DE102008064610A1

DE102008064610A1 - Anregung von Ionen in ICR-Massenspektrometern

Info

Publication number: DE102008064610A1
Application number: DE102008064610A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2010-07-01
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: US20100176289A1; GB2466702B; DE102008064610B4; US8648298B2; GB0922303D0; GB2466702A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Aufnahme von Massenspektren in Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern, insbesondere auf Verfahren für die Anregung der Ionen zu Zyklotronbahnen. Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Anregung der Ionen an, das durch einen nichtlinearen Frequenzgang der Anregungsfrequenzen in einem "Chirp" Transienten liefert, die keine ausgeprägten Beats zeigen, auch wenn Gemische von vielen Ionensorten mit jeweils gleichen Massendifferenzen vorliegen. Dadurch kann der dynamische Messbereich für die Messung der Bildströme besser ausgenutzt werden. Es können insbesondere Summenspektren vorgegebener Qualität aus einer wesentlich geringeren Anzahl von Einzeltransienten und damit in wesentlich kürzerer Messzeit erzeugt werden.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Aufnahme von Massenspektren in Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern, insbesondere auf Verfahren für die Anregung der Ionen zu Zyklotronbahnen.
Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Anregung der Ionen an, das durch einen nichtlinearen Frequenzgang der Anregungsfrequenzen in einem „Chirp” Transienten liefert, die keine ausgeprägten Beats zeigen, auch wenn Gemische von vielen Ionensorten mit jeweils gleichen Massendifferenzen vorliegen. Dadurch kann der dynamische Messbereich für die Messung der Bildströme besser ausgenutzt werden. Es können insbesondere Summenspektren vorgegebener Qualität aus einer wesentlich geringeren Anzahl von Einzeltransienten und damit in wesentlich kürzerer Messzeit erzeugt werden.
Stand der Technik
In Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS) werden die ladungsbezogenen Massen m/z der Ionen durch Messung ihrer Umlauffrequenzen in einem homogenen Magnetfeld hoher Feldstärke bestimmt. Die Umlaufbewegung ist im Wesentlichen eine Zyklotronbewegung, der meist eine kleinere Magnetronbewegung überlagert ist. Das Magnetfeld wird üblicherweise durch supraleitende Magnetspulen erzeugt, die mit flüssigem Helium gekühlt werden. Kommerzielle Massenspektrometer bieten heute nutzbare Durchmesser der ICR-Messzellen bis etwa 6 Zentimeter bei magnetischen Feldstärken von 7 bis 15 Tesla.
Die Ionenumlauffrequenz wird in den ICR-Messzellen im homogensten Teil des magnetischen Feldes gemessen. Die ICR-Messzellen bestehen gewöhnlich aus vier Längselektroden, die sich parallel zu den magnetischen Feldlinien erstrecken und den Innenraum der Messzelle mantelförmig umschließen. Meist werden zylindrische Messzellen verwendet, wie sie 1 zeigt. Üblicherweise werden zwei gegenüberstehende Längselektroden, die „Anregungselektroden”, dazu verwendet, durch einen Puls mit elektrischen Wechselfeldern achsennah eingebrachte Ionen zu ihrer Zyklotron-Bewegung anzuregen, wobei Ionen jeweils gleicher ladungsbezogener Masse m/z möglichst kohärent angeregt werden müssen, um eine phasengleich umlaufende Wolke dieser Ionen zu erhalten. Die Anregung zur Zyklotron-Bewegung bringt die Ionen auf kreisförmige Umlaufbahnen, deren Durchmesser zumeist bei etwa zwei Dritteln des Innendurchmessers der ICR-Messzelle liegt. Die beiden anderen Elektroden, die „Messelektroden”, dienen dazu, den Umlauf der Ionenwolken durch Bildströme zu messen, die im Vorbeiflug der Ionenwolken in den Messelektroden induziert werden.
Einfüllen der Ionen in die Messzelle, Ionenanregung und Ionendetektion erfolgen in aufeinander folgenden Verfahrensphasen. Für das Einführen der Ionen in die ICR-Messzelle und besonders für ihr Einfangen gibt es verschiedene Verfahren, wie beispielsweise das „side-kick”-Verfahren oder das Verfahren des dynamischen Einfangens mit einer Potentialerhöhung, die hier aber nicht näher besprochen werden. Der einschlägige Fachmann kennt diese Verfahren.
Die Anregung der Ionen erfolgt durch ihre Energieaufnahme in einem dipolaren elektrischen Wechselfeld zwischen den beiden Anregungselektroden, dessen Frequenz die Zyklotronfrequenz einer Ionensorte resonant treffen muss. Die Zyklotronfrequenz der Ionen ist umgekehrt proportional zu ihrer Masse m/z. Weil das Verhältnis m/z der Masse m zur Anzahl z der Elementarladungen der Ionen (im Folgenden einfach als „ladungsbezogene Masse”, manchmal einfach auch nur als „Masse” bezeichnet) vor der Messung unbekannt ist, erfolgt die Anregung der Ionen durch eine möglichst homogene Mischung aller Anregungsfrequenzen für einen gewünschten Massenbereich. Die Mischung kann dabei eine zeitliche Mischung sein, mit zeitlich linear ansteigenden oder abfallenden Frequenzen (man spricht dann von einem „Chirp”), oder sie kann eine synchrone, durch Computer berechnete Mischung aller Frequenzen sein (einem „Synch-Pulse”). Kommerzielle Massenspektrometer arbeiten in der Regel mit Chirps; dabei werden deren Anfangs- und End-Frequenzen, Zeitdauer und Spannung so gewählt, dass sie Ionen eines ausgewählten Massenbereichs gleichmäßig auf eine Zyklotronbahn mit gewünschtem Radius anheben.
Die Bildströme, die durch die umlaufenden Ionenwolken in den Detektionselektroden induziert werden, bilden als Funktion der Zeit einen sogenannten „Transienten”. Der Transient ist ein „Zeitdomänensignal”. Er beginnt meist mit zunächst hohen Bildströmen, die aber im Laufe der Messzeit so weit abnehmen, dass nur noch Rauschen übrig bleibt. Die nutzbare Länge des Transienten bis zum informationslosen Rauschen liegt meist bei einigen Sekunden, kann aber in richtig eingestellten ICR-Messzellen mit Kompensationselektroden, wie beispielsweise in 2 gezeigt, bis zu einigen Zehn Sekunden dauern.
Die Bildströme der Transienten werden verstärkt, digitalisiert und durch Fourier-Analyse auf die darin vorkommenden Umlauffrequenzen der Ionenwolken untersucht, wobei die Ionenwolken jeweils aus phasengleich umlaufenden Ionen verschiedener Massen bestehen. Die Fourier-Analyse transformiert dabei die Folge der originären Bildstrom-Messwerte des Transienten aus der „Zeitdomäne” in eine Folge von Frequenzwerten in einer „Frequenzdomäne”. Man spricht deshalb auch von Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FTMS), wobei jedoch anzumerken ist, dass es heute auch andere Arten der FTMS gibt, die nicht auf dem Umlauf von Ionen in Magnetfeldern beruhen.
Aus den als Peaks in der Frequenzdomäne erkennbaren Frequenzsignalen der verschiedenen Ionensorten werden dann ihre ladungsbezogenen Massen m/z und ihre Intensitäten bestimmt. Wegen der hohen Konstanz der verwendeten Magnetfelder und wegen der hohen Messgenauigkeit für Frequenzmessungen kann eine außergewöhnlich hohe Genauigkeit der Massenbestimmung erzielt werden. Gegenwärtig sind die Fourier-Transformations-ICR-Massenspektrometer (FT-ICR-MS) die genauesten aller Arten von Massenspektrometern, mit Genauigkeiten, die für Massen im Bereich bis zu etwa tausend atomaren Masseneinheiten weit besser sind als ein Millionstel der Masse. FT-ICR-MS liefert auch die besten Massenauflösungen, die für leichtere Ionen meist über eine Million liegen, aber mit zunehmender Masse der Ionen umgekehrt proportional zur Masse abnehmen. Die Massenauflösung ist im Wesentlichen von der Anzahl der Ionenumläufe abhängig, die durch die Messung erfasst werden können.
Der Transient sieht für gewöhnlich wie ein stark verrauschtes Signal aus, das mit der Zeit in etwa exponentiell abfällt. Das Rauschen ist nur scheinbar; das Signal besteht sehr reproduzierbar aus der Überlagerung der vielen Bildstromfrequenzen. In 3 ist als Beispiel ein besonders langer Transient der Bildströme der zweifach geladenen Ionen von „Substanz P” zu sehen, der die typische Form eines solchen Transienten wiedergibt. Aus diesem Transienten kann durch Fourier-Transformation und weitere Umrechnungen das Massenspektrum der Isotopengruppe dieser Ionen gewonnen werden, wie es in den 4a und 4b gezeigt wird. 4a zeigt das vollständige Massenspektrum, das aus den monoisotopischen Ionen, dem ersten ¹³C-Satelliten und dem zweiten ¹³C-Satelliten besteht und eine Massenauflösung von R = 2 500 000 hat. 4b gibt in einem stark vergrößerten Ausschnitt die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten wieder, die nur mit einer so hohen Massenauflösung sichtbar wird. Solche Messungen sind in vieler Hinsicht nützlich; so lässt sich damit beispielsweise schnell und einfach die Elementarzusammensetzung der untersuchten Substanz bestimmen.
Wenn aber ein besonderes Gemisch von Ionen aus einer größeren Anzahl von Ionensorten vorliegt, deren Massen sich jeweils um eine gleiche Massendifferenz unterscheiden, entsteht ein Bildstrom-Transient, der völlig anders aussieht. Mit der Anregung der Ionen durch einen gewöhnlichen Chirp kommt es bei der Messung der Bildströme im Transienten zur Ausbildung von sogenannten „Beats”. Die gemeinsam auf die Zyklotronbahn gehobenen Ionenwolken sind zu nächst alle nahe beieinander und erzeugen die starken Bildströme eines ersten Beats. Die Ionenwolken der leicht voneinander verschiedenen Massen laufen dann aber zunehmend auseinander und verteilen sich über lange Zeit fast gleichmäßig über die ganze Umlaufbahn; ihre Bildstromsignale löschen sich dabei wie bei einer Interferenz scheinbar fast aus. Erst wenn sich die Ionenwolken nach vielen Umläufen wieder nahe zusammenfinden, wird ein nächster „Beat” des Bildstroms erzeugt. Dieser Vorgang wiederholt sich periodisch. Die Zahl der Umläufe n_b zwischen zwei Beats liegt bei n_b = M/ΔM, wenn M die Masse des ersten Ions der Gruppe und ΔM die Massendifferenz zwischen den verschiedenen Ionen des Gemischs ist.
Diese Beats treten besonders oft auf, wenn man organische Substanzen sehr hoher Molekulargewichte untersucht. Die Ionen dieser Substanzen werden in aller Regel durch Elektrosprühen erzeugt, wobei für große Moleküle eine breite Verteilung aus vielfach geladenen Ionen entsteht. Als Beispiel ist in 5 ein Breitband-Massenspektrum von BSA gezeigt (Bovines Serumalbumin, Molekülmasse M = 66 432,455 58 u). Es sind die Signale der 32fach bis 63fach protonierten Molekülionen zu sehen. Für solche Substanzen mit sehr hoher Masse in der Größenordnung einiger Zehntausend atomarer Masseneinheiten ist es üblich, nach einer Breitband-Aufnahme eines Übersichtsspektrums eine weitere Aufnahme eines Schmalband-Massenspektrums anzuschließen, das bei höchster Auflösung nur die Ionen eines Ladungszustands zeigt. Diese Massenspektren höchster Massenauflösung sind analytisch sehr nützlich; aus ihnen lassen sich neben der Elementzusammensetzung auch Derivatisierungszustände, Reinheit der Substanz und Assoziationen mit kleineren Molekülen ablesen.
Die Ionen jeweils eines Ladungszustands bilden für sehr schwere organische Substanzen eine Isotopengruppe mit oft weit mehr als hundert Isotopensatelliten. Da die Ionen dieser Isotopengruppe sich jeweils um eine Masseneinheit unterscheiden (genauer um jeweils die Massendifferenz zwischen ¹²C und ¹³C), hat man es mit einem sehr gleichförmig strukturiertem Ionengemisch zu tun, das bei einer Anregung mit einem Chirp einen Transienten mit ausgeprägten Beats bildet, wie in 6 für die 49fach protonierten Molekülionen des BSA zu sehen.
Die Information, die in den Transienten enthalten ist, steckt aber nicht nur in den Beats, sondern auch in den visuell scheinbar fast leer erscheinenden Zwischenräumen zwischen den Beats. In den Zwischenräumen überlagern sich die Bildstrom-Frequenzen in ähnlicher Weise wie in dem „normalen” Transienten der 3. Um die Bildstrom-Messwerte in den Zwischenräumen gut messen zu können, muss der dynamische Messbereich außerordentlich hoch sein. Der üblicherweise schon hohe dynamische Messbereich von 20 bit in kommerzieller ICR-Elektronik reicht hierfür nicht aus. Nur mit besonderen Maßnahmen kann die volle Information gewonnen werden, die in den Messwerten eines solchen Transienten mit starkem Beat steckt. Die besonderen Maßnahmen bestehen für gewöhnlich darin, den Bildstrom-Transienten nicht nur einmal, sondern viele hundert Male aufzunehmen.
Das Massenspektrum der Isotopensignale der 49fach geladenen Ionen von BSA, das in den 7a, 7b und 7c in drei Spreizungen dargestellt ist, konnte nur deshalb gut und sogar mit einer Massenauflösung von R = 800 000 gemessen werden, weil hier die Transienten von 200 Bildstrommessungen addiert wurden. Da der Transient eine Länge von jeweils 15 Sekunden hatte, betrug die gesamte Messzeit hier 3000 Sekunden oder 50 Minuten. Eine solch lange Messzeit ist für viele analytische Aufgaben nicht akzeptabel. Eine erfolgreiche Addition von 200 Einzelspektren verlangt außerdem nicht nur ein stabiles Magnetfeld, sondern eine außergewöhnlich hohe Konstanz aller elektrischen Größen in der Elektronik, die selten gegeben ist.
Wie schon angemerkt, entstehen die Beats durch ein Interferenzverhalten der Ionen bei ihren Umläufen. Die Ionen werden bei der Anregung auf eine Zyklotronbahn gehoben, bei der sich alle Ionenwolken zunächst sehr dicht beieinander befinden und ein hohes Bildstromsignal, den ersten Beat, ergeben. Dann laufen die Ionenwolken, die sich ja jeweils um einen winzigen relativen Massenbetrag und somit um einen winzigen Betrag ihrer Geschwindigkeit unterscheiden, langsam auseinander und verteilen sich fast gleichmäßig über die gesamte Zyklotronbahn. Bei gleichmäßiger Verteilung löschen sich aber die Bildstromsignale gegenseitig fast aus; die Intensität der Signale ist sehr klein und neben den intensiven Beats kaum zu messen. Bei BSA kommen dann alle Ionen nach 66 389 Umläufen der monoisotopischen Ionen wieder zusammen, wobei die Ionen der ersten ¹³C-Satellitenmasse gegenüber den monoisitopischen Ionen einen Umlauf weniger durchlaufen haben, die Ionen des zweiten Satelliten zwei Umläufe weniger, die Ionen des dritten Satelliten drei Umläufe weniger, usw. So entsteht der zweite Beat. Die Ionensorten laufen dann wieder auseinander, bis sie sich nach weiteren 66 389 Umläufen wieder zu einem dritten Beat zusammenfinden.
Dieser Vorgang setzt sich periodisch fort, wobei aber die Beats immer kleiner werden, da zwar die Massendifferenzen über das ganze Gemisch exakt gleich sind, nicht aber die Differenzen der zu den Massen reziproken Geschwindigkeiten, wie man leicht mathematisch nachvollziehen kann. Da die Differenzen der Geschwindigkeiten nur in erster, wenn auch sehr guter Näherung gleich sind, linden sich die Ionen nach jeweils weiteren 66 389 Umläufen immer weniger zusammen, ihr Beat wird kleiner.
Die im heutigen Stand der Technik verwendeten Chirps haben einen linearen Frequenzgang mit gleicher Amplitude für alle Frequenzen, wie in 8 dargestellt. In kommerziellen ICR-Massenspektrometern lassen sich in der Regel Anfangsfrequenz, Endfrequenz, Zeitdauer und Amplitude (Spannung) des Chirps einstellen. Der Frequenzbereich liegt bei einigen wenigen Kilohertz bis zu etwa 100 Kilohertz; die Spannung kann zwischen einigen Volt und etwa 300 Volt eingestellt werden; die Zeitdauer des Chirps kann bis zu 20 Millisekunden und mehr betragen.
Für die Messung der Bildströme werden Verstärker mit Verstärkungen, die in weiten Bereichen einstellbar sind, und Analog-zu-Digital-Wandlern (ADC) mit 16 bis 20 bit Wandlungsbreite eingesetzt. Letztere bestimmen den dynamischen Messbereich, mit dem ein Transient gemessen werden kann.
Wenn im Folgenden der Begriff „Aufnahme eines ICR-Massenspektrums” oder eine ähnliche Formulierung verwendet wird, so umfasst das, wie jedem einschlägigen Fachmann bekannt, die gesamte Folge von Schritten über die Füllung der ICR-Messzelle mit Ionen, Anregung der Ionen zu Zyklotronbahnen, Messung des Bildstrom-Transienten, Digitalisierung, Fourier-Transformation, Bestimmung der Frequenzen der einzelnen Ionensorten und schließlich Berechnung der ladungsbezogenen Massen und Intensitäten der Ionensorten, die das Massenspektrum darstellen.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren für die Anregung der Ionen in ICR-Messzellen bereitzustellen, die nicht zur Ausbildung von Beats in den Bildstrom-Transienten führen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Anregungsverfahren für die Ionen in einer ICR-Messzelle bereit, das durch einen nichtlinearen Frequenzgang in einem Chirp die Bildung von Beats zumindest stark mindert oder sogar vollkommen verhindert.
Für die Beschreibung der Wirkung eines Chirps werde hier einmal ein Chirp mit linear ansteigender Frequenz angenommen. Bei diesem Chirp mit linear ansteigendem Frequenzgang werden die Ionen von schweren zu leichten Massen nacheinander angeregt. Überstreichen die ansteigenden Frequenzen eines solchen linearen Chirps die Zyklotronresonanzfrequenzen aller Ionen eines Ionengemischs in etwa zehn Millisekunden, erreichen die leichtesten Ionen ihre Zyklotron-Umlaufbahn etwa zehn Millisekunden später als die schwersten Ionen. Die Zeitabstände der Ionen zueinander für das Erreichen der Umlaufbahn sind dabei proportional zu ihrer Massendifferenz.
Besteht das Ionengemisch aus Ionen mit durchgehend gleichen Massendifferenzen, so werden alle Ionen die schwersten Ionen gleichzeitig einholen, weil die leichten Ionen auf ihrer Umlaufbahn etwas schneller fliegen und weil die Zeitabstände der leichteren Ionen zu den schwereren bei jeweiligem Erreichen der Umlaufbahn umgekehrt proportional zu ihrer Geschwindigkeit sind. Es werden sich also alle leichten und schweren Ionen zum gleichen Zeitpunkt überholend zusammenfinden, was zum ersten Beat führt.
Die Erfindung gibt nun einen nichtlinearen Frequenzgang im Chirp vor, so dass die Abstände auf der Umlaufbahn, die die Ionen nach ihrem jeweiligen Erreichen ihrer Umlaufbahn voneinander besitzen, nicht mehr proportional zu ihren Geschwindigkeiten sind. Es können sich daher nicht mehr alle Ionen zu einem einzigen Zeitpunkt treffen. Je weiter die Ionen bei engster Annäherung voneinander entfernt sind, umso besser wird die Entstehung eines Beats verhindert.
Als Frequenzgang kann eine beliebige stetige und möglichst auch stetig differenzierbare nichtlineare Funktion gewählt werden. Günstig ist beispielsweise eine quadratische Abhängigkeit der Frequenz von der Zeit, oder auch eine Wurzelfunktion.
Da bei einem nichtlinearem Frequenzgang mit konstanter Amplitude der Anregungsspannung die Ionen verschiedener Masse zeitlich leicht verschieden lange angeregt und so auf leicht verschieden hohe Zyklotronbahnen gehoben werden, ist es vorteilhaft, die Amplitude mit dem Frequenzgang so zu verändern, dass die Ionen auf gleiche Zyklotronbahnen gehoben werden. 9 zeigt in einem Diagramm einen Frequenzgang F und einen kompensierenden Amplitudengang (V). Die Amplituden sind hier proportional zum Betrag der Steigung des Frequenzganges angenommen, also proportional zur ersten Ableitung der Frequenz als Funktion der Zeit.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 gibt eine zylindrische ICR-Messzelle nach dem Stand der Technik wieder. Zwischen den beiden Trapping-Elektroden (01) und (07), die hier als Lochblenden ausgebildet sind, befinden sich vier Längselektroden (02–05) in der Form von Zylindermantelsegmenten, von den hier aber nur zwei Längselektroden (03, 04) sichtbar sind. Von den vier Längselektroden dienen zwei gegenüberliegende Elektroden, beispielsweise die Elektroden (03) und (05), zur Anregung der Ionen zu Zyklotronbahnen und die beiden anderen zum Messen der Bildströme.
2 zeigt eine verbesserte ICR-Messzelle, ebenfalls nach dem Stand der Technik, mit vier Reihen von Längselektroden (11–17), (21–27), (31–37) und (41–47), von denen nicht alle sichtbar sind. Die Längselektroden sind jeweils in sieben Segmente eingeteilt, um ein günstigeres Trapping-Potential erzeugen zu können. Mit ICR-Messzellen dieser Art können die langen Transienten erzeugt werden, die in 3 und 6 gezeigt sind.
3 zeigt das typische Aussehen eines Transienten ohne Beats. Hier ist ein 26 Sekunden langer Bildstrom-Transient wiedergegeben, der für die Aufnahme eines Schmalband-Massenspektrums der zweifach geladenen Molekülionen der Substanz P (Bruttoformel C₆₃H₁₀₀N₁₈O₁₃S) gemessen wurde.
4a zeigt das zugehörige Schmalband-Massenspektrum, das mit einem Auflösungsvermögen von R = 2 500 000 gemessen wurde. In dem Massenspektrum sind das monoisotopische Signal der doppelt geladenen Molekülionen und drei ¹³C-Satelliten sichtbar. 4b gibt als Vergrößerung aus 4a die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten wieder, die durch das hohe Auflösungsvermögen gut aufgelöst zu sehen ist.
5 zeigt ein Breitband-Massenspektrum von BSA (bovine serum albumin) mit dem Molekulargewicht von M = 66 432,45558 u, zur Vorbereitung der Aufnahmen von Massenspektren einer Isotopengruppe mit höchstem Auflösungsvermögen.
6 zeigt die prinzipiell störenden Beats in einem Transienten, wie er bei der Messung der Bildströme der Isotopengruppe der 49-fach geladenen Ionen von BSA erhalten wurde.
In 7a ist das Schmalband-Massenspektrum mit der gesamten Isotopengruppe der 49fach geladenen Ionen dargestellt, darunter in 7b als Vergrößerung ein zentraler Ausschnitt, der sich über nur zwei atomare Masseneinheiten erstreckt, und darunter in 7c ein nochmals vergrößerter Ausschnitt, der sich nur noch über 0,030 atomare Masseneinheiten hinzieht, aber noch 15 Ionensignale der einzelnen Isotopensatelliten enthält. Die Massenauflösung liegt bei R = 800 000. Die Aufnahme so guter Massenspektren wurde nur möglich, weil hier 200 Einzelmessungen des Transienten in 6 addiert werden konnten, was insgesamt 50 Minuten Messzeit in Anspruch nahm. Alle Messungen wurden in einem Magnetfeld von sieben Tesla gemacht. Die hier dargestellten Massenspektren von BSA sind nicht auf genaue Massen kalibriert, können also von den wahren Werten abweichen.
8 gibt Frequenzgang (F) und Amplitudengang (V) eines Chirps nach dem Stand der Technik wieder.
9 zeigt einen Chirp nach dieser Erfindung mit einem nichtlinearen Frequenzgang (F) und einem kompensierenden Amplitudengang (V).
Beste Ausführungsformen
Die Erfindung besteht in der Verwendung nichtlinearer Chirps für die Anregung der Ionen in einer ICR-Messzelle. Unter dem Begriff „nichtlinearer Chirp” soll hier ein Chirp mit nichtlinearem Frequenzgang verstanden werden. Der nichtlineare Frequenzgang bei der Anregung kann die Bildung von Beats zumindest stark mindern, meist sogar vollkommen verhindern.
Chirps können mit ansteigendem oder auch mit absteigendem Frequenzgang eingesetzt werden. Für den nichtlinearen Frequenzgang kann eine beliebige stetige und möglichst auch stetig differenzierbare nichtlineare Funktion gewählt werden. Günstig ist beispielsweise eine quadratische Abhängigkeit der Frequenz von der Zeit, oder auch eine Wurzelfunktion. Aber auch höhere Potenzfunktionen, Exponentialfunktion oder Logarithmusfunktion können Verwendung finden. In 9 ist ein absteigender Frequenzgang mit quadratischer Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.
Bei einem Chirp mit linear ansteigendem Frequenzgang werden die Ionen von schweren zu leichten Massen nacheinander angeregt. Überstreichen die ansteigenden Frequenzen eines solchen linearen Chirps die Zyklotronresonanzfrequenzen aller Ionen eines Ionengemischs von den schwersten bis zu den leichtesten Ionen in etwa zehn Millisekunden, erreichen die leichtesten Ionen ihre Zyklotron-Umlaufbahn etwa zehn Millisekunden später als die schwersten Ionen. Die Linearität des Frequenzganges bewirkt dabei, dass die Zeitdifferenzen der Ionen, mit denen sie jeweils nacheinander die Umlaufbahnen erreichen, streng proportional zu ihren Massendifferenzen sind.
Besteht das Ionengemisch aus vielen Ionensorten mit stets gleichen Massendifferenzen, so werden sie mit gleichen Zeitdifferenzen ihre jeweiligen Umlaufbahnen erreichen, und auf diesen Umlaufbahnen zunächst gleiche Abstände zueinander haben. Da ihre Geschwindigkeitsdifferenzen in sehr guter Näherung ebenfalls gleich sind und da die leichten Ionen schneller fliegen, werden alle Ionenwolken verschiedener Massen die langsamste Ionenwolke der Ionen mit schwerster Masse gleichzeitig einholen. Das führt zum ersten Beat.
Die Erfindung gibt nun einen nichtlinearen Frequenzgang im Chirp vor, so dass die Zeitdifferenzen und auch die Abstände bei Erreichen der Umlaufbahn nichtlinear auseinander gezogen werden. Die Abstände der Ionenwolken sind nicht mehr proportional zu ihren Geschwindigkeiten, die durch die Zyklotronfrequenzen ihrer Ionen unveränderlich vorgegeben sind. Da also die Startpunkte der Ionen auf der Umlaufbahn in nichtlinearer Weise auseinandergezogen sind, können sich die Ionen nicht mehr zu einem einzigen Zeitpunkt treffen.
Je weiter die Ionen bei einer engsten Annäherung voneinander entfernt sind, umso besser wird die Entstehung eines Beats verhindert.
Die verschiedenen Ionensorten verschiedener Masse werden bei einem nichtlinearem Frequenzgang mit konstanter Amplitude der Anregungsspannung nicht mehr in gleicher Weise angeregt. Da die Änderungsgeschwindigkeit der Frequenzen nicht mehr konstant ist, werden einige Ionensorten länger angeregt als andere, da ihre Resonanzfrequenz etwas länger angeboten wird. Durch die verschieden lange Zeitdauer der Anregung werden verschieden Ionensorten auf leicht verschieden hohe Zyklotronbahnen gehoben. Die Änderungsgeschwindigkeit entspricht der Steigung des Frequenzgangs oder der ersten Ableitung der Frequenz als Funktion der Zeit.
Um alle Ionen auf die gleiche Umlaufbahn zu heben, muss die Amplitude mit dem Frequenzgang verändert werden. Es ist günstig, die Amplitude proportional zur Steigung des Frequenzgangs zu verändern. 9 zeigt in einem Diagramm einen Frequenzgang F und einen kompensierenden Amplitudengang V. Bei einem Frequenzgang, der sich mit dem Quadrat der Zeit ändert, entsteht ein linearer Gang der Amplitude für eine günstige Kompensation der Anregung.
Die Anregung der Ionen in der ICR-Messzelle wird durch zwei Anregungselektroden (oder zwei Reihen von Anregungselektroden) bewirkt, die sich gegenüberstehen und an die die Spannungen des Chirps angelegt werden. Es entsteht ein etwas verzerrtes Dipolfeld. Es hat sich erwiesen, dass die Verzerrung praktisch keine Rolle spielt. 1 zeigt eine einfache ICR-Messzelle mit ihren vier Längselektroden.
In 2 ist eine verbesserte ICR-Messzelle gezeigt, deren vier Längselektroden in jeweils sieben Segmente eingeteilt sind. Das zentrale Segment (24, 34) nimmt die Ionenwolken auf, die Elektroden der endständigen Segmente (21, 31) und (27, 37) tragen die Trapping-Potentiale. Die Elektroden der Segmente zwischen dem zentralen Segment und den endständigen Segmenten sind Kompensationselektroden; die Messzelle der 2 hat je zwei Segmente mit Kompensationselektroden zu beiden Seiten des zentralen Segments. Die Potentiale an den Kompensationselektroden können so eingestellt werden, dass ein langer Transient gemessen werden kann, wodurch sich ein hohes Auflösungsvermögen ergibt, wenn nicht die Ausprägung eines starken Beats dieses Auflösungsvermögen wieder verhindert. Von den vier Reihen von Längselektroden der ICR-Messzellen werden im Allgemeinen zwei gegenüberstehende Elektrodenreihen verwen det, um die in einer schlanken Wolke gesammelten Ionen durch elektrische Anregung auf weite Zyklotronbahnen zu heben. Einige oder auch alle Elektroden der beiden übrigen einander gegenüberstehenden Elektrodenreihen werden für die Messung der Bildströme verwendet.
Für höchste Auflösungsvermögen werden ICR-Massenspektrometer stets in einem sogenannten „Schmalband-Modus” betrieben, mit dem jeweils nur ein kleiner Ausschnitt aus einem vollen Massenspektrum gemessen wird, wie dem einschlägigen Fachmann bekannt. Kommerzielle ICR-Massenspektrometer bieten jeweils diesen Schmalband-Modus an, zusätzlich zu einem Breitband-Modus, der Massenspektren über einen weiten Massenbereich zu messen gestattet. Transienten mit Beats treten vorwiegend bei der Aufnahme von solchen Schmalbad-Massenspektren auf.
Die statt der Chirps manchmal eingesetzten Synch-Pulse heben die Ionenwolken verschiedener Masse synchron auf ihre Umlaufbahn. Hier entsteht anfänglich immer ein Beat, bis die Ionen auseinandergelaufen sind und sich statistisch über die Umlaufbahn verteilt haben. Möchte man mit einem Synch-Puls die gleiche Wirkung erzielen wie mit einem nichtlinearen Chirp, so muss man, die Grundidee eines Synch-Pulses verlassend, innerhalb des Synch-Pulses die Frequenzen zeitlich nichtlinear verteilen. Verfolgt man diesen Gedanken konsequent weiter, so endet man bei einem nichtlinearen Chirp.
Alle nachfolgend beschriebenen Messungen wurden in einem Magnetfeld von nur sieben Tesla durchgeführt; in heute erhältlichen supraleitenden Magneten mit einer magnetischen Flussdichte von 11 und 15 Tesla würden entsprechend höhere Massenauflösungsvermögen erzielt werden können.
3 zeigt einen ohne Beats geformten Transienten mit typisch in etwa exponentiell abnehmender Form und sehr langer nutzbarer Länge. Er stammt aus einer Messung eines kleinen Massenbereichs um die doppelt geladenen Ionen der „Substanz P” (C₆₃H₁₀₀N₁₈O₁₃S) herum. Wird ein solcher Transient erhalten, braucht ein nichtlinearer Chirp nach dieser Erfindung nicht zur Anwendung zu kommen, obwohl er auch nicht schaden würde.
In 4a ist das Schmalband-Massenspektrum wiedergegeben, das aus dem Transienten der 3 gewonnen wurde. Das Massenspektrum zeigt neben dem Signal der doppelt geladenen monoisotopischen Ionen der Masse m/z = 674,37135 u auch den ersten (m/z = 674,87303 u) und zweiten ¹³C-Satelliten (m/z = 675,37470 u). Die Massenauflösung beträgt R = 2 500 000. Unter „monoisotopischen Ionen” werden in der Massenspektrometrie diejenigen Ionen verstan den, die nur aus den Hauptisotopen der Elemente zusammengesetzt sind, also nur aus ¹H, ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ³¹P, ³²S oder ³⁵Cl.
4b stellt in einem vergrößerten Ausschnitt aus 4a die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten dar. Die Feinstruktur entsteht, weil hier nicht nur das Signal der Ionen vorhanden ist, die statt zweier ¹²C-Atome zwei Atome ¹³C enthalten, sondern auch Signale der Ionen mit ¹⁸O statt ¹⁶O, ³⁴S statt ³²S, ¹³C¹⁵N statt ¹²C¹⁴N, ¹³C²D statt ¹²C¹H, usw. Für unbekannte Substanzen können aus der Messung einer solchen Feinstruktur leicht die beteiligten Elemente bestimmt werden, die mit anderen Mitteln nur schwer zu bestimmen sind.
Für Substanzen mit sehr viel höherer Masse in der Größenordnung einiger Zehntausend atomarer Masseneinheiten ist es üblich, nach einer Breitband-Aufnahme eines Übersichtsspektrums eine weitere Aufnahme eines Schmalband-Massenspektrums anzuschließen, das bei höchster Auflösung nur die Ionen eines Ladungszustands zeigt. Ein Breitband-Massenspektrum von BSA ist in 5 gezeigt.
Die Ionen jeweils eines Ladungszustands schwerer Moleküle bilden eine Isotopengruppe mit oft weit mehr als hundert Isotopensatelliten. Hier tritt das Problem mit den Beats auf. Da die Ionen dieser Isotopengruppe sich jeweils um eine Masseneinheit unterscheiden (genauer um jeweils die Massendifferenz zwischen ¹²C und ¹³C), hat man es mit einem Gemisch von vielen Ionen gleicher Massendifferenzen zu tun, die in einer Schmalband-Messung einen Transienten ausbilden, der, wie in 6 zu sehen, aus einer Folge von einzelnen „Beats” besteht.
Die Bildung dieser Beats beeinträchtigt das Auflösungsvermögen des daraus gewonnenen Massenspektrums, weil die Beats einen besonders hohen dynamischen Messbereich für die Messung der Bildströme verlangen. Die Beats übersteigen den eigentlichen Transienten in den Zwischenräumen um einen Faktor 100 und mehr. Die Messungen der Bildströme normaler Transienten erfordern einen Messbereich von etwa 1:10⁶, das Auftreten der Beats bewirkt, dass nunmehr ein Messbereich von 1:10⁸ gebraucht würde. Dieser Messbereich ist durch die Elektronik kaum bereitzustellen, daher wird nach bisheriger Verfahrensweise durch eine sehr hohe Anzahl von wiederholten Messungen Abhilfe geschaffen. Es werden dabei Hunderte von Bildstrommessungen durchgeführt und addiert, was aber erheblich lange Messzeiten erfordert.
In den 7b, 7c und 7d kann gezeigt werden, dass trotz des Auftretens der Beats im Transienten der 6 ein Massenspektrum der Isotopensignale der 49fach geladenen Ionen von BSA (bovine serum albumin; Molekülmasse M = 66 432,455 58 u) mit einer Massen auflösung von R = 800 000 gemessen werden kann, wenn dafür 200 Einzelspektren addiert werden. Die Information kann also extrahiert werden, wenn der dynamische Messbereich durch besondere Maßnahmen angepasst werden kann. Hier wurde der dynamische Messbereich durch die Addition der 200 Transienten vergrößert, die Erfindung dagegen verkleinert den notwendigen Messbereich durch Unterdrückung der Beats.
Es soll hier angemerkt werden, dass eine erfolgreiche Addition von 200 Einzeltransienten eine außergewöhnlich hohe Konstanz der Elektronik verlangt, die selten vorhanden ist. Außerdem ist eine lange Messzeit von rund einer Stunde notwendig, die für Analysen in Routinelaboratorien nicht zur Verfügung steht.
Aus Massenspektren der Art nach 7a, 7b und 7c kann bestimmt werden, ob es sich um eine einzige Substanz hohen Molekulargewichts oder um eine Mischung handelt. Solche Substanzen hohen Molekulargewichts sind häufig nicht rein, sondern enthalten neben der Grundsubstanz auch oxidierte oder sonst derivatisierte Moleküle, oder sie sind verbunden mit assoziierten Molekülen kleineren Molekulargewichts. Aus diesen Massenspektren können Analysen dieser Art vorgenommen werden. Daher ist ihre erfolgreiche Messung nicht nur von akademischem Interesse.
Die Erfindung bietet somit den Vorteil, Messungen von gleichförmig strukturierten Ionengemischen in wesentlich kürzerer Zeit durchzuführen, wobei Massenspektren gleicher Qualität erhalten werden können. Es ist sogar zu erwarten, dass Massenspektren mit noch höheren Qualitäten, beispielsweise besseren Auflösungsvermögen und höheren Massengenauigkeiten, gemessen werden können. Nichtlineare Chirps brauchen aber nicht nur dann angewendet werden, wenn gleichförmig strukturierte Ionengemische vorliegen, sondern können für alle Arten von Spektrenaufnahmen quasi als Grundeinstellung verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Anregung der Ionen in einer ICR-Messzelle, dadurch gekennzeichnet, dass ein Chirp mit nichtlinearem Frequenzgang verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Frequenzgang (Abhängigkeit der Frequenz von der Zeit) eine quadratische Funktion, eine Wurzelfunktion, eine höhere Potenzfunktion, eine Exponentialfunktion oder eine Logarithmusfunktion verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Chirp zusätzlich zu einem nichtlinearen Frequenzgang auch einen Gang der Amplituden enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Amplituden proportional zur ersten Ableitung der Frequenzen als Funktion der Zeit ändern.