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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches System zum Aufbau
und zur anschließenden Untersuchung von komplexen Zellanordnungen sowie
ein entsprechendes Verfahren.
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In
vielen Bereichen der wissenschaftlichen Forschung sowie der Diagnostik,
sei es im Forschungslabor oder im Alltag eines mit Routineuntersuchungen
befassten Labors, besteht Bedarf an komplexen Zellanordnungen, die
unter möglichst physiologischen Bedingungen, also beispielsweise
in der anatomisch korrekten Anordnung der einzelnen Zelltypen zueinander
vorliegen und/oder physiologisch funktionell perfundiert werden
können.
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Ein
Anwendungsbeispiel für derartige komplexe Zellanordnungen
ist die Bestimmung der Toxizität und des Metabolismus von
Medikamenten in der pharmazeutischen Industrie.
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Gegenwärtig
wird die Toxizität von Medikamenten anhand von 2D-Zellkulturen
in vitro bestimmt, was jedoch nur eine geringe Vorhersagekraft für
die Wirkung der Medikamente in vivo bietet. Ein Grund hierfür
ist die Tatsache, dass die zur Zeit verfügbaren komplexen
Zellanordnungen, die in vitro zu entsprechenden Untersuchungen herangezogen werden
können, aufgrund ihrer Struktur und Anordnung nicht die
gleichen Eigenschaften aufweisen wie entsprechende Zell- bzw. Gewebestrukturen
in vivo.
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Daraus
resultiert nur eine begrenzte Aussagekraft der mit den bekannten
Zellkulturen durchgeführten Versuche in Bezug auf das Verhalten
(Toxizität, Metabolismus, Wirkmechanismen) in vivo, so dass
beispielsweise Nebenwirkungen von Medikamenten oft erst in klinischen
Studien entdeckt werden, wenn das Präparat Patienten verabreicht
wird und hohe Ausgaben für Forschung und Entwicklung bereits
getätigt wurden.
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Ein
anderer Ansatz für die Bestimmung der Toxizität
von Medikamenten sind Tierversuche, die jedoch neben ihrer nur bedingt
auf den Menschen übertragbaren Aussagekraft auch aus ethischen Gründen
immer weiter in den Hintergrund treten.
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Ein
weiterer Ansatz besteht darin, die Wirkung von Medikamenten auf
vereinzelte Zellen zu untersuchen, wobei wie bei den oben erwähnten 2D-Zellkulturen
auch hier die Vorhersagekraft begrenzt ist, da sich einzelne Zellen
oder zweidimensionale Zellanordnungen in wesentlichen Funktionen von
denen des dreidimensionalen ”natürlichen” Zellverbundes
unterscheiden.
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Daher
besteht ein Bedarf an komplexen, organotypischen Zellkultursystemen,
die aus „natürlichen” Zellen bestehen,
die in Umgebungen wachsen, die eine Differenzierung über
einen entsprechend langen Zeitraum sowie eine zur in vivo-Situation
vergleichbare Funktion ermöglichen.
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Von
besonderem Interesse ist dabei zum einen eine organotypische Leberzellen-Kokultur,
mit der Medikamente auf Toxizität und Metabolisierung getestet
werden sollen. Die Leber dient unter anderem dem Abbau und der Ausscheidung
von Stoffwechselprodukten, Medikamenten und Giftstoffen, die über
das Blutkreislaufsystem in die Leber gelangen. Diese Substanzen
werden von den Hepatozyten metabolisiert und über die Gallenflüssigkeit
abtransportiert. Die von der Leber produzierte Gallenflüssigkeit
gelangt über das Gallengangsystem in den Darm und wird
auf diese Wiese ausgeschieden. Für eine organotypische
Leberzellkultur für die Medikamententestung ist es wichtig,
dass die Hepatocyten nach außen von Endothelzellen besetzt
werden, wobei die Perfusion der komplexen Zellkultur von der Seite
der Endothelzellen her erfolgt. Die Kokultur der Hepatozyten mit
Endothelzellen und gegebenenfalls Sternzellen gewährleistet
die gewebetypische Differenzierung der Hepatozyten und damit verbundenen
Expression von Genen, die zur Metabolisierung der genannten Stoffe
erforderlich sind.
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Weiter
besteht ein Bedarf an einer organotypischen Gewebestruktur, wie
sie beispielsweise im Darm zu finden ist. Auch hier ist es für
eine physiologisch funktionelle Perfusion erforderlich, dass zwischen ”innen” und ”außen” unterschieden
wird. Im Darm werden durch den Verzehr aufgenommene Stoffe enzymatisch
gespalten und über das Darmepithel in den Blutkreislauf
transportiert. Das Darmepithel besteht aus einer einschichtigen
Epithelschicht, die dem Darmlumen zugewendet ist, und einer darunterliegenden
Schicht von Mesenchymzellen, die die Differenzierung und Funktion
der Epithelzellen aufrecht erhält. An einem solchen in
vitro hergestellten Zellverbund, könnten Untersuchungen
zur Aufnahme von Medikamenten bei oraler Verabreichung durchgeführt
werden.
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Ein
weiteres Anwendungsgebiet ist die sogenannte Blut-Hirn Schranke,
die den Übertritt von Substanzen aus dem Blut in das Gehirn
kontrolliert und dafür sorgt, dass die chemische Zusammensetzung der
Intrazellularflüssigkeiten des Gehirns weitgehend konstant
bleibt, was für eine präzise Signalübertragung
zwischen den Nervenzellen des Zentralnervensystems notwendig ist.
Um Blutgefäße herum wird die Blut-Hirn-Schranke
durch Endothelzellen und Astrocyten gebildet. Sie sorgen über
aktive Transportsysteme für den Transfer von Nährstoffen
und Sauerstoff bzw. Metaboliten. Im Zusammenhang mit der Entwicklung
von Wirkstoffen sind Kenntnisse über die Durchlässigkeit
der Blut-Hirn-Schranke für diese Wirkstoffe und damit ihre
Verfügbarkeit in Bereichen des Nervensystems von besonderem
Interesse.
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Aus
der Veröffentlichung "Rapid Heterogenous
Liver-Cell On-Chip Patterning via the Enhanced Field-induced Dielectrophoresis
Trap" von Ho et al., Lab Chip, 2006, 6, 724–734,
ist ein mikrofluidischer Chip bekannt, auf dem eine planare Struktur
von Leberzellen, d. h. eine 2D-Anordnung, etablierbar ist. Durch
die geometrische Struktur und Anordnung der Elektroden wird ein
inhomogenes elektrisches Feld mit definierten Gradienten erzeugt,
das in einer Kammer randomisiert vorliegende Zellen von zwei Zelltypen
zu einem gewünschten planaren Gewebemuster zusammenführt.
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Die
Autoren erwähnen, dass mikrofluidische Musterbildung mit
Mikrokanälen und laminarem Fluss für Leberzellen
nicht anwendbar ist, da dieses Verfahren in seiner Wirkung zu grob
strukturiert ist. Ferner wird positive Dielektrophorese als Möglichkeit beschrieben,
um Zellen aktiv zu manipulieren. Die Autoren erwähnen jedoch,
dass dieses Verfahren noch nicht erfolgreich eingesetzt wurde, um
komplexe Zellanordnungen aufzubauen.
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Vor
diesem Hintergrund schlagen die Autoren vor, die Mikrofluidik zusammen
mit einem räumlich strukturierten elektrischen Feld einzusetzen,
um gewünschte Gewe bemuster herzustellen. Der Chip enthält
dazu eine Zellstrukturkammer, der über Mikrokanäle
kontinuierlich Zellen zugeführt werden, die über
das in der Kammer ausgebildete elektrische Feld zu der komplexen
Struktur zusammengelagert werden. Danach wird das elektrische Feld
ausgeschaltet und reines Medium wird durch bzw. in den Chip gepumpt.
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Die
mit der bekannten Vorrichtung erzeugbare Zellanordnung ist jedoch
planar, so dass sich für den Einsatz in der pharmakologischen
Forschung die oben beschriebenen Nachteile ergeben. Eine physiologisch
funktionell perfundierbare, komplexe Zellanordnung, die als organotypisches
Gewebe beispielsweise für Toxizitätsmessungen
eingesetzt werden kann, lässt sich mit der Vorrichtung
und dem Verfahren von Ho et al. nicht erzeugen.
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Vor
diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe
zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren der eingangs genannten
Art bereitzustellen, mit der bzw. dem organotypische Gewebe aufgebaut
werden können, die dann perfundiert und unter vorzugsweise
physiologischen Bedingungen untersucht werden können.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein mikrofluidisches System zum Aufbau und zur anschließenden
Kultivierung von komplexen Zellanordnungen, mit
- – einer
dreidimensionalen Mikrostruktur, in der die Zellanordnung aufgebaut
und kultiviert wird,
- – zumindest zwei in der Mikrostruktur verlaufende, eine
Flussrichtung definierende Mikrokanalabschnitte, über die
die Mikrostruktur von außen mit einem Medium perfundierbar
ist, wobei die Mikrokanalabschnitte zumindest bereichsweise annähernd
parallel oder äquidistant zueinander verlaufen,
- – einer die zumindest beiden Mikrokanalabschnitte trennenden
Wandstruktur, in der zumindest eine die zumindest zwei Mikrokanalabschnitte verbindende Öffnung
vorgesehen ist, und
- – einer in oder an der Mikrostruktur vorgesehenen Elektrodenanordnung,
um im Bereich der zumindest einen Öffnung ein inhomogenes
elektrisches Feld zu erzeugen.
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Ferner
wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst
durch ein Verfahren zum Aufbau und Kultivieren von komplexen Zellanordnungen,
bei dem
- – in dem zuvor beschriebenem
mikrofluidischem System zunächst die komplexe Zellanordnung aufgebaut
wird, indem
- – der Mikrostruktur Medium mit Zellen zum Aufbau der
Zellanordnung zugeführt wird, und
- – in der Mikrostruktur ein durch die Mikrostruktur bestimmtes
inhomogenes elektrisches Feld erzeugt wird, das den Aufbau einer
Zellanordnung aus den zugeführten Zellen bewirkt,
- – und anschließend die Zellanordnung in der
dreidimensionalen Mikrostruktur kultiviert wird, indem sie mit Medium
perfundiert wird.
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Schließlich
betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Untersuchung
von komplexen Zellanordnungen, bei dem
- – in
dem neuen mikrofluidischem System eine Zellanordnung gemäß dem
neuen Verfahren aufgebaut und kultiviert wird, und
- – die Untersuchung des Stoffwechsels oder gerichteten
Transports von zugeführten Stoffen an einer so etablierten
Zellanordnung anhand von abgeführten Stoffwechselprodukten
und/oder über mit dem Medium zugeführte Marker
erfolgt, die im Zusammenwirken mit der Zellanordnung ein messbares
Signal erzeugen.
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Die
der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen
gelöst.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nämlich erkannt,
dass es bei einer entsprechenden Auslegung der Kanalstruktur und
Anwendung der Prinzipien der Dielektrophorese möglich ist,
komplexe organotypische Zellanordnungen zu assemblieren.
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Die
Erfindung basiert dabei einerseits auf der Positionierung von Zellen
mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte. Da diese Kräfte
in Richtung maximaler Feldstärke gerichtet sind, kann durch
ein geeignetes inhomogenes Feld die Form und Position des entstehenden
Mikrogewebes vordefiniert werden.
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Die
Erfinder machen sich dabei eine spezielle Kanalstruktur zunutze,
durch die der Ort maximaler Feldstärke definiert wird.
Dazu sind in der Mikrostruktur zumindest zwei Mikrokanalabschnitte
vorgesehen, die durch eine Wandstruktur voneinander getrennt sind,
in der zumindest eine Öffnung vorgesehen ist. Die Mikrokanalabschnitte
verlaufen im Bereich der Wandstruktur dabei entweder gerade und annähernd
parallel zueinander, wobei auch gebogene oder gekrümmte
Mikrokanalabschnitte möglich sind, sofern sie bereichsweise äquidistant
zueinander verlaufen.
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Die
Erfinder konnten in ersten Versuchen zeigen, dass es mit der erfindungsgemäßen
Mikrostruktur möglich ist, Leber-ähnliche oder
membranartige Zellanordnungen aufzubauen, die unter physiologischen
Bedingungen kultiviert und untersucht werden können.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung besteht dabei darin, die Inhomogenität
der elektrischen Felder durch die Mikrostruktur vorzugeben und durch
die sich aufbauende Zellanordnung selbst zu beeinflussen. Die Akkumulation
der Zellen am Ort der höchsten Feldstärke erhöht
in diesem Bereich nämlich die elektrische Impedanz, so
dass in der Umgebung dieses Aggregates die Feldstärke abnimmt
und dadurch eine geringere Tendenz für weitere Anlagerung
von Zellen besteht. Die Assemblierung von Zellen wird also durch
diese Rückkopplung geregelt.
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Die
Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, dass durch zwei abschnittsweise
annähernd parallel oder äquidistant verlaufende
Mikrokanalabschnitte, die durch eine Wandstruktur mit zumindest einer Öffnung
voneinander getrennt sind, ein definiert inhomogenes elektrisches
Feld aufgebaut werden kann, dessen höchste Feldstärke
im Bereich der Öffnung in der Wandstruktur liegt, und das
für die Assemblierung komplexer Zellanordnungen geeignet ist.
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Weil
das elektrische Feld im Bereich der Öffnungen seine höchste
Feldstärke aufweist, werden die durch beide Mikrokanäle
zugeführten Zellen im Bereich dieser Öffnungen
aufkonzentriert und dort assembliert. Aufgrund dieser Feldstruktur
können die Zellen dabei nicht von dem einen Mikrokanal
in den anderen gelangen.
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Schließlich
bietet das neue mikrofluidische System die Möglichkeit,
die etablierte komplexe Zellanordnung optisch und/oder biochemisch
zu analysieren.
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Nach
dem Aufbau der komplexen Zellanordnung in der Mikrostruktur kann
das inhomogene elektrische Feld abgeschaltet werden, es kann aber
auch unverändert oder mit veränderten Feldstärken und/oder
Frequenzen weiterhin angelegt bleiben.
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Dabei
ist es bevorzugt, wenn die Mikrokanalabschnitte entweder jeweils
Teil eines gesonderten Mikrokanals sind, der durch die Mikrostruktur
verläuft, oder vor und hinter der Wandstruktur in einen gemeinsamen
Mikrokanal übergehen.
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Wenn
ein gemeinsamer Mikrokanal vorgesehen ist, werden beide Mikrokanalabschnitte
von demselben Medium durchströmt. Hier ist von Vorteil,
dass bspw. zum Aufbau einer Leberstruktur Zellen desselben Zelltyps
von beiden Mikrokanalabschnitten aus in den Bereich der Öffnung(en)
wandern und dort assembliert werden. Nachdem so eine innere Zellanordnung
aus Zellen eines ersten Zelltyps aufgebaut wurde, können
mit dem Medium Zellen eines zweiten Zelltyps zugeführt
werden, die sich von beiden Mikrokanalabschnitten aus an der inneren
Zellanordnung anlagern und eine äußere Zellanordnung
bilden. Danach können Zellen eines dritten Zelltyps zugeführt werden,
die eine zweite äußere Zellanordnung bilden, und
so weiter.
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Es
versteht sich, dass zum Aufbau der inneren und jeder sich außen
anschließenden äußeren Zellanordnung
auch jeweils Gemische aus verschiedenen Zelltypen zugeführt
werden können.
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Sind
gesonderte Mikrokanäle vorgesehen, so kann auf beiden Seiten
der Wandstruktur unterschiedliches Medium zugeführt werden.
Hier ist von Vorteil, dass bspw. zum Aufbau einer schichtartigen Zellanordnung
zeitgleich auf den voneinander abgelegenen Seiten der Öffnung(en)
Zellen unterschiedlicher Zelltypen zugeführt und abgelagert
werden können, die auf ihrer jeweiligen Seite dann eigene
Zellanordnungen aufbauen, die jeweils aus Zellen eines oder mehrerer
Zelltypen bestehen können.
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Ferner
ist von Vorteil, dass über einen der gesonderten Mikrokanäle
bspw. Medium mit Nährstoffen und ggf. Testsubstanzen zugeführt
werden kann, während durch den anderen Mikrokanal Stoffwechselprodukte
abgeführt und einer Analyse zugeleitet werden können.
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Bei
dem neuen mikrofluidischen System ist es dabei einerseits bevorzugt,
wenn die zumindest eine Öffnung einen sich in Flussrichtung
der beiden Mikrokanalabschnitte erstreckenden Spalt aufweist, wobei
vorzugsweise in Flussrichtung mehrere Spalte hintereinander angeordnet
sind.
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Andererseits
ist es bevorzugt, wenn mehrere Öffnungen vorgesehen sind,
die in Flussrichtung der beiden Mikrokanalabschnitte sowie quer
zur Flussrichtung in der Wandstruktur verteilt angeordnet sind.
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Wenn
die Öffnung in Form eines oder mehrerer sich in Flussrichtung
der Mikrokanäle bzw. Mikrokanalabschnitte erstreckender
Spalte ausgebildet ist, lässt sich beispielsweise eine
dreidimensionale Leberstruktur aufbauen. Wenn jedoch viele porenartige Öffnungen
gleichmäßig oder ungleichmäßig über
die Wandstruktur verteilt angeordnet sind, so kann sich eine schichtartige
Zellanordnung ausbilden.
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Weiter
ist es bevorzugt, wenn die Elektrodenanordnung zumindest eine in
dem ersten Mikrokanalabschnitt und zumindest eine weitere, in dem zweiten
Mikrokanalabschnitt vorgesehene Kanal-Elektrode aufweist, wobei
die beiden Kanal-Elektroden in der Nähe der zumindest einen Öffnung
vorgesehen sind, wobei vorzugsweise in jedem Mikrokanalabschnitt
zumindest eine Kanal-Elektrode an einer der Wandstruktur gegenüberliegenden
Wand angeordnet ist, weiter vorzugsweise in jedem Mikrokanalabschnitt
zumindest eine Kanal-Elektrode an einer an die Wandstruktur angrenzenden
Wand angeordnet ist.
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In
Abhängigkeit von der zu etablierenden Zellanordnung und
unter Abstimmung auf die Formgebung der Öffnung(en) kann
so das für den jeweiligen Anwendungsfall optimale inhomogene
Feld erzeugt werden, durch das Zellen aus den Mikrokanalabschnitten
in die Öffnung(en) transportiert und dort assembliert werden.
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Schließlich
ist es bevorzugt, wenn die Wandstruktur zwei mit ihrer Stirnfläche
aufeinander zu weisende Stege aufweist, die zwischen sich zumindest einen
Spalt definieren, wobei vorzugsweise zumindest einer der beiden
Stege im Querschnitt rechteckförmig, trapezförmig,
dreieckförmig oder ballig ausgebildet ist und/oder zumindest
einer der beiden Stege auf seiner Stirnfläche einen in
Flussrichtung verlaufenden Grat aufweist.
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Hier
ist von Vorteil, dass die Form des inhomogenen elektrischen Feldes
durch die sich aus der Stegform ergebende Form des Spaltes mit bestimmt wird.
Der Bereich maximaler Feldstärke kann so für den
Anwendungsfall optimal eingestellt werden.
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Ferner
ist es bevorzugt, wenn die Elektrodenanordnung zumindest zwei an
den Stegen vorgesehene Steg-Elektroden aufweist, die vorzugsweise in
Flussrichtung gegenüberliegend angeordnet und/oder zumindest
auf der Stirnfläche eines der beiden Stege angeordnet sind.
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Hier
ist von Vorteil, dass auf oder an den Stegen Zellen aufkonzentriert
werden, die zwischen den Steg-Elektroden bspw. wie eine Perlenschnur
aufgereiht werden.
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Dann
ist es bevorzugt, wenn zwischen den zumindest zwei Mikrokanalabschnitten
zumindest ein weiterer Mikrokanal verläuft, der in fluidischer
Verbindung zu der zumindest einen Öffnung steht.
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Hier
ist von Vorteil, dass aus der Öffnung Stoffwechselprodukte
abtransportiert werden können. Bei einer Leberstruktur
steht der weitere Mikrokanal dabei nur mit den Hepatocyten in Verbindung. In
einer dem Lebersinusoid ähnlichen Gewebestruktur verbinden
sich nämlich die Gallenkanälchen der einzelnen
Hepatozyten zu einem gemeinsamen Gallenkanal mit einer zur (äußeren)
Perfusionrichtung entlang der Endothelzellen parallelen Achse.
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Der
weitere Mikrokanal kann dabei entweder „durch die Öffnung” hindurch
verlaufen, oder nur einseitig mit der Öffnung in Verbindung
stehen. Im Falle einer dem Lebersinusoid ähnlichen Gewebestruktur ist
es bevorzugt, wenn der weitere Mikrokanal als Gallenkanal nur einseitig
mit der Öffnung in Verbindung steht, um die Galle „physiologisch”,
also entgegen der Flussrichtung des Mediums in den beiden Mikrokanalabschnitten,
abzuführen.
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Das
neue mikrofluidisches System ist vorzugsweise mit Anschlüssen
zur fluidischen Steuerung versehen.
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Hier
ist von Vorteil, dass der Fluss durch die beiden Mikrokanalabschnitte
so gesteuert werden kann, dass keine Querströmung durch
die Öffnung(en) hindurch erzwungen wird. Dies kann beispielsweise
dadurch erfolgen, dass die Zuflussraten für beide Mikrokanalabschnitte
sowie die Abflussrate für einen der beiden Mikrokanalabschnitte
gesteuert wird, wodurch sich zwangsläufig die Abflussrate
in dem anderen Mikrokanalabschnitt ergibt. Bei entsprechender Einstellung
dieser Flussraten ist eine Querströmung durch die Öffnung(en)
in der Wandstruktur ausgeschlossen.
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Ferner
ist es bevorzugt, wenn die Mikrostruktur in unterschiedlichen Bereichen
mit unterschiedlichen selektiven Beschichtungen versehen ist.
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Hier
ist von Vorteil, dass die Besiedelung bestimmter Bereiche der Mikrostruktur
durch eine adhäsive Beschichtung unterstützt oder
durch eine non-adhäsive Beschichtung – z. B. in
den Kanalabschnitten – vermieden werden kann. Ferner kann eine
Beschichtung mit Extrazellulärmatrix vorgesehen sein, um
Zellwachstum und -differenzierung zu unterstützen. Weiterhin
kann nach der Assemblierung einer ersten Zellsorte ein Medium mit
Zell-Zell Interaktion vermittelnden (Extrazellulärmatrix-)Molekülen
eingespült werden, um einen funktionellen Kontakt zu Zellen
eines weiteren Zelltyps herzustellen, die in einem weiteren, darauf
folgenden Schritt in das Mikrosystem eingebracht werden.
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Allgemein
ist es noch bevorzugt, wenn im Bereich der zumindest einen Öffnung
zumindest eine dielektrische Struktur zur Beeinflussung des elektrischen
Feldes vorgesehen ist.
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Bei
dieser Maßnahme ist von Vorteil, dass die Feldstärke
im Bereich der Öffnung(en) gezielt moduliert werden kann,
um eine bestimmte Anordnung der Zellen zu erreichen.
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Bei
dem neuen Verfahren ist es bevorzugt, wenn der Mikrostruktur über
beide Mikrokanalabschnitte zunächst erste Zellen zum Aufbau
einer Zellanordnung zugeführt werden, und danach von den ersten
Zellen verschiedene zweite Zellen zugeführt werden, um
auf der Zellanordnung aus den ersten Zellen eine Zellanordnung aus
den zweiten Zellen aufzubauen, wobei die ersten Zellen Hepatocyten und
die zweiten Zellen Endothelzellen sein können.
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Nachdem
so beispielsweise ein erster Zelltyp in einen Spalt oder in Öffnungen
assembliert wurde, kann ein zweiter Zelltyp durch die Mikrokanalabschnitte
geleitet werden, der sich dann außen an dem Aggregat aus
den ersten Zellen ansammelt, so dass die ersten Zellen zum ersten
und zum zweiten Mikrokanal hin durch die zweiten Zellen vollständig
abgeschirmt sind.
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Auf
diese Weise lässt sich bspw. ein organotypisches Lebergewebe
erzeugen, bei dem die ersten Zellen Hepatozyten und die zweiten
Zellen Endothelzellen sind. Nachdem diese komplexe Struktur aufgebaut
wurde, wird sie dann durch beide Mikrokanäle mit Nährflüssigkeit
perfundiert und somit über längere Zeiträume
kultiviert. Wenn dem Medium jetzt Medikamente zugesetzt werden,
können sie auf Toxizität und Metabolisierung getestet
werden. Dabei ist es von Vorteil, dass die Hepatocyten nach außen vollständig
von Endothelzellen besetzt werden, so dass die Perfusion der komplexen
Zellkultur von der Seite der Endothelzellen her erfolgt, wie es
im intakten Lebergewebe der Fall ist.
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Andererseits
ist es bevorzugt, wenn der Mikrostruktur über den ersten
Mikrokanalabschnitt erste Zellen und über den zweiten Mikrokanalabschnitt von
den ersten Zellen verschiedene zweite Zellen zugeführt
werden, wobei die ersten Zellen Astrocyten oder darmtypische Mesenchymzellen
und die zweiten Zellen Epithelzellen sein können.
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Hier
werden in den beiden Mikrokanalabschnitten voneinander verschiedene
Zelltypen zeitgleich oder zeitlich nacheinander zugeführt,
so dass sich vom ersten Mikrokanalabschnitt aus erste Zellen und
vom zweiten Mikrokanalabschnitt aus zweite Zellen in und an der Öffnung
assemblieren und eine zweilagige Gewebestruktur aus zwei verschiedenen Zelltypen
entsteht. Nach Aufbau dieser komplexen Zellanordnung gelangen die
ersten Zellen nur mit dem Medium im ersten Mikrokanalabschnitt und
die zweiten Zellen nur mit Medium im zweiten Mikrokanalabschnitt
in Kontakt.
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Auf
diese Weise kann die Barriere der Blut-Hirn-Schranke durch Endothelzellen
und Astrocyten etabliert werden. Im Zusammenhang mit der Entwicklung
von Wirkstoffen kann jetzt die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke
für diese Wirkstoffe und damit ihre Verfügbarkeit
in Bereichen des Nervensystems bestimmt werden.
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Ferner
kann die Struktur des Darmepithels aus Mesenchymzellen und Epithelzellen
etabliert werden, und der Transport von Wirkstoffen durch das Darmepithel
und damit ihre Verfügbarkeit für den Eintritt
in das Blutgefäßsystem gemessen werden.
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Unter „ersten
Zellen” bzw. „zweiten Zellen” werden
im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht nur Zellen eines einzigen
Zelltyps sondern auch Mischungen aus Zellen verschiedener Zelltypen
verstanden. So können bei dem Aufbau einer Leberstruktur
den Endothelzellen bspw. Sternzellen beigemischt werden.
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Allgemein
ist es bevorzugt, wenn der Zellanordnung mit dem Medium Nährstoffe
und/oder Testsubstanzen zugeführt werden, und/oder wenn über einen
der beiden Mikrokanäle oder einen weiteren Mikrokanal Stoffwechselprodukte
von der Zellanordnung abgeführt werden.
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Der
Nährflüssigkeit können somit Marker zugegeben
werden, um die Reaktion des organotypischen Zellgewebes auf diese
Substanzen zu untersuchen. Dies können Fluoreszenzmarker
wie bspw. Antikörper sein, die zellspezifisch binden und
somit eine Untersuchung der tatsächlichen Zellanordung ermöglichen.
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Ferner
können die Zellanordnungen mit Testsubstanzen und/oder
Medikamenten perfundiert werden, deren Wirkung, Transport oder Metabolisierung bei
der etablierten Zellanordnung untersucht werden sollen.
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Es
versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils
angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder
in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden
Erfindung zu verlassen.
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Weitere
Vorteile ergeben sich aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen
und im Zusammenhang mit den Zeichnungen, in denen
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1 eine
schematische, nicht maßstabsgetreue, ausschnittsweise Draufsicht
auf ein Unterteil eines ersten Ausführungsbeispiels einer
Mikrostruktur des neuen mikrofluidischen Systems längs
der Linie I-I aus 2 zeigt;
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2 eine
schematische, nicht maßstabsgetreue Schnittdarstellung
durch die Mikrostruktur aus 1 längs
der dortigen Linie II-II zeigt;
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3 in
einer Darstellung wie 1 eine Gesamtdraufsicht auf
das neue mikrofluidische System der 1 und 2 mit
abgenommenen Oberteil zeigt, bei dem mehrere Spalte seriell hintereinander
angeordnet sind;
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4 in
einer Darstellung wie 3 ein mikrofluidisches System
zeigt, bei dem der weitere Mikrokanal nur einseitig mit dem Spalt
verbunden ist;
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5 in
einer ausschnittsweisen Darstellung wie 3 oder 4 ein
mikrofluidisches System zeigt, bei dem mehrere Spalte parallel zueinander angeordnet
sind;
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6 in
einer Darstellung wie 2 eine perspektivische Ansicht
eines weiteren Ausführungsbeispiels des neuen mikrofluidischen
Systems im Bereich der Wandstruktur zeigt, wobei Kanalelektroden an
Kanalboden und -deckel vorgesehen sind;
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7 in
einer Darstellung wie 6 ein weiteres Ausführungsbeispiel
des neuen mikrofluidischen Systems im Bereich der Wandstruktur zeigt, wobei
Kanalelektroden an den Seitenwänden vorgesehen sind;
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8 vier
schematische, nicht maßstabsgetreue Schnittdarstellungen
für unterschiedliche Stegformen bei dem Ausführungsbeispiel
der 6 oder 7 zeigt;
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9 in
einer Darstellung wie 8 beispielhaft die Assemblierung
von Zellen auf den Stegen der Wandstruktur zeigt;
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10 in
einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel
des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem auf dem Steg Steg-Elektroden
angeordnet sind;
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11 in
einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel
der Mikrostruktur des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei
dem sich die beiden Mikrokanäle vor und hinter der Wandstruktur
zu einem Mikrokanal vereinigen;
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12 in
einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel
des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem auf dem Steg dielektrische
Strukturen zur Modulation der Feldstärke vorgesehen sind;
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13 in
einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel
des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem die Wandstruktur
mehrere Trennwände aufweist;
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14 in
einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel
des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem mehrer Öffnungen
in der Wandstruktur vorgesehen sind, und über beide Mikrokanalabschnitte
voneinander verschiedene Zelltypen zeitgleich zugeführt
werden, um eine schichtartige Zellanordnung aufzubauen; und
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15 bis 18 Fluoreszenzaufnahmen zu
dem allmählichen Aufbau von Aggregaten der Zelllinie LCL
17001 in einem mikrofluidischen System zeigen, das in 15 unten
prinzipiell dargestellt ist.
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In 1 ist
eine schematische, nicht maßstabsgetreue, ausschnittsweise
Draufsicht auf ein Unterteil 10 eines ersten Ausführungsbeispiels
einer Mikrostruktur 11 eines mikrofluidischen Systems dargestellt.
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2 zeigt
einen Schnitt quer durch das mikrofluidische System 12 längs
der Linie II-II aus 1, während die Draufsicht
der 1 längs der Linie I-I aus 2 gesehen
ist.
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Die
Mikrostruktur 11 weist ein vom geometrischen Aufbau her
dem Unterteil 10 entsprechendes Oberteil 14 auf,
das das Unterteil 10 verschließt.
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Durch
die Mikrostruktur 11 verlaufen parallel und im Abstand
zueinander zwei Mikrokanalabschnitte 16, 17, die
in dem gezeigten Beispiel teilweise im Unterteil 10 und
teilweise im Oberteil 14 ausgebildet sind. Selbstverständlich
können die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 auch
gänzlich im Unterteil 10 oder im Oberteil 14 ausgebildet
sein, das Oberteil 14 bzw. das Unterteil 10 bilden
dann lediglich einen Kanaldeckel bzw. Kanalboden.
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Über
die Mikrokanalabschnitte 16, 17 wird die Mikrostruktur 11 von
außen in durch die Mikrokanalabschnitte 16, 17 definierten
Flussrichtungen 18 und 19 mit Medium perfundiert,
das in 2 bei 21 und 22 angedeutet ist.
Mit dem Medium 21, 22 können Nährstoffe
und Testsubstanzen zu- sowie Stoffwechselprodukte abgeführt
werden. Ferner können in dem Medium 21, 22 Zellen 23, 24 transportiert
werden, die in noch zu beschreibender Weise eine komplexe Zellanordnung
aufbauen.
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Die
Mikrokanalabschnitte 16, 17 werden durch eine
Wandstruktur 25 voneinander getrennt, in der eine die beiden
Mikrokanalabschnitte 16, 17 miteinander verbindende Öffnung 26 vorgesehen
ist.
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Ferner
ist in der Mikrostruktur 11 eine Elektrodenanordnung 27 vorgesehen, über
die im Bereich der Öffnung 26 ein inhomogenes
elektrisches Feld 28 erzeugt wird, von dem in 2 einige
Feldlinien 29 beispielhaft gestrichelt dargestellt sind.
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Durch
dieses Feld 28 werden die Zellen 23, 24 zu
der Öffnung 26 hin bewegt, wo sie assemblieren
und eine in 2 nicht gezeigte komplexe Zellanordnung
bilden. Dabei wird der bspw. in der eingangs genannten Veröffentlichung
von Ho et al. beschriebene Effekt der Feld-induzierten
Dielektrophorese genutzt.
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In 1 und 2 ist
zu erkennen, dass das Unterteil 10 sich vom jeweiligen
Kanalboden 31, 32 nach oben erstreckende Außenwände 33, 34 aufweist,
denen am Oberteil 14 Außenwände 35, 36 entsprechen,
die sich vom jeweiligen Kanaldeckel 37 bzw. 38 aus
erstrecken. Die Außenwände 33, 34, 35, 36 liegen
mit ihren aufeinander zu weisenden Stirnflächen aufeinander
auf.
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In
oder an den Außenwänden 33, 34, 35, 36 sind
gegenüber der Öffnung 26 Kanal-Elektroden 39 und 40 der
Elektrodenanordnung 27 angeordnet, die über Zuleitungen 41 bzw. 42 an
einen in 3 zu sehenden elektrischen Wechselspannungsgenerator 43 mit
variabler Frequenz f und variablem Spannungshub Upp angeschlossen
werden können.
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Die
Wandstruktur 25 umfasst eine Trennwand 44, die
durch entsprechende Bereiche von Oberteil 14 und Unterteil 10 gebildet
wird, die wie die Außenwände 33, 34, 35, 36 aufeinander
aufliegen. Im Bereich der Öffnung 26 ist die Trennwand 44 mit gegenüber
der Auflagefläche zurückgesetzten Stegen 45, 46 ausgebildet,
deren Stirnflächen 47 bzw. 48 aufeinander
zuweisen und zwischen sich die Öffnung 26 begrenzen.
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Die
Stege 45, 46 verlaufen in Flussrichtung 18, 19 so
dass die Öffnung 25 die Form eines langgestreckten
Spaltes 49 aufweist.
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In
der Trennwand 44 verläuft parallel zu und zwischen
den Mikrokanalabschnitten 16, 17 ein weiterer
Mikrokanal 51, der in fluidischer Verbindung mit dem Spalt 49 steht,
so dass Material aus dem Bereich des Spaltes 49 abgeführt
werden kann.
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Der
weitere Mikrokanal 51 kann dabei – wie in 1 gezeigt – den
Spalt 49 durchsetzen, also beidseits an den Spalt 49 bzw.
die Öffnung 26 angeschlossen sein, er kann aber
auch nur an einer Seite des Spaltes 49 vorgesehen sein,
was insbesondere für die Untersuchung von organotypischen
Leberstrukturen von Vorteil ist, wenn der weitere Mikrokanal 51 als
Gallenkanal dient.
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Die
Mikrostruktur 11 ist aus einem dielektrischen Material
gefertigt, so dass durch die insoweit beschriebene Geometrie die
Feldstruktur mit bestimmt wird. Das Feld 28 weist im Bereich
des Spaltes 49 seine höchste Felddichte auf, wobei
die Form des Feldes im Wesentlichen durch diese Geometrie, die Feldstärke
durch den Spannungshub Upp bestimmt wird.
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Als
geeignetes Material für die Mikrostruktur 11 hat
sich Glas, Silizium, ggf. mit einer isolierenden Schicht z. B. aus
Siliziumoxid oder Siliziumnitrid beschichtet, sowie Polymere wie
beispielsweise PMMA, Polystyrol, PEEK, COC (cyclic olefin copolymer) erwiesen.
Vorzugsweise werden transparente, nichtleitende Materialien eingesetzt,
wobei die obige Aufzählung nur als beispielhaft zu verstehen
ist.
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Hergestellt
werden kann die Mikrostruktur 11 mit geeigneten, an sich
bekannten Verfahren zur Mikrostrukturierung, wie bspw. Photolithographie
in Kombination mit Plasmaätzverfahren oder nasschemischen Ätzverfahren
sowie im Falle von Polymermaterialien durch Mikrospritzguss oder
Heißprägen.
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Die
Länge des Spaltes 49 in Flussrichtung 18, 19 beträgt
bspw. 20 bis 2000 μm, vorzugsweise ca. 1500 μm.
Die Höhe des Spaltes 49 zwischen den Stirnflächen 47, 48 beträgt
bspw. 10 bis 100 μm, vorzugsweise ca. 50 μm. Die
Breite des Spaltes 49 an der Stirnfläche 47, 48 quer
zur Flussrichtung 18, 19 beträgt bspw.
10 bis 200 μm, vorzugsweise ca. 100 μm.
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Die
Höhe der Mikrokanalabschnitte 16, 17 zwischen
Kanalboden 31, 32 und Kanaldeckel 37, 38 beträgt
bspw. 50 bis 2000 μm, vorzugsweise ca. 500 μm.
Die Breite der der Mikrokanalabschnitte 16, 17 zwischen
Außenwand 33, 34, 35, 36 und
Trennwand 44 beträgt bspw. 20 bis 2000 μm,
vorzugsweise ca. 200 μm.
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Die
Breite des weiteren Mikrokanals 51 quer zur Flussrichtung
beträgt ca. 5 bis 10 μm. Die Länge der
Kanal-Elektroden 39, 40 in Flussrichtung 18, 19 ist
größer als die Länge des Spaltes 49,
wobei die Höhe der Kanal-Elektroden 39, 40 quer
zur Flussrichtung größer ist als die Höhe
des Spaltes 49 zwischen den Stirnflächen 47, 48.
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Diese
Maßangaben und Größenverhältnisse sind
lediglich beispielhaft zu verstehen, sie können in Abhängigkeit
von den zu assemblierenden Zellen 23, 24 variieren.
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Wichtig
ist dabei, dass durch die Geometrie der Mikrostruktur 11 ein
inhomogenes Feld aufgebaut wird, wozu es nicht zwingend erforderlich
ist, dass die Abmaße der Kanal-Elektroden 39, 40 größer sind
als die des Spaltes 49. Wenn die Mikrostruktur 11 mit
Medium gefüllt ist, variiert der elektrischen Widerstand
zwischen den Kanal-Elektroden 39, 40 über dem
Abstand zwischen den Kanal-Elektroden 39, 40, was
dazu führt, dass sich ein inhomogenes Feld 28 einstellt.
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Wie
bereits erwähnt, ist die Mikrostruktur 11 bspw.
für die Etablierung einer organotypischen Leberstruktur
geeignet. Hepatocyten haben einen Durchmesser von ca. 50 μm,
wobei in einem Lebersinusoid zwei Reihen von je ca. 20 bis 30 Hepatocyten hintereinander
angeordnet sind. Für den Spalt 49 ergeben sich
daraus als Optimalmaße eine Breite von 100 μm,
eine Höhe von 50 μm, und eine Länge von 1000
bis 1500 μm.
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In 3 ist
ein Ausführungsbeispiel zu erkennen, bei dem die Mikrokanalabschnitte 16, 17 insgesamt
vier Spalte 49 in Flussrichtung hintereinander aufweisen,
zu denen jeweils eigene Zuleitungen 41 bzw. 42 für
Kanal-Elektroden 39, 40 führen.
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Die
Mikrokanalabschnitte 16, 17 sind dabei jeweils
Teil eines gesonderten Mikrokanals 52 bzw. 53,
zwischen denen der weitere Mikrokanal 51 verläuft,
der alle vier Spalte 49 miteinander verbindet.
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Alle
drei Mikrokanäle 51, 52, 53 weisen
an ihren Enden Anschlüsse 54 zur fluidischen Steuerung auf,
um die Flussrate des Mediums in den Mikrokanälen 51, 52, 53 individuell
einstellen zu können.
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Der
Fluss des Mediums durch die beiden Mikrokanäle 52, 53 kann
dabei so gesteuert werden, dass keine Querströmung durch
die Spalte 49 hindurch erzwungen wird.
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Die
Mikrostruktur 11 ist dabei in unterschiedlichen Bereichen
mit unterschiedlichen selektiven Beschichtungen versehen. Dabei
kann die Besiedelung im Bereich der Spalte 49 durch eine
adhäsive Beschichtung unterstützt und durch eine
non-adhäsive Beschichtung in den Mikrokanälen 52, 53 vermieden
werden. Ferner kann eine Beschichtung mit Extrazellulärmatrix
vorgesehen sein, um Zellwachstum und -differenzierung zu unterstützen.
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Mit
dem insoweit beschriebenen mikrofluidischen System 12 lässt
sich jetzt eine organotypische, komplexe Zellanordnung aufbauen.
Soll beispielsweise eine Leberstruktur etabliert werden, so werden in
beiden Mikrokanälen 52 und 53 dem Medium 21 bzw. 22 zunächst
Hepatocyten zugegeben, die sich aufgrund der Struktur des inhomogenen
Feldes 28 in den Spalten 49 ablagern. Wie bereits
eingangs erwähnt, führen die dielektrophoretischen
Kräfte dazu, dass die Zellen in Richtung der größten
Felddichte bewegt werden.
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Nachdem
sich so Hepatocyten in den Spalten 49 assembliert haben,
wird dem Medium 21 bzw. 22 jetzt ein zweiter Zelltyp,
im vorliegenden Fall also Endothelzellen, hinzugegeben, die sich
außen an der Hepatocytenstruktur anlagern und diese schließlich vollständig
gegenüber den Medien 21, 22 isolieren.
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Jetzt
können über die Mikrokanäle 52 und 53 Nährstoffe
und Testsubstanzen hinzugegeben werden, während die Stoffwechselprodukte
aus den seriell über den Mikrokanal 51 miteinander
verbundenen Spalten 49, in denen sich die Zellanordnungen assembliert
haben, abgeführt werden.
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Selbstverständlich
ist der Aufbau einer organotypischen Leberstruktur nur ein Beispiel
für die Anwendung des neuen mikrofluidischen Systems.
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In 3 sind
vier seriell hintereinander geschaltete Spalte 49 vorgesehen,
die über einen gemeinsamen Mikrokanal 51 miteinander
verbunden sind. Es kann jedoch – wie oben schon erwähnt – auch
nur ein Spalt 49 vorgesehen sein, der nur einseitig an
den Mikrokanal 51 angeschlossen ist, wie dies in 4 gezeigt
ist. Der Mikrokanal 51 verläuft dann entgegen
der Flussrichtung 18, 19.
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Andererseits
ist es auch möglich, die Spalte 49 parallel zueinander
vorzusehen, indem mehrere Wandstrukturen bzw. Trennwände 44 quer
zur Flussrichtung 18, 19 nebeneinander angeordnet
werden, wie dies ausschnittsweise in 5 für
drei Spalte 49 gezeigt ist. Jeder Spalt 49 ist
dann über einen eigenen Mikrokanal 51' mit dem
gemeinsamen Mikrokanal 51 verbunden.
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In 5 sind
die Zuleitungen zu den Kanal-Elektroden 39, 40 und
die Mikrokanäle 52, 53 aus Gründen
der Übersichtlichkeit nicht gezeigt. Die Mikrokanalabschnitte 16, 17 und
die Mikrokanäle 51, 51' sowie die nicht
gezeigten Zuleitungen zu den Elektroden müssen ggf. in
verschiedenen Ebenen – parallel zur Zeichnungsebene – angeordnet
sein, um Probleme bei möglichen Kreuzungspunkten zu vermeiden.
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Während
bei dem Ausführungsbeispiel der 1 bis 5 die
Stege 45 und 46 im Querschnitt rechteckförmig
sind, können die Stege auch trapezförmig ausgebildet
sein, wie dies in den 6 und 7 gezeigt
ist. Durch die trapezförmige Stegstruktur lässt
sich das inhomogene elektrische Feld weiter beeinflussen, so dass
eine Feldstruktur entsteht, die für die Assemblierung von
Zellen besonders geeignet ist.
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Während
in 7 die Kanalelektroden 39, 40 wie
in den 1 und 2 an den in 7 nicht gezeigten
Außenwänden angeordnet sind, sind in dem Ausführungsbeispiel
gemäß 6 Kanalelektroden 55 am
Kanalboden 31, 32 sowie am Kanaldeckel 35, 38 angeordnet.
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Selbstverständlich
ist es auch möglich, Kanalelektroden sowohl an den Außenwänden
als auch am Kanalboden und am Kanaldeckel vorzusehen.
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Durch
die gewählte Anordnung der Kanalelektroden 39, 40, 55 kann
das sich ausbildende inhomogene Feld weiter beeinflusst werden.
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In
den 8 und 9 sind jeweils vier Stegformen
im Querschnitt gezeigt, oben links ist der Steg 46, 47 jeweils
im Querschnitt trapezförmig, oben rechts ballig, unten
rechts dreieckförmig und unten links trapezförmig
mit in Flussrichtung verlaufenden Graten 56.
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In
den 8 und 9 sind gestrichelt wieder Feldlinien 29 des
sich ausbildenden inhomogenen elektrischen Feldes 28 gezeigt,
wobei in 9 ferner zu sehen ist, wie sich
Zellen 23, 24 in dem jeweiligen Spalt 49 anordnen.
Allen Strukturen ist das Prinzip gemeinsam, dass sich in der oder
den Engstellen ein oder mehrere Feldmaxima ausbilden, durch die
die Position der Zellen 23, 24 definiert wird.
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10 zeigt
in einer Darstellung wie 1 ein Unterteil 10 einer
Mikrostruktur, wobei dort auf der Stirnfläche 47 des
Steges 45 in Flussrichtung 18, 19 aufeinander
zu weisende Stegelektroden 57 vorgesehen sind, zwischen
denen sich Zellen 23 perlenschnurartig anordnen. Durch
die zusätzlichen Stegelektroden 57 kann also die
Struktur des sich in dem Spalt 49 ausbildenden organotypischen
Gewebes beeinflusst werden.
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In 11 ist
in einer Darstellung wie in den 1 und 10 ein
weiteres Ausführungsbeispiel der neuen Mikrostruktur 11 gezeigt,
bei dem sich die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 vor
und hinter der Wandstruktur bzw. Trennwand 44 zu einem
gemeinsamen Mikrokanal 58 vereinigen.
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Während
es mit den Mikrostrukturen aus den 1 und 10 möglich
ist, zeitgleich über die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 Zellen
verschiedener Zelltypen zuzuführen, so dass sich erste
Zellen vom Mikrokanalabschnitt 16 aus und zeitgleich zweite
Zellen 24 vom Mikrokanalabschnitt 17 aus in den
Spalt 49 assemblieren, werden bei der Mikrokanalstruktur 11 aus 11 nur
Zellen 23 eines Zelltyps zeitgleich zugeführt,
wie dies beim Aufbau einer organotypischen Leberstruktur erfolgen
kann.
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In 12 ist
in einer Darstellung wie 1 eine Mikrokanalstruktur gezeigt,
bei der auf der Stirnfläche 47 des Steges 45 insgesamt
fünf weitere dielektrische Strukturen 59 vorgesehen
sind, die hier als runde Pfosten ausgebildet sind und das inhomogene elektrische
Feld 28 weiter beeinflussen, wie aus dem Verlauf der Feldlinien 29 zu
ersehen ist, und eine entsprechende Anordnung der Zellen 23, 24 bewirken.
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13 zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel, bei dem die Wandstruktur 25 eine
Vielzahl von Trennwänden 44 mit jeweils einem
darin vorgesehen Spalt 49 aufweist. Bei dieser Mikrostruktur 11 ist
der eine Mikrokanal 58 also in viele Mikrokanalabschnitte 16, 17 aufgespalten,
zwischen denen jeweils eine Trennwand 44 verläuft,
ansonsten entspricht er dem in 11 gezeigten
Aufbau, wo nur ein Mikrokanal 58 für die Perfusion
vorgesehen ist.
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Allen
insoweit beschriebenen Mikrostrukturen 11 ist gemeinsam,
dass durch die Formgebung im Bereich der Öffnung 26 bzw.
des Spaltes 49 die Struktur des inhomogenen elektrischen
Feldes 28 beeinflusst wird, um je nach gewünschter,
zu assemblierender Zellanordnung unterschiedliche Positionen für
die Ansammlung der Zellen zu bevorzugen.
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In 14 schließlich
ist wie in der Darstellung der 1, 10, 11, 12 und 13 eine
Mikrostruktur 11 gezeigt, bei der die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 durch
eine Trennwand 44 voneinander getrennt sind, in der mehrere Öffnungen 26 vorgesehen
sind, die in Flussrichtung 18, 19 nebeneinander
sowie – in 14 nicht dargestellt – auch übereinander,
also parallel zur Zeichnungsebene angeordnet sind. Die Kanalelektroden 38 und 39 erstrecken
sich über den gesamten Bereich der Trennwand 44,
der mit Öffnungen 26 versehen ist.
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Diese
Struktur ist dazu geeignet, um eine zweilagige schichtartige Zellanordnung
aus Zellen 23 und 24 aufzubauen, die sich von
den beiden Mikrokanalabschnitten 16 und 17 her
an den Öffnungen 26 anlagern.
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Wie
eingangs geschildert, ist es auf diese Weise möglich, die
Struktur des Darmepithels oder der Blut-Hirn-Schranke nachzubilden.
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In
den Mikrokanalabschnitt 16 kann dann beispielsweise Medium
mit Nährstoffen und Testsubstanzen zugeführt werden,
während aus dem Mikrokanalabschnitt 17 dann Medium
abtransportiert wird, indem nachgewiesen werden kann, ob die Testsubstanzen
die aus den Zellen 23 und 24 gebildete Membran
durchdringen können.
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In
den 15 bis 18 ist
beispielhaft von a nach g fortschreitend die Assemblierung von Zellen in
einem Spalt gezeigt. Die Struktur des Spaltes 49 ist in 15 unten
gezeigt, die Kanalelektroden 39 und 40 sind im
Querschnitt bauchig ausgeführt.
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An
die Kanalelektroden wurde ein elektrisches Feld der Frequenz 90
kHz und der Spannung U = 54 V pp angelegt. Die Fluoreszenzaufnahmen
a bis g wurden im Abstand von ca. 30 Sekunden aufgenommen. Von a
nach g fortschreitend ist an den Fluoreszenzaufnahmen zu erkennen,
dass sich im Bereich des Spaltes 49 immer mehr Zellen ansammeln, die
als helle Punkte erscheinen.
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In
dem gezeigten Beispiel wurden Zellen der lymphoiden Zelllinie des
Typs LCL 17001 verwendet. Die Medien enthielten Zellen in einer
Dichte von 1 × 106 pro ml Kulturmedium,
das 480 mM Saccharose in einem Puffer bei ca. pH 7,0 enthielt. Zur
Analyse der Viabilität wurde 3 μl des Fluoreszenzfarbstoffes
Calcein-AM zu 4 ml der Saccharose-Zellsuspension zugegeben.
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Die
obigen Experimente wurden in Zellkulturmedien für proof-of-principle
Experimente unter Verwendung der Zelllinie LCL 17001 durchgeführt.
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In
den tatsächlichen Versuchen wird dann ein Zellkulturmedium
speziell für Hepatozyten bzw. die jeweils verwendeten anderen
Zelltypen eingesetzt.
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Mit
Kulturmedium wird nachstehend jeweils das Medium bezeichnet, in
dem die Zellen optimal wachsen, während Suspensionsmedium
das auf die Erfordernisse der positiven Dielektrophorese optimierte
Medium bezeichnet, das insbesondere eine niedrige Leitfähigkeit
aufweist und die Viabilität der Zellen für einen
relativ kurzen Zeitraum von einigen Minuten bis Stunden sicherstellt.
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Für
LCL (lymphoid cell line) wird als Kulturmedium 500 ml RPMI 1640
Kulturmedium, + 20% (120 ml) FBS (Fetal Bovine Serum), + 6 ml Penstrep (Antibiotika),
+ 2 mmol L-Glutamin verwendet; siehe Lindl, T., Zell- und
Gewebekultur. 4. Auflage ed. 2000, Berlin/Heidelberg: Spektrum Akademischer
Verlag.
-
Als
Suspensionsmedium wird DI-Wasser, + 480 mmol D-Saccharose verwendet,
es erfolgt keine Pufferkorrektur, da der pH-Wert nur um 0,4 vom
Kulturmedium ab weicht, siehe auch Sebastian, A., A.-M. Buckle,
and G. H. Markx, Formation of multilayer aggregates of mammalian
cells by dielectrophoresis. Journal of Micromechanics and Microengineering, 2006.
16(9): p. 1769.
-
Aufbau
und Wachstumsverhalten der LCL Zellen werden in einer Publikation
von Nilsson dargestellt; Nilsson, K., Human B-lymphoid cell
lines. Hum Cell, 1992. 5(1): p. 25–41.
-
Für
Hepatozyten wird als Kulturmedium DMEM (Dulbecco’s modified
Eagle – Medium), + 10% FBS (fetal bovine serum), + 0.5
U/ml insulin, + 7 ng/ml Glucagon, + 20 ng/ml epidermal growth factor, +
7.5 μg/ml hydrocortisone, + 100 U/ml Penicillin, + 100 μg/ml
Streptomycin verwendet.
-
Zu
dem verwendeten Suspensionsmedium ist noch zu erwähnen,
dass für positive Dielektrophorese (DEP) Medien mit einer
besonders niedrigen Leitfähigkeit erforderlich sind. Diese
werden hergestellt, indem die Salz- bzw. Pufferkonzentration der Kulturmedien
möglichst weit reduziert wird. Kulturmedien basieren meist
auf einer PBS (phosphate buffered saline) Lösung, die ca.
150 mM NaCl enthält, welches eine für die DEP
zu hohe Leitfähigkeit bewirkt. Zur Kompensation der im
Falle des Weglassens des Salzes reduzierten Osmolarität,
d. h. um ein Platzen der Zellen infolge des Konzentrationsunterschiedes
zwischen Cytosol und Medium zu vermeiden, wird dem Medium ein Zucker,
z. B. Sacharose oder Sorbitol anstelle des Salzes in einer Konzentration
von bis zu 500 mM zugesetzt.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - ”Rapid
Heterogenous Liver-Cell On-Chip Patterning via the Enhanced Field-induced
Dielectrophoresis Trap” von Ho et al., Lab Chip, 2006,
6, 724–734 [0012]
- - Ho et al. [0015]
- - Ho et al. [0088]
- - Lindl, T., Zell- und Gewebekultur. 4. Auflage ed. 2000, Berlin/Heidelberg:
Spektrum Akademischer Verlag [0138]
- - Sebastian, A., A.-M. Buckle, and G. H. Markx, Formation of
multilayer aggregates of mammalian cells by dielectrophoresis. Journal
of Micromechanics and Microengineering, 2006. 16(9): p. 1769 [0139]
- - Nilsson dargestellt; Nilsson, K., Human B-lymphoid cell lines.
Hum Cell, 1992. 5(1): p. 25–41 [0140]