DE102008041299A1 - Novel, universally applicable addiction system - Google Patents

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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist eine gentechnisch veränderte Zelle, die mindestens eine geänderte Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme aufweist, so dass diese Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zelle mindestens eine gesteigerte, im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität aufweist, durch die diese Zelle eine erhöhte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag.The invention relates to a genetically modified cell which has at least one altered activity of the enzymes present in the wild-type, so that this cell is able to form a reduced amount of isopentenyl diphosphate compared to its wild-type, characterized in that this cell has at least one increased, in the Wild type non-enzyme activity present, by which this cell is able to form an increased amount of Isopentenyldiphosphat.

Description

Gebiet der ErfindungField of the invention

Gegenstand der Erfindung ist eine gentechnisch veränderte Zelle, die mindestens eine geänderte Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme aufweist, so dass diese Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zelle mindestens eine gesteigerte, im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität aufweist, durch die diese Zelle eine erhöhte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag.object The invention is a genetically engineered cell, the at least one altered activity of the wild-type has existing enzymes, making this cell one in comparison to form reduced to their wild-type amount of Isopentenyldiphosphat vermag, characterized in that this cell at least one increased enzyme activity not present in the wild type through which this cell has an increased amount of isopentenyl diphosphate to be able to form.

Stand der TechnikState of the art

Bekannte addiction-SystemeKnown addiction systems

Addiction-Systeme werden z. B. immer dann eingesetzt, wenn in Zellen ein oder mehrere Produkte hergestellt werden sollen, für die es nötig ist, dass eine oder mehrere DNAs (wie z. B. ein Gen, eine cDNA) stabil in der produzierenden Zelle aufrechterhalten werden muss, ohne dass man einen externen Selektionsdruck in Form von z. B. Antibiotika ausüben muss.Addiction systems be z. B. always used when in cells one or more Products should be produced for which it is necessary is that one or more DNAs (such as a gene, a cDNA) are stable must be maintained in the producing cell without that one external selection pressure in the form of z. B. antibiotics must exercise.

Bekannte addiction-Systeme zur stabilen Aufrechterhaltung von Fremd-DNA in Zellen stellen z. B. das pTF-FC2 System, das Doc-Toxin, Phd Antidote, das ColE3 System und weitere dar. Eine Übersicht über weitere bekannte bakterielle addiction-Systeme sind beispielsweise Urszula Zielenkiewicz and Piotr Cegowski, 2001. Mechanisms of plasmid stable maintenance with special focus an plasmid addiction systems. Acta Biochimica Polonica. 48, 1003–1023 zu entnehmen.Known addiction systems for the stable maintenance of foreign DNA in cells provide z. For example, the pTF-FC2 system, the doc toxin, Phd antidote, the ColE3 system and others. An overview of other known bacterial addiction systems are, for example Urszula Zielenkiewicz and Piotr Cegowski, 2001. Mechanisms of plasmid stable maintenance with special focus on plasmid addiction systems. Acta Biochimica Polonica. 48, 1003-1023 refer to.

Allen bekannten addiction-Systemen ist gemein, dass es sich um katabole, toxin-antitoxin- oder Operator Repressor Titrations(„ORT”; siehe Cranenburg et al. 2001, Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration )-Systeme handelt. Diese Systeme haben die Eigenschaft, sich aufgrund des nachlassenden Selektionsdrucks (z. B. Metabolisierung bzw. Spaltung der Antibiotika, Bindung des Toxins durch das Antidot) im Verlauf einer Kultivierung aus dem System wieder heraus zu selektieren, da sie gegenüber stoffwechselaktiveren Zellen benachteiligt sind, die einen niedrigeren metabolischen Aufwand und somit weniger Energie aufwenden müssen. Dies führt schnell dazu, dass sich nur noch die Zellen durchsetzen und vermehren werden, die gar kein Plasmid mit den gewünschten Eigenschaften enthalten. Bei dem pTF-FC2 proteic poison-antidote plasmid addiction system (pas) wird die Plasmidstabilität durch drei Gene (pasA, pasB, pasC) gewährleistet, die auf dem Plasmid lokalisiert sind, wobei das eine Gen für ein Toxin, das zweite Gen für das Antidot und ein weiteres für einen Enhancer kodiert. Dieses System ermöglicht jedoch lediglich eine 3fache Stabilisierung des Plasmids ( Smith AS, Rawlings DE, 1997. The poison-antidote stability system of the broad-hostrange Thiobacillus ferrooxidans plasmid pTF-FC2. Mol Microbiol. Dec; 26(5): 961–70 ).Common to all known addiction systems is that they are catabolic, toxin-antitoxin or operator repressor titrations ("ORT"; Cranenburg et al. 2001, Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration ) Systems. These systems have the property of being able to select out again during the course of a culture out of the system due to the decreasing selection pressure (eg, metabolization or cleavage of the antibiotics, binding of the toxin by the antidote), since they are disadvantaged compared to metabolically active cells, which must expend a lower metabolic expenditure and thus less energy. This quickly leads to the fact that only the cells will prevail and multiply that contain no plasmid with the desired properties. In the pTF-FC2 proteic poison-antidote plasmid addiction system (pas), plasmid stability is ensured by three genes (pasA, pasB, pasC) located on the plasmid, one gene for a toxin, the second gene for the plasmid Antidote and another coded for an enhancer. However, this system allows only a 3-fold stabilization of the plasmid ( Smith AS, Rawlings DE, 1997. The poison-antidote stability system of the broad-host range Thiobacillus ferrooxidans plasmid pTF-FC2. Mol Microbiol. Dec; 26 (5): 961-70 ).

Das addiction-System auf Basis des Doc-Toxins des Bakteriophagen P1 beruht darauf, dass das Phd-Protein direkt an das Doc-Protein bindet und somit dessen Toxizität inaktiviert ( Gazit E, Sauer RT, 1999. The Doc toxin and Phd antidote Proteins of the bacteriophage P1 plasmid addiction system form a heterotrimeric complex. J Biol Chem. 1999 Jun 11; 274(24): 16813–8 ). Da aber bei diesen Systemen sowohl die Gene für die Toxine, als auch für die Antidote auf ein und demselben Plasmid kodiert vorliegen, ist eine effiziente Stabilisierung desselben schwierig, da ein Verlust des Plasmids eigentlich einen Vorteil für die Zelle darstellt.The addiction system based on the Doc toxin of the bacteriophage P1 is based on the fact that the Phd protein binds directly to the Doc protein and thus inactivates its toxicity ( Gazit E, Sauer RT, 1999. The Doc toxin and Phd antidote Proteins of the bacteriophage P1 plasmid addiction system form a heterotrimeric complex. J Biol Chem. 1999 Jun 11; 274 (24): 16813-8 ). However, since both the genes for the toxins and for the antidotes are encoded on one and the same plasmid in these systems, efficient stabilization of the same is difficult, since loss of the plasmid actually represents an advantage for the cell.

Ein kataboles addiction-System ist in 'Voss and Steinbüchel' beschrieben ( Application of a KDPG-aldolase gene-dependent addiction system for enhanced production of cyanophycin in Ralstonia eutropha strain H16.Metab Eng. 2006 Jan; 8(1): 66–78 ). Der Mechanismus der Plasmidstabilisierung beruht hier auf einer katabolen Verwertung des zugefütterten Natrium-Gluconats durch Einbringen einer singulären plasmidkodierten Kopie des KDPG-Aldolase-Gens (eda). Wobei Na-Gluconat in der Kultivierung die einzige Kohlenstoffquelle darstellt. Da der eingesetzte Mikroorganismus jedoch chemolithoautotroph wachsen kann, das heißt mit Kohlendioxid als einziger Kohlenstoffquelle alle Zellbestandteile zu synthetisieren vermag, und zudem RecA-positiv ist, kann es in diesem Sytstem zu Mutationen während einer Langzeitkultivierung, zum Ausdünnen des Plasmids und somit letztendlich zum Verlust des klonierten Gens führen.A catabolic addiction system is described in 'Voss and Steinbüchel' ( Application of a KDPG aldolase gene-dependent addiction system for enhanced production of cyanophycin in Ralstonia eutropha strain H16.Metab Eng. 2006 Jan; 8 (1): 66-78 ). The mechanism of plasmid stabilization is based here on a catabolic utilization of the added sodium gluconate by introducing a single plasmid-encoded copy of the KDPG aldolase gene (eda). Na-gluconate is the only source of carbon in cultivation. However, since the microorganism used can grow chemolithoautotrophically, ie with carbon dioxide as sole carbon source to synthesize all cell components, and is also RecA-positive, it can in this system to mutations during long-term cultivation, thinning of the plasmid and thus ultimately to the loss of the lead cloned gene.

Isopentenyldiphosphat (Isopentenylpyrophosphat, kurz IPP) ist ein essentieller Metabolit, der in biologischen Systemen auf verschiedenen Wegen synthetisiert werden kann. Oft findet eine Umwandlung des IPPs zu Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), beispielsweise über eine IPP-Isomerase statt; dadurch können DMAPP und IPP, beides Isoprenoide, gemeinsam im Gleichgewicht vorliegen.Isopentenyl diphosphate (isopentenyl pyrophosphate, IPP for short) is an essential metabolite that can be synthesized in biological systems in a variety of ways. Often, conversion of IPP to dimethylallyl diphosphate (DMAPP) occurs, for example via an IPP isomerase; This allows DMAPP and IPP, both isoprenoids, are in equilibrium together.

MEP-WegMEP pathway

1 zeigt den ausgehend von Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-Phosphat IPP bereitstellenden Methylerythritolphospat-Stoffwechselweg (MEP-Weg, auch DOXP-Weg, Mevalonat unabhängiger oder Rohmer-Weg genannt) auf. Dieser Weg ist in Eubakterien, Prokaryoten und einigen einzelligen Algen, beispielsweise Chlamydomonas reinhardtii und in Protisten wie z. B. Plasmodium falciparum ( KEGGG-Datenbank, Acta Biochim Pol. Isoprenoid biosynthesis via 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate/2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP/MEP) pathway. Wanke et al. 2001 ) oder Theileria annulata, Theileria parva beschrieben worden. Auch wird in den Chloroplasten höherer Pflanzen der MEP-Weg zur Bildung von IPP genutzt. Hieraus wird für die Photosynthese notwendiges Phytol, Plastochinone oder Carotenoide synthetisiert. 1 shows the methylerythritol phosphate pathway starting from pyruvate and glyceraldehyde-3-phosphate IPP (MEP pathway, also called DOXP pathway, called mevalonate independent or Rohmer pathway). This pathway is in eubacteria, prokaryotes and some unicellular algae, such as Chlamydomonas reinhardtii and in protists such. Plasmodium falciparum ( KEGGG database, Acta Biochim Pol. Isoprenoid biosynthesis via 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate / 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP / MEP) pathway. Wanke et al. 2001 ) or Theileria annulata, Theileria parva. Also in the chloroplasts of higher plants the MEP pathway is used to form IPP. From this phytol, plastoquinones or carotenoids necessary for photosynthesis are synthesized.

MVA WegMVA way

Der zumeist in höheren Organismen wie Hefen, Säugern, und Eukaryoten und einigen Prokaryonten vorkommende Mevalonat-Weg (MVA-Weg) setzt über mehrere Stufen zwei Moleküle Acetyl-CoenzymA zu IPP um; 2 zeigt alle Zwischenschritte und involvierte Enzyme auf.The mevalonate pathway (MVA pathway), which mostly occurs in higher organisms such as yeasts, mammals, and eukaryotes and some prokaryotes, converts two molecules of acetyl-coenzyme A into IPP in several stages; 2 shows all intermediate steps and involved enzymes.

Alternative MVA WegAlternative MVA way

Ein alternativer MVA Weg wurde beschrieben in Grochowski et al. Methanocaldococcus jannaschii uses a modified mevalonate pathway for biosynthesis of isopentenyl diphosphate J Bacteriol. 2006 May; 188(9): 3192–8 . Ab dem Mevalonat-5-Phosphat (vgl. 2) wird über eine Monophosphomevalonat-Decarboxylase Isopentenylmonophosphat erhalten, welches wiederum durch eine Isopentenylphosphat-Kinase zu Isopentenyldiphosphat umgesetzt wird.An alternative MVA pathway has been described in Grochowski et al. Methanocaldococcus jannaschii uses a modified mevalonate pathway for biosynthesis of isopentenyl diphosphate J Bacteriol. 2006 May; 188 (9): 3192-8 , From the mevalonate-5-phosphate (see. 2 ) is obtained via a monophosphomevalonate decarboxylase isopentenyl monophosphate, which in turn is converted by a Isopentenylphosphat kinase to Isopentenyldiphosphat.

Bekannte IPP defiziente Stämme und KomplimentierungKnown IPP deficient strains and compliment

Aus der Literatur sind Bakterienstämme mit defekter IPP Synthese bekannt, so z. B. aus McAteer, S., A. Coulson, N. F. McLennan, M. Masters 2001. The lytB gene of Escherichia coli is essential and specifies a product needed for isoprenoid biosynthesis. J. Bacteriol. 183: 7403–7407 und aus Franci X et al. 2000. Evidence of a Role for LytB in the Nonmevalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis. J. Bacteriol. 182: 5841–5848 .From the literature bacterial strains with defective IPP synthesis are known, such. B. off McAteer, S., A. Coulson, NF McLennan, M. Masters 2001. The lytB gene of Escherichia coli is essential and specifies a product needed for isoprenoid biosynthesis. J. Bacteriol. 183: 7403-7407 and from Franci X et al. 2000. Evidence of a Role for LytB in the Nonmevalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis. J. Bacteriol. 182: 5841-5848 ,

Im „The Coli Genetic Stock Center” der Yale Universität der E. coli Stamm CGSC#: 8074 hinterlegt, der eine Deletion im lytB-Gen trägt. In dem Stamm liegt ein Hybridplasmid (pBADL) vor, welches eine Kopie des lytB bzw. ispH-Gens enthält. Bei nicht induziertem Promotor (Arabinose-Induktion) ist dieser Stamm aufgrund IPP-Synthese-Mangels nicht lebensfähig. Die endogene Mutation wird somit durch Expression des plasmoidal vorliegenden lytB-Gens komplementiert. Somit wird hier lediglich exakt dieselbe Enzymaktivität, die zuvor reduziert wurde, durch eine exogene Bereitstellung wieder erhöht.In "The Coli Genetic Stock Center "of Yale University the E. coli strain CGSC #: 8074 deposited, which contains a deletion in the lytB gene wearing. There is a hybrid plasmid (pBADL) in the strain, which contains a copy of the lytB or ispH gene. at uninduced promoter (arabinose induction) is this strain not viable due to IPP synthesis deficiency. The endogenous Mutation is thus present by expression of the plasmoidal lytB gene complemented. Thus, here only exactly the same Enzyme activity that was previously reduced by an exogenous Deployment increased again.

Bekannter Transfer von kompletten MEP oder MVA Wegen in andere Wirte, die nicht IPP defizient sind US 2007166782 Keasling Jay D. et. al. 2007 beschreibt eine Methode, zusätzliches IPP in der Zelle durch Einbringen von Genen des MVA-Weges bzw. des gesamten MVA-Weges bereitzustellen. Die modifizierten Zellen sind selber bereits in der Lage, IPP über alternative Routen zu synthetisieren.Known transfer of complete MEP or MVA routes to other hosts that are not IPP deficient US 2007166782 Keasling Jay D. et. al. 2007 describes a method to provide additional IPP in the cell by introducing MVA pathway or MVA pathway genes, respectively. The modified cells themselves are already able to synthesize IPP via alternative routes.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein alternatives addiction-System bereitzustellen, mit dem die Stabilität einer exogenen Nukleinsäure in einer Zelle erhöht wird.task It was the object of the present invention to provide an alternative addiction system to provide with the stability of an exogenous Nucleic acid is increased in a cell.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebene gentechnisch veränderte Zelle, die mindestens eine geänderte Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme aufweist, so dass diese Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zelle mindestens eine gesteigerte, im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität aufweist, durch die diese Zelle eine erhöhte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag, einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet. Bevorzugt weist erfindungsgemäße Zelle mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier und am meisten bevorzugt mindestens fünf gesteigerte, im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivitäten auf.Surprisingly was found to be genetically engineered as described below changed cell that has at least one changed Activity of the enzymes present in the wild type, so that this cell is a reduced amount compared to its wild type to form isopentenyl diphosphate, characterized in that that this cell has at least one increased, not present in the wild type Enzyme activity by which this cell increased Amount of isopentenyl diphosphate is able to contribute to the Solution of the aforementioned tasks makes. Prefers cell according to the invention has at least two, more preferably at least three, moreover preferably at least four, and most preferably at least five increased enzyme activities not present in the wild type on.

Eine für mindestens eine im Wildtyp nicht vorhandene, die reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat erhöhende und gesteigerte Enzymaktivität kodierende Nukleinsäure vermag ohne Selektionsdruck stabil in der gentechnisch veränderten Zelle zu verweilen und wird weiterhin in die nächste Generation übertragen.A for at least one non-wild type, the reduced Amount of isopentenyl diphosphate increasing and increasing Enzyme activity encoding nucleic acid is able without selection pressure stable in the genetically modified Lingering and will continue to be transferred to the next generation.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher eine gentechnisch veränderte Zelle, Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle und Nukleinsäuren.object Therefore, the present invention is a genetically engineered Cell, process for producing a genetically engineered Cell and nucleic acids.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass das erfindungsgemäße addiction-System nicht auf einem plasmidbasierten Toxin-Antitoxin-System, einem katabolen addiction Sytem oder einem ORT-System basiert.One Advantage of the present invention is the fact that the inventive addiction system not on a plasmid-based toxin antitoxin system, based on a catabolic addiction system or a LOC system.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass das erfindungsgemäße addiction-System ohne Resistenzmarker auskommt.One Another advantage of the present invention is that the inventive addiction system without resistance marker.

Noch ein weiterer Vorteil ist, dass mit der hier vorliegenden Erfindung ein eingangs erwähnter, aufgrund von RecA-Positivität verursachter Verlust des Hybridplasmids unterbunden ist.Yet Another advantage is that with the present invention an aforementioned, due to RecA positivity caused loss of the hybrid plasmid is prevented.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass das addiction-System auf Stoffwechselwegen basiert, die Isopentenyldiphosphat (Isopentenylpyrophosphat, kurz IPP), synthetisieren: IPP ist z. B. als Vorstufe von Isoprenen ein interessanter Metabolit, und mit der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich in einer gegebenen Zelle die Kohlenstoffquelle zur IPP-Synthese geändert bzw. vorgegeben werden.One Another advantage of the present invention is that the addiction system based on metabolic pathways, the isopentenyl diphosphate (isopentenyl pyrophosphate, short IPP), synthesize: IPP is z. B. as a precursor of isoprenes an interesting metabolite, and with the present invention Additionally, in a given cell, the carbon source changed or specified for IPP synthesis.

Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass es zur verstärkten Synthese von IPP und somit zur verstärkten Bildung von Terpenoiden kommen kann.Yet Another advantage of the present invention is that it provides for enhanced synthesis of IPP and thus enhanced Formation of terpenoids can occur.

Insbesondere können erfindungsgemäße Zellen hergestellt werden, die veränderte Mengen an Isoprenoiden und Terpenoiden (wie beispielsweise Steroide, Flavonoide, Gummistoffe oder Carotenoide), Monoterpenen, Sesquiterpenen, Diterpenen, Triterpenen, Polyterpenen, Cyclischen Monoterpenen, Cyclischen Sesquiterpenen, Cyclischen Diterpenen, Cyclischen Triterpenen oder auch Hormonen, Fetten, Ölen oder Vitaminen aufweisen, oder deren Gehalt an löslichen Zuckern, wie z. B. Glucose, Fructose und Saccharose, sowie an Stärke verändert ist. Derartige Zellen können wiederum vorteilhafte Ausgangsstoffe für weitere Verwendungen sein. Beispielsweise können diese Zellen zur heterologen Expression weiterer Gene mit dem Ziel der verstärkten Synthese von benötigten Substanzen dienen. So können etwa zusätzlich DNA-Sequenzen eingeführt und aufgrund des addiction-Systems stabil ohne Selektionsdruck (wie z. B. durch Antibiotikazugabe) in der erfindungsgemäßen Zelle aufrechterhalten werden, die die Enzyme zur Synthese von gewünschten Substanzen kodieren. Auf diese Weise kann das gegebenenfalls verstärkt gebildete IPP zur Synthese von z. B. Polyketiden, Aromastoffen, Kautschuk, Alkaloiden, Isoprenoiden, Polyisoprenoiden und zur verstärkten posttranlationalen Modifikation von Proteinen (prenylierte Proteine) oder Prenylierung von Olefinen etc genutzt werden.Especially it is possible to produce cells according to the invention the altered amounts of isoprenoids and terpenoids (such as steroids, flavonoids, gums or carotenoids), Monoterpenes, sesquiterpenes, diterpenes, triterpenes, polyterpenes, Cyclic monoterpenes, cyclic sesquiterpenes, cyclic diterpenes, Cyclic triterpenes or hormones, fats, oils or vitamins or their soluble content Sugars, such as As glucose, fructose and sucrose, and to starch is changed. Such cells can turn be advantageous starting materials for further uses. For example, these cells can be used for heterologous expression other genes with the goal of enhanced synthesis of serve required substances. For example, in addition DNA sequences introduced and due to the addiction system stable without selection pressure (such as by adding antibiotics) maintained in the cell of the invention which encode the enzymes for the synthesis of desired substances. In this way, the possibly reinforced formed IPP for the synthesis of z. As polyketides, flavorings, rubber, Alkaloids, isoprenoids, polyisoprenoids and reinforced posttranlational modification of proteins (prenylated proteins) or prenylation of olefins etc are used.

Wildtypwildtype

Unter einem „Wildtyp” einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp” fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind. Die erfindungsgemäßen Zellen können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln.Under a "wild-type" cell is preferred denotes a cell whose genome is in a state such as it naturally originated through evolution. The term will apply to both the entire cell as well used for individual genes. Under the term "wild type" fall therefore in particular not such cells or genes whose gene sequences at least in part by humans using recombinant techniques have been changed. The invention Cells can be prokaryotes or eukaryotes. there it can be mammalian cells (such as cells from the Humans), plant cells or micro-organisms such as yeasts, Act fungi or bacteria.

Enzymaktivität und Aktivität von Enzymen so wie deren ÄnderungEnzyme activity and activity of enzymes as well as their modification

Unter der Formulierung „geänderte Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme” sind sowohl Erhöhung als auch Erniedrigung einer Aktivität eines Enzyms, welches in der Wildtyp-Zelle beliebig nachweisbar ist, zu verstehen. Unter der Formulierung „eine gesteigerte, im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität” ist zu verstehen, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle entweder keine oder keine mit unten aufgeführten Methoden nachweisbare Enzymaktivität aufweist, und diese nicht vorhandene Enzymaktivität nach der gentechnischen Veränderung gesteigert und somit erst erzeugt und nachweisbar wird. Unter „geänderte Aktivität eines Enzyms oder gesteigerte Enzymaktivität”, wie vorstehend erwähnt und nachfolgenden im Zusammenhang mit den Enzymen E1 bis E13 verwendet, ist vorzugsweise geänderte oder gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.By the term "altered activity of the enzymes present in the wild-type" are meant both increasing and decreasing an activity of an enzyme which is arbitrarily detectable in the wild-type cell. The expression "an increased enzyme activity that is not present in the wild type" means that the wild type of the genetically modified cell either has no or no enzyme activity detectable with the methods listed below, and increases and thus does not generate this enzyme activity that is not present after the genetic modification and becomes detectable. By "altered activity of an enzyme or enhanced enzyme activity" as mentioned above and hereinafter used in connection with the enzymes E 1 to E 13 is meant preferably altered or increased intracellular activity.

Die nun folgenden Ausführungen zum „Ändern, Erhöhen, Erniedrigen und Steigern einer Aktivität eines Enzyms oder einer Enzymaktivität” gelten für alle in diesem Text genannten Enzyme und Enzymaktivitäten, deren Aktivität gegebenenfalls geändert, erhöht, erniedrigt oder gesteigert werden kann.The now following remarks on "changing, Increase, decrease and increase activity an enzyme or an enzyme activity " for all enzymes and enzyme activities referred to in this text whose Activity changed if necessary, increased, can be lowered or increased.

Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden ( Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182(19): 5624–5627 ; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182(8): 2277–2284 ; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823) bestimmt werden.The intracellular enzymatic activities can be determined by various methods described ( Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627 ; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284 ; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823) be determined.

Die Aktivität einer 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphate-Reductoisomerase (EC 1.1.1.267) wird bevorzugt bestimmt, wie in Takahashi et al. A 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Aug 18; 95(17): 9879–84 beschrieben.The activity of a 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (EC 1.1.1.267) is preferably determined as in Takahashi et al. A 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 1998 Aug 18; 95 (17): 9879-84 described.

Die Aktivität einer 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat-Cytidylyltransferase (EC 2.7.7.60) wird bevorzugt bestimmt, wie in Rohdich et al. Cytidine 5-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids: YgbP Protein of Escherichia coli catalyzes the formation of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11758–11763 beschrieben.The activity of a 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase (EC 2.7.7.60) is preferably determined as in Rohdich et al. Cytidine 5-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids: YgbP protein of Escherichia coli catalyzes the formation of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11758-11763 described.

Die Aktivität einer 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol-Kinase (EC 2.7.1.148) wird bevorzugt bestimmt, wie in Bernal et al. A spectrophotometric assay for the determination of 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase activity. Anal Biochem. 2005 May 15; 340(2): 245–51 beschrieben.The activity of a 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol kinase (EC 2.7.1.148) is preferably determined as in Bernal et al. A spectrophotometric assay for the determination of 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase activity. Anal Biochem. 2005 May 15; 340 (2): 245-51 described.

Die Aktivität einer 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat-Synthase (EC 4.6.1.12) wird bevorzugt bestimmt, wie in Herz et al. Biosynthesis of terpenoids: YgbB Protein converts 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphate to 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Mar 14; 97(6): 2486–90 beschrieben.The activity of a 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase (EC 4.6.1.12) is preferably determined as in Herz et al. Biosynthesis of terpenoids: YgbB protein converts 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphate to 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate. Proc Natl Acad Sci USA 2000 Mar 14; 97 (6): 2486-90 described.

Die Aktivität einer E5 eine 4-Hydroxy-3-Methylbut-2-en-1-yl-Diphosphat-Synthase (EC 1.17.4.3) wird bevorzugt bestimmt, wie in Hecht et al. Studies an the nonmevalonate pathway to terpenes: the role of the GcpE (IspG) Protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18; 98(26): 14837–42 beschrieben.The activity of an E 5, a 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase (EC 1.17.4.3) is preferably determined as in Hecht et al. Studies on the nonmevalonate pathway to terpenes: the role of the GcpE (IspG) protein. Proc Natl Acad Sci USA 2001 Dec 18; 98 (26): 14837-42 described.

Die Aktivität einer 4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reductase (EC 1.17.1.2) wird bevorzugt bestimmt, wie in Altincicek et al. LytB Protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-Phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 2002 Dec 18; 532(3): 437–40 beschrieben.The activity of a 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (EC 1.17.1.2) is preferably determined as in Altincicek et al. LytB protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 2002 Dec 18; 532 (3): 437-40 described.

Die Aktivität einer Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Synthase (EC 2.3.3.1.10) wird bevorzugt bestimmt, wie in Sirinupong et al. Molecular cloning of a new cDNA and expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase gene from Hevea brasiliensis. Planta. 2005 Jun; 221(4): 502–12. Epub 2005 Mar 3 beschrieben.The activity of a hydroxymethylglutaryl-coenzyme A synthase (EC 2.3.3.1.10) is preferably determined as in Sirinupong et al. Molecular cloning of a new cDNA and expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase gene from Hevea brasiliensis. Planta. 2005 Jun; 221 (4): 502-12. Epub 2005 Mar 3 described.

Die Aktivität einer Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.1.1.34) wird bevorzugt bestimmt, wie in Hedl et al. Enterococcus faecalis acetoacetyl-coenzyme A thiolase/3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a dual-function Protein of isopentenyl diphosphate biosynthesis. J Bacteriol. 2002 Apr; 184(8): 2116–22 beschrieben.The activity of a hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase (EC 1.1.1.34) is preferably determined as in Hedl et al. Enterococcus faecalis acetoacetyl-coenzymes A thiolase / 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a dual-function protein of isopentenyl diphosphate biosynthesis. J Bacteriol. 2002 Apr; 184 (8): 2116-22 described.

Die Aktivität einer Mevalonat-Kinase (EC 2.7.1.36) wird bevorzugt bestimmt, wie in Hedl et al. Enterococcus faecalis mevalonate kinase. Protein Sci. 2004 Mar; 13(3): 687–93. Epub 2004 Feb 6 beschrieben.The activity of a mevalonate kinase (EC 2.7.1.36) is preferably determined as in Hedl et al. Enterococcus faecalis mevalonate kinase. Protein sci. 2004 Mar; 13 (3): 687-93. Epub 2004 Feb 6 described.

Die Aktivität einer Phosphomevalonat-Kinase (EC 2.7.4.1) wird bevorzugt bestimmt, wie in Tzeng et al. The multiple activities of Polyphosphate kinase of Escherichia coli and their subunit structure determined by radiation target analysis. J Biol Chem. 2000 Feb 11; 275(6): 3977–83 . beschrieben.The activity of a phosphomevalonate kinase (EC 2.7.4.1) is preferably determined as in Tzeng et al. The multiple activities of polyphosphate kinase of Escherichia coli and their subunit structure determined by radiation target analysis. J Biol Chem. 2000 Feb 11; 275 (6): 3977-83 , described.

Die Aktivität einer Diphosphomevalonat-Decarboxylase (EC 4.1.1.33) wird bevorzugt bestimmt, wie in Lindberg et al. On the mechanism of formation of isopentenylpyrophosphate. Biochemistry 1 (1962), pp. 182–188 beschrieben.The activity of a diphosphomevalonate decarboxylase (EC 4.1.1.33) is preferably determined as in Lindberg et al. On the mechanism of formation of isopentenyl pyrophosphate. Biochemistry 1 (1962), pp. 182-188 described.

Die Aktivität einer Isopentenylphosphat-Kinase wird bevorzugt bestimmt, wie in Lange and Croteau Isopentenyl diphosphate biosynthesis via a mevalonate-independent pathway: Isopentenyl monophosphate kinase katalyzes the terminalenzymatic step (1999) beschrieben.The activity of an isopentenyl phosphate kinase is preferably determined as in Lange and Croteau isopentenyl diphosphate biosynthesis via a mevalonate-independent pathway: isopentenyl monophosphate kinase catalyzes the terminal enzymatic step (1999) described.

Die Aktivität einer Isopentenyldiphosphat-delta-Isomerase (EC: 5.3.3.2) wird bevorzugt bestimmt, wie in Laupitz et al. Biochemical characterization of Bacillus subtilis type II isopentenyl diphosphate isomerase, and phylogenetic distribution of isoprenoid biosynthesis pathways. European Journal of Biochemistry (2004), 271(13), 2658–2669 . beschriebenThe activity of an isopentenyl diphosphate delta isomerase (EC: 5.3.3.2) is preferably determined as in Laupitz et al. Biochemical characterization of Bacillus subtilis type II isopentenyl diphosphate isomerase, and phylogenetic distribution of isoprenoid biosynthesis pathways. European Journal of Biochemistry (2004), 271 (13), 2658-2669 , described

Da die Aktivität von Enzymen in einer Zelle mit der Menge an Enzym korreliert, kann für ein gegebenes Enzym der Expressionslevel als Maß für die Aktivität herangezogen werden. Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2- dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei z. B. Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper ( Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989 ) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung ( Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39 ; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647 ) analysiert werden.Since the activity of enzymes in a cell correlates with the amount of enzyme, the level of expression for a given enzyme can be used as a measure of activity. The expression of the above and all the enzymes mentioned below can be detected with the aid of 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration with appropriate evaluation software in the gel. If the increase in enzyme activity is based solely on an increase in the expression of the corresponding gene, the quantification of the increase in enzyme activity can be determined in a simple manner by comparing the 1- or 2-dimensional protein separations between wild-type and genetically modified cell. A common method for the preparation of the protein gels at z. B. Bacteria and to identify the proteins is that of Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) described procedure. The protein concentration can also be determined by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected ( Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989 ) and subsequent optical evaluation with appropriate software for concentration determination ( Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39 ; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647 ) to be analyzed.

Sofern in den vorangegangenen oder nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712–23 (2001) , Lohaus et al., Biospektrum 5 32–39 (1998) , Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999) und Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001) beschriebenen Methoden.Unless specific methods for determining the activity of a particular enzyme are given in the preceding or following statements, the determination of the increase in the enzyme activity and also the determination of the reduction of an enzyme activity is preferably carried out by means of the in Hermann et al., Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001) . Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998) . Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) and Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) described methods.

Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch die erfindungsgemäß besonders bevorzugte Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt. Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.Basically, an increase in enzymatic activity can be achieved by increasing the copy number of the gene sequence (s) encoding the enzyme, using a strong promoter, or using a gene or allele encoding a corresponding enzyme with enhanced activity and, where appropriate, combining these measures. Genetically engineered cells according to the invention are produced for example by transformation, transduction, conjugation or a combination of these methods with a vector which contains the desired gene, an allele of this gene or parts thereof and a vector which enables expression of the gene. The heterologous expression is achieved in particular by the particularly preferred integration according to the invention of the gene or of the alleles into the chromosome of the cell or an extrachromosomally replicating vector. An overview of the possibilities for increasing the enzyme activity in cells using the example of pyruvate carboxylase gives DE-A-100 31 999 , which is hereby incorporated by reference, and the disclosure of which relates to the potential for increasing enzyme activity in cells forms part of the disclosure of the present invention.

Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte ”Enhancer” zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert, wobei eine Integration im Genom besonders bevorzugt ist.Becomes the increase of enzyme activity by increase the expression of an enzyme accomplished, it increases for example, the copy number of the corresponding genes or mutated the promoter and regulatory region or ribosome binding site, which is located upstream of the structural gene. In the same way act expression cassettes upstream of the structural gene to be built in. It is additionally by inducible promoters possible to use the expression at any time increase. Furthermore, the enzyme gene can be used as regulatory Sequences but also be associated with so-called "enhancers", the over an improved interaction between RNA polymerase and DNA also cause increased gene expression. By measures to extend the life the m-RNA is also improved expression. Continue by preventing degradation of the enzyme protein also enzyme activity strengthened. The genes or gene constructs are either in plasmids with different copy numbers or are in the chromosome integrated and amplified, with an integration in the genome especially is preferred.

Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)) , bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)) , Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)) , bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)) , in EP-A-0 472 869 , im US 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991) , bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) , bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)) , in WO-A-96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993) , in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich beispielsweise solche, die in Bakterien repliziert werden können. Bevorzugt werden solche Plasmide eingesetzt, die eine Shuttle-Funktion aufweisen, d. h. potenziell in mehreren Organismen repliziert werden können.Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by changing the composition of the medium and culture. Instructions for this, the expert finds among others Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)) , at Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)) . Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)) . in Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)) , in EP-A-0 472 869 , in the US 4,601,893 , at Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991) , at Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) , at LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) , in WO-A-96/15246 , at Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993) , in JP-A-10-229891 , at Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) and in known textbooks of genetics and molecular biology. To increase the expression of the respective genes, episomal plasmids are used, for example. Suitable plasmids are, for example, those which can be replicated in bacteria. Preferably, those plasmids are used which have a shuttle function, ie can potentially be replicated in several organisms.

Wird die Änderung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien (wie z. B salpetrige Säure, MNNG/N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin, Natriumnitrit), oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Hierdurch können beispielsweise auch Enzymaktivitäten generiert werden, die im Vergleich zur Wildtyp-Enzymaktivität vermindert oder vermehrt feedbackinhibierbar sind.Becomes the change of enzyme activity by mutation of the endogenous gene, such Mutations generated either undirected by classical methods be such as by UV irradiation or by mutagenic Chemicals (such as nitrous acid, MNNG / N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, Sodium nitrite), or specifically by genetic engineering methods such as deletion (s), insertion (s) and / or nucleotide exchange (s). These mutations will make genetically engineered cells receive. As a result, for example, enzyme activities generated compared to the wild-type enzyme activity diminished or increasingly feedbackinhibierbar.

Zur Erniedrigung einer Enzymaktivität in einer Zelle sind dem Fachmann verschieden Techniken, wie beispielsweise gerichteter Knockout, Gendeletionen, Zufallsmutagenese oder Verwendung von spezifischen Inhibitoren geläufig. Es können auch induzierbare bzw. konditionale Knockout-Systeme generiert werden, wie z. B. in McAteer et al. (J Bacteriol. 2001 Dec; 183(24): 7403–7 ) beschrieben. Ein ebenfalls einsetzbares und mittlerweile verbreitetes Mittel zur Herabregulierung von Genen ist der Einsatz von antisense-Nukleinsäuren wie beispielsweise siRNAs (small interfering RNAs). Weitere Beispiele für antisense-Nukleinsäuren verwendende Systeme kann der Fachmann z. B. bei Zaratiequi et al. (Cell. 2007 Feb 23; 128(4): 763–76) , Scherr et al. (Cell Cycle. 2007 Feb 1; 6(4): 444–9) und Sahu et al. (Curr Pharm Biotechnol. 2007 Oct; 8(5): 291–304) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie nachschlagen.Techniques such as directed knockout, gene deletions, random mutagenesis, or use of specific inhibitors are well known to those skilled in the art for lowering enzyme activity in a cell. Inducible or conditional knockout systems can also be generated, such. In McAteer et al. (J Bacteriol 2001 Dec; 183 (24): 7403-7 ). A likewise usable and now widespread means for gene downregulation is the use of antisense nucleic acids such as, for example, siRNAs (small interfering RNAs). Further examples of systems using antisense nucleic acids can be obtained by the person skilled in the art. B. at Zaratiequi et al. (Cell, 2007 Feb 23; 128 (4): 763-76) . Scherr et al. (Cell Cycle, 2007 Feb 1; 6 (4): 444-9) and Sahu et al. (Curr Pharm Biotechnol., 2007 Oct; 8 (5): 291-304) and look up in well-known textbooks on genetics and molecular biology.

„Durch Änderung mindestens einer Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat”"By change at least an activity of the enzymes present in the wild type reduced amount of isopentenyl diphosphate compared to its wild type "

Gemäß oben beschriebener Ausführungsform bildet erfindungsgemäße Zelle in dem Fall, dass keine im Wildtyp nicht vorhandenen Enzymaktivität erhöht wurde, durch Änderung mindestens einer Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat. Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, höchstens die Hälfte, besonders bevorzugt höchstens ein Zehntel, darüber hinaus bevorzugt höchstens ein hundertstel, darüber hinaus noch mehr bevorzugt höchstens ein Tausendstel und am meisten bevorzugt höchstens gar kein nachweisbares IPP verglichen zu dem Wildtyp der Zelle bildet, in dem Fall, dass keine im Wildtyp nicht vorhandenen Enzymaktivität erhöht wurde. Die Abnahme der Bildung des IPPs kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle, bei der keine im Wildtyp nicht vorhandenen Enzymaktivität erhöht wurde, und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an IPP bestimmt wird.As per above described embodiment forms inventive Cell in the case that no enzyme activity not present in the wild type was increased by changing at least one Activity of the enzymes present in the wild type one in comparison reduced amount of isopentenyl diphosphate to its wild type. there it is inventively preferred that the genetic engineering changed cell so genetically modified is that they are in a defined time interval, preferably within of 2 hours, more preferably within 8 hours and on most preferably within 24 hours, at most the Half, more preferably at most one-tenth, moreover, preferably a maximum of one hundredth, moreover, more preferably at most one Thousandth, and most preferably no at all detectable IPP compared to the wild-type cell forms, in in the case that no enzyme activity not present in the wild type was increased. The decrease of the formation of the IPP can thereby For example, be determined by the inventive Cell with no enzyme activity not present in the wild type was increased, and the wild-type cell separated under each same conditions (same cell density, same nutrient medium, same culture conditions) for a certain time interval are cultured in a suitable nutrient medium and then the amount of IPP is determined.

„Erhöhung der reduzierten Menge an Isopentenyldiphosphat durch Steigerung mindestens einer im Wildtyp nicht vorhandenen Enzymaktivität”"Increase the reduced Amount of isopentenyl diphosphate by increasing at least one no enzyme activity present in the wild type "

Des Weiteren erhöht gemäß oben beschriebener Ausführungsform erfindungsgemäße Zelle durch Änderung mindestens einer Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat durch Steigerung mindestens einer im Wildtyp nicht vorhandenen Enzymaktivität. Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens ein Tausendstel, besonders bevorzugt mindestens ein Hundertstel, darüber hinaus bevorzugt mindestens ein Zehntel, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens genauso viel und am meisten bevorzugt mindestens 10 mal mehr IPP bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Bildung des IPPs kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an IPP bestimmt wird.Of Further increased according to the above Embodiment of the invention cell by changing at least one activity of the enzymes present in the wild type compared to their wild type reduced amount of isopentenyl diphosphate by increasing at least a non-wild-type enzyme activity. there it is inventively preferred that the genetic engineering changed cell so genetically modified is that they are in a defined time interval, preferably within of 2 hours, more preferably within 8 hours and on most preferably within 24 hours, at least one-thousandth, more preferably at least a hundredth, above In addition, at least one-tenth, moreover, is preferred even more preferably at least as much and most preferred at least 10 times more IPP than the wild-type cell. The Increase in the formation of the IPP can thereby be determined, for example be that the cell of the invention and the Wild-type cell separately under the same conditions (same Cell density, same nutrient medium, same culture conditions) for a given time interval in a suitable nutrient medium cultivated and then the amount of IPP is determined.

Ersetzen der IPP Synthese durch MEP gegen IPP Synthese durch MVAReplacement of IPP synthesis by MEP against IPP synthesis by MVA

Gemäß einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist diese dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E1, welches die Umsetzung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat katalysiert,
ein Enzym E2, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und Cytidintriphosphat zu 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert,
ein Enzym E3, welches die Umsetzung von 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol und ATP zu 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert,
ein Enzym E4, welches die Umsetzung von 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat katalysiert,
ein Enzym E5, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat zu (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat katalysiert und
ein Enzym E6, welches die Umsetzung von (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat zu IPP und/oder DMAPP katalysiert
und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier und am meisten bevorzugt mindestens fünf Enzyme ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E7, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A katalysiert,
ein Enzym E8, welches die Umsetzung von 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A zu Mevalonat katalysiert,
ein Enzym E9, welches die Umsetzung von Mevalonat zu Mevalonat-5-Phosphat katalysiert,
ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und
ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert.
According to a first embodiment of the cell according to the invention, this is characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising:
An enzyme E 1 which catalyzes the conversion of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate to 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,
an enzyme E 2 which catalyzes the conversion of 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate and cytidine triphosphate to 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol,
an enzyme E 3 , which is the reaction of 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol and ATP to 2-phospho-4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C Catalyzes methyl D-erythritol,
an enzyme E 4 which catalyzes the conversion of 2-phospho-4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol to 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate .
an enzyme E 5 , which catalyzes the conversion of 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate to (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate, and
an enzyme E 6 which catalyzes the conversion of (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate to IPP and / or DMAPP
and the enzyme activity not present in the wild-type is caused by at least one, preferably at least two, more preferably at least three, more preferably at least four and most preferably at least five enzymes selected from the group comprising:
An enzyme E 7 , which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A,
an enzyme E 8 , which catalyzes the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A to mevalonate,
an enzyme E 9 , which catalyzes the conversion of mevalonate to mevalonate-5-phosphate,
an enzyme E 10 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and
an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate.

Im Rahmen der gesamten Erfindung ist bevorzugt, dass für mindestens eines der Enzyme E1 bis E11 zutrifft, besonders bevorzugt, dass für jedes Enzym E1 bis E11 zutrifft, dass
E1 eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphate-Reductoisomerase (EC 1.1.1.267),
E2 eine 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat-Cytidylyltransferase (EC 2.7.7.60),
E3 eine 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol-Kinase (EC 2.7.1.148),
E4 eine 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat-Synthase (EC 4.6.1.12),
E5 eine 4-Hydroxy-3-Methylbut-2-en-1-yl-Diphosphat-Synthase (EC 1.17.4.3),
E6 eine 4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reductase (EC 1.17.1.2),
E7 eine Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Synthase (EC 2.3.3.1.10),
E8 eine Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.1.1.34),
E9 eine Mevalonat-Kinase (EC 2.7.1.36),
E10 eine Phosphomevalonat-Kinase (EC 2.7.4.1),
E11 eine Diphosphomevalonat-Decarboxylase (EC 4.1.1.33),
Within the scope of the overall invention it is preferred that at least one of the enzymes E 1 to E 11 is true, particularly preferred that for each enzyme E 1 to E 11 is true that
E 1 is a 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (EC 1.1.1.267),
E 2 is a 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase (EC 2.7.7.60),
E 3 is a 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol kinase (EC 2.7.1.148),
E 4 is a 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase (EC 4.6.1.12),
E 5 is a 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase (EC 1.17.4.3),
E 6 is a 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (EC 1.17.1.2),
E 7 is a hydroxymethylglutaryl-coenzyme A synthase (EC 2.3.3.1.10),
E 8 is a hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase (EC 1.1.1.34),
E 9 a mevalonate kinase (EC 2.7.1.36),
E 10 is a phosphomevalonate kinase (EC 2.7.4.1),
E 11 is a diphosphomevalonate decarboxylase (EC 4.1.1.33),

In dieser ersten Ausführungsform erfindungsgemäßer Zelle ist ganz besonders bevorzugt mindestens eines, bevorzugt mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens fünf und am meisten bevorzugt mindestens sechs der Enzyme:
E6 Genprodukt des ispH,
E7 Genprodukt des mvaS aus Staphylococcus aureus,
E8 Genprodukt des mvaA aus Lactobacillus lactis oder aus Staphylococcus aureus,
E9 Genprodukt des mvaK1 aus Staphylococcus aureus,
E10 Genprodukt des mvaK2 aus Staphylococcus aureus und
E11 Genprodukt des mvaD aus Staphylococcus aureus.
In this first embodiment of the cell according to the invention, most preferably at least one, preferably at least two, more preferably at least three, more preferably at least four, further more preferably at least five and most preferably at least six of the enzymes:
E 6 gene product of ispH,
E 7 gene product of mvaS from Staphylococcus aureus,
E 8 gene product of mvaA from Lactobacillus lactis or from Staphylococcus aureus,
E 9 gene product of mvaK1 from Staphylococcus aureus,
E 10 gene product of mvaK2 from Staphylococcus aureus and
E 11 gene product of mvaD from Staphylococcus aureus.

In dieser Ausführungsform erfindungsgemäßer Zelle ist am meisten bevorzugt:
E6 Genprodukt des ispH
E7 Genprodukt des mvaS aus Staphylococcus aureus,
E8 Genprodukt des mvaA aus Lactobacillus lactis und aus Staphylococcus aureus,
E9 Genprodukt des mvaK1 aus Staphylococcus aureus,
E10 Genprodukt des mvaK2 aus Staphylococcus aureus und
E11 Genprodukt des mvaD aus Staphylococcus aureus.
In this embodiment of the cell according to the invention, the most preferred is:
E 6 gene product of ispH
E 7 gene product of mvaS from Staphylococcus aureus,
E 8 gene product of mvaA from Lactobacillus lactis and from Staphylococcus aureus,
E 9 gene product of mvaK1 from Staphylococcus aureus,
E 10 gene product of mvaK2 from Staphylococcus aureus and
E 11 gene product of mvaD from Staphylococcus aureus.

Weiterhin ist es im Zusammenhang mit dem vorstehend beschriebenen Ausführungsform der gentechnisch veränderten Zelle bevorzugt, dass es sich bei der Zelle um einen nur über den MEP-Weg zur IPP-Synthese befähigten Mikroorganismus, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Eubakterien,
Plastiden von Apicomplexa
und Plastiden höherer Pflanzen
handelt.
Furthermore, it is in the context of the embodiment described above, the gentech It is preferred that the cell is a microorganism which is capable of IPP synthesis only via the MEP route, preferably selected from the group comprising:
eubacteria
Plastids of Apicomplexa
and plastids of higher plants
is.

Unter den Eubakterien sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Lactobacillus, Lactococcus, Escherichia, Staphylococcus, Ralstonia, Bacillus, Corynebacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Streptococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Alcanivorax, Agrobacterium, Bifidobacterium, Borellia, Burkholderia, Clostridium, Enterococcus, Fusobacterium, Gluconobacter, Gordonia, Helicobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Porphyromonas, Propionibacterium, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Zymomonas, Vibrio, Myxococcus, Chromobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Paracoccus, Thiobacillus, Desulfovibrio, Streptomyces, Acinetobacter, Comamonas, Escherichia coli, Lactococcuss lactis, Lactobacillus brevis, S aureus Ralstonia eutropha, Ralstonia solanacearum, Ralstonia metallidurans, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, Bacillus licheniformes, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluoreszens, Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Peptostreptococcus sp., Leuconostoc mesenteroides (subsp. dextranicum), Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, Alcanivorax borkumensis, Agrobacterium tumefaciens, Bifidobacterium longum, Borellia burgdorferi, Burkholderia pseudomallei, Clostridium acetobutylicum, Clostridium propionicum, Clostridium pasteurianum, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Gluconobacter oxydans, Gordonia westfalica, Gordonia polyisoprenivorans, Helicobacter pylori, Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tubercolosis, Nocardia farcinica, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium freudenreichii, Rhizobium leguminosarum, Rhodococcus opacus, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Zymomonas mobilis, Vibrio fisheri, Vibrio cholerae, Myxococcus sp., Chromobacterium violaceum, Nitrosomonas europaea, Nitrobacter winogradskyi, Paracoccus denitrificans Thiobacillus ferrooxidans, Desulfovibrio desulfuricans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albulus, Acinetobacter borkumensis und Comamonas testosteroni.
Among the eubacteria, in particular those cells are selected which are selected from the group comprising:
Lactobacillus, Lactococcus, Escherichia, Staphylococcus, Ralstonia, Bacillus, Corynebacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Streptococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Alcanivorax, Agrobacterium, Bifidobacterium, Borellia, Burkholderia, Clostridium, Enterococcus, Fusobacterium, Gluconobacter, Gordonia, Helicobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Porphyromonas, Propionibacterium, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Zymomonas, Vibrio, Myxococcus, Chromobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Paracoccus, Thiobacillus, Desulfovibrio, Streptomyces, Acinetobacter, Comamonas, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, S aureus Ralstonia eutropha, Ralstonia solanacearum, Ralstonia metallidurans, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, Bacillus licheniformes, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Streptoc occus salivarius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Peptostreptococcus sp., Leuconostoc mesenteroides (subsp. dextranicum), Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, Alcanivorax borkumensis, Agrobacterium tumefaciens, Bifidobacterium longum, Borrelia burgdorferi, Burkholderia, pseudomallei Clostridium acetobutylicum, propionicum Clostridium Clostridium pasteurianum, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Gluconobacter oxydans, Gordonia westfalica, Gordonia polyisoprenivorans, Helicobacter pylori , Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia farcinica, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium freudenreichii, Rhizobium leguminosarum, Rhodococcus opacus, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Zymomonas mobilis, Vibrio fisheri, Vibrio cholerae, Myxococcus sp., Chromobacterium violaceum, Nitrosomonas europaea, Nitrobacter winogradskyi, Paracoccus denitrificans Thiobacillus ferrooxidans, Desulfovibrio desulfuricans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albulus, Acinetobacter borkumensis and Com amonas testosteroni.

Ebenso bevorzugte Vertreter von Eubakterien sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend alle einen obligat oder fakultativ phototrophen Stoffwechsel besitzenden Proteobakterien, besonders bevorzugt sind hier Rhodospirillum, Rhodobacter, Allochromatium, Chromatium, Synechococcus, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Allochromatium vinosum, Chromatium okenii, Synechococcus sp..As well preferred representatives of eubacteria are selected from the group comprising all one obligate or facultative phototrophic Metabolism possessing proteobacteria are particularly preferred here Rhodospirillum, Rhodobacter, Allochromatium, Chromatium, Synechococcus, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Allochromatium vinosum, Chromatium okenii, Synechococcus sp.

Unter den Apicomplexa sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Plasmodium,
Paramecium,
Tetrahymena,
Chlamydomonas reinhardtii
Theileria annulata,
Theileria parva
Among the Apicomplexa, in particular those cells are selected which are selected from the group comprising:
Plasmodium,
paramecium,
Tetrahymena,
Chlamydomonas reinhardtii
Theileria annulata,
Theileria parva

Ersetzen der IPP Synthese durch MVA gegen IPP Synthese durch MEPReplacement of IPP synthesis by MVA against IPP synthesis by MEP

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist diese dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E7, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A katalysiert,
ein Enzym E8, welches die Umsetzung von 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A zu Mevalonat katalysiert,
ein Enzym E9, welches die Umsetzung von Mevalonat zu Mevalonat-5-Phosphat katalysiert,
ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und
ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert
und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens fünf und am meisten bevorzugt mindestens sechs Enzyme ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E1, welches die Umsetzung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat katalysiert,
ein Enzym E2, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und Cytidintriphosphat zu 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert,
ein Enzym E3, welches die Umsetzung von 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol und ATP zu 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert,
ein Enzym E4, welches die Umsetzung von 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat katalysiert,
ein Enzym E5, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat zu (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat katalysiert und
ein Enzym E6, welches die Umsetzung von (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat zu IPP und/oder DMAPP katalysiert.
According to a second embodiment of the cell according to the invention, this is characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising:
An enzyme E 7 , which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A,
an enzyme E 8 , which catalyzes the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A to mevalonate,
an enzyme E 9 , which catalyzes the conversion of mevalonate to mevalonate-5-phosphate,
an enzyme E 10 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and
an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate
and the enzyme activity not present in the wild type is caused by at least one, preferably at least two, more preferably at least three, more preferably at least four, further more preferably at least five and most preferably at least six enzymes selected from the group comprising:
An enzyme E 1 , which is the reaction of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate to 2-C-methyl-D-erythri tol-4-phosphate catalyzes,
an enzyme E 2 which catalyzes the conversion of 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate and cytidine triphosphate to 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol,
an enzyme E 3 , which is the reaction of 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol and ATP to 2-phospho-4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C Catalyzes methyl D-erythritol,
an enzyme E 4 which catalyzes the conversion of 2-phospho-4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol to 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate .
an enzyme E 5 , which catalyzes the conversion of 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate to (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate, and
an enzyme E 6 which catalyzes the conversion of (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate to IPP and / or DMAPP.

In dieser zweiten Ausführungsform erfindungsgemäßer Zelle ist ganz besonders bevorzugt mindestens eines, bevorzugt mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens fünf, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens sechs und am meisten bevorzugt mindestens sieben der Enzyme:
E10 Genprodukt des mvaK1,
E1 Genprodukt des ispC,
E2 Genprodukt des ispD,
E3 Genprodukt des ispE,
E4 Genprodukt des ispF,
E5 Genprodukt des ispG und
E6 Genprodukt des ispH.
In this second embodiment of the cell according to the invention, most preferably at least one, preferably at least two, more preferably at least three, more preferably at least four, more preferably at least five, further more preferably at least six and most preferably at least seven of the enzymes :
E 10 gene product of mvaK1,
E 1 gene product of ispC,
E 2 gene product of ispD,
E 3 gene product of ispE,
E 4 gene product of ispF,
E 5 gene product of ispG and
E 6 gene product of ispH.

In dieser Ausführungsform erfindungsgemäßer Zelle ist am meisten bevorzugt:
E10 Genprodukt des mvaK1,
E1 Genprodukt des ispC,
E2 Genprodukt des ispD,
E3 Genprodukt des ispE,
E4 Genprodukt des ispF,
E5 Genprodukt des ispG und
E6 Genprodukt des ispH.
In this embodiment of the cell according to the invention, the most preferred is:
E 10 gene product of mvaK1,
E 1 gene product of ispC,
E 2 gene product of ispD,
E 3 gene product of ispE,
E 4 gene product of ispF,
E 5 gene product of ispG and
E 6 gene product of ispH.

Weiterhin ist es im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen zweiten Ausführungsform der gentechnisch veränderten Zelle bevorzugt, dass es sich bei der Zelle um einen nur über den MVA-Weg zur IPP-Synthese befähigten Mikroorganismus, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Hefen,
Pilze,
handelt.
Furthermore, in connection with the above-described second embodiment of the genetically modified cell, it is preferred that the cell is a microorganism which is capable of IPP synthesis only via the MVA route, preferably selected from the group comprising:
yeasts,
mushrooms,
is.

Unter den Pilzen sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Absidia
Agaricus
Ajellomyces
Arthroderma
Acremonium
Aspergillus
Disporotrichum
Geosmithia
Mortierella
Paecilomyces
Penicillium
Rhizopus
Trichoderma
Talaromyces
Thielavia.
Among the fungi, in particular those cells are preferred, selected from the group comprising:
Absidia
Agaricus
Ajellomyces
Arthroderma
Acremonium
Aspergillus
Disporotrichum
Geosmithia
Mortierella
paecilomyces
Penicillium
Rhizopus
Trichoderma
Talaromyces
Thielavia.

Unter den Hefen sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Candida
Pichia
Saccharomyces
Arxula
Klyveromyces
Yarrowia
Hansenula
Brettanomyces
Among the yeasts, in particular those cells are preferred, selected from the group comprising:
Candida
Pichia
Saccharomyces
Arxula
Kluyveromyces
Yarrowia
Hansenula
Brettanomyces

Ersetzen der IPP Synthese durch „MVA alternativ” gegen IPP Synthese durch „MVA”Replacement of IPP synthesis by "MVA alternatively "against IPP synthesis by" MVA "

Gemäß einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist diese dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E12, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Isopentenylmonophosphat katalysiert und
ein Enzym E13, welches die Umsetzung von Isopentenylmonophosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert,
und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und
ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert.
According to a third embodiment of the cell according to the invention, this is characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising:
An enzyme E 12 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to isopentenyl monophosphate and
an enzyme E 13 which catalyzes the conversion of isopentenyl monophosphate to isopentenyl diphosphate,
and the enzyme activity not present in the wild type is caused by at least one enzyme selected from the group comprising:
An enzyme E 10 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and
an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate.

Dabei ist es bevorzugt, dass für mindestens eines der Enzyme E12 oder E13 zutrifft, besonders bevorzugt, dass für jedes Enzym E12 und E13 zutrifft, dass
E12 eine Monophosphomevalonat-Decarboxylase,
E13 eine Isopentenylphosphat-Kinase
ist.
It is preferred that for at least one of the enzymes E 12 or E 13 is true, particularly preferred that for each enzyme E 12 and E 13 is true that
E 12 is a monophosphomevalonate decarboxylase,
E 13 is an isopentenyl phosphate kinase
is.

In dieser dritten Ausführungsform erfindungsgemäßer Zelle ist ganz besonders bevorzugt mindestens eines, bevorzugt beide der Enzyme:
E10 Genprodukt des mvaK2 aus Staphylococcus aureus und
E11 Genprodukt des mvaD aus Staphylococcus aureus.
In this third embodiment of the cell according to the invention, very particularly preferably at least one, preferably both, of the enzymes are:
E 10 gene product of mvaK2 from Staphylococcus aureus and
E 11 gene product of mvaD from Staphylococcus aureus.

Weiterhin ist es im Zusammenhang mit dieser dritten Ausführungsform der gentechnisch veränderten Zelle bevorzugt, dass es sich bei der Zelle um einen Mikroorganismus handelt, ausgewählt aus der Gruppe der Archaeen.Farther it is in the context of this third embodiment the genetically modified cell prefers that in the cell is a microorganism selected from the group of Archaea.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Archaeon um einen ausgewählt aus der Gruppe umfassernd:
Methanocaldococcus janaschii
Methanothermobacter thermoautotrophicum
Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus
Mathanosarcina mazei
Sulfolobus solfataricus
Aeropyrum pernix
Preferably, the archaeon is one selected from the group comprising:
Methanocaldococcus janaschii
Methanothermobacter thermoautotrophicum
Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus
Mathanosarcina mazei
Sulfolobus solfataricus
Aeropyrum pernix

Ersetzen der IPP Synthese durch „MVA” gegen IPP Synthese durch „MVA alternativ”Replacement of IPP synthesis by "MVA" vs. IPP synthesis by "MVA alternative"

Gemäß einer vierten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist diese dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und
ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert,
und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Ein Enzym E12, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Isopentenylmonophosphat katalysiert und
ein Enzym E13, welches die Umsetzung von Isopentenylmonophosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert.
According to a fourth embodiment of the cell according to the invention, this is characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising:
An enzyme E 10 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and
an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate 5-diphosphate to isopentenyl diphosphate,
and the enzyme activity not present in the wild type is caused by at least one enzyme selected from the group comprising:
An enzyme E 12 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to isopentenyl monophosphate and
an enzyme E 13 which catalyzes the conversion of isopentenyl monophosphate to isopentenyl diphosphate.

Dabei ist es bevorzugt, dass für mindestens eines der Enzyme E12 oder E13 zutrifft, besonders bevorzugt, dass für jedes Enzym E12 und E13 zutrifft, dass
E12 eine Monophosphomevalonat-Decarboxylase,
E13 eine Isopentenylphosphat-Kinase
ist.
It is preferred that for at least one of the enzymes E 12 or E 13 is true, particularly preferred that for each enzyme E 12 and E 13 is true that
E 12 is a monophosphomevalonate decarboxylase,
E 13 is an isopentenyl phosphate kinase
is.

In dieser vierten Ausführungsform erfindungsgemäßer Zelle ist besonders bevorzugt mindestens eines, bevorzugt beide der Enzyme:
E12 eine Monophosphomevalonat-Decarboxylase, die sich aus Methanocaldococcus janaschii isolieren läßt,
E13 Genprodukt ausgewählt aus der Gruppe:
MJ0044 aus Methanocaldococcus janaschii,
MTH47 aus Methanothermobacter thermoautotrophicum,
AF2288 aus Archaeoglobus fulgidus,
PF1636 aus Pyrococcus furiosus,
MM1763 aus Mathanosarcina mazei,
SSO0064 aus Sulfolobus solfataricus und
APE1768 aus Aeropyrum pernix,
wobei MJ0044 aus Methanocaldococcus janaschii ganz besonders bevorzugt ist
In this fourth embodiment of the cell according to the invention, at least one, preferably both, of the enzymes is particularly preferred:
E 12 is a monophosphome valonate decarboxylase which can be isolated from Methanocaldococcus janaschii,
E 13 gene product selected from the group:
MJ0044 from Methanocaldococcus janaschii,
MTH47 from Methanothermobacter thermoautotrophicum,
AF2288 from Archaeoglobus fulgidus,
PF1636 from Pyrococcus furiosus,
MM1763 from Mathanosarcina mazei,
SSO0064 from Sulfolobus solfataricus and
APE1768 from Aeropyrum pernix,
MJ0044 from Methanocaldococcus janaschii being most preferred

Weiterhin ist es im Zusammenhang mit dieser vierten Ausführungsform der gentechnisch veränderten Zelle bevorzugt, dass es sich bei der Zelle um einen Mikroorganismus handelt wie für die oben genannte, zweite Ausführungsform der gentechnisch veränderten Zelle beschrieben, einschließlich der dargelegten BevorzugungenFarther it is in the context of this fourth embodiment the genetically modified cell prefers that in the cell is a microorganism as for the above-mentioned, second embodiment of the genetic engineering described altered cell, including the stated preferences

Für alle vier oben genannten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Zelle kann es des Weiteren von Vorteil sein, wenn die Zelle mindestens eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp geänderte, bevorzugt eine erhöhte Aktivität eines Enzymes E14, welches die Umsetzung von Isopentenyldiphosphat zu Dimethylallyldiphosphat katalysiert, aufweist.For all four above-mentioned embodiments of the cell according to the invention, it may furthermore be advantageous if the cell has at least one altered, preferably increased, activity of an enzyme E 14 which catalyzes the conversion of isopentenyl diphosphate to dimethylallyl diphosphate compared to its wild-type.

Es ist bevorzugt, dass E14 Isopentenyldiphosphat-delta-Isomerase (EC: 5.3.3.2) ist.It is preferred that E 14 is isopentenyl diphosphate delta isomerase (EC: 5.3.3.2).

Besonders bevorzugt ist E14, Genprodukt eines Isopentenyldiphosphat-delta-Isomerase-Genes, welches sich isolieren lässt aus einer Zelle ausgeählt aus der Gruppe umfassend:
Adonis aestivalis var. palaestina
Adonis aestivalis var. palaestina
Adonis aestivalis var. palaestina
Adonis aestivalis var. palaestina
Aeropyrum pernix
Agrobacterium rhizogenes
Agromyces mediolanus
Anabaena sp. (strain PCC 7120)
Anabaena variabilis (strain ATCC 29413/PCC 7937)
Anabaena variabilis (strain ATCC 29413/PCC 7937)
Anaeromyxobacter sp. (strain Fw109-5)
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Archaeoglobus fulgidus
Arthrobacter aurescens (strain TC1)
Aspergillus fumigatus
Aspergillus niger
Azoarcus sp. (strain EbN1)
Azoarcus sp. (strain EbN1)
Azotobacter vinelandii AvOP
Bacillus amyloliquefaciens FZB42
Bacillus anthracis
Bacillus cereus (strain ATCC 10987)
Bacillus cereus (strain ATCC 14579/DSM 31)
Bacillus cereus (strain ZK/E33L)
Bacillus cereus G9241
Bacillus cereus subsp. cytotoxis NVH 391-98
Bacillus coagulans 36D1
Bacillus licheniformis (strain DSM 13/ATCC 14580)
Bacillus sp. NRRL B-14911
Bacillus sp. SG-1
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis serovar israelensis ATCC 35646
Bacillus thuringiensis subsp. konkukian
Bdellovibrio bacteriovorus
Bombyx mori
Borrelia burgdorferi
Borrelia garinii
Bos taurus
Brassica oleracea var. botrytis
Brevibacterium linens
Burkholderia multivorans ATCC 17616
Caldivirga maquilingensis IC-167
Caldivirga maquilingensis IC-167
Camptotheca acuminata
Camptotheca acuminata
Camptotheca acuminata
Candidatus Nitrosopumilus maritimus SCM1
Capsicum annuum
Catharanthus roseus
Cenarchaeum symbiosum
Chlamydomonas reinhardtii
Chlorobium chlorochromatii (strain CaD3)
Chlorobium ferrooxidans DSM 13031
Chlorobium limicola DSM 245
Chlorobium phaeobacteroides (strain DSM 266)
Chlorobium phaeobacteroides BS1
Chlorobium tepidum
Chloroflexus aggregans DSM 9485
Cinchona robusta
Citrobacter freundii
Citrus sp.
Clarkia breweri
Clarkia breweri
Clarkia xantiana
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (strain NCPPB 382)
Claviceps purpurea
Claviceps sp.
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052
Corynebacterium diphtheriae
Corynebacterium efficiens
Corynebacterium glutamicum
Crocosphaera watsonii
Cucurbita sp.
Cyanothece sp. CCY 0110
Cytophaga hutchinsonii (strain ATCC 33406/NCIMB 9469)
Deinococcus geothermalis (strain DSM 11300)
Deinococcus radiodurans
Desulfotomaculum reducens MI-1
Dichelobacter nodosus (strain VCS1703A)
Dinoroseobacter shibae DFL 12
Enterobacter sp. 638
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium DO
Erwinia carotovora subsp. atroseptica
Escherichia coli
Escherichia coli (strain K12)
Escherichia coli (strain UTI89/UPEC)
Escherichia coli B
Escherichia coli E24377A
Escherichia coli HS
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O6
Escherichia coli O6:K15:H31 (strain 536/UPEC)
Escherichia vulneris
Flavobacteria bacterium BBFL7
Flavobacterium johnsoniae UW101
Flavobacterium psychrophilum (strain JIP02/86/ATCC 49511)
Frankia alni (strain ACN14a)
Frankia sp. (strain CcI3)
Frankia sp. EAN1pec
Gallus gallus
gamma proteobacterium HTCC2207
Gramella forsetii (strain KT0803)
Guillardia theta
Haematococcus pluvialis
Haematococcus pluvialis
Haematococcus pluvialis
Haloarcula marismortui
Halobacterium salinarium
Halobacterium salinarium
Haloquadratum walsbyi (strain DSM 16790)
Haloquadratum walsbyi (strain DSM 16790)
Halorhodospira halophila (strain DSM 244/SL1)
Halorubrum lacusprofundi ATCC 49239
Halorubrum lacusprofundi ATCC 49239
Herpetosiphon aurantiacus ATCC 23779
Hevea brasiliensis
Homo sapiens
Homo sapiens
Homo sapiens
Hyperthermus butylicus (strain DSM 5456/JCM 9403)
Hyphomicrobium zavarzinii
Ignicoccus hospitalis KIN4/I
Janibacter sp. HTCC2649
Kineococcus radiotolerans SRS30216
Kitasatospora griseola
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (strain ATCC 11842/DSM 20081)
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus reuteri 100-23
Lactobacillus reuteri F275
Lactobacillus sakei subsp. sakei (strain 23K)
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (strain UCC118)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (strain MG1363)
Lactococcus lactis subsp. lactis
Lactuca sativa
Lactuca sativa
Legionella pneumophila subsp. pneumophila (strain
Philadelphia 1/ATCC 33152/DSM 7513)
Leifsonia xyli subsp. xyli
Leishmania braziliensis
Leishmania infantum
Leishmania major strain Friedlin
Listeria innocua
Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes serotype 4b (strain F2365)
Listeria monocytogenes str. 1/2a F6854
Listeria monocytogenes str. 4b H7858
Listeria welshimeri serovar 6b (strain ATCC 35897/DSM 20650/SLCC5334)
Lycopersicon esculentum
Lyngbya sp. PCC 8106
Macaca fascicularis
marine actinobacterium PHSC20C1
Mesocricetus auratus
Mesocricetus auratus
Metallosphaera sedula DSM 5348
Methanobacterium thermoautotrophicum
Methanobrevibacter smithii (strain PS/ATCC 35061/DSM 861)
Methanococcoides burtonii (strain DSM 6242)
Methanococcus aeolicus (strain Nankai-3/ATCC BAA-1280)
Methanococcus jannaschii
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis (strain C5/ATCC BAA-1333)
Methanococcus maripaludis (strain C7/ATCC BAA-1331)
Methanococcus vannielii SB (strain SB/ATCC 35089/DSM 1224)
Methanocorpusculum labreanum (strain ATCC 43576/DSM 4855/Z)
Methanoculleus marisnigri (strain ATCC 35101/DSM 1498/JR1)
Methanopyrus kandleri
Methanoregula boonei (strain 6A8)
Methanosaeta thermophila (strain DSM 6194/PT)
Methanosarcina acetivorans
Methanosarcina barkeri (strain Fusaro/DSM 804)
Methanosarcina mazei
Methanosphaera stadtmanae (strain DSM 3091)
Methanospirillum hungatei (strain JF-1/DSM 864)
Methanothermobacter thermautotrophicus
Microscilla marina ATCC 23134
Microscilla marina ATCC 23134
Moorella thermoacetica (strain ATCC 39073)
Morinda citrifolia
Mus musculus
Mus musculus
Mycobacterium avium (strain 104)
Mycobacterium bovis
Mycobacterium bovis (strain BCG/Paris 1173P2)
Mycobacterium gilvum PYR-GCK
Mycobacterium gilvum PYR-GCK
Mycobacterium smegmatis (strain ATCC 700084/mc(2)155)
Mycobacterium sp. (strain JLS)
Mycobacterium sp. (strain KMS)
Mycobacterium sp. (strain MCS)
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium vanbaalenii (strain DSM 7251/PYR-1)
Mycobacterium vanbaalenii (strain DSM 7251/PYR-1)
Mycoplasma laidlawii
Myxococcus xanthus (strain DK 1622)
Narcissus pseudonarcissus
Natronomonas pharaonis (strain DSM 2160/ATCC 35678)
Natronomonas pharaonis (strain DSM 2160/ATCC 35678)
Natronomonas pharaonis (strain DSM 2160/ATCC 35678)
Natronorubrum sp. Tenzan-10
Nicotiana benthamiana
Nicotiana langsdorffii × Nicotiana sanderae
Nicotiana tabacum
Nocardia farcinica
Nocardia farcinica
Nodularia spumigena CCY 9414
Nodularia spumigena CCY 9414
Oceanobacillus iheyensis
Oryza sativa
Paracoccus zeaxanthinifaciens
Parvularcula bermudensis HTCC2503
Pelodictyon luteolum (strain DSM 273)
Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1
Phaffia rhodozyma
Phaffia rhodozyma
Photobacterium profundum
Photorhabdus luminescens subsp. laumondii
Photorhabdus luminescens subsp. laumondii
Pichia stipitis
Picrophilus torridus
Pinus radiata
Pongo pygmaeus
Propionibacterium acnes
Prosthecochloris aestuarii DSM 271
Prosthecochloris vibrioformis DSM 265
Pseudomonas entomophila (strain L48)
Pyrobaculum aerophilum
Pyrobaculum arsenaticum (strain DSM 13514/JCM 11321)
Pyrobaculum calidifontis (strain JCM 11548/VA1)
Pyrobaculum islandicum (strain DSM 4184/JCM 9189)
Pyrococcus abyssi
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus horikoshii
Pyrococcus kodakaraensis
Rattus norvegicus
Rattus norvegicus
Rhizobium etli (strain CFN 42/ATCC 51251)
Rhizobium loti
Rhodobacter capsulatus
Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023/2.4.1/NCIB 8253/DSM 158)
Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17025/ATH 2.4.3)
Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17029/ATH 2.4.9)
Rhodococcus sp. (strain RHA1)
Ricinus communis
Rickettsia bellii (strain RML369-C)
Rickettsia conorii
Rickettsia felis
Rickettsia prowazekii
Rickettsia typhi
Roseiflexus castenholzii DSM 13941
Roseiflexus sp. (strain RS-1)
Roseobacter denitrificans (strain ATCC 33942/OCh 114)
Rubrobacter xylanophilus (strain DSM 9941/NBRC 16129)
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharopolyspora erythraea (strain NRRL 23338)
Saccharopolyspora erythraea (strain NRRL 23338)
Salinibacter ruber (strain DSM 13855)
Salinispora arenicola CNS205
Salinispora arenicola CNS205
Salinispora tropica CNB-440
Salmonella choleraesuis
Salmonella paratyphi-a
Salmonella typhi
Salmonella typhimurium
Salvia officinalis
Schizosaccharomyces pombe
Schizosaccharomyces pombe
Serratia proteamaculans 568
Shigella boydii serotype 4 (strain Sb227)
Shigella dysenteriae serotype 1 (strain Sd197)
Shigella flexneri
Shigella sonnei (strain Ss046)
Silicibacter pomeroyi
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (strain bovine RF122)
Staphylococcus aureus (strain COL)
Staphylococcus aureus (strain MRSA252)
Staphylococcus aureus (strain MSSA476)
Staphylococcus aureus (strain Mu50/ATCC 700699)
Staphylococcus aureus (strain MW2)
Staphylococcus aureus (strain N315)
Staphylococcus aureus (strain USA300)
Staphylococcus epidermidis (strain ATCC 12228)
Staphylococcus epidermidis (strain ATCC 35984/RP62A)
Staphylococcus haemolyticus (strain JCSC1435)
Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (strain ATCC 15305/DSM 20229)
Staphylothermus marinus (strain ATCC 43588/DSM 3639/F1)
Stevia rebaudiana
Stigmatella aurantiaca DW4/3-1
Streptococcus agalactiae 18RS21
Streptococcus agalactiae serotype Ia
Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255/R6)
Streptococcus pneumoniae serotype 2 (strain D39/NCTC 7466)
Streptococcus pneumoniae SP11-BS70
Streptococcus pneumoniae SP14-BS69
Streptococcus pneumoniae SP18-BS74
Streptococcus pneumoniae SP19-BS75
Streptococcus pneumoniae SP23-BS72
Streptococcus pneumoniae SP3-BS71
Streptococcus pneumoniae SP6-BS73
Streptococcus pneumoniae SP6-BS73
Streptococcus pneumoniae SP9-BS68
Streptococcus pyogenes serotype M1
Streptococcus pyogenes serotype M12 (strain MGAS2096)
Streptococcus pyogenes serotype M12 (strain MGAS9429)
Streptococcus pyogenes serotype M18
Streptococcus pyogenes serotype M2 (strain MGAS10270)
Streptococcus pyogenes serotype M28
Streptococcus pyogenes serotype M3
Streptococcus pyogenes serotype M4 (strain MGAS10750)
Streptococcus pyogenes serotype M5 (strain Manfredo)
Streptococcus pyogenes serotype M6
Streptococcus sanguinis (strain SK36)
Streptococcus suis 89/1591
Streptomyces avermitilis
Streptomyces coelicolor
Streptomyces sp. (strain CL190)
Sulfolobus acidocaldarius
Sulfolobus shibatae
Sulfolobus shibatae
Sulfolobus shibatae
Sulfolobus solfataricus
Sulfolobus tokodaii
Sus scrofa
Symbiobacterium thermophilum
Synechococcus elongatus
Synechococcus sp. (strain ATCC 27144/PCC 6301/SAUG 1402/1)
Synechococcus sp. (strain JA-2-3B'a (2-13))
Synechococcus sp. (strain JA-3-3Ab)
Synechococcus sp. (strain PCC 7942)
Synechocystis sp.
Synechocystis sp. (strain PCC 6803)
Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei (strain Goettingen)
Tagetes erecta
Thermococcus kodakaraensis
Thermofilum pendens (strain Hrk 5)
Thermoplasma acidophilum
Thermoplasma volcanium
Thermosinus carboxydivorans Nor1
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus (strain HB27/ATCC BAA-163/DSM 7039)
Thermus thermophilus (strain HB27/ATCC BAA-163/DSM 7039)
Thiomicrospira crunogena (strain XCL-2)
Trichodesmium erythraeum (strain IMS101)
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
Uncultured methanogenic archaeon RC-I
Vibrio fischeri (strain ATCC 700601/ES114)
Vibrio harveyi HY01
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus AQ3810
Vibrio sp. Ex25
Xanthobacter sp. (strain Py2)
Zea mays
Particularly preferred is E 14 , gene product of an isopentenyl diphosphate delta isomerase gene, which can be isolated from a cell selected from the group comprising:
Adonis aestivalis var. Palaestina
Adonis aestivalis var. Palaestina
Adonis aestivalis var. Palaestina
Adonis aestivalis var. Palaestina
Aeropyrum pernix
Agrobacterium rhizogenes
Agromyces mediolanus
Anabaena sp. (strain PCC 7120)
Anabaena variabilis (strain ATCC 29413 / PCC 7937)
Anabaena variabilis (strain ATCC 29413 / PCC 7937)
Anaeromycobacter sp. (strain Fw109-5)
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Archaeoglobus fulgidus
Arthrobacter aurescens (strain TC1)
Aspergillus fumigatus
Aspergillus niger
Azoarcus sp. (strain EbN1)
Azoarcus sp. (strain EbN1)
Azotobacter vinelandii AvOP
Bacillus amyloliquefaciens FZB42
Bacillus anthracis
Bacillus cereus (strain ATCC 10987)
Bacillus cereus (strain ATCC 14579 / DSM 31)
Bacillus cereus (strain ZK / E33L)
Bacillus cereus G9241
Bacillus cereus subsp. cytotoxis NVH 391-98
Bacillus coagulans 36D1
Bacillus licheniformis (strain DSM 13 / ATCC 14580)
Bacillus sp. NRRL B-14911
Bacillus sp. SG-1
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis serovar israelensis ATCC 35646
Bacillus thuringiensis subsp. konkukian
Bdellovibrio bacteriovorus
Bombyx mori
Borrelia burgdorferi
Borrelia garinii
Bos taurus
Brassica oleracea var. Botrytis
Brevibacterium linens
Burkholderia multivorans ATCC 17616
Caldivirga maquilensis IC-167
Caldivirga maquilensis IC-167
Camptotheca acuminata
Camptotheca acuminata
Camptotheca acuminata
Candidatus Nitrosopumilus maritimus SCM1
Capsicum annuum
Catharanthus roseus
Cenarchaeum symbiosum
Chlamydomonas reinhardtii
Chlorobium chlorochromatii (strain CaD3)
Chlorobium ferrooxidans DSM 13031
Chlorobium limicola DSM 245
Chlorobium phaeobacteroides (strain DSM 266)
Chlorobium phaeobacteroides BS1
Chlorobium tepidum
Chloroflexus aggregans DSM 9485
Cinchona robusta
Citrobacter freundii
Citrus sp.
Clarkia breweri
Clarkia breweri
Clarkia xantiana
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (strain NCPPB 382)
Claviceps purpurea
Claviceps sp.
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052
Corynebacterium diphtheriae
Corynebacterium efficiens
Corynebacterium glutamicum
Crocosphaera watsonii
Cucurbita sp.
Cyanothece sp. CCY 0110
Cytophaga hutchinsonii (strain ATCC 33406 / NCIMB 9469)
Deinococcus geothermalis (strain DSM 11300)
Deinococcus radiodurans
Desulfotomaculum reducing MI-1
Dichelobacter nodosus (strain VCS1703A)
Dinoroseobacter shibae DFL 12
Enterobacter sp. 638
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium DO
Erwinia carotovora subsp. atroseptica
Escherichia coli
Escherichia coli (strain K12)
Escherichia coli (strain UTI89 / UPEC)
Escherichia coli B
Escherichia coli E24377A
Escherichia coli HS
Escherichia coli O157: H7
Escherichia coli O6
Escherichia coli O6: K15: H31 (strain 536 / UPEC)
Escherichia vulneris
Flavobacteria bacterium BBFL7
Flavobacterium johnsoniae UW101
Flavobacterium psychrophilum (strain JIP02 / 86 / ATCC 49511)
Frankia alni (strain ACN14a)
Frankia sp. (strain CcI3)
Frankia sp. EAN1pec
Gallus gallus
gamma proteobacterium HTCC2207
Gramella forsetii (strain KT0803)
Guillardia theta
Haematococcus pluvialis
Haematococcus pluvialis
Haematococcus pluvialis
Haloarcula marismortui
Halobacterium salinarium
Halobacterium salinarium
Haloquadratum walsbyi (strain DSM 16790)
Haloquadratum walsbyi (strain DSM 16790)
Halorhodospira halophila (strain DSM 244 / SL1)
Halorubrum lacus profundi ATCC 49239
Halorubrum lacus profundi ATCC 49239
Herpetosiphon aurantiacus ATCC 23779
Hevea brasiliensis
homo sapiens
homo sapiens
homo sapiens
Hyperthermic butylicus (strain DSM 5456 / JCM 9403)
Hyphomicrobium zavarzinii
Ignicoccus hospitalis KIN4 / I
Janibacter sp. HTCC2649
Kineococcus radiotolerans SRS30216
Kitasatospora griseola
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (strain ATCC 11842 / DSM 20081)
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus reuteri 100-23
Lactobacillus reuteri F275
Lactobacillus sakei subsp. sakei (strain 23K)
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (strain UCC118)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (strain MG1363)
Lactococcus lactis subsp. lactis
Lactuca sativa
Lactuca sativa
Legionella pneumophila subsp. pneumophila (strain
Philadelphia 1 / ATCC 33152 / DSM 7513)
Leifsonia xyli subsp. xyli
Leishmania braziliensis
Leishmania infantum
Leishmania major strain Friedlin
Listeria innocua
Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes serotype 4b (strain F2365)
Listeria monocytogenes str. 1 / 2a F6854
Listeria monocytogenes str. 4b H7858
Listeria welshimeri serovar 6b (strain ATCC 35897 / DSM 20650 / SLCC5334)
Lycopersicon esculentum
Lyngbya sp. PCC 8106
Macaca fascicularis
marine actinobacterium PHSC20C1
Mesocricetus auratus
Mesocricetus auratus
Metallosphaera sedula DSM 5348
Methanobacterium thermoautotrophicum
Methanobrevibacter smithii (strain PS / ATCC 35061 / DSM 861)
Methanococcoides burtonii (strain DSM 6242)
Methanococcus aeolicus (strain Nankai-3 / ATCC BAA-1280)
Methanococcus jannaschii
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis (strain C5 / ATCC BAA-1333)
Methanococcus maripaludis (strain C7 / ATCC BAA-1331)
Methanococcus vannielii SB (strain SB / ATCC 35089 / DSM 1224)
Methanocorpusculum labreanum (strain ATCC 43576 / DSM 4855 / Z)
Methanoculleus marisnigri (strain ATCC 35101 / DSM 1498 / JR1)
Methanopyrus kandleri
Methanoregula boonei (strain 6A8)
Methanosaeta thermophila (strain DSM 6194 / PT)
Methanosarcina acetivorans
Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804)
Methanosarcina mazei
Methanosphaera stadtmanae (strain DSM 3091)
Methanospirillum hungatei (strain JF-1 / DSM 864)
Methanothermobacter thermautotrophicus
Microscilla marina ATCC 23134
Microscilla marina ATCC 23134
Moorella thermoacetica (strain ATCC 39073)
Morinda citrifolia
Mus musculus
Mus musculus
Mycobacterium avium (strain 104)
Mycobacterium bovis
Mycobacterium bovis (strain BCG / Paris 1173P2)
Mycobacterium gilvum PYR-GCK
Mycobacterium gilvum PYR-GCK
Mycobacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc (2) 155)
Mycobacterium sp. (strain JLS)
Mycobacterium sp. (strain KMS)
Mycobacterium sp. (strain MCS)
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium vanbaalenii (strain DSM 7251 / PYR-1)
Mycobacterium vanbaalenii (strain DSM 7251 / PYR-1)
Mycoplasma laidlawii
Myxococcus xanthus (strain DK 1622)
Narcissus pseudonarcissus
Natronomonas pharaonis (strain DSM 2160 / ATCC 35678)
Natronomonas pharaonis (strain DSM 2160 / ATCC 35678)
Natronomonas pharaonis (strain DSM 2160 / ATCC 35678)
Natronorubrum sp. Tenzan-10
Nicotiana benthamiana
Nicotiana slowdorffii × Nicotiana sanderae
Nicotiana tabacum
Nocardia farcinica
Nocardia farcinica
Nodularia spumigena CCY 9414
Nodularia spumigena CCY 9414
Oceanobacillus iheyensis
Oryza sativa
Paracoccus zeaxanthinifaciens
Parvularcula bermudensis HTCC2503
Pelodictyon luteolum (strain DSM 273)
Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1
Phaffia rhodozyma
Phaffia rhodozyma
Photobacterium profundum
Photorhabdus luminescens subsp. laumondii
Photorhabdus luminescens subsp. laumondii
Pichia stipitis
Picrophilus torridus
Pinus radiata
Pongo pygmaeus
Propionibacterium acnes
Prosthecochloris aestuarii DSM 271
Prosthecochloris vibrioformis DSM 265
Pseudomonas entomophila (strain L48)
Pyrobaculum aerophilum
Pyrobaculum arsenaticum (strain DSM 13514 / JCM 11321)
Pyrobaculum calidifontis (strain JCM 11548 / VA1)
Pyrobaculum islandicum (strain DSM 4184 / JCM 9189)
Pyrococcus abyssi
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus horikoshii
Pyrococcus kodakaraensis
Rattus norvegicus
Rattus norvegicus
Rhizobium etli (strain CFN 42 / ATCC 51251)
Rhizobium loti
Rhodobacter capsulatus
Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023 / 2.4.1 / NCIB 8253 / DSM 158)
Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17025 / ATH 2.4.3)
Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17029 / ATH 2.4.9)
Rhodococcus sp. (strain RHA1)
Ricinus communis
Rickettsia bellii (strain RML369-C)
Rickettsia conorii
Rickettsia felis
Rickettsia prowazekii
Rickettsia typhi
Roseiflexus castenholzii DSM 13941
Roseiflexus sp. (strain RS-1)
Roseobacter denitrificans (strain ATCC 33942 / OCh 114)
Rubrobacter xylanophilus (strain DSM 9941 / NBRC 16129)
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharopolyspora erythraea (strain NRRL 23338)
Saccharopolyspora erythraea (strain NRRL 23338)
Salinibacter ruber (strain DSM 13855)
Salinispora arenicola CNS205
Salinispora arenicola CNS205
Salinispora tropica CNB-440
Salmonella choleraesuis
Salmonella paratyphi-a
Salmonella typhi
Salmonella typhimurium
Salvia officinalis
Schizosaccharomyces pombe
Schizosaccharomyces pombe
Serratia proteamaculans 568
Shigella boydii serotype 4 (strain sb227)
Shigella dysenteriae serotype 1 (strain sd197)
Shigella flexneri
Shigella sonnei (strain Ss046)
Silicibacter pomeroyi
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (strain bovine RF122)
Staphylococcus aureus (strain COL)
Staphylococcus aureus (strain MRSA252)
Staphylococcus aureus (strain MSSA476)
Staphylococcus aureus (strain Mu50 / ATCC 700699)
Staphylococcus aureus (strain MW2)
Staphylococcus aureus (strain N315)
Staphylococcus aureus (strain USA300)
Staphylococcus epidermidis (strain ATCC 12228)
Staphylococcus epidermidis (strain ATCC 35984 / RP62A)
Staphylococcus haemolyticus (strain JCSC1435)
Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (strain ATCC 15305 / DSM 20229)
Staphylothermus marinus (strain ATCC 43588 / DSM 3639 / F1)
Stevia rebaudiana
Stigmatella aurantiaca DW4 / 3-1
Streptococcus agalactiae 18RS21
Streptococcus agalactiae serotype Ia
Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6)
Streptococcus pneumoniae serotype 2 (strain D39 / NCTC 7466)
Streptococcus pneumoniae SP11-BS70
Streptococcus pneumoniae SP14-BS69
Streptococcus pneumoniae SP18-BS74
Streptococcus pneumoniae SP19-BS75
Streptococcus pneumoniae SP23-BS72
Streptococcus pneumoniae SP3-BS71
Streptococcus pneumoniae SP6-BS73
Streptococcus pneumoniae SP6-BS73
Streptococcus pneumoniae SP9-BS68
Streptococcus pyogenes serotype M1
Streptococcus pyogenes serotype M12 (strain MGAS2096)
Streptococcus pyogenes serotype M12 (strain MGAS9429)
Streptococcus pyogenes serotype M18
Streptococcus pyogenes serotype M2 (strain MGAS10270)
Streptococcus pyogenes serotype M28
Streptococcus pyogenes serotype M3
Streptococcus pyogenes serotype M4 (strain MGAS10750)
Streptococcus pyogenes serotype M5 (strain Manfredo)
Streptococcus pyogenes serotype M6
Streptococcus sanguinis (strain SK36)
Streptococcus suis 89/1591
Streptomyces avermitilis
Streptomyces coelicolor
Streptomyces sp. (strain CL190)
Sulfolobus acidocaldarius
Sulfolobus shibatae
Sulfolobus shibatae
Sulfolobus shibatae
Sulfolobus solfataricus
Sulfolobus tokodaii
Sus scrofa
Symbiobacterium thermophilum
Synechococcus elongatus
Synechococcus sp. (strain ATCC 27144 / PCC 6301 / SAUG 1402/1)
Synechococcus sp. (strain JA-2-3B'a (2-13))
Synechococcus sp. (strain JA-3-3Ab)
Synechococcus sp. (strain PCC 7942)
Synechocystis sp.
Synechocystis sp. (strain PCC 6803)
Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei (strain Goettingen)
Tagetes erecta
Thermococcus kodakaraensis
Thermofilum pendens (strain Hrk 5)
Thermoplasma acidophilum
Thermoplasma volcanium
Thermosinus carboxydivorans Nor1
Thermus thermophilus
Thermus thermophilus (strain HB27 / ATCC BAA-163 / DSM 7039)
Thermus thermophilus (strain HB27 / ATCC BAA-163 / DSM 7039)
Thiomicrospira crunogena (strain XCL-2)
Trichodesmium erythraeum (strain IMS101)
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
Uncultured methanogenic archaeon RC-I
Vibrio fischeri (strain ATCC 700601 / ES114)
Vibrio harveyi HY01
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus AQ3810
Vibrio sp. Ex25
Xanthobacter sp. (Py2 strain)
Zea mays

Weitere Gene zur ExpressionOther genes for expression

Es ist dem Fachmann geläufig, dass ein addiction-Sytem generell dazu genutzt werde kann, um ein oder mehrere weitere Fremdgene stabil in einer Zelle zu erhalten, und somit die Genprodukte der Fremdgene produziert werden können, so wie es beispielsweise in einem Expressionssystem geschieht.It It is well known to those skilled in the art that an addiction system generally can be used to stabilize one or more other foreign genes in a cell, thus producing the gene products of the foreign genes can be, for example, in an expression system happens.

Gegenstand der Erfindung ist somit ebenfalls eine vorstehend beschriebene gentechnisch veränderte Zelle, die mindestens ein zusätzliches Fremdgen expremiert.object The invention is therefore also a genetic engineering described above altered cell that has at least one additional Foreign genex expressed.

Die Genprodukte der Fremdgene können wiederum von der erfindungsgemäßen Zelle genutzt werden, weitere Substanzen zu erzeugen.The In turn, gene products of the foreign genes can be derived from the invention Cell can be used to generate more substances.

Beipiele für zusätzliches Fremdgene sind: Mitglieder des PHA-Synthese Gen Clusters (z. B. phaC, phaA, phaB-Cluster aus z. B. R. eutropha, P. oleovorans, P. aeruginosa, Thiocapsa pfennigii), Synthesegene für Polythioester und abgeleitete Sequenzen zur Erzeugung eines „künstlichen Stoffwechselweges” zur mikrobiellen Polythioestersynthese (z. B. eine Butyratkinase [Buk; EC 2.7.2.7] aus Clostridium acetobutylicum, eine Phosphotransbutyrylase [Ptb; EC 2.3.1.19] aus Clostridium acetobutylicum, und PHA-Synthase Gene (phaE und phaC) aus z. B. Chromatium vinosum oder Thiocapsa pfennigii und abgeleitete Sequenzen, vgl. Lütke-Eversloh et al. [2000] in Nature Materials: Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli , sowie Liu und Steinbüchel 2000 in Applied and Environmental Microbiology: A Novel Genetically Engineered Pathway for Synthesis of Poly(Hydroxyalkanoic Acids) in Escherichia coli .), Mitglieder des Alginat-Synthese-Gen-Clusters und abgeleitete Sequenzen (z. B. das Alginat Biosynthese Gen algX aus z. B. Pseudomonas aeruginosa PAO1. und Enzyme gelsistet in: A. Becker et al. [1998] : Xanthan gum biosynthesis and application: a biochemical/genetic perspective), Xanthan-Biosynthese-Gene und abgeleitete Sequenzen sowie Gene für die Produktion weiterer Polysaccharide (z. B. Glycosyltransferase-Gene), Cyanophycin-Synthese Gene und abgeleitete Sequenzen (z. B. cphA; cphA1; cphA2 aus z. B. Synechocystis PCC6208, Anabaena variabilis sp. ATCC 29413 Cyanothece sp. ATCC 51142; Cyanobakterien; Acinetobacter calcoaceticus; Gene kodierend für Insulin (z. B. ins aus z. B. homo sapiens; Wachsestersynthasen und abgeleitete Sequenzen (z. B. Wachs estersynthase/Acyl-CoA:diacylglycerol Acyltransferase ws/dgat aus z. B. Acinetobacter calcoaceticus ADP1 oder Mycobacterium smegmatis vgl. R. Kalscheuer und Steinbüchel, 2003 in J Biol Chem. ), Gene zur sowohl template-basierten als auch template-unabhängigen Synthese für Polyaminosäuren und abgeleitete Sequenzen, Gene zur Polylactat-Synthese und abgeleitete Sequenzen, Gene zur Methylcitronensäure Synthese und abgeleitete Sequenzen (z. B. prpC aus z. B. P. putida KT2440, R. eutropha H16 oder Aspergillus niger und in WO 2007101866 gelistete).Examples of additional foreign genes are: members of the PHA synthesis gene cluster (eg, phaC, phaA, phaB clusters of, for example, E. eutropha, P. oleovorans, P. aeruginosa, Thiocapsa pfennigii), synthesis genes for polythioesters, and derived sequences for Generation of an "artificial metabolic pathway" for microbial synthesis of polythioester (eg, a butyrate kinase [Buk; EC 2.7.2.7] from Clostridium acetobutylicum, a phosphotransbutyrylase [Ptb; EC 2.3.1.19] from Clostridium acetobutylicum, and PHA synthase genes (phaE and phaC) from, for example, Chromatium vinosum or Thiocapsa pfennigii and derived sequences, cf. Lütke-Eversloh et al. [2000] in Nature Materials: Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli , such as Liu and Steinbüchel 2000 in Applied and Environmental Microbiology: A Novel Genetically Engineered Pathway for Synthesis of Poly (Hydroxyalkanoic Acids) in Escherichia coli ), Members of the alginate synthesis gene cluster, and derived sequences (eg, the alginate biosynthesis gene algX from, eg, Pseudomonas aeruginosa PAO1 and enzymes listed in: A. Becker et al. [1998] Xanthan gum biosynthesis and application: a biochemical / genetic perspective), xanthan biosynthesis genes and deduced sequences, and genes for the production of other polysaccharides (eg, glycosyltransferase genes), cyanophycin synthesis genes, and deduced sequences (e.g. cphA; cphA1; cphA2 from, for example, Synechocystis PCC6208, Anabaena variabilis sp ATCC 29413 Cyanothece sp ATCC 51142; cyanobacteria; Acinetobacter calcoaceticus; Genes coding for insulin (eg from eg homo sapiens, wax ester synthases and derived sequences (eg wax ester synthase / acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase ws / dgat from for example Acinetobacter calcoaceticus ADP1 or Mycobacterium smegmatis see. R. Kalscheuer and Steinbüchel, 2003 in J Biol Chem. ), Templates for both template-based and template-independent synthesis of polyamino acids and deduced sequences, genes for polylactate synthesis and deduced sequences, genes for methylcitric acid synthesis and derived sequences (eg, prpC from, for example, putida KT2440, R eutropha H16 or Aspergillus niger and in WO 2007101866 listed).

Verfahren zur Herstellung der ZellenProcess for producing the cells

Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte A) Erniedrigung der Aktivität mindestens eines der bereits im Wildtyp vorhandenen Enzyme E1 bis E6 und B) Steigerung mindestens einer bevorzugt mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier und am meisten bevorzugt mindestens fünf der nicht im Wildtyp vorhandenen Enzymaktivitäten von E7 bis E11.A further contribution to the solution of the above-mentioned objects is made by a process for producing a genetically modified cell comprising the process steps A) lowering the activity of at least one of the enzymes already present in the wild-type E 1 to E 6 and B) increasing at least one, preferably at least two, more preferably at least three, more preferably at least four and most preferably at least five of the non-wild-type enzyme activities of E 7 to E 11 .

Die Steigerung der Enzymaktivitäten wird durch Einbringen mindestens einer exogenen Nukleinsäure in die Zelle erreicht; diese exogene Nukleinsäure vermag ohne Selektionsdruck stabil in der gentechnisch veränderten Zelle zu verweilen und wird weiterhin in die nächste Generation übertragen.The Increase of enzyme activities is by introducing at least reaches an exogenous nucleic acid into the cell; these exogenous nucleic acid is stable without selection pressure to stay in the genetically modified cell and will continue to be transferred to the next generation.

In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass diese exogene Nukleinsäure in das Genom der Zelle integriert wird oder aber in Form eines Expressionsvektors in die Zelle eingeführt wird.In In this connection it is preferred that this exogenous nucleic acid is integrated into the genome of the cell or in the form of an expression vector is introduced into the cell.

In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle ist bevorzugt:
E6 Genprodukt des ispH
E7 Genprodukt des mvaS aus Staphylococcus aureus,
E8 Genprodukt des mvaA aus Lactobacillus lactis und aus Staphylococcus aureus,
E9 Genprodukt des mvaK1 aus Staphylococcus aureus,
E10 Genprodukt des mvaK2 aus Staphylococcus aureus und
E11 Genprodukt des mvaD aus Staphylococcus aureus.
In this embodiment of the method according to the invention for producing a genetically modified cell, preference is given to:
E 6 gene product of ispH
E 7 gene product of mvaS from Staphylococcus aureus,
E 8 gene product of mvaA from Lactobacillus lactis and from Staphylococcus aureus,
E 9 gene product of mvaK1 from Staphylococcus aureus,
E 10 gene product of mvaK2 from Staphylococcus aureus and
E 11 gene product of mvaD from Staphylococcus aureus.

Weiterhin ist es im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass es sich bei der Zelle um einen nur über den MEP-Weg zur IPP-Synthese befähigten Mikroorganismus, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Eubakterien,
Plastiden von Apicomplexa
und Plastiden höherer Pflanzen
handelt.
Furthermore, in connection with the embodiment of the method according to the invention described above, it is preferred that the cell is a microorganism which is capable of IPP synthesis only via the MEP route, preferably selected from the group comprising:
eubacteria
Plastids of Apicomplexa
and plastids of higher plants
is.

Unter den Eubakterien sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Lactobacillus, Lactococcus, Escherichia, Staphylococcus, Ralstonia, Bacillus, Corynebacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Streptococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Alcanivorax, Agrobacterium, Bifidobacterium, Borellia, Burkholderia, Clostridium, Enterococcus, Fusobacterium, Gluconobacter, Gordonia, Helicobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Porphyromonas, Propionibacterium, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Zymomonas, Vibrio, Myxococcus, Chromobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Paracoccus, Thiobacillus, Desulfovibrio, Streptomyces, Acinetobacter, Comamonas, Escherichia coli, Lactococcuss lactis, Lactobacillus brevis, S aureus Ralstonia eutropha, Ralstonia solanacearum, Ralstonia metallidurans, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, Bacillus licheniformes, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluoreszens, Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Peptostreptococcus sp., Leuconostoc mesenteroides (subsp. dextranicum), Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, Alcanivorax borkumensis, Agrobacterium tumefaciens, Bifidobacterium longum, Borellia burgdorferi, Burkholderia pseudomallei, Clostridium acetobutylicum, Clostridium propionicum, Clostridium pasteurianum, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Gluconobacter oxydans, Gordonia westfalica, Gordonia polyisoprenivorans, Helicobacter pylori, Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tubercolosis, Nocardia farcinica, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium freudenreichii, Rhizobium leguminosarum, Rhodococcus opacus, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Zymomonas mobilis, Vibrio fisheri, Vibrio cholerae, Myxococcus sp., Chromobacterium violaceum, Nitrosomonas europaea, Nitrobacter winogradskyi, Paracoccus denitrificans Thiobacillus ferrooxidans, Desulfovibrio desulfuricans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albulus, Acinetobacter borkumensis und Comamonas testosteroni.
Among the eubacteria, in particular those cells are selected which are selected from the group comprising:
Lactobacillus, Lactococcus, Escherichia, Staphylococcus, Ralstonia, Bacillus, Corynebacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Streptococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Alcanivorax, Agrobacterium, Bifidobacterium, Borellia, Burkholderia, Clostridium, Enterococcus, Fusobacterium, Gluconobacter, Gordonia, Helicobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Porphyromonas, Propionibacterium, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Zymomonas, Vibrio, Myxococcus, Chromobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Paracoccus, Thiobacillus, Desulfovibrio, Streptomyces, Acinetobacter, Comamonas, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, S aureus Ralstonia eutropha, Ralstonia solanacearum, Ralstonia metallidurans, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus anthracis, Bacillus licheniformes, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Streptoc occus salivarius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Peptostreptococcus sp., Leuconostoc mesenteroides (subsp. dextranicum), Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, Alcanivorax borkumensis, Agrobacterium tumefaciens, Bifidobacterium longum, Borrelia burgdorferi, Burkholderia, pseudomallei Clostridium acetobutylicum, propionicum Clostridium, Clostridium pasteurianum, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Gluconobacter oxydans, Gordonia westfalica, Gordonia polyisoprenivorans, Helicobacter pylori , Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia farcinica, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium freudenreichii, Rhizobium leguminosarum, Rhodo coccus opacus, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Zymomonas mobilis, Vibrio fisheri, Vibrio cholerae, Myxococcus sp., Chromobacterium violaceum, Nitrosomonas europaea, Nitrobacter winogradskyi, Paracoccus denitrificans Thiobacillus ferrooxidans, Desulfovibrio desulfuricans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albulus, Acinetobacter borkumensis and Comamonas testosteroni ,

Ebenso bevorzugte Vertreter von Eubakterien sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend alle einen obligat oder fakultativ phototrophen Stoffwechsel besitzenden Proteobakterien, besonders bevorzugt sind hier Rhodospirillum, Rhodobacter, Allochromatium, Chromatium, Synechococcus, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Allochromatium vinosum, Chromatium okenii, Synechococcus sp.As well preferred representatives of eubacteria are selected from the group comprising all one obligate or facultative phototrophic Metabolism possessing proteobacteria are particularly preferred here Rhodospirillum, Rhodobacter, Allochromatium, Chromatium, Synechococcus, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Allochromatium vinosum, Chromatium okenii, Synechococcus sp.

Unter den Apicomplexa sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Plasmodium,
Paramecium,
Tetrahymena,
Chlamydomonas reinhardtii
Theileria annulata,
Theileria parva
Among the Apicomplexa, in particular those cells are selected which are selected from the group comprising:
Plasmodium,
paramecium,
Tetrahymena,
Chlamydomonas reinhardtii
Theileria annulata,
Theileria parva

Verfahren zur Herstellung delta mvaK1::ispC-HProcess for preparing delta mvaK1 :: ispC-H

Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte A) Erniedrigung der Aktivität mindestens eines der bereits im Wildtyp vorhandenen Enzyme E7 bis E11 und B) Steigerung mindestens einer bevorzugt mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens vier, darüber hinaus weiter bevorzugt mindestens fünf und am meisten bevorzugt mindestens sechs der nicht im Wildtyp vorhandenen Enzymaktivitäten von E1 bis E6.A further contribution to the solution of the abovementioned objects is provided by a method for producing a genetically modified cell, comprising the method steps A) lowering the activity of at least one of the enzymes already present in the wild-type E 7 to E 11 and B) increasing at least one, preferably at least two, more preferably at least three, more preferably at least four, more preferably at least five, and most preferably at least six of the non-wild-type enzyme activities of E 1 to E 6 .

Die Steigerung der Enzymaktivitäten wird durch Einbringen mindestens einer exogenen Nukleinsäure in die Zelle erreicht; diese exogene Nukleinsäure vermag ohne Selektionsdruck stabil in der gentechnisch veränderten Zelle zu verweilen und wird weiterhin in die nächste Generation übertragen.The Increase of enzyme activities is by introducing at least reaches an exogenous nucleic acid into the cell; these exogenous nucleic acid is stable without selection pressure to stay in the genetically modified cell and will continue to be transferred to the next generation.

In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass diese exogene Nukleinsäure in das Genom der Zelle integriert wird oder aber in Form eines Expressionsvektors in die Zelle eingeführt wird.In In this connection it is preferred that this exogenous nucleic acid is integrated into the genome of the cell or in the form of an expression vector is introduced into the cell.

In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle ist bevorzugt:
E10 Genprodukt des mvaK1,
E1 Genprodukt des ispC,
E2 Genprodukt des ispD,
E3 Genprodukt des ispE,
E4 Genprodukt des ispF,
E5 Genprodukt des ispG und
E6 Genprodukt des ispH.
In this embodiment of the method according to the invention for producing a genetically modified cell, preference is given to:
E 10 gene product of mvaK1,
E 1 gene product of ispC,
E 2 gene product of ispD,
E 3 gene product of ispE,
E 4 gene product of ispF,
E 5 gene product of ispG and
E 6 gene product of ispH.

Weiterhin ist es im Zusammenhang mit dem vorstehend beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass es sich bei der Zelle um einen nur über den MVA-Weg zur IPP-Synthese befähigten Mikroorganismus, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Hefen,
Pilze,
handelt.
Furthermore, in connection with the embodiment of the method according to the invention described above, it is preferred that the cell is a microorganism which is capable of IPP synthesis only via the MVA route, preferably selected from the group comprising:
yeasts,
mushrooms,
is.

Unter den Pilzen sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Absidia
Agaricus
Ajellomyces
Arthroderma
Acremonium
Aspergillus
Disporotrichum
Geosmithia
Mortierella
Paecilomyces
Penicillium
Rhizopus
Trichoderma
Talaromyces
Thielavia.
Among the fungi, in particular those cells are preferred, selected from the group comprising:
Absidia
Agaricus
Ajellomyces
Arthroderma
Acremonium
Aspergillus
Disporotrichum
Geosmithia
Mortierella
paecilomyces
Penicillium
Rhizopus
Trichoderma
Talaromyces
Thielavia.

Unter den Hefen sind insbesondere diejenigen Zellen bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Candida
Pichia
Sacharomyces
Arxula
Klyveromyces
Yarrowia
Hansenula
Brettanomyces
Among the yeasts, in particular those cells are preferred, selected from the group comprising:
Candida
Pichia
Saccharomyces
Arxula
Kluyveromyces
Yarrowia
Hansenula
Brettanomyces

Zellen, die durch Verfahren hergestellt wurdenCells made by process were

Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlichen, gentechnisch veränderten Zellen.a further contribution to the solution of the aforementioned tasks continues to perform by the methods described above available, genetically modified cells.

Relevantes PlasmidRelevant plasmid

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe leistet weiterhin eine isolierte Nukleinsäure pCOLADuet-1::MVA1-5 mit der Sequenz nach SEQ ID NO: 3.a Contribute to the solution of the problem mentioned above furthermore an isolated nucleic acid pCOLADuet-1 :: MVA1-5 with the sequence according to SEQ ID NO: 3.

Verfahren zu Herstellung von Produkten mit erfindungsgemäßen ZellenProcess for the production of products with cells according to the invention

Wie eingangs beschrieben werden addiction-Systeme in biotechnologischen Produktionsprozessen eingesetzt; die gentechnische Manipulation der das addiction-System aufweisenden Zelle ist daher in diesem Zusammenhang zwangsläufig mit der Herstellung von gewünschten Produkten verbunden. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist als Produkt jede Substanz zu verstehen, die von erfindungsgemäßer Zelle aufgrund der gentechnischen Veränderung im Vergleich zu ihrem Wildtyp vermehrt synthetisiert wird. Dies können daher beispielsweise Zwischenprodukte der IPP-Stoffwechselwege, Genprodukte der Fremdgene, aber auch durch die Genprodukte der Fremdgene synthetisierten Substanzen sein, wie z. B. das unten beschriebene Cyanophycin.As initially described are addiction systems in biotechnological Production processes used; the genetic manipulation the cell having the addiction system is therefore in this context inevitably with the production of desired Connected products. In connection with the present invention is to be understood as a product of any substance that is inventive Cell due to the genetic modification in comparison is increasingly synthesized to its wild type. This can therefore, for example, intermediates of the IPP metabolic pathways, Gene products of foreign genes, but also by the gene products of foreign genes be synthesized substances, such as. As described below Cyanophycin.

Erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von Produkten umfasst den Verfahrensschritt des in Kontakt Bringens einer erfindungsgemäßen Zelle mit einem Nährmedium beinhaltend eine Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, unter denen Produkt gebildet wird, sowie gegebenenfalls Aufreinigung des Produktes aus der Kultur.inventive Process for the preparation of products comprises the process step contacting a device according to the invention Cell with a nutrient medium including a carbon source below Conditions under which product is formed, and optionally Purification of the product from the culture.

Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion mit dem Nährmedium in Kontakt und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.The genetically modified cells according to the invention can be brought into contact with the nutrient medium continuously or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed-batch process (feed process) or repeated-fed-batch process (repetitive feed process) be cultivated. Also conceivable is a semi-continuous process, as described in the GB-A-1009370 is described. A summary of known cultivation methods are in the textbook of Chmiel ("Bioprocessing Technology 1. Introduction to Bioprocess Engineering" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook of Storhas ("Bioreactors and Peripheral Facilities", Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994) described.

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen.The The culture medium to be used must suitably meet the requirements satisfy the respective strains.

Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.Descriptions of culture media of various microorganisms are in the handbook "Manual of Me Thods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) contain.

Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Kohlenwasserstoffe wie Methan, Aminosäuren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure sowie Kohlendioxid bei chemolitho-autotroph wachsenden Mikroorganismen zum Beispiel Ralstonia eutropha bzw. photo-autotroph wachsenden Mikroorganismen wie zum Beispiel Rhodobacter sphaeroides, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Weiter bevorzugt ist der Einsatz von Komplexmediumbestandteilen aus Resten von Agrargütererzeugnissen. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlehydraten, insbesondere Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide, wie dies in US 6,01,494 und US 6,136,576 beschrieben ist, von C5-Zuckern oder von Glycerin.As a carbon source carbohydrates such. As glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such. As soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such. As palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such. As glycerol and methanol, hydrocarbons such as methane, amino acids such as L-glutamate or L-valine or organic acids such. As acetic acid and carbon dioxide in chemolitho-autotroph-growing microorganisms such as Ralstonia eutropha or photo-autotroph-growing microorganisms such as Rhodobacter sphaeroides used. These substances can be used individually or as a mixture. Further preferred is the use of complexing agent components from residues of agricultural products. Particular preference is given to the use of carbohydrates, in particular monosaccharides, oligosaccharides or polysaccharides, as described in US Pat US 6,01,494 and US 6,136,576 described C5 sugars or glycerol.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat bzw. N2 bei stickstofffixierenden Mikroorganismen z. B. Rhizobium leguminosarum oder auch Cyanobakterien verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.As nitrogen source organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate or N 2 in nitrogen-fixing microorganisms z. B. Rhizobium leguminosarum or cyanobacteria can be used. The nitrogen sources can be used singly or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.When Phosphorus source can phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing ones Salts are used. The culture medium must continue to salts of Metals include such. As magnesium sulfate or iron sulfate, the necessary for growth. Finally, you can essential growth factors such as amino acids and vitamins in addition used for the above-mentioned substances. The culture medium In addition, suitable precursors may be added become. The stated feedstocks can be used to culture in Formed as a one-off approach or as appropriate be fed during cultivation.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure bzw. Kohlensäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester oder Pflanzenöl eingesetzt werden. Weitere geläufige Methoden der Prozesskontrolle und Schaumkontrollsysteme für Fermentationsprozesse können in einschlägiger Literatur nachgelesen werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von (weiteren) Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Insbesondere bei der Verwendung von Zellen, welche Glycerin als Substrat umwandeln können, kann es bevorzugt sein, als Zellen solche Zellen einzusetzen, die in der US 6,803,218 beschrieben werden. In diesem Fall können die Zellen bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 100°C kultiviert werden.For pH control of the culture, basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid or carbonic acid are suitably used. To control the foam development antifoams such. B. fatty acid polyglycol ester or vegetable oil can be used. Other common methods of process control and foam control systems for fermentation processes can be found in the relevant literature. In order to maintain the stability of (further) plasmids, the medium suitable selective substances such. B. antibiotics are added. In order to maintain aerobic conditions, oxygen or oxygen-containing gas mixtures, such. As air, registered in the culture. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, and preferably 25 ° C to 40 ° C. In particular, in the use of cells which can convert glycerol as a substrate, it may be preferable to use as cells those cells which are used in the US 6,803,218 to be discribed. In this case, the cells can be cultured at temperatures ranging from 40 to 100 ° C.

Die Zellen können, falls das Produkt nicht in das Kulturmedium sezerniert wird, aufgeschlossen, und das Produkt nach bekannten Aufreinigungsverfahren aus dem Lysat gewonnen werden. Die Zellen können beispielsweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.The Cells can, if the product is not in the culture medium is secreted, open-minded, and the product according to known Purification process can be obtained from the lysate. The cells For example, by high-frequency ultrasound, by high pressure, such. In a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic Solvents, by homogenizers or by combination several of the listed methods are digested.

Die Aufreinigung des Produktes kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie beispielsweise Tangentialfiltration, Fällung, Destillation, Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), Q-Sepharose-Chromatographie, Innenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese.The Purification of the product can be carried out by known, chromatographic Be achieved, such as tangential filtration, Precipitation, distillation, molecular sieve chromatography (gel filtration), Q-sepharose chromatography, Internal exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, as well as other common Methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis.

Produkte aus Verfahren mit erfindungsgemäßen ZellenProducts from processes with inventive cell

Ebenfalls Bestandteil der Erfindung sind Produkte, hergestellt mit dem vorstehend beschriebenen, erfindungemäßen Verfahren zur Herstellung von Produkten. Bevorzugt ist das Produkt ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Isoprenoide und Terpenoide (wie beispielsweise Steroide, Flavonoide, Gummistoffe oder Carotenoide), Monoterpene, Sesquiterpene, Diterpene, Triterpene, Polyterpene, Cyclische Monoterpene, Cyclische Sesquiterpene, Cyclische Diterpene, Cyclische Triterpene oder auch Hormone, Fette, Öle oder Vitamine und das Genprodukt des Fremdgens.
Also part of the invention are products prepared by the erfindungemäßen method according to the invention for the preparation of products described above. Preferably, the product is selected from the group comprising
Isoprenoids and terpenoids (such as steroids, flavonoids, gums or carotenoids), monoterpenes, sesquiterpenes, diterpenes, triterpenes, polyterpenes, cyclic monoterpenes, cyclic sesquiters pene, cyclic diterpenes, cyclic triterpenes or even hormones, fats, oils or vitamins and the gene product of the foreign gene.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.In The examples below are the present Invention described by way of example, without the invention, whose Scope of application is apparent from the entire description and the claims, limited to the embodiments mentioned in the examples should be.

Folgende Figuren sind Bestandteil der Offenbarung:The following Figures are part of the disclosure:

1: Der MEP-Weg 1 : The MEP route

2: Der MVA-Weg 2 : The MVA route

3: Kultivierung von E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5 und E. coli HMS174 (DE3) ΔispH Ω FRT/Amp/FRT pCOLADuet-1::MVA1-5 in LB-Medium. 3 : Cultivation of E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 and E. coli HMS174 (DE3) ΔispH Ω FRT / Amp / FRT pCOLADuet-1 :: MVA1-5 in LB medium.

4: Plasmidkarte pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA 4 : Plasmid Map pCOLADuet-1 :: MVA1-5 :: cphA

5: Fremdgenexpression 5 : Foreign gene expression

Beispiele:Examples:

Herstellung des pCOLADuet-1::MVA1-5Preparation of pCOLADuet-1 :: MVA1-5

Für die DNA-Manipulationen wurden Standardtechniken benutzt wie sie in Sambrook, J. et al. (1989), ”Molecular Cloning: a laboratory manual”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York , angegeben sind. Die für Klonierungen genutzten Enzyme stammen von New England Biolabs, Ipswich, MA, und wurden gemäß Herstellerangeben eingesetzt.For the DNA manipulations standard techniques were used as in Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: a laboratory manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York , are indicated. The enzymes used for cloning are from New England Biolabs, Ipswich, MA and were used according to the manufacturer's instructions.

Zur Herstellung des pCOLADuet-1::MVA1-5, SEQ ID NO: 3, wurden zunächst zwei Plasmide, pCOLADuet-1::MVA-top, SEQ ID NO: 1, und pCOLADuet-1::MVA-bottom, SEQ ID NO: 2, durch die Firma BioBasic Inc., Ontario, Canada, künstlich synthetisiert.to Preparation of pCOLADuet-1 :: MVA1-5, SEQ ID NO: 3, were initially performed two plasmids, pCOLADuet-1 :: MVA-top, SEQ ID NO: 1, and pCOLADuet-1 :: MVA-bottom, SEQ ID NO: 2, manufactured by BioBasic Inc., Ontario, Canada synthesized.

Beide Plasmide wurden mit KpnI/MfeI, verdaut; das erhaltene 2103 Basenpaar große Fragment aus pCOLADuet-1::MVA-bottom wurde in das 8321 Basenpaar große Fragment aus pCOLADuet-1::MVA-top unter Erhalt von pCOLADuet-1::MVA1-5 ligiert.Both Plasmids were digested with KpnI / MfeI; the obtained 2103 base pair large fragment from pCOLADuet-1 :: MVA-bottom was added to the 8321 base pair fragment from pCOLADuet-1 :: MVA-top to ligate pCOLADuet-1 :: MVA1-5.

Die Sequenz des Vektors wurde durch Sequenzierung bei der Firma GATC Biotech, Konstanz, Schweiz, überprüft.The Sequence of the vector was determined by sequencing at GATC Biotech, Constance, Switzerland.

Transformation von pColaDuet-1::MVA1-5 in E. coli Die Transformation des pCOLADuet-1::MVA1-5 (KmR) Hybridplasmids in E. coli HMS174 (DE3) fand gleichzeitig mit einer Transformation des PLasmides pRed/ET (TcR) (Fa.Genebridges) statt. Die Selektion erfolgte auf entsprechenden LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 μg/ml Endkonzentration) und Tetrazyklin (12,5 μg/ml Endkonzentration) als Selektionsmarker für eine positive Selektierung.transformation of pColaDuet-1 :: MVA1-5 in E. coli The Transformation of pCOLADuet-1 :: MVA1-5 (KmR) Hybrid plasmids in E. coli HMS174 (DE3) co-located with a Transformation of the plasmid pRed / ET (TcR) (Fa.Genebridges) instead. Selection was on appropriate LB agar plates with kanamycin (50 μg / ml final concentration) and tetracycline (12.5 μg / ml Final concentration) as a selection marker for a positive Triage.

Die Kultivierung bei erfolgte bei 30°C, da sonst Plasmidverlust und Induktion des Hybridplasmids pRed/ET zu befürchten war. Der so generierte Stamm wird im folgenden als „E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5” bezeichnet.The Cultivation occurred at 30 ° C, otherwise plasmid loss and induction of the hybrid plasmid pRed / ET was. The strain thus generated is hereinafter referred to as "E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 ".

Herstellung der ispH-Mutante von E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5Preparation of the ispH mutant of E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5

Die Amplifizierung der FRT/Amp/FRT Selektionskassette (Fa.Genebridges) zur Erhaltung homologer 5' und 3' DNA Sequenzen des ispH-Gens wurde mittels AccuPrimePfx Polymerase (Invitrogen) und zweistufiger PCR (Denaturierung bei 95°C für 15 sec.; Elongation 68°C für 2 Minuten). (Primersequenzen: ispH integr fw: 5'-atgcagatcctgttggccaacccgcgtggtttttgtgccggggtagaccgaattaaccctcactaaagggcggc-3') (ispH integr rev: 5'-ttcacgaatatcgacacgcagctctttcggcacttcgaaaacaatgtttttaatacgactcactatagggctc-3') durchgeführt. Das Fragment (ca. 1,8 kbp) wurde mittels Agarosegel isoliert (Gel Extraktions Kit Fa.Qiagen). 400 μg wurden für die Red/Et vermittelte Integration mittels Elektroporation nach den Herstellerangaben der Fa. Genebridges nach E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5 transformiert und weiterbehandelt.The Amplification of the FRT / Amp / FRT selection cassette (Genbridges) to obtain homologous 5 'and 3' DNA sequences of the ispH gene using AccuPrimePfx polymerase (Invitrogen) and two-step PCR (Denaturation at 95 ° C for 15 sec .; elongation 68 ° C for 2 minutes). (Primer sequences: ispH integr fw: 5'-atgcagatcctgttggccaacccgcgtggtttttgtgccggggtagaccgaattaaccctcactaaagggcggc-3 ') (ispH integr rev: 5'-ttcacgaatatcgacacgcagctctttcggcacttcgaaacaatgtttttaatacgactcactatagggctc-3 ') carried out. The fragment (about 1.8 kbp) was using Agarose gel isolated (Gel Extraction Kit Fa.Qiagen). 400 μg were used for Red / Et-mediated integration by electroporation according to the manufacturer's instructions of Genebridges after E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 transformed and treated.

Der so generierte Stamm wird im folgenden als „E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5” bezeichnet.Of the thus generated strain is hereinafter referred to as "E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 ".

Der Kontrollversuch wurde mit E. coli HMS174 (DE3) ohne pCOLADuet-1::MVA1-5 durchgeführt. Eine Selektion der erhaltenen Klone wurde für den Ansatz mit MVA1-5 auf Kanamycin (Km)/Ampicillin (Amp) LB-Platten und für die Kontrolle ohne MVA1-5 auf Amp LB-Platten ausplattiert. Die Kontrolle zeigte keine vitalen Kolonien, welche bei einer nicht letalen Integration der FRT/Amp/FRT Integration in das ispH-Gen entstanden sein müssten.Of the Control experiment was carried out with E. coli HMS174 (DE3) without pCOLADuet-1 :: MVA1-5 carried out. A selection of the obtained clones was for the approach with MVA1-5 on kanamycin (Km) / ampicillin (Amp) LB plates and for control without MVA1-5 on Amp LB plates plated. The control showed no vital Colonies resulting in non-lethal integration of FRT / Amp / FRT Integration into the ispH gene would have to have arisen.

Der Stamm E. coli HMS174 (DE3) ΔispH Ω FRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5 zeigte ca. 320 Kolonien bildende Einheiten (cfu) bei gleicher ausplattierter Menge an Zellen aus dem Regenerationsansatz. Es folgten zahlreiche Versuche die belegten, dass die Ampicillinresistenz genomisch korrekt integriert wurde und dauerhaft erhalten blieb.Of the Strain E. coli HMS174 (DE3) ΔispH Ω FRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 showed about 320 colony forming units (cfu) with the same plated-out quantity of cells from the regeneration batch. Numerous experiments followed that confirmed the ampicillin resistance Genomic was correctly integrated and permanently preserved.

Vektorstabilität ohne Antibiotikum in ispH-MutanteVector stability without antibiotic in ispH mutant

Die stabilisierende Wirkung in E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5 gegenüber dem Stamm E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5 konnte festgestellt werden: E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5 wies keinen quantifizierbarer Plasmidverlust auf, E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5 hingegen wies einen Plasmidverlust über 24 h von 20% auf,.The stabilizing effect in E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 against strain E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 could be detected: E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 no quantifiable plasmid loss, E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5, however, had a plasmid loss 24 h from 20% up ,.

3 zeigt Zellwachstum der rekombinanten Zellen. Das Zellwachstum wurde als Trübungsmessung über ein Klett Summerson Colorimeter (Filter Nr. 54; Manostat Corporation Cat. Nr. 76-550-220, USA) bei 520 nm ermittelt. Das Wachstums-Monitoring wurde in relativen Klett-Units (KU) gegen unbeimpftes Medium verfolgt. 3 shows cell growth of the recombinant cells. Cell growth was measured by turbidity measurement on a Klett Summerson Colorimeter (Filter No. 54, Manostat Corporation Cat. No. 76-550-220, U.S.A.) at 520 nm. Growth monitoring was monitored in relative Klett units (KU) against uninoculated medium.

Die verwendeten rekombinanten Stämme von E. coli wurden mit 1% einer 12stündigen Vorkultur (LB-Medium mit entspr. Antibiotika: Rifampizin für E. coli HMS174 (DE3) + Kanamycin für pColaDuet-1 und gegebenenfalls Ampicillin für genomisches Insertionsfragment) angeimpft und in einem 4-fach Schikane Klett-Kolben (250 ml Gesamtvolumen mit 100 ml LB-Medium) bei 37°C und 180 rpm kultiviert. Die Messung der optischen Dichte erfolgte aus dem Schikane-Klett-Kolben direkt mit einem Klett Summerson Colorimeter. Zur Bestimmung des Plasmidverlustes wurden die Zellen mit steriler Saline (NaCl 0,9% in H2O) einheitlich verdünnt und in gleichen Volumina auf LB und LB-Selektionsplatten (mit 50 μg Kanamycin) ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37°C für 24 h erfolgte die Auszählung der Koloniebildenden Einheiten (cfu) hinsichtlich der aufgetretenen Kolonie zahlen. Mittelwert cfu auf LB-Platten, 10–5 Verdünnung, Ohne Antibiotikum normiert auf 100 Mit Kanamycin PlasmidVerlust in % E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5 100 78 22 E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5 100 99 1 The recombinant strains of E. coli used were inoculated with 1% of a 12-hour pre-culture (LB medium with corresponding antibiotics: rifampicin for E. coli HMS174 (DE3) + kanamycin for pColaDuet-1 and optionally ampicillin for genomic insertion fragment) and in a 4-fold chicane Velcro flask (250 ml total volume with 100 ml LB medium) cultivated at 37 ° C and 180 rpm. The optical density measurement was made from the chicane Velcro piston directly with a Klett Summerson colorimeter. To determine the plasmid loss, the cells were diluted uniformly with sterile saline (NaCl 0.9% in H 2 O) and plated in equal volumes on LB and LB selection plates (containing 50 μg kanamycin). After incubation at 37 ° C. for 24 h, the count of colony-forming units (cfu) was paid in respect of the colony that had occurred. Mean cfu on LB plates, 10 -5 dilution, Normalized to 100 without antibiotic With kanamycin Plasmid loss in% E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 100 78 22 E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 100 99 1

Herstellung eines addiction-System Plasmides mit zusätzlichem Fremdgen: pColaDuet-1::MVA1-5::cphAMaking an addiction system Plasmides with additional foreign gene: pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA

Es wurde als beispielhaftes Fremdgene die T7 Cyanophycin-Synthethase (cphA6308C595S) Transkriptionseinheit in das Plasmid pCOLADuet-1::MVA1-5 funktional einkloniert Ausgehend von einem gereinigtem template Plasmid, pET23a::cphA6308C5956S, umfassend eine DNA kodierend für die Cyanophycinsynthetase mit NCBI accession number: AAF43647, enthaltend eine Aminosäure-Modifikation [C595S], wurde mittels des 5'Primers „pET23aXhoIT7 fw” (5'-AACTCGAGATTAATACGACTCACTATAGG-3') und des 3'Primers „T7-Terminator” 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' eine cphA6308C595S Transkriptionseinheit (T7 Promoter-RBS-cphA) mittels des folgenden PCR-Programms in einem Thermocycler (Modell Primus96 advanced, Fa. Peqlab, Erlangen, Deutschland) amplifiziert. Der Einsatz des 5'Primers ermöglichte das Hinzufügen einer 3' XhoI Schnittstelle. Eine 5' XhoI Schnittstelle befand sich bereits Stromabwärts des cphA Gen welches zuvor mittels NdeI/XhoI in den Vektor pET23a kloniert wurde.It became as exemplary foreign genes the T7 Cyanophycin Synthethase (cphA6308C595S) transcriptional unit into the plasmid pCOLADuet-1 :: MVA1-5 Functionally cloned Starting from a cleaned template Plasmid, pET23a :: cphA6308C5956S, comprising a DNA coding for the cyanophycin synthetase with NCBI accession number: AAF43647 containing an amino acid modification [C595S] was determined by means of the 5'Primers "pET23aXhoIT7 fw" (5'-AACTCGAGATTAATACGACTCACTATAGG-3 ') and the 3 'primer "T7 terminator" 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' a cphA6308C595S transcription unit (T7 promoter-RBS-cphA) using the following PCR program in a thermocycler (Model Primus 96 advanced, Peqlab, Erlangen, Germany). The use of the 5'Primers enabled the addition a 3 'XhoI interface. A 5 'XhoI interface was located already downstream of the cphA gene previously by means of NdeI / XhoI was cloned into the vector pET23a.

Der Ansatz enthält:
10 μl Primer 5', 10 μl Primer 3', 10 μl dNTP-MIX (je 2,5 mM), 10 μl 10fach Pfx-Amplifikationspuffer (Fa. Invitrogen), 2,5 μl MgSO4 (50 mM), 10 μl (2 ng) Template DNA (pET23a::cphA6308), 0,5 μl Platinum® Pfx-DNA-Polymerase (Fa. Invitrogen), ad 100 μl H2O bidest. PCR-Programm: 1.) Denaturierung: 2 min 94°C 2.) Denaturierung: 15 s 94°C 3.) Annealing 30 s 55°C 4.) Elongation 3 min 68°C 5.) 32fache Wiederholung der Schritte 1.)–4.) 6.) finale Elongation 5 min 68°C
The approach includes:
10 μl of primer 5 ', 10 μl of primer 3', 10 μl of dNTP-MIX (2.5 mM each), 10 μl of 10x Pfx amplification buffer (Invitrogen), 2.5 μl of MgSO 4 (50 mM), 10 μl (2 ng) template DNA (pET23a :: cphA6308), 0.5 ul Platinum ® Pfx DNA polymerase (Invitrogen), ad 100 ul H 2 O bidist. PCR program: 1.) Denaturation: 2 min 94 ° C 2.) Denaturation: 15 s 94 ° C 3.) Annealing 30 s 55 ° C 4.) Elongation 3 min 68 ° C 5.) 32-fold repetition of steps 1) - 4.) 6.) final elongation 5 min 68 ° C

Das PCR-Produkt wurde mittels GeneClean Kit der Firma Qiagen (QIAquick Gel Extraktion Kit) nach beiliegender Gebrauchsanweisung gereinigt. Anschließend wurde das gereinigte PCR-Produkt mittels Restriktionsenzym XhoI (Fa. Fermentas) nach beiliegender Gebrachsanweisung für 12 h bei 37°C verdaut und das Enzym bei 80°C für 15 min inaktiviert. Für die Ligation wurde dieses Verdaute Fragment folgendermaßen in den durch XhoI verdaut und linearisierten Zielvektor pCOLADuet-1::MVA1-5 ligiert. Entsprechend der Gleichung von DUGAICZYK et al. (1975) kann die einzusetzende Konzentration des Vektors (j) im Ligationsansatz berechnet werden, bei der die theoretische Anfangsgeschwindigkeit von bimolekularer Verknüpfungsreaktion und intramolekularer Zyklisierung gleich groß ist. j (ng/ml) = 51,1 × Mr-0,5 × 1.000 Basierend auf dieser Konzentrationsberechnung wurde das zu ligierende DNA-Fragment mit dem 2–4fachen molaren Überschuss an vektorieller DNA ligiert. Der Ligationsansatz bestand aus den zu ligierenden DNA-Spezies und des mitgelieferten Ligase-Puffers in einer Endkonzentration von 1 ×. pro μg DNA wurde für die Ligation kohäsiver Enden 1 U eingesetzt. Die Reaktion erfolgte über Nacht bei einer Temperatur von 14,5°C in einem Peltier-Thermoblock (Firma HLC). Diese Temperatur stellt somit einen Kompromiss zwischen Stabilität und ausreichender Aktivität des Enzyms dar. Abschließend wurden der Ligationsansatz in E. coli TOP10 transformiert und die auf LB-Kanamycin Platten erhaltenen Klone überprüft (37°C Inkubation ÜN). Durch eine Plasmidisolation (Fast Plasmid Mini-Kit; Fa. Eppendorf) einiger Klone und einem XhoI-Verdau wurden vermeintlich positive Klone selektiert. Eine abschließende Sequenzierung mit dem pCOLADuet-1 spezifischen T7-Terminator Sequenzierprimer (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') bestätigte die erfolgreiche Ligation von cphA6308C595S. Das so erhaltene Plasmid wurde pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA bezeichnet und ist in 4 dargestellt.The PCR product was purified using the GeneClean kit from Qiagen (QIAquick Gel Extraction Kit) according to the enclosed instructions for use. Subsequently, the purified PCR product was digested by means of restriction enzyme XhoI (Fa. Fermentas) according to the instructions given in the instructions for 12 h at 37 ° C and the enzyme was inactivated at 80 ° C for 15 min. For ligation, this digested fragment was ligated into the XhoI digested and linearized target vector pCOLADuet-1 :: MVA1-5 as follows. According to the equation of DUGAICZYK et al. (1975) the concentration of the vector (j) to be used can be calculated in the ligation batch, in which the initial theoretical rate of bimolecular coupling reaction and intramolecular cyclization is the same. j (ng / ml) = 51.1 x Mr-0.5 x 1000 Based on this concentration calculation, the DNA fragment to be ligated was ligated with the 2-4-fold molar excess of vectorial DNA. The ligation mixture consisted of the DNA species to be ligated and the supplied ligase buffer in a final concentration of 1 ×. 1 ug DNA was used for the ligation of cohesive ends 1 U. The reaction was carried out overnight at a temperature of 14.5 ° C in a Peltier thermoblock (HLC). This temperature thus represents a compromise between stability and sufficient activity of the enzyme. Finally, the ligation mixture was transformed into E. coli TOP10 and the clones obtained on LB kanamycin plates were checked (37 ° C. incubation overnight). By means of a plasmid isolation (Fast Plasmid Mini-Kit, Eppendorf) of some clones and an XhoI digestion supposedly positive clones were selected. Final sequencing with the pCOLADuet-1 specific T7 terminator sequencing primer (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 ') confirmed the successful ligation of cphA6308C595S. The resulting plasmid was named pCOLADuet-1 :: MVA1-5 :: cphA and is available in 4 shown.

Transformation von pColaDuet-1::MVA1-5::cphA in E. coliTransformation of pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA in E. coli

Das Plasmid wurde in den Stamm E. coli HMS174 (DE3) transformiert. Dieser rekombinante Stamm war die Ausgangsbasis für den folgenden ispH knockout und wird im folgenden als „E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5::cphA” bezeichnet.The Plasmid was transformed into strain E. coli HMS174 (DE3). This recombinant strain was the starting point for the following ispH knockout and is hereinafter referred to as "E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA ".

Herstellung der ispH-Mutante von E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5::cphAPreparation of the ispH mutant of E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA

Es wurde analog der Herstellung der ispH-Mutante von E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5 verfahren.It was analogous to the production of the ispH mutant of E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5.

Der so generierte Stamm wird im Folgenden als „E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5::cphA” bezeichnet.Of the thus generated strain is hereinafter referred to as "E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA ".

Expression eines weiteren FremdgensExpression of another foreign gene

Die Expression des Fremdgens ist durch die Synthese von Cyanophycin festzustellen. Diese ist eindeutig an Hand der weißen Färbung von expremierenden Bakterien auszumachen. 5 zeigt weiße, opake Bakterienkolonien von E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5::cphA. Cyanophycin ist daher ein Beispiel für ein durch das Genprodukt eines Fremdgens synthetisierte Substanz.The expression of the foreign gene can be determined by the synthesis of cyanophycin. This is clearly indicated by the white color of expressing bacteria. 5 shows white, opaque bacterial colonies of E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA. Cyanophycin is therefore an example of a substance synthesized by the gene product of a foreign gene.

Vektorstabilität mit Expression eines weiteren FremdgensVector stability with expression another foreign gene

Die verwendeten rekombinanten Stämme von E. coli (E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5::cphA und E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5::cphA) wurden mit 1% einer 12stündigen Vorkultur (LB-Medium mit entspr. Antibiotika: Rifampizin für E. coli HMS174 (DE3) + Kanamycin für pColaDuet-1 und gegebenenfalls Ampicillin für genomisches Insertionsfragment) inokoliert und in einem 4fach Schikane Klett-Kolben (250 ml Gesamtvolumen mit 100 ml LB-Medium ohne Antibiotika) bei 37°C und 180 rpm kultiviert. Die Messung oder Optischen Dichte erfolgte aus dem Schikane-Klett-Kolben direkt mit einem Klett Summerson Colorimeter. Zur Bestimmung des Plasmidverlustes wurden die Zellen mit steriler Saline (NaCl 0,9% in H2O) einheitlich verdünnt und in gleichen Volumina auf LB und LB-Selektionsplatten (mit 50 μg Kanamycin) ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37°C für 16 h erfolgte die Auszählung der Kolonie-bildenden Einheiten (cfu) hinsichtlich der aufgetretenen Koloniezahlen.The recombinant strains of E. coli used (E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA and E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5: : cphA) were inoculated with 1% of a 12-hour pre-culture (LB medium with corresponding antibiotics: rifampicin for E. coli HMS174 (DE3) + kanamycin for pColaDuet-1 and optionally ampicillin for genomic insertion fragment) in a 4-fold beaker Klett flask (250 ml total volume with 100 ml LB medium without antibiotics) cultivated at 37 ° C and 180 rpm. The measurement or optical density was taken from the chicane Velcro piston directly with a Klett Summerson colorimeter. To determine the plasmid loss, the cells were diluted uniformly with sterile saline (NaCl 0.9% in H 2 O) and plated in equal volumes on LB and LB selection plates (containing 50 μg kanamycin). After incubation at 37 ° C for 16 h, the colony-forming units (cfu) were counted for colony counts.

Die hier angeführte Tabelle zeigt Mittelwerte der vergleichenden, quantitativen Bestimmung des Plasmidverlusts nach 70 h in LB-Medium ohne Antibiotika: Mittelwert cfu auf LB-Platten, 10–5 Verdünnung, Ohne Antibiotikum normiert auf 100 Mit Kanamycin PlasmidVerlust in % E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1::MVA1-5::cphA 100 64 36 E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT/Amp/FRT pColaDuet-1::MVA1-5::cphA 100 100 0 The table given here shows mean values of the comparative, quantitative determination of the plasmid loss after 70 h in LB medium without antibiotics: Mean cfu on LB plates, 10 -5 dilution, Normalized to 100 without antibiotic With kanamycin Plasmid loss in% E. coli HMS174 (DE3) pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA 100 64 36 E. coli HMS174 (DE3) ΔispH ΩFRT / Amp / FRT pColaDuet-1 :: MVA1-5 :: cphA 100 100 0

Hieraus geht hervor, dass über einen Zeitraum von 72 Stunden bis zu 35% Plasmidverlust ohne Einsatz des addiction-Systems auftreten.From this it turns out that over a period of 72 hours to to 35% plasmid loss without use of the addiction system occur.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • - US 2007166782 [0013] US 2007166782 [0013]
  • - DE 10031999 A [0043] - DE 10031999 A [0043]
  • - EP 0472869 A [0045] EP 0472869 A [0045]
  • - US 4601893 [0045] US 4601893 [0045]
  • - WO 96/15246 A [0045] WO 96/15246 A [0045]
  • - JP 10-229891 A [0045] JP 10-229891 A [0045]
  • - WO 2007101866 [0079] WO 2007101866 [0079]
  • - GB 1009370 A [0099] - GB 1009370 A [0099]
  • - US 601494 [0102] - US 601494 [0102]
  • - US 6136576 [0102] US 6136576 [0102]
  • - US 6803218 [0105] - US 6803218 [0105]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • - Urszula Zielenkiewicz and Piotr Cegowski, 2001. Mechanisms of plasmid stable maintenance with special focus an plasmid addiction systems. Acta Biochimica Polonica. 48, 1003–1023 [0003] - Urszula Zielenkiewicz and Piotr Cegowski, 2001. Mechanisms of plasmid stable maintenance with special focus on plasmid addiction systems. Acta Biochimica Polonica. 48, 1003-1023 [0003]
  • - Cranenburg et al. 2001, Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration [0004] Cranenburg et al. 2001, Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration [0004]
  • - Smith AS, Rawlings DE, 1997. The poison-antidote stability system of the broad-hostrange Thiobacillus ferrooxidans plasmid pTF-FC2. Mol Microbiol. Dec; 26(5): 961–70 [0004] Smith AS, Rawlings DE, 1997. The poison-antidote stability system of the broad-host range Thiobacillus ferrooxidans plasmid pTF-FC2. Mol Microbiol. Dec; 26 (5): 961-70 [0004]
  • - Gazit E, Sauer RT, 1999. The Doc toxin and Phd antidote Proteins of the bacteriophage P1 plasmid addiction system form a heterotrimeric complex. J Biol Chem. 1999 Jun 11; 274(24): 16813–8 [0005] - Gazit E, Sauer RT, 1999. The Doc toxin and Phd antidote Proteins of the bacteriophage P1 plasmid addiction system form a heterotrimeric complex. J Biol Chem. 1999 Jun 11; 274 (24): 16813-8 [0005]
  • - Application of a KDPG-aldolase gene-dependent addiction system for enhanced production of cyanophycin in Ralstonia eutropha strain H16.Metab Eng. 2006 Jan; 8(1): 66–78 [0006] - Application of a KDPG aldolase gene-dependent addiction system for enhanced production of cyanophycin in Ralstonia eutropha strain H16.Metab Eng. 2006 Jan; 8 (1): 66-78 [0006]
  • - KEGGG-Datenbank, Acta Biochim Pol. Isoprenoid biosynthesis via 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate/2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP/MEP) pathway. Wanke et al. 2001 [0008] - KEGGG database, Acta Biochim Pol. Isoprenoid biosynthesis via 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate / 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP / MEP) pathway. Wanke et al. 2001 [0008]
  • - Grochowski et al. Methanocaldococcus jannaschii uses a modified mevalonate pathway for biosynthesis of isopentenyl diphosphate J Bacteriol. 2006 May; 188(9): 3192–8 [0010] Grochowski et al. Methanocaldococcus jannaschii uses a modified mevalonate pathway for biosynthesis of isopentenyl diphosphate J Bacteriol. 2006 May; 188 (9): 3192-8 [0010]
  • - McAteer, S., A. Coulson, N. F. McLennan, M. Masters 2001. The lytB gene of Escherichia coli is essential and specifies a product needed for isoprenoid biosynthesis. J. Bacteriol. 183: 7403–7407 [0011] McAteer, S., A. Coulson, NF McLennan, M. Masters 2001. The lytB gene of Escherichia coli is essential and specifies a product needed for isoprenoid biosynthesis. J. Bacteriol. 183: 7403-7407 [0011]
  • - Franci X et al. 2000. Evidence of a Role for LytB in the Nonmevalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis. J. Bacteriol. 182: 5841–5848 [0011] - Franci X et al. 2000. Evidence of a Role for LytB in the Nonmevalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis. J. Bacteriol. 182: 5841-5848 [0011]
  • - Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182(19): 5624–5627 [0027] Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627 [0027]
  • - Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182(8): 2277–2284 [0027] - Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284 [0027]
  • - Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823) [0027] Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823) [0027]
  • - Takahashi et al. A 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Aug 18; 95(17): 9879–84 [0028] Takahashi et al. A 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 1998 Aug 18; 95 (17): 9879-84 [0028]
  • - Rohdich et al. Cytidine 5-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids: YgbP Protein of Escherichia coli catalyzes the formation of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11758–11763 [0029] - Rohdich et al. Cytidine 5-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids: YgbP protein of Escherichia coli catalyzes the formation of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11758-11763 [0029]
  • - Bernal et al. A spectrophotometric assay for the determination of 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase activity. Anal Biochem. 2005 May 15; 340(2): 245–51 [0030] Bernal et al. A spectrophotometric assay for the determination of 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase activity. Anal Biochem. 2005 May 15; 340 (2): 245-51 [0030]
  • - Herz et al. Biosynthesis of terpenoids: YgbB Protein converts 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphate to 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Mar 14; 97(6): 2486–90 [0031] - Herz et al. Biosynthesis of terpenoids: YgbB protein converts 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphate to 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate. Proc Natl Acad Sci USA 2000 Mar 14; 97 (6): 2486-90 [0031]
  • - Hecht et al. Studies an the nonmevalonate pathway to terpenes: the role of the GcpE (IspG) Protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18; 98(26): 14837–42 [0032] Hecht et al. Studies on the nonmevalonate pathway to terpenes: the role of the GcpE (IspG) protein. Proc Natl Acad Sci USA 2001 Dec 18; 98 (26): 14837-42 [0032]
  • - Altincicek et al. LytB Protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-Phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 2002 Dec 18; 532(3): 437–40 [0033] Altincicek et al. LytB protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 2002 Dec 18; 532 (3): 437-40 [0033]
  • - Sirinupong et al. Molecular cloning of a new cDNA and expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase gene from Hevea brasiliensis. Planta. 2005 Jun; 221(4): 502–12. Epub 2005 Mar 3 [0034] Sirinupong et al. Molecular cloning of a new cDNA and expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase gene from Hevea brasiliensis. Planta. 2005 Jun; 221 (4): 502-12. Epub 2005 Mar 3 [0034]
  • - Hedl et al. Enterococcus faecalis acetoacetyl-coenzyme A thiolase/3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a dual-function Protein of isopentenyl diphosphate biosynthesis. J Bacteriol. 2002 Apr; 184(8): 2116–22 [0035] - Hedl et al. Enterococcus faecalis acetoacetyl-coenzymes A thiolase / 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a dual-function protein of isopentenyl diphosphate biosynthesis. J Bacteriol. 2002 Apr; 184 (8): 2116-22 [0035]
  • - Hedl et al. Enterococcus faecalis mevalonate kinase. Protein Sci. 2004 Mar; 13(3): 687–93. Epub 2004 Feb 6 [0036] - Hedl et al. Enterococcus faecalis mevalonate kinase. Protein sci. 2004 Mar; 13 (3): 687-93. Epub 2004 Feb 6 [0036]
  • - Tzeng et al. The multiple activities of Polyphosphate kinase of Escherichia coli and their subunit structure determined by radiation target analysis. J Biol Chem. 2000 Feb 11; 275(6): 3977–83 [0037] - Tzeng et al. The multiple activities of polyphosphate kinase of Escherichia coli and their subunit structure determined by radiation target analysis. J Biol Chem. 2000 Feb 11; 275 (6): 3977-83 [0037]
  • - Lindberg et al. On the mechanism of formation of isopentenylpyrophosphate. Biochemistry 1 (1962), pp. 182–188 [0038] Lindberg et al. On the mechanism of formation of isopentenyl pyrophosphate. Biochemistry 1 (1962), pp. 182-188 [0038]
  • - Lange and Croteau Isopentenyl diphosphate biosynthesis via a mevalonate-independent pathway: Isopentenyl monophosphate kinase katalyzes the terminalenzymatic step (1999) [0039] - Lange and Croteau Isopentenyl diphosphate biosynthesis via a mevalonate-independent pathway: isopentenyl monophosphate kinase catalyzes the terminal enzymatic step (1999) [0039]
  • - Laupitz et al. Biochemical characterization of Bacillus subtilis type II isopentenyl diphosphate isomerase, and phylogenetic distribution of isoprenoid biosynthesis pathways. European Journal of Biochemistry (2004), 271(13), 2658–2669 [0040] - Laupitz et al. Biochemical characterization of Bacillus subtilis type II isopentenyl diphosphate isomerase, and phylogenetic distribution of isoprenoid biosynthesis pathways. European Journal of Biochemistry (2004), 271 (13), 2658-2669 [0040]
  • - Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) [0041] - Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) [0041]
  • - Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989 [0041] Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989 [0041]
  • - Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39 [0041] Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39 [0041]
  • - Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647 [0041] Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647 [0041]
  • - Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712–23 (2001) [0042] Hermann et al., Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001) [0042]
  • - Lohaus et al., Biospektrum 5 32–39 (1998) [0042] Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998) [0042]
  • - Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999) [0042] Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) [0042]
  • - Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001) [0042] Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) [0042]
  • - Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)) [0045] - Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)) [0045]
  • - Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)) [0045] - Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)) [0045]
  • - Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)) [0045] Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)). [0045]
  • - bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)) [0045] - in Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)) [0045]
  • - Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991) [0045] Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991) [0045]
  • - Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) [0045] - Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) [0045]
  • - LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)) [0045] - LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) [0045]
  • - Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993) [0045] Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993) [0045]
  • - Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) [0045] - Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) [0045]
  • - McAteer et al. (J Bacteriol. 2001 Dec; 183(24): 7403–7 [0047] McAteer et al. (J Bacteriol 2001 Dec; 183 (24): 7403-7 [0047]
  • - Zaratiequi et al. (Cell. 2007 Feb 23; 128(4): 763–76) [0047] - Zaratiequi et al. (Cell, 2007 Feb 23; 128 (4): 763-76) [0047]
  • - Scherr et al. (Cell Cycle. 2007 Feb 1; 6(4): 444–9) [0047] Scherr et al. (Cell Cycle, 2007 Feb 1; 6 (4): 444-9) [0047]
  • - Sahu et al. (Curr Pharm Biotechnol. 2007 Oct; 8(5): 291–304) [0047] Sahu et al. (Curr Pharm Biotechnol., 2007 Oct; 8 (5): 291-304) [0047]
  • - Lütke-Eversloh et al. [2000] in Nature Materials: Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli [0079] Lütke-Eversloh et al. [2000] in Nature Materials: Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli [0079]
  • - Liu und Steinbüchel 2000 in Applied and Environmental Microbiology: A Novel Genetically Engineered Pathway for Synthesis of Poly(Hydroxyalkanoic Acids) in Escherichia coli [0079] - Liu and Steinbüchel 2000 in Applied and Environmental Microbiology: A Novel Genetically Engineered Pathway for Synthesis of Poly (Hydroxyalkanoic Acids) in Escherichia coli [0079]
  • - A. Becker et al. [1998] [0079] - A. Becker et al. [1998] [0079]
  • - R. Kalscheuer und Steinbüchel, 2003 in J Biol Chem. [0079] R. Kalscheuer and Steinbüchel, 2003 in J Biol Chem. [0079]
  • - Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) [0099] - Chmiel ("Bioprocessing Technology 1. Introduction to Bioprocess Engineering" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) [0099]
  • - Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) [0099] - Storhas ("Bioreactors and Peripheral Facilities", Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994) [0099]
  • - ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) [0101] "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) [0101]
  • - Sambrook, J. et al. (1989), ”Molecular Cloning: a laboratory manual”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York [0116] Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: a laboratory manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York [0116]
  • - DUGAICZYK et al. (1975) [0131] DUGAICZYK et al. (1975) [0131]

Claims (19)

Eine gentechnisch veränderte Zelle, die mindestens eine geänderte Aktivität der im Wildtyp vorhandenen Enzyme aufweist, so dass diese Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp reduzierte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zelle mindestens eine gesteigerte, im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität aufweist, durch die diese Zelle eine erhöhte Menge an Isopentenyldiphosphat zu bilden vermag.A genetically engineered cell which has at least one altered activity of the enzymes present in the wild-type such that this cell is capable of producing a reduced amount of isopentenyl diphosphate compared to its wild-type, characterized in that said cell has at least one enhanced enzyme activity not present in the wild-type by which this cell is capable of forming an increased amount of isopentenyl diphosphate. Eine Zelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: Ein Enzym E1, welches die Umsetzung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat katalysiert, ein Enzym E2, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und Cytidintriphosphat zu 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert, ein Enzym E3, welches die Umsetzung von 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol und ATP zu 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert, ein Enzym E4, welches die Umsetzung von 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat katalysiert, ein Enzym E5, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat zu (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat katalysiert und ein Enzym E6, welches die Umsetzung von (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat zu IPP und/oder DMAPP katalysiert und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Ein Enzym E7, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A katalysiert, ein Enzym E8, welches die Umsetzung von 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A zu Mevalonat katalysiert, ein Enzym E9, welches die Umsetzung von Mevalonat zu Mevalonat-5-Phosphat katalysiert, ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert.A cell according to claim 1, characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising: an enzyme E 1 , which is the reaction of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate to 2-C-methyl D-erythritol-4-phosphate catalyzes an enzyme E 2 , which inhibits the conversion of 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate and cytidine triphosphate to 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C- Methyl-D-erythritol catalyzes an enzyme E 3 which inhibits the conversion of 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol and ATP to 2-phospho-4- (cytidine-5 ' Diphospho) 2-C-methyl-D-erythritol catalyzes an enzyme E 4 , which is the reaction of 2-phospho-4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol to 2 C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate catalyzes an enzyme E 5 , which is the reaction of 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate to (E) -4-hydroxy-3 Methyl but-2-enyl diphosphate and an enzyme E 6 , which is the reaction of (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldi catalyzes phosphate to IPP and / or DMAPP and the non-wild type enzyme activity is caused by at least one enzyme selected from the group comprising: An enzyme E 7 , which is the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A catalyzes an enzyme E 8 , which catalyzes the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A to mevalonate, an enzyme E 9 , which catalyzes the conversion of mevalonate to mevalonate-5-phosphate, an enzyme E 10 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate. Eine Zelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: Ein Enzym E7, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A katalysiert, ein Enzym E8, welches die Umsetzung von 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A zu Mevalonat katalysiert, ein Enzym E9, welches die Umsetzung von Mevalonat zu Mevalonat-5-Phosphat katalysiert, ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Ein Enzym E1, welches die Umsetzung von 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat katalysiert, ein Enzym E2, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und Cytidintriphosphat zu 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert, ein Enzym E3, welches die Umsetzung von 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol und ATP zu 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol katalysiert, ein Enzym E4, welches die Umsetzung von 2-Phospho-4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D- Erythritol zu 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat katalysiert, ein Enzym E5, welches die Umsetzung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat zu (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat katalysiert und ein Enzym E6, welches die Umsetzung von (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyldiphosphat zu IPP und/oder DMAPP katalysiertA cell according to claim 1, characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising: an enzyme E 7 which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A, an enzyme E 8 , which catalyzes the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A to mevalonate, an enzyme E 9 , which catalyzes the conversion of mevalonate to mevalonate-5-phosphate, an enzyme E 10 , which is the reaction of Mevalonate-5-phosphate catalyses mevalonate-5-diphosphate and an enzyme E 11 , which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate and the non-wild-type enzyme activity is caused by at least one enzyme selected from the group comprising: A Enzyme E 1 , which catalyzes the conversion of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate to 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, an enzyme E 2 , which is the reaction of 2-C-methyl D-erythritol-4- Phosphate and cytidine triphosphate catalyses 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol, an enzyme E 3 which catalyzes the conversion of 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C- Methyl-D-erythritol and ATP catalyze 2-phospho-4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol, an enzyme E 4 which catalyzes the conversion of 2-phospho-4 ( Cytidine 5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol catalyses 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate, an enzyme E 5 which inhibits the conversion of 2-C-methyl- Catalyzes D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate to give (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate and an enzyme E 6 , which catalyzes the reaction of (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-ene enyl diphosphate catalysed to IPP and / or DMAPP Eine Zelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: ein Enzym E12, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Isopentenylmonophosphat katalysiert und ein Enzym E13, welches die Umsetzung von Isopentenylmonophosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert, und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe umfassend: ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert.A cell according to claim 1, characterized in that at least one of the enzymes present in the wild-type is selected from the group comprising: an enzyme E 12 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to isopentenyl monophosphate and an enzyme E 13 , which catalyzes the reaction catalyzed by isopentenyl monophosphate to Isopentenyldiphosphat, and the non-wild type enzyme activity is caused by at least one enzyme out selects from the group comprising: an enzyme E 10 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate. Eine Zelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der im Wildtyp vorhandenen Enzyme ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: ein Enzym E10, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Mevalonat-5-Diphosphat katalysiert und ein Enzym E11, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Diphosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert, und die im Wildtyp nicht vorhandene Enzymaktivität hervorgerufen wird durch mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe umfassend: ein Enzym E12, welches die Umsetzung von Mevalonat-5-Phosphat zu Isopentenylmonophosphat katalysiert und ein Enzym E13, welches die Umsetzung von Isopentenylmonophosphat zu Isopentenyldiphosphat katalysiert.A cell according to claim 1, characterized in that at least one of the wild-type enzymes is selected from the group comprising: an enzyme E 10 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-diphosphate and an enzyme E 11 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-diphosphate to isopentenyl diphosphate, and the enzyme activity not present in the wild-type is caused by at least one enzyme selected from the group comprising: an enzyme E 12 which catalyzes the conversion of mevalonate-5-phosphate to isopentenyl monophosphate and an enzyme E 13 , which catalyzes the conversion of isopentenyl monophosphate to isopentenyl diphosphate. Eine Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass für mindestens eines der Enzyme E1 bis E13 zutrifft, dass E1 eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphate-Reductoisomerase (EC 1.1.1.267), E2 eine 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat-Cytidylyltransferase (EC 2.7.7.60), E3 eine 4-(Cytidin-5'-Diphospho)-2-C-Methyl-D-Erythritol-Kinase (EC 2.7.1.148), E4 eine 2-C-Methyl-D-Erythritol-2,4-Cyclodiphosphat-Synthase (EC 4.6.1.12), E5 eine 4-Hydroxy-3-Methylbut-2-en-1-yl-Diphosphat-Synthase (EC 1.17.4.3), E6 eine 4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reductase (EC 1.17.1.2), E7 eine Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Synthase (EC 2.3.3.1.10), E8 eine Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.1.1.34), E9 eine Mevalonat-Kinase (EC 2.7.1.36), E10 eine Phosphomevalonat-Kinase (EC 2.7.4.1), E11 eine Diphosphomevalonat-Decarboxylase (ECA cell according to any one of claims 2 to 5, characterized in that for at least one of the enzymes E 1 to E 13 is true that E 1 is a 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (EC 1.1.1.267) , E 2 is a 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase (EC 2.7.7.60), E 3 is a 4- (cytidine-5'-diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol Kinase (EC 2.7.1.148), E 4 a 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase (EC 4.6.1.12), E 5 a 4-hydroxy-3-methylbut-2-ene 1-yl diphosphate synthase (EC 1.17.4.3), E 6 a 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (EC 1.17.1.2), E 7 a hydroxymethylglutaryl-coenzyme A synthase (EC 2.3.3.1.10), E 8 a hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase (EC 1.1.1.34), E 9 a mevalonate kinase (EC 2.7.1.36), E 10 a phosphomevalonate kinase (EC 2.7.4.1), E 11 a diphosphomevalonate decarboxylase (EC 1.1.33), E12 eine Monophosphomevalonat-Decarboxylase und E13 eine Isopentenylphosphat-Kinase ist.1.1.33), E 12 is a monophosphome valonate decarboxylase and E 13 is an isopentenyl phosphate kinase. Eine Zelle gemäß Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Enzyme ist: E6 Genprodukt des ispH, E7 Genprodukt des mvaS aus Staphylococcus aureus, E8 Genprodukt des mvaA aus Lactobacillus lactis oder aus Staphylococcus aureus, E9 Genprodukt des mvaK1 aus Staphylococcus aureus, E10 Genprodukt des mvaK2 aus Staphylococcus aureus und E11 Genprodukt des mvaD aus Staphylococcus aureus.A cell according to claim 2 or 4, characterized in that at least one of the enzymes is: E 6 gene product of ispH, E 7 gene product of mvaS from Staphylococcus aureus, E 8 gene product of mvaA from Lactobacillus lactis or from Staphylococcus aureus, E 9 gene product of mvaK1 from Staphylococcus aureus, e 10 gene product of the mvaK2 from Staphylococcus aureus and e 11 gene product of the MVAD from Staphylococcus aureus. Eine Zelle gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um einen nur über den MEP-Weg zur IPP-Synthese befähigten Mikroorganismus handelt.A cell according to claim 1 or 2, characterized in that the cell is a only about the MEP pathway for IPP synthesis capable microorganism is. Eine Zelle gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Enzyme ist: E10 Genprodukt des mvaK1, E1 Genprodukt des ispC, E2 Genprodukt des ispD, E3 Genprodukt des ispE, E4 Genprodukt des ispF, E5 Genprodukt des ispG und E6 Genprodukt des ispH.A cell according to claim 3, characterized in that at least one of the enzymes is E 10 gene product of mvaK1, E 1 gene product of ispC, E 2 gene product of ispD, E 3 gene product of ispE, E 4 gene product of ispF, E 5 gene product of ispG and E 6 gene product of ispH. Eine Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 1, 3, 5 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um einen nur über den MVA-Weg zur IPP-Synthese befähigten Mikroorganismus handelt.A cell according to at least one of claims 1, 3, 5 and 9, characterized in that the cell is only accessible via the MVA pathway IPP synthesis capable of microorganism. Eine Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle mindestens eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp geänderte?) Aktivität eines Enzyms E14, welches die Umsetzung von Isopentenyldiphosphat zu Dimethylallyldiphosphat katalysiert, aufweist.A cell according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the cell has at least one changed compared to their wild type?) Activity of an enzyme E 14 , which catalyzes the conversion of isopentenyl diphosphate to dimethylallyl diphosphate. Eine Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle mindestens ein zusätzliches Fremdgen expremiert.A cell according to at least one of claims 1 to 11, characterized in that the Cell expressed at least one additional foreign gene. Ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte: A) Erniedrigung der Aktivität mindestens eines der bereits im Wildtyp vorhandenen Enzyme E1 bis E6 und B) Steigerung mindestens einer der nicht im Wildtyp vorhandenen Enyzmaktivitäten von E7 bis E11 A method for producing a genetically modified cell comprising the method steps: A) lowering the activity of at least one of the enzymes E 1 to E 6 already present in the wild-type and B) increasing at least one of the non-wild-type enzyme activities of E 7 to E 11 Ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte: A) Erniedrigung der Aktivität mindestens eines der bereits im Wildtyp vorhandenen Enzyme E7 bis E11. und B) Steigerung mindestens einer der nicht im Wildtyp vorhandenen Enzymaktivitäten von E1 bis E6 A method for producing a genetically modified cell comprising the method steps: A) lowering the activity of at least one of the enzymes E 7 to E 11 already present in the wild-type. and B) increasing at least one of the non-wild-type enzyme activities of E 1 to E 6 Eine Zelle, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14.A cell, obtainable by a process according to one of claims 13 or 14. Eine isolierte Nukleinsäure pCOLADuet-1::MVA1-5 mit der Sequenz nach SEQ ID NO: 3.An isolated nucleic acid pCOLADuet-1 :: MVA1-5 with the sequence according to SEQ ID NO: 3. Verfahren zur Herstellung von Produkten umfassend den Verfahrensschritt des in Kontakt Bringens einer Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 und 15 mit einem Nährmedium beinhaltend eine Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, unter denen Produkt gebildet wird, sowie gegebenenfalls Aufreinigung des Produktes aus der Kultur.Process for the preparation of products comprising the step of contacting a cell according to at least one of claims 1 to 12 and 15 with a nutrient medium containing a carbon source under conditions where Product is formed, and optionally purification of the product from the culture. Produkt erhalten nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17.Product obtained by a method according to claim 17th
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111410A (en) * 2018-03-14 2020-12-22 扬州大学 Preparation method of dibenzoxepin compound

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US601494A (en) 1898-03-29 Spar for vessels
GB1009370A (en) 1962-12-18 1965-11-10 Ajinomoto I I A process for the production of 1-glutamic acid by fermentation
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
EP0472869A2 (en) 1990-08-30 1992-03-04 Degussa Ag Plasmids of corynebacterium glutamicum and derived plasmid vectors
WO1996015246A1 (en) 1994-11-11 1996-05-23 Forschungszentrum Jülich GmbH Dna which regulates gene expression in coryne-form bacteria
JPH10229891A (en) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd Production of malonic acid derivative
US6136576A (en) 1996-11-13 2000-10-24 Genencor International, Inc. Method for the recombinant production of 1,3-propanediol
DE10031999A1 (en) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Process for the fermentative production of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
US6803218B1 (en) 1999-09-24 2004-10-12 Genencor Intl., Inc. Enzymes which dehydrate glycerol
US20070166782A1 (en) 2001-12-06 2007-07-19 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
WO2007101866A2 (en) 2006-03-08 2007-09-13 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Micro-organism and method for producing 2-methylcitric acid

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007093962A2 (en) * 2006-02-14 2007-08-23 Firmenich Sa Method for producing terpenes and mep-transformed microorganisms therefore

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US601494A (en) 1898-03-29 Spar for vessels
GB1009370A (en) 1962-12-18 1965-11-10 Ajinomoto I I A process for the production of 1-glutamic acid by fermentation
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
EP0472869A2 (en) 1990-08-30 1992-03-04 Degussa Ag Plasmids of corynebacterium glutamicum and derived plasmid vectors
WO1996015246A1 (en) 1994-11-11 1996-05-23 Forschungszentrum Jülich GmbH Dna which regulates gene expression in coryne-form bacteria
US6136576A (en) 1996-11-13 2000-10-24 Genencor International, Inc. Method for the recombinant production of 1,3-propanediol
JPH10229891A (en) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd Production of malonic acid derivative
DE10031999A1 (en) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Process for the fermentative production of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
US6803218B1 (en) 1999-09-24 2004-10-12 Genencor Intl., Inc. Enzymes which dehydrate glycerol
US20070166782A1 (en) 2001-12-06 2007-07-19 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
WO2007101866A2 (en) 2006-03-08 2007-09-13 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Micro-organism and method for producing 2-methylcitric acid

Non-Patent Citations (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)
A. Becker et al. [1998]
Altincicek et al. LytB Protein catalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-Phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis. FEBS Lett. 2002 Dec 18; 532(3): 437-40
Application of a KDPG-aldolase gene-dependent addiction system for enhanced production of cyanophycin in Ralstonia eutropha strain H16.Metab Eng. 2006 Jan; 8(1): 66-78
bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))
Bernal et al. A spectrophotometric assay for the determination of 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase activity. Anal Biochem. 2005 May 15; 340(2): 245-51
Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
Cranenburg et al. 2001, Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration
Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182(19): 5624-5627
DUGAICZYK et al. (1975)
Franci X et al. 2000. Evidence of a Role for LytB in the Nonmevalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis. J. Bacteriol. 182: 5841-5848
Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823)
Gazit E, Sauer RT, 1999. The Doc toxin and Phd antidote Proteins of the bacteriophage P1 plasmid addiction system form a heterotrimeric complex. J Biol Chem. 1999 Jun 11; 274(24): 16813-8
Grochowski et al. Methanocaldococcus jannaschii uses a modified mevalonate pathway for biosynthesis of isopentenyl diphosphate J Bacteriol. 2006 May; 188(9): 3192-8
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))
Hecht et al. Studies an the nonmevalonate pathway to terpenes: the role of the GcpE (IspG) Protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18; 98(26): 14837-42
Hedl et al. Enterococcus faecalis acetoacetyl-coenzyme A thiolase/3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a dual-function Protein of isopentenyl diphosphate biosynthesis. J Bacteriol. 2002 Apr; 184(8): 2116-22
Hedl et al. Enterococcus faecalis mevalonate kinase. Protein Sci. 2004 Mar; 13(3): 687-93. Epub 2004 Feb 6
Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)
Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001)
Herz et al. Biosynthesis of terpenoids: YgbB Protein converts 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphate to 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Mar 14; 97(6): 2486-90
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))
KEGGG-Datenbank, Acta Biochim Pol. Isoprenoid biosynthesis via 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate/2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP/MEP) pathway. Wanke et al. 2001
LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))
Lange and Croteau Isopentenyl diphosphate biosynthesis via a mevalonate-independent pathway: Isopentenyl monophosphate kinase katalyzes the terminalenzymatic step (1999)
Laupitz et al. Biochemical characterization of Bacillus subtilis type II isopentenyl diphosphate isomerase, and phylogenetic distribution of isoprenoid biosynthesis pathways. European Journal of Biochemistry (2004), 271(13), 2658-2669
Lindberg et al. On the mechanism of formation of isopentenylpyrophosphate. Biochemistry 1 (1962), pp. 182-188
Liu und Steinbüchel 2000 in Applied and Environmental Microbiology: A Novel Genetically Engineered Pathway for Synthesis of Poly(Hydroxyalkanoic Acids) in Escherichia coli
Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998)
Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39
Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647
Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)
Lütke-Eversloh et al. [2000] in Nature Materials: Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli
Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))
McAteer et al. (J Bacteriol. 2001 Dec; 183(24): 7403-7
McAteer, S., A. Coulson, N. F. McLennan, M. Masters 2001. The lytB gene of Escherichia coli is essential and specifies a product needed for isoprenoid biosynthesis. J. Bacteriol. 183: 7403-7407
R. Kalscheuer und Steinbüchel, 2003 in J Biol Chem.
Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182(8): 2277-2284
Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))
Rohdich et al. Cytidine 5-triphosphate-dependent biosynthesis of isoprenoids: YgbP Protein of Escherichia coli catalyzes the formation of 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11758-11763
Sahu et al. (Curr Pharm Biotechnol. 2007 Oct; 8(5): 291-304)
Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989
Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: a laboratory manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
Scherr et al. (Cell Cycle. 2007 Feb 1; 6(4): 444-9)
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)
Sirinupong et al. Molecular cloning of a new cDNA and expression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase gene from Hevea brasiliensis. Planta. 2005 Jun; 221(4): 502-12. Epub 2005 Mar 3
Smith AS, Rawlings DE, 1997. The poison-antidote stability system of the broad-hostrange Thiobacillus ferrooxidans plasmid pTF-FC2. Mol Microbiol. Dec; 26(5): 961-70
Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)
Takahashi et al. A 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Aug 18; 95(17): 9879-84
Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))
Tzeng et al. The multiple activities of Polyphosphate kinase of Escherichia coli and their subunit structure determined by radiation target analysis. J Biol Chem. 2000 Feb 11; 275(6): 3977-83
Urszula Zielenkiewicz and Piotr Cegowski, 2001. Mechanisms of plasmid stable maintenance with special focus an plasmid addiction systems. Acta Biochimica Polonica. 48, 1003-1023
Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)
Zaratiequi et al. (Cell. 2007 Feb 23; 128(4): 763-76)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111410A (en) * 2018-03-14 2020-12-22 扬州大学 Preparation method of dibenzoxepin compound
CN112111410B (en) * 2018-03-14 2022-06-14 扬州大学 Preparation method of dibenzooxepinone compound

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