der Milz-Zellen durch die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Lipopeptiden nahezu gestoppt werden ( As with the secretion of eosinophilia in the lung fluid IL-5 production spleen cells was almost stopped by the treatment with the novel lipopeptides ( ). ). Die effektivste Wirkung konnte bei den Applikationsmengen 5 μg und 20 μg erzielt werden. The most effective action could be achieved in the application rates 5 micrograms and 20 micrograms.
  • Insgesamt konnte durch die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Lipopeptiden die allergische Reaktion gegen das OVA deutlich eingedämmt werden. Overall, the allergic reaction against the OVA was significantly curbed by the treatment with the novel lipopeptides. Dabei korrelieren die biochemischen Effekte ausgezeichnet mit den phänomenologischen Beobachtungen. The biochemical effects correlate awarded the phenomenological observations.
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  • Zitierte Patentliteratur Cited patent literature
    • - WO 2001/049319 [0018] - WO 2001/049319 [0018]
    • - WO 2006/029685 [0018] - WO 2006/029685 [0018]
    • - US 2006/0217328 [0025] - US 2006/0217328 [0025]
    • - US 2006/0251677 [0025] - US 2006/0251677 [0025]
    • - WO 2008/014979 [0025] - WO 2008/014979 [0025]
    • - WO 2007/095976 [0025] - WO 2007/095976 [0025]
    • - WO 2005/004907 [0026] - WO 2005/004907 [0026]
    • - WO 2006/096497 [0026] - WO 2006/096497 [0026]
    • - WO 2008/073661 [0026] - WO 2008/073661 [0026]
    • - EP 1387167 [0028] - EP 1387167 [0028]
    • - WO 2004/092210 [0028] - WO 2004/092210 [0028]
    • - US 2008/0241139 [0028] - US 2008/0241139 [0028]
    • - WO 2008/059035 [0028] - WO 2008/059035 [0028]
    • - US 2008/0119145 [0028] - US 2008/0119145 [0028]
    • - WO 2004/074435 [0029] - WO 2004/074435 [0029]
    • - EP 0210412 [0030] - EP 0210412 [0030]
    • - EP 0519327 [0030] - EP 0519327 [0030]
    • - WO 2007/103322 [0031] - WO 2007/103322 [0031]
    • - WO 2006/104389 [0031] - WO 2006/104389 [0031]
    • - US 7387271 [0031] - US 7387271 [0031]
    • - WO 2005/063201 [0031] - WO 2005/063201 [0031]
    • - WO 2005/063288 [0031] - WO 2005/063288 [0031]
    • - WO 2007/078879 [0032, 0036] - WO 2007/078879 [0032, 0036]
    • - WO 2007/079448 [0032] - WO 2007/079448 [0032]
    • - WO 2004/014956 [0032] - WO 2004/014956 [0032]
    • - WO 2004/014957 [0032] - WO 2004/014957 [0032]
    • - WO 2005/039504 [0033] - WO 2005/039504 [0033]
    • - WO 2007/047396 [0033] - WO 2007/047396 [0033]
    • - WO 2005/115430 [0033] - WO 2005/115430 [0033]
    • - WO 2005/067959 [0033] - WO 2005/067959 [0033]
    • - WO 2007/098371 [0033] - WO 2007/098371 [0033]
    • - WO 2007/118901 [0033] - WO 2007/118901 [0033]
    • - WO 1996/12740 [0034] - WO 1996/12740 [0034]
    • - WO 1996/22067 [0036] - WO 1996/22067 [0036]
    • - WO 1998/027110 [0036] - WO 1998/027110 [0036]
    • - WO 1999/059610 [0036] - WO 1999/059610 [0036]
    • - WO 2002/028887 [0036] - WO 2002/028887 [0036]
    • - WO 2003/084568 [0036] - WO 2003/084568 [0036]
    • - WO 2004/108145 [0036] - WO 2004/108145 [0036]
    • - US 5688771 [0036] - US 5688771 [0036]
    • - WO 2004/030608 [0072] - WO 2004/030608 [0072]
    • - WO 2008/054892 [0072] - WO 2008/054892 [0072]
    • - US 2003/0190322 [0072] - US 2003/0190322 [0072]
    • - WO 2006/087576 [0072] - WO 2006/087576 [0072]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur Cited non-patent literature
    • - GB Pajno et al. - GB Pajno et al. 2001. Clinical and Experimental Allergy 31: 1392–1397 [0015] 2001. Clinical and Experimental Allergy 31: 1392-1397 [0015]
    • - L. Jacobsen et al. - L. Jacobsen et al. 2007. Allergy 62(8): 943–948 [0015] 2007. Allergy 62 (8): 943-948 [0015]
    • - C. Möller et al. - C. Moller et al. 2002. J Allergy Clin Immunol 109(2): 251–256 [0015] 2002. J Allergy Clin Immunol 109 (2): 251-256 [0015]
    • - A. Bufe et al. - A. Bufe et al. 2009. J Allergy Clin Immunol 123(1): 167–173 [0015] 2009. J Allergy Clin Immunol 123 (1): 167-173 [0015]
    • - J. Riedler et al. - J. Riedler et al. 2001. Lancet 358: 1129–1133 [0017] 2001. Lancet 358: 1129-1133 [0017]
    • - M. Peters et al. - M. Peters et al. 2006. Thorax 61: 134–139 [0018] 2006. Thorax 61: 134-139 [0018]
    • - J. Douwes et al. - J. Douwes et al. 2008. Eur Respir J 32: 603–611 [0019] 2008. Eur Respir J 32: 603-611 [0019]
    • - H. Heine et al. - H. Heine et al. 2003. Int Arch Allergy Immunol 130: 180–192 [0021] 2003. Int Arch Allergy Immunol 130: 180-192 [0021]
    • - C. Zuany-Amorim 2002. Nat Rev Drug Discov 1: 797–807 [0027] - C. Zuany-Amorim 2002. Nat Rev Drug Discov 1: 797-807 [0027]
    • - Mühlradt et al. - Mühlradt et al. [0036] [0036]
    • - http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop [0050] - http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop [0050]
    • - M. Peters et al. - M. Peters et al. 2006. Thorax 61: 134–139 [0080] 2006. Thorax 61: 134-139 [0080]

Claims (29)

  1. Lipopeptid mit der folgenden allgemeinen Struktur Lipopeptide having the following general structure
    Figure 00380001
    wobei R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen, R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen oder H und R4 für ein aus 1 bis 25 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid stehen oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz, ein Stereoisomer, ein Stereoisomeren-Gemisch oder eine Prodrug-Verbindung davon, dadurch gekennzeichnet , dass es eine immunstimulatorische Wirkung aufweist. wherein R1 and R2, which may be identical or different, represent a saturated or unsaturated acyl radical having 7 to 25 carbon atoms, R3 represents a saturated or unsaturated acyl radical having 7 to 25 carbon atoms or H, and R4 for a from 1 to 25 amino acid residues existing, physiologically acceptable and in the treated species not per se immunogenic peptide are or a pharmaceutically acceptable salt, a stereoisomer, a stereoisomeric mixture or a prodrug compound thereof, characterized in that it comprises an immunostimulatory effect having.
  2. Lipopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid R4 vom Keimungs-Protein GerD der Bacillus cereus-Sporen abgeleitet ist. A lipopeptide as claimed in claim 1, characterized in that the peptide R4 from germination protein GERD of Bacillus cereus spores is derived.
  3. Lipopeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid R4 a) die Aminosäure-Sequenz AQEKEAKSELDYDQT (SEQ ID NO 1), b) die Aminosäure-Sequenz AQGKETKSELDYDQT (SEQ ID NO 2), c) die Aminosäure-Sequenz AQEKEAKSELDYD (SEQ ID NO 3), d) die Aminosäure-Sequenz AEEKEAEEK (SEQ ID NO 4), e) die Aminosäure-Sequenz GEEKEEK (SEQ ID NO 5), f) eine daraus durch Austausch von 1–5 Aminosäuren erhaltene analoge Aminosäure-Sequenz, g) eine daraus durch Deletion von 1–5 Aminosäuren erhaltene analoge Aminosäure-Sequenz oder h) eine daraus durch Verlängerung um 1–5 Aminosäuren erhaltene analoge Aminosäure-Sequenz aufweist. A lipopeptide as claimed in claim 2, characterized in that the peptide R4 a) the amino acid sequence AQEKEAKSELDYDQT (SEQ ID NO 1), b) the amino acid sequence AQGKETKSELDYDQT (SEQ ID NO 2), c) the amino acid sequence AQEKEAKSELDYD (SEQ ID NO 3), d) the amino acid sequence AEEKEAEEK (SEQ ID NO 4), e) the amino acid sequence GEEKEEK (SEQ ID NO 5), f) an analogous amino acid sequence, g obtained therefrom by replacement of amino acids 1-5 ) one obtained therefrom by deletion of 1-5 amino acids analogous amino acid sequence, or h) having an analogous amino acid sequence obtained therefrom by elongation by 1-5 amino acids.
  4. Lipopeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die sich ergebenden analogen Peptide R4 in bezug auf die Ausgangssequenzen einen Homologiegrad von größer als 55%, bevorzugt etwa 80%, insbesondere etwa 90% aufweisen. A lipopeptide as claimed in claim 3, characterized in that the resulting analogue peptides R4 with respect to the output sequences have a degree of homology of greater than 55%, preferably about 80%, in particular about 90%.
  5. Lipopeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure an Position 1 des Peptides R4 eine kleine, sterisch anspruchslose Aminosäure, bevorzugt Alanin oder Glycin ist. A lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the amino acid at position 1 of the peptide is a small R4, sterically undemanding amino acid, preferably alanine or glycine.
  6. Lipopeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen und R3 für einen gesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen oder H stehen. A lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that R1 and R2, which may be identical or different, represent a saturated acyl radical having 7 to 25 carbon atoms and R3 is a saturated acyl radical having 7 to 25 carbon atoms, or H are provided.
  7. Lipopeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R1, R2 und R3 für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen stehen. A lipopeptide as claimed in claim 6, characterized in that R1, R2 and R3 represent a saturated acyl radical containing 16 carbon atoms.
  8. Lipopeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und R2 für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen und R3 für H stehen. A lipopeptide as claimed in claim 6, characterized in that R1 and R2 is a saturated acyl radical containing 16 carbon atoms and R3 are H.
  9. Lipopeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Dihydroxypropylcystein als RR-Stereoisomer vorliegt. A lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the Dihydroxypropylcystein present as RR stereoisomer.
  10. Lipopeptid nach einem der Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass es als Gemisch aus beliebigen möglichen Stereoisomeren vorliegt. A lipopeptide according to one of claims 1-8, characterized in that it is present as a mixture of any of the possible stereoisomers.
  11. Lipopeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es synthetisch hergestellt oder aus einem Bacillus cereus-Klon isoliert worden ist. A lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that it has been prepared synthetically or isolated from a Bacillus cereus clone.
  12. Lipopeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immunstimulatorische Wirkung über die Toll-like-Rezeptoren TLR 1, TLR 2 und/oder TLR 6 vermittelt wird. A lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the immune stimulatory effect on the Toll-like receptors, TLR-1, TLR 2 and / or TLR mediated. 6
  13. Lipopeptid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die immunstimulatorische Wirkung über die Toll-like-Rezeptoren TLR 1, TLR 2 und/oder TLR 6 die Therapie und Prophylaxe allergischer Erkrankungen ermöglicht. A lipopeptide as claimed in claim 12, characterized in that the immune stimulatory effect on the Toll-like receptors, TLR-1, TLR 2 and / or TLR 6 allows the therapy and prophylaxis of allergic diseases.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Lipopeptides nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ungewöhnliche Aminosäure Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-RS-Dhc-OH) in Lösung oder an fester Phase mit einem ebenfalls an fester Phase aufgebauten, Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft und anschließend acyliert wird und dass dabei die Zielverbindung als Stereoisomeren-Gemisch erhalten wird. A process for the preparation of a lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the unusual amino acid Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2RS) -propyl] - [R] -cysteine ​​(Fmoc-RS is -Dhc-OH) is also constructed in solution or on solid phase with a solid-phase linked side-chain protected peptide, and then acylated and in that case the target compound is obtained as a stereoisomeric mixture.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Lipopeptides nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Synthesebaustein Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2R)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-RR-Dhc-OH) in Lösung oder an fester Phase mit einem an dieser Phase aufgebauten Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft und anschließend acyliert wird und dass dabei die Zielverbindung als stereochemisch definiertes RR-Derivat erhalten wird. A process for the preparation of a lipopeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the synthesis building block Nα-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2R) -propyl] - [R] -cysteine ​​(Fmoc-RR Dhc-OH) is linked in solution or on solid phase with a built at this stage side-chain protected peptide, and then acylated and in that case the target compound is obtained as stereochemically defined RR derivative.
  16. Verwendung eines Lipopeptides nach einem der Ansprüche 1–13, dadurch gekennzeichnet, dass es als Immunstimulanz beim Säuger, vorzugsweise beim Menschen, geeignet ist. Use of a lipopeptide according to any one of claims 1-13, characterized in that it is useful as immunostimulant in mammals, preferably in humans.
  17. Verwendung eines Lipopeptides nach einem der Ansprüche 1–13, dadurch gekennzeichnet, dass es zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Allergien, vorzugsweise allergischem Asthma, beim Säuger, vorzugsweise beim Menschen, geeignet ist. Use of a lipopeptide according to any one of claims 1-13, characterized in that it is suitable for prophylactic or therapeutic treatment of allergy, preferably allergic asthma in mammals, preferably in humans.
  18. Pharmazeutisches Präparat enthaltend mindestens ein Lipopeptid nach einem der Ansprüche 1–13, dadurch gekennzeichnet, dass es gegebenenfalls weitere Bestandteile wie pharmazeutische Wirkstoffe, Adjuvantien sowie übliche, pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Hilfsmittel enthält. A pharmaceutical preparation containing at least one lipopeptide according to any one of claims 1-13, characterized in that it optionally contains other ingredients such as pharmaceutical agents, adjuvants, as well as usual pharmaceutically acceptable carriers and / or auxiliaries.
  19. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man zu seiner Herstellung die Lipopeptide mit mindestens einem oder keinem anderen Bestandteil vermischt und/oder in Lösung bringt. A pharmaceutical preparation according to claim 18, characterized in that mixing of manufacturing the lipopeptides with at least one or any other ingredient and / or brought into solution.
  20. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipopeptide mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert oder verbunden sind. Pharmaceutical preparation according to claim 18, characterized in that the lipopeptides are associated with a physical or biological carrier or connected.
  21. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipopeptide in Liposomen eingebaut sind. Pharmaceutical preparation according to claim 18, characterized in that the lipopeptides are incorporated into liposomes.
  22. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 18–21, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer für die orale oder parenterale Applikation geeigneten Formulierung vorliegt. A pharmaceutical preparation according to any one of claims 18-21, characterized in that it is in a form suitable for oral or parenteral application formulation.
  23. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form einer Salbe, einer Lotion, einer Suspension, einer Emulsion, einer Lösung oder eines Pflasters vorliegt. A pharmaceutical preparation according to claim 22, characterized in that it is in the form of an ointment, a lotion, a suspension, an emulsion, a solution or a patch.
  24. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 22–23, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Inhalation, mucosal, intranasal, durch Auftragen auf die Haut, durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder direkt in die Lymphknoten appliziert werden kann. A pharmaceutical preparation according to any one of claims 22-23, characterized in that it can be administered by inhalation, mucosal, intranasal, by application to the skin, by subcutaneous, intramuscular or intravenous injection or directly into the lymph nodes.
  25. Verwendung eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 18–24, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Simulation einer natürlichen mikrobiellen Umgebung zum Zweck der Reifung des Immunsystems geeignet ist. Use of a pharmaceutical preparation according to any of claims 18-24, characterized in that it is suitable for simulating a natural microbial environment for the purpose of maturation of the immune system.
  26. Verwendung eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 18–24, dadurch gekennzeichnet, dass es zum Vorbeugen oder Behandeln von allergischen Erkrankungen geeignet ist. Use of a pharmaceutical preparation according to any of claims 18-24, characterized in that it is suitable for preventing or treating allergic diseases.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 25–26, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutische Präparat zum Vorbeugen oder Behandeln von Heuschnupfen, atopischer Dermatitis oder allergischem Asthma geeignet ist. Use according to any one of claims 25-26, characterized in that the pharmaceutical preparation for preventing or treating symptoms of hay fever, atopic dermatitis or allergic asthma is suitable.
  28. Verwendung nach einem der Ansprüche 25–27, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutische Präparat zum Vorbeugen von allergischen Erkrankungen bei Patienten, die aufgrund einer positiven Familienanamnese ein deutlich erhöhtes Risiko aufweisen, eine allergische Erkrankung zu entwickeln, geeignet ist. Use according to any one of claims 25-27, characterized in that the pharmaceutical preparation is suitable for the prevention of allergic diseases in patients who have a significantly increased risk because of a positive family history of developing an allergic disease.
  29. Verwendung nach einem der Ansprüche 25–27, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmazeutische Präparat zum Behandeln von allergischen Erkrankungen bei Patienten, die erste manifestierte Allergie-Symptome aufweisen, geeignet ist. Is suitable use of any one of claims 25-27, characterized in that the pharmaceutical preparation for treating allergic diseases in patients, the first manifested allergy symptoms have.
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DE (1) DE102009034779A1 (en)
WO (1) WO2011012240A2 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012146364A1 (en) 2011-04-23 2012-11-01 Charite - Universitätsmedizin Berlin Microparticle and/or nanoparticle vaccine for prophylactic and/or therapeutic application
DE102016005550A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-09 Emc Microcollections Gmbh Adjuvant to lnduzierung a cellular immune response

Citations (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0114787A2 (en) * 1983-01-25 1984-08-01 Ciba-Geigy Ag Peptide derivatives
EP0210412A2 (en) 1985-06-24 1987-02-04 Hoechst Aktiengesellschaft Anchoring membrane ingredient conjugate, and its use
EP0519327A1 (en) 1991-06-17 1992-12-23 Hoechst Aktiengesellschaft N-Acyl-S-(2-hydroxyalkyl)-cysteines, their preparation and their use as intermediates in the preparation of synthetic immunoadjuvants and synthetic vaccines
EP0604957A1 (en) * 1992-12-28 1994-07-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. 2-Amino-6,7-dihydroxy-4-thiaheptanoic acid derivatives, production and use thereof
WO1996012740A1 (en) 1994-10-25 1996-05-02 United Biomedical, Inc. SYNTHETIC IgE MEMBRANE ANCHOR PEPTIDE IMMUNOGENS FOR THE TREATMENT OF ALLERGY
WO1996022067A2 (en) 1994-12-27 1996-07-25 United Biomedical, Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
US5688771A (en) 1992-04-03 1997-11-18 Biochem Pharma Inc. Lipophilic oligopeptides with immunomodulating activity
WO1998027110A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Dihydroxypropyl cysteine peptide and agent containing this peptide
WO1999059610A2 (en) 1998-05-20 1999-11-25 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Use of lipopeptides or lipoproteins for wound treatment
WO2001049319A1 (en) 1999-12-30 2001-07-12 Erika Mutius Von Composition containing bacterial antigens, used for the prophylaxis and the treatment of allergic diseases
WO2002028887A2 (en) 2000-10-02 2002-04-11 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Use of lipopeptides or lipoproteins for treating lung infections and lung tumours
US20030190322A1 (en) 2000-03-31 2003-10-09 Peter Kaastrup Immunostimulating properties of a fragment of tgf-beta
WO2003084568A2 (en) 2002-04-04 2003-10-16 Gbf Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh Use of a lipopeptide or lipoprotein as an adjuvant in therapeutic or prophylactic vaccinations
EP1387167A1 (en) 2002-07-24 2004-02-04 Centre National De La Recherche Scientifique Method for identifying biologically active compounds with anti-asthmatic, anti-allergic and/or immunosuppresive properties
WO2004014956A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and b-cell epitopes
WO2004014957A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and cytotoxic t lymphocyte (ctl) epitopes
WO2004030608A2 (en) 2001-06-05 2004-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
WO2004074435A2 (en) 2003-01-30 2004-09-02 Emory University Methods for identifying and administering agents that bias the immune response via dendritic cells
WO2004092210A2 (en) 2003-04-17 2004-10-28 National University Of Singapore Molecules having immunomodulatory activity
WO2004108145A1 (en) 2003-06-04 2004-12-16 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Therapeutical composition containing dentritic cells and use thereof
WO2005004907A1 (en) 2003-07-10 2005-01-20 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles
WO2005039504A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Eisai Co., Ltd. Compounds and methods for treating toll-like receptor 2-related diseases and conditions
WO2005063288A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Pharmexa A/S Synergistic liposomal adjuvants
WO2005063201A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Pharmexa A/S Liposomes and liposomal compositions for vaccination and drug delivery
WO2005067959A1 (en) 2004-01-16 2005-07-28 Cbio Limited Chaperonin 10 modulation of toll-like receptor-inducible cytokine and chemokine secretion
WO2005115430A1 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Gropep Limited Treatment of inflammatory airway disease
WO2006029685A1 (en) 2004-09-18 2006-03-23 Albrecht Bufe Barn dust extract providing protection from allergies
WO2006087576A1 (en) 2005-02-19 2006-08-24 Royal Holloway And Bedford New College Listeriolysin-containing bacillus spores as antigen delivery agents
WO2006096497A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
US20060217328A1 (en) 2003-07-15 2006-09-28 Hybridon, Inc. Synergisitic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
WO2006104389A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Leiden University Medical Center Methods and means for diagnostics, prevention and treatment of mycobacterium infections and tuberculosis disease
US20060251677A1 (en) 2003-03-26 2006-11-09 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
WO2007047396A2 (en) 2005-10-12 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
WO2007079448A2 (en) 2006-01-03 2007-07-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Three component carbohydrate vaccine
WO2007078879A2 (en) 2005-12-21 2007-07-12 Vaxinnate Corporation Lipopeptide compositions and methods of use thereof
WO2007098371A2 (en) 2006-02-16 2007-08-30 Wayne State University Use of flagellin to prevent and treat gram negative bacterial infection
WO2007095976A2 (en) 2006-02-17 2007-08-30 Curevac Gmbh Adjuvant in the form of a lipid-modified nucleic acid
WO2007103322A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
WO2007118901A2 (en) 2006-04-18 2007-10-25 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Tracheal cytotoxin (tct) and related compounds for suppressing immune responses
WO2008014979A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
WO2008054892A2 (en) 2006-06-16 2008-05-08 Florida Atlantic University Chitin micro-particles as an adjuvant
US20080119145A1 (en) 2006-11-21 2008-05-22 Samsung Electronics Co., Ltd. Hybrid duplex apparatus and method for supporting low-complexity terminal in wireless communication system
WO2008059035A2 (en) 2006-11-16 2008-05-22 Om Pharma Functionalized beta 1,6 glucosamine disaccharides and process for their preparation
US7387271B2 (en) 2002-12-30 2008-06-17 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory combinations
WO2008073661A2 (en) 2006-11-09 2008-06-19 Dynavax Technologies Corporation Long term disease modification using immunostimulatory oligonucleotides
US20080241139A1 (en) 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity

Patent Citations (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0114787A2 (en) * 1983-01-25 1984-08-01 Ciba-Geigy Ag Peptide derivatives
EP0210412A2 (en) 1985-06-24 1987-02-04 Hoechst Aktiengesellschaft Anchoring membrane ingredient conjugate, and its use
EP0519327A1 (en) 1991-06-17 1992-12-23 Hoechst Aktiengesellschaft N-Acyl-S-(2-hydroxyalkyl)-cysteines, their preparation and their use as intermediates in the preparation of synthetic immunoadjuvants and synthetic vaccines
US5688771A (en) 1992-04-03 1997-11-18 Biochem Pharma Inc. Lipophilic oligopeptides with immunomodulating activity
EP0604957A1 (en) * 1992-12-28 1994-07-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. 2-Amino-6,7-dihydroxy-4-thiaheptanoic acid derivatives, production and use thereof
WO1996012740A1 (en) 1994-10-25 1996-05-02 United Biomedical, Inc. SYNTHETIC IgE MEMBRANE ANCHOR PEPTIDE IMMUNOGENS FOR THE TREATMENT OF ALLERGY
WO1996022067A2 (en) 1994-12-27 1996-07-25 United Biomedical, Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
WO1998027110A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Dihydroxypropyl cysteine peptide and agent containing this peptide
WO1999059610A2 (en) 1998-05-20 1999-11-25 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Use of lipopeptides or lipoproteins for wound treatment
WO2001049319A1 (en) 1999-12-30 2001-07-12 Erika Mutius Von Composition containing bacterial antigens, used for the prophylaxis and the treatment of allergic diseases
US20030190322A1 (en) 2000-03-31 2003-10-09 Peter Kaastrup Immunostimulating properties of a fragment of tgf-beta
WO2002028887A2 (en) 2000-10-02 2002-04-11 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Use of lipopeptides or lipoproteins for treating lung infections and lung tumours
WO2004030608A2 (en) 2001-06-05 2004-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
WO2003084568A2 (en) 2002-04-04 2003-10-16 Gbf Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh Use of a lipopeptide or lipoprotein as an adjuvant in therapeutic or prophylactic vaccinations
EP1387167A1 (en) 2002-07-24 2004-02-04 Centre National De La Recherche Scientifique Method for identifying biologically active compounds with anti-asthmatic, anti-allergic and/or immunosuppresive properties
WO2004014956A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and b-cell epitopes
WO2004014957A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and cytotoxic t lymphocyte (ctl) epitopes
US7387271B2 (en) 2002-12-30 2008-06-17 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory combinations
WO2004074435A2 (en) 2003-01-30 2004-09-02 Emory University Methods for identifying and administering agents that bias the immune response via dendritic cells
US20060251677A1 (en) 2003-03-26 2006-11-09 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
WO2004092210A2 (en) 2003-04-17 2004-10-28 National University Of Singapore Molecules having immunomodulatory activity
WO2004108145A1 (en) 2003-06-04 2004-12-16 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Therapeutical composition containing dentritic cells and use thereof
WO2005004907A1 (en) 2003-07-10 2005-01-20 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles
US20060217328A1 (en) 2003-07-15 2006-09-28 Hybridon, Inc. Synergisitic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
WO2005039504A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Eisai Co., Ltd. Compounds and methods for treating toll-like receptor 2-related diseases and conditions
WO2005063288A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Pharmexa A/S Synergistic liposomal adjuvants
WO2005063201A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Pharmexa A/S Liposomes and liposomal compositions for vaccination and drug delivery
WO2005067959A1 (en) 2004-01-16 2005-07-28 Cbio Limited Chaperonin 10 modulation of toll-like receptor-inducible cytokine and chemokine secretion
WO2005115430A1 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Gropep Limited Treatment of inflammatory airway disease
WO2006029685A1 (en) 2004-09-18 2006-03-23 Albrecht Bufe Barn dust extract providing protection from allergies
WO2006087576A1 (en) 2005-02-19 2006-08-24 Royal Holloway And Bedford New College Listeriolysin-containing bacillus spores as antigen delivery agents
WO2006096497A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
WO2006104389A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Leiden University Medical Center Methods and means for diagnostics, prevention and treatment of mycobacterium infections and tuberculosis disease
WO2007047396A2 (en) 2005-10-12 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
WO2007078879A2 (en) 2005-12-21 2007-07-12 Vaxinnate Corporation Lipopeptide compositions and methods of use thereof
WO2007079448A2 (en) 2006-01-03 2007-07-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Three component carbohydrate vaccine
WO2007098371A2 (en) 2006-02-16 2007-08-30 Wayne State University Use of flagellin to prevent and treat gram negative bacterial infection
WO2007095976A2 (en) 2006-02-17 2007-08-30 Curevac Gmbh Adjuvant in the form of a lipid-modified nucleic acid
WO2007103322A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
WO2007118901A2 (en) 2006-04-18 2007-10-25 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Tracheal cytotoxin (tct) and related compounds for suppressing immune responses
WO2008054892A2 (en) 2006-06-16 2008-05-08 Florida Atlantic University Chitin micro-particles as an adjuvant
WO2008014979A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
US20080241139A1 (en) 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity
WO2008073661A2 (en) 2006-11-09 2008-06-19 Dynavax Technologies Corporation Long term disease modification using immunostimulatory oligonucleotides
WO2008059035A2 (en) 2006-11-16 2008-05-22 Om Pharma Functionalized beta 1,6 glucosamine disaccharides and process for their preparation
US20080119145A1 (en) 2006-11-21 2008-05-22 Samsung Electronics Co., Ltd. Hybrid duplex apparatus and method for supporting low-complexity terminal in wireless communication system

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Bufe et al. 2009. J Allergy Clin Immunol 123(1): 167-173
C. Möller et al. 2002. J Allergy Clin Immunol 109(2): 251-256
C. Zuany-Amorim 2002. Nat Rev Drug Discov 1: 797-807
G. B. Pajno et al. 2001. Clinical and Experimental Allergy 31: 1392-1397
H. Heine et al. 2003. Int Arch Allergy Immunol 130: 180-192
http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop
J. Douwes et al. 2008. Eur Respir J 32: 603-611
J. Riedler et al. 2001. Lancet 358: 1129-1133
L. Jacobsen et al. 2007. Allergy 62(8): 943-948
M. Peters et al. 2006. Thorax 61: 134-139
Mühlradt et al.
T. Jida et.al., "Synthesis and biological activities of TAN-1511 analogues"- In: Journal of Antibiotics, ISSN 0021-8820, 1995, 48, 589-603 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012146364A1 (en) 2011-04-23 2012-11-01 Charite - Universitätsmedizin Berlin Microparticle and/or nanoparticle vaccine for prophylactic and/or therapeutic application
DE102016005550A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-09 Emc Microcollections Gmbh Adjuvant to lnduzierung a cellular immune response

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011012240A2 (en) 2011-02-03
WO2011012240A3 (en) 2011-09-29

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Bashir et al. Toll-like receptor 4 signaling by intestinal microbes influences susceptibility to food allergy
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