DE102007047468A1

DE102007047468A1 - Verfahren und Anordnung zur optischen Erfassung einer beleuchteten Probe

Info

Publication number: DE102007047468A1
Application number: DE102007047468A
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. Kempe; Michael Dr. Schwertner; Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2009-04-02
Also published as: EP2212739A1; JP5955505B2; EP2557451B1; JP6023147B2; WO2009043545A1; JP2015018284A; JP2010540998A; EP2557451A1; EP2212739B1

Abstract

Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, bei dem eine Probe oder ein Teil davon mittels vorzugsweise linienförmiger Beleuchtung abgetastet wird, die Beleuchtung der Probe im Fokus in mindestens einer Raumrichtung periodisch strukturiert wird, von der Probe kommendes Licht detektiert und Bilder der Probe erzeugt werden und aus den Bildern mindestens ein optisches Schnittbild und/oder ein Bild mit erhöhter Auflösung durch die Probe berechnet wird, eine Bildaufnahme und Schnittbildverrechnung mehrfach unter Veränderung der Orientierung der linienförmigen Beleuchtung zur Probe erfolgt und/oder auf einem Flächendetektor oder einer Kamera zur zeilenweisen nicht gescannten Detektion zwischen mit Detektionslicht aus dem beleuchteten Probenbereich belichteten Zeilen Zwischenräume erzeugt werden und/oder während eines Scanvorgangs vor dem Detektor eine weitere Lichtablenkung in Richtung der Abtastung der Probe durch die Linie erfolgt.

Description

Strukturierte Beleuchtung wird in der Mikroskopie zur Tiefendiskriminierung im Weitfeld [1] und zur Auflösungs- und Kontraststeigerung [2] eingesetzt. Im Allgemeinen wird dabei ein Gitter oder eine periodische Struktur in die Probe projiziert [3] oder durch Interferenz kohärenter Teilstrahlen ein Interferenzmuster in der Probe erzeugt [4]. Durch Verschiebung der Beleuchtungsstruktur werden voneinander verschiedene Bilder mit unterschiedlicher Phasenlage der periodischen Struktur erzeugt. Diese werden anschließend in geeigneter Weise miteinander verrechnet, um ein optisches Schnittbild bzw. ein Bild mit erhöhtem Kontrast und erhöhter Auflösung zu gewinnen. Nachteilig wirkt sich dabei aus, dass Signal von außerfokalen Bereichen der Probe mit detektiert wird und durch den limitierten Dynamikbereich des Detektors zu einem verringerten Signal-zu-Rausch-Verhältnis führt. Die Stärke des außerfokalen Signals begrenzt, dabei die nutzbare Probendicke. Das ist besonders dann von erheblicher Bedeutung, wenn die Frequenz der Strukturierung sich der beugungsbegrenzten Grenzfrequenz des optischen Systems nähert und der Kontrast der Strukturierung daher prinzipbedingt niedrig ist. Das ist immer dann der Fall, wenn eine Kontrast- und Auflösungssteigerung erzielt werden soll.
Eine Lösung dieses Problems besteht in der teilweise konfokalen Detektion, die durch die Strukturierung einer Beleuchtungslinie und der Detektion des dadurch angeregten Fluoreszenzlichts mit einem Spaltdetektor möglich wird [5]. Dieses Verfahren hat allerdings Nachteile. Die Strukturierung erfolgt nur entlang der Linie. Als Folge davon bleiben die Effekte der Kontrast- und Auflösungssteigerung auf diese Richtung beschränkt. Insbesondere bei nichtlinearer [6], aber auch bei linearer Strukturierung [7] ist damit die Diskrepanz zwischen der einen Richtung mit Auflösungssteigerung und allen anderen Raumrichtungen signifikant. Das Scannen der Linie in einer beliebigen Richtung in der Probenebene und auch die Einstellung der Phasenlage der periodischen Struktur ist notwendig. Entsprechend dem Stand der Technik werden hierzu separate Aktuatoren für die Ansteuerung der Relativen Phasenlage und den Scanvorgang benötigt.
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden
Erfindungsgemäß werden die Vorteile der strukturierten Beleuchtung im Weitfeld (wenige optische Komponenten, hohe Parallelisierung) mit denen der strukturierten Beleuchtung entlang einer Linie (teilkonfokale Unterdrückung des Untergrundsignals für maximalen Kontrast, hohe Intensitäten im Fokus für nichtlineare und lineare Probenwechselwirkungen) zu verbinden. Die vorgeschlagene Anordnung gestattet eine schnelle, variable und präzise Rotation der Scanrichtung und eine Einstellung der relativen Phasenlage der abgebildeten strukturierten periodischen Struktur mit Hilfe von nur zwei Scannern. Zusätzlich wird eine variabel einstellbare konfokale Detektion bei gleichzeitig nur sehr geringen Lichtverlusten im Detektionsstrahlengang ermöglicht. Es wird auch auf DE 10155002 A1 verwiesen.
Die erfindungsgemäße Lösung ist vorzugsweise ein linienscannendes Mikroskop (siehe 1) welches im Detektionsstrahlengang im Vergleich zu einem Weitfeldsystem ebenso wenig Komponenten enthält. Konkret sind dies ein für einen unendlichen Strahlengang korrigiertes Objektiv (27), die Tubuslinse (21), der Hauptfarbteiler (19), ein Emissionsfilter (17) und die Kamera (15). Im Anregungsstrahlengang befindet sich die Strahlformungseinheit (8), die den durch den Modulator (5) intensitätsmodulierten Lichtstrahl der Lichtquelle (3) zu einer Linie formt, welche entlang der Linienausdehnung moduliert ist. In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Strahlformungseinheit durch eine Kombination aus Linienformungsoptik (7) und einer periodische Struktur (13) zusammengesetzt, wobei (7) und (13) zu einer mechanischen Gruppe (8) zusammengefasst sind, welche um die optische Achse (1) rotiert werden kann. Die Rotation der Strahlformungseinheit (8), welche vorzugsweise durch einen schnellen Schrittmotor realisiert ist, kann die Orientierung der in die Probe abgebildeten Linie in der x/y Ebene eingestellt werden.
In einer weiteren Implementierung entsprechend der vorliegenden Erfindung (nicht in 1 dargestellt) kann die Strahlformungseinheit (8) auch durch ein einziges diffraktives optisches Element implementiert sein, welches ebenfalls um die optische Achse (1) rotiert werden kann. Ein solches diffraktives Element kann Linienformung in einer Richtung und Linienstrukturierung in einer dazu orthogonalen Richtung in einem Schritt durchführen.
Im weiteren Verlauf der optischen Achse befinden sich ein erster Scanner (9), ein weiterer, zum ersten Scanner (9) orthogonal stehender Scanner (23) und ein Scanobjektiv (11). Die Rotationsachse oder Schwenkachse (25) des Scanners (23) ist zur Rotationsachse des ersten Scanners (9) im Wesentlichen orthogonal angeordnet. Hierbei wird Scanner (9) für eine Verschiebung der Linie in der Probe in x-Richtung und Scanner (23) für eine Verschiebung der Linie in y-Richtung verwendet.
Beide Scanner (9) und (23) befinden sich in der Nähe der konjugierten Pupillenebene.
1 zeigt den schematischen Aufbau des erfindungsgemäßen Mikroskops (1) ist die Optische Achse, (3) die Lichtquelle, (5) ein Schaltbarer Attenuator/AOM, (8) eine Strahlformungseinheit mit einer (7) Linienformungsoptik, beispielsweise einer Zylinderlinse, (9) ein Scanner mit einer Rotationsachse senkrecht zur Zeichenebene, (23) ein Scanner mit einer Rotationsachse (25) im wesentlichen parallel zur Zeichenebene, (11) eine Scanoptik, (13) eine Maske mit periodischer Struktur in der einer zur Probe konjugierten Zwischenbildebene, (15) ein ortsauflösender Flächensensor wie z. B. eine CCD-Empfängermatrix, (17) ein Emissionsfilter, (19) ein Hauptfarbteiler, (21) eine Tubuslinse, (27) ein Mikroskopobjektiv, (29) die Probe. Die Elemente (7) und (13) sind zu einer mechanischen Gruppe, der Strahlformungseinheit (8) zusammengefasst, welche vorzugsweise um die optische Achse (1) rotierbar angeordnet ist.
Im Folgenden soll die Verschiebung der Phase der strukturierten Linie sowie des Abscannen des Bildfeldes durch die Zusammenwirkung der beiden Scanner (9) und (23) mit dem AOM (5) beschrieben werden.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit soll im Folgenden ein Beispiel betrachtet werden, bei dem die Linie in der Probe entlang der x-Richtung ausgerichtet ist und das Abscannen des Bildfeldes in der dazu senkrechten y-Richtung stattfindet. Dies erfordert auch die entsprechende Orientierung der Strahlformungseinheit (8) um eine Orientierung der Linie in x-Richtung zu erzeugen.
Die Funktion des Scanners (23) besteht bei dieser Linienorientierung darin, die Phasenlage der Strukturierung zwischen zwei und mehr aufgenommenen Bildern zu verändern, wobei der Scanner (9) für den Scanvorgang in y-Richtung verantwortlich it.
Aus den aufgenommenen Bildern bei jeweils unterschiedlicher Phasenlage („Phasenbildern") erfolgt die Berechnung (Rekonstruktion) eines Schnittbildes. Auf DE10155002A1 wird verwiesen.
2 zeigt die Strukturierung der Beleuchtung
Wenn während eines linearen Scans des Scanners (9) über eine Zeit Δt = t3 – t1 die Kamera synchron ein Bild mit einer Belichtungszeit von mindestens Δt einzieht, erhält man ein einem Weitfeldbild des Objektes äquivalentes Resultat. Dabei wird der außerfokale Untergrund ebenfalls mit detektiert. Eine konfokale Filterung wird erfindungsgemäß möglich, wenn durch den Modulator (5) synchron zum Scanvorgang bei der Aufnahme jedes Phasenbildes das zur Berechnung eines Schnittbildes gehört, in y-Richtung die Beleuchtung in gleicher Weise periodisch an- und ausgeschaltet wird.
Hierbei kann der Scanner neben der kontinuierlichen Scanbewegung mit Ein- und Ausschalten vorteilhaft auch in den ausgeschalteten Abschnitten schnell zur nächsten Position mit angeschalteter Beleuchtung bewegt werden, in der der beleuchtete Scanvorgang fortgesetzt wird. Die Bewegung könnte auch wie mit einem Schrittmotor schrittartig erfolgen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ergibt sich eine in y-Richtung strukturierte Belichtung in der Kameraebene (siehe 3). Die Abstände zwischen den belichteten Zeilen der Kamera werden in einer vorteilhaften Ausprägung der Erfindung so gewählt, dass ein Übersprechen des außerfokalen Untergrundes bei der Beleuchtung einer Linie auf der Probe in die Region auf der Kamera , die der Beleuchtung der nächsten Linie in der Probe entspricht, minimiert wird. Bei Abtastung des Objektes nach dem Nyquist-Theorem (eine Detektorzeile entspricht der halben Breite der beugungsbegrenzten Linie) sollten empirisch M = 5 bis 10 Zeilen Abstand zwischen benachbarten Belichtungszeilen ausreichen. Im nächsten von der Kamera erfassten Bild wird dann das belichtete Zeilenmuster um vorzugsweise eine Zeile verschoben, was durch eine entsprechende Verzögerung beim Anschalten des Modulators erzielt wird. Es wird also beispielsweise zunächst die 1., 10., 20. Zeile, dann die 2., 11. und 21. Zeile belichtet.
Dieser Prozess der zeilenweisen Verschiebung der Objektbeleuchtung wird solange wiederholt, bis alle Abschnitte der Probe im Bildfeld abgetastet sind, wobei als Resultat dieses Aufnahmevorganges M Bilder pro Phasenlage vorliegen.
Alternativ könnte für eine Abstandseinstellung zwischen belichteten Zeilen zunächst die Aufnahme bei mehreren Phasenlagen der periodischen Struktur erfolgen und dann der Abstand für die Aufnahme wiederum mehrerer Phasenbilder verändert werden.
Jedes dieser Bilder kann wiederum zusätzlich zur schon beschriebenen Verfahrensweise durch wiederholte Aufnahme, vorzugsweise mit möglichst geringer Intensität zur Probenschonung, mit gleichen Scanner-Einstellungen und anschließender Mittelung entstanden sein. Dieses Verfahren kann Artefakte aufgrund von Bleichvorgängen in der Probe reduzieren. Über die Verrechnung der M Bilder pro Phasenlage kann nun die Konfokalität eingestellt werden.
Insbesondere muss für die einzelnen Bilder der durch den Empfänger erfasste belichtete Untergrund zwischen den belichteten Empfängerzeilen herausgerechnet werden. Dieser ist auf dem Empfänger leicht zu identifizieren, da die belichteten Zeilen im Objekt eindeutig voneinander separierten Bereichen auf der Kamera zuzuordnen sind.
Wenn alle M Bilder einer Phasenlage einfach aufsummiert werden, erhält man ein dem Weitfeldbild entsprechendes Ergebnis. Die Aufsummierung der Bilder nach Selektion der Zeilen, die den entsprechenden beleuchteten Zeilen im Fokus des Objektes entsprechen, ergibt ein konfokales Bild. In diesem Schritt werden die zu den selektierten Zeilen benachbarten Bildbereiche wie beschrieben maskiert und nicht ausgewertet. Dies entspricht der Funktion einer virtuellen Spaltblende, da die nicht genutzten, maskierten Bildbereiche den Detektionsorten des außerfokalen Streulichtes entsprechen. Die Konfokalität kann dabei von 1 Airy Unit (2 Zeilen selektiert) bis M Airy-Units variiert werden (virtuelle Spaltblende).
3 zeigt Belichtungsmuster auf der Kamera für konfokale Detektion bei ein- und ausgeschaltetem Modulator (AOM).
Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme wird dabei im Vergleich zur nichtkonfokalen Detektion um den Faktor M verringert. Wenn man einen Bildeinzug von 50 Bildern/s zugrunde legt, kann man bei M = 5 ein vollständiges Bild (bei einer Phasenlage der Strukturierung) in 100 ms erhalten. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass pro Strukturierungsrichtung N = 3 bis 5 Bilder mit verschiedenen Phasenlagen aufgenommen werden müssen. Im linearen Strukturierungsfall mit 3 Strukturierungsrichtungen ergeben sich daher typischerweise 9 Bilder [7], was bei M = 5 zu einer Bildaufnahmezeit von ca. 1 s pro Ebene führt. Eine etwas günstigere Situation ergibt sich, wenn Scanner (9) nicht gleichförmig (mit Geschwindigkeit v_s) über das Bildfeld scannt, sondern sich in den Zeiten mit ausgeschaltetem Laser mit Maximalgeschwindigkeit v_max bewegt, Das stellt zwar höhere Anforderungen an die Steuerung und Synchronität der Scanner, erhöht die Bildaufnahmezeit aber um den Faktor
d. h. ungefähr um das M-fache (wenn v_max >> v_s) bzw. bis zur maximalen Bildaufnahmerate der Kamera.
Bei der linienförmigen, strukturierten Beleuchtung ist zu beachten, dass mit zunehmender Strukturierungsfrequenz die Länge der durch die zirkulare Pupille transmittierten höheren Ordnungen kleiner wird (siehe 4). Dies bedeutet, dass der Kontrast einer Interferenz mit der 0. Ordnung beleuchtungsseitig kleiner wird. Der Kontrast der Interferenz zwischen den höheren Ordnungen ist allerdings bei symetrischen Durchgang durch die Pupille unverändert 100%. Ferner wird die Breite der beugungsbegrenzten Linie im Bild größer. Bei einer auf die Grenzfrequenz normierten Strukturierungsfrequenz von f ergibt sich eine Verbreiterung b (Linienbreite geteilt durch minimale Breite bei voller NA) von
Für eine typische Strukturierungsfrequenz von 90% der Grenzfrequenz (f = 0.9) ergibt sich eine Verbreiterung von 15%. Bei 95% der Grenzfrequenz steigt diese bereits auf 60% an.
Dieser Verbreiterung hat keinen Einfluß auf die Auflösung, die durch die Strukturierungsfrequenz und die Übertragungsfunktion des Objektivs bestimmt wird, wohl aber auf die Unterdrückung außerfokalen Untergrunds und muss für die konfokale Filterung berücksichtigt werden.
4 zeigt Ordnungen der strukturierten Linienbeleuchtung in der Pupille (Fouriertransformation einer strukturierten Linienverteilung). Durch die interferierenden ersten Beugungsordnungen wird auf der Probe eine strukturierte Linie erzeugt. Der Abstand der Beugungsordnungen ist s, a ist die Pupillengröße. Das Verhältnis von s und b ist die auf die Grenzfrequenz normierten Strukturierungsfrequenz f.
Die in 3 dargestellten Linien parallel zur x-Richtung repräsentieren nur eine Strukturierungsrichtung. Die Orientierung der Linien auf der Kamera kann durch Rotation der Einheit (8) (1) eingestellt werden. Die Verschiebungsrichtung und Phasenlage der periodischen Struktur wir mittels der Scanner (9) und (23) eingestellt. Der allgemeine Fall mit einer beliebigen Linienorientierung wird in 5 veranschaulicht.
5 dient zur Erläuterung der Einstellung von Scanrichtung und Phasenlage durch die Scanner bei synchroner Scannerbewegung (a) und bei Scannen mit einem Scanner (b).
Die Phasenlage (Doppelpfeil) der projizierten Struktur wird dabei durch den relativen, konstanten Offset der beiden Scanner (9) und (23) während des Scanvorgangs bestimmt, während die vorzugsweise dazu senkrechte Scan-Richtung (Pfeil) durch die relative Geschwindigkeit der beiden Scanner festgelegt ist. Es ist aber auch möglich, das Abscannen der Probe nur mit Scanner (9) durchzuführen. Dies vereinfacht die Systemsteuerung. Abhängig vom Scanmodus ist sicherzustellen, dass das im Allgemeinen vom Detektor bestimmte Bildfeld auch bei rotierter Linie möglichst homogen ausgeleuchtet wird.
In der bisher beschriebenen Anordnung wird die Formung der in die Probe projizierten Struktur durch die Strahlformungseinheit (8) gewährleistet. Erfindungsgemäß kann die Einheit (8) aus der Kombination einer Linienformungsoptik (7) mit einer periodischen Struktur (13) bestehen. Dabei kann die Linienformungsoptik eine Powell-Linse enthalten. Die periodische Struktur kann eine Phasenstruktur, eine Amplitudenstruktur oder eine Kombination aus beidem darstellen. Weiterhin kann die gesamte Strahlformungseinheit (8) durch ein diffraktiv-optisches Element ersetzt werden (siehe auch DE10155002A1 ). Dieses Element kann auf der Probe eine oder mehrere strukturierte Linien im Mindestabstand M erzeugen um die Zahl der Verschiebungen zu reduzieren.
Ein potentielles Problem der sequentiellen Abtastung der Probe mit M Zeilenmustern entsteht durch Probenbewegung während der Bildaufnahmezeit. Dies ist ein grundsätzliches Problem der Verfahren zur strukturierten Beleuchtung und sollte durch minimale Bildaufnahmezeiten so klein wie möglich gehalten werden. Daher kommt der empfindlichen Detektion mit minimalen Fluoreszenzverlusten zwischen Objekt und Detektor hohe Bedeutung zu. Eine Alternative zur sequentiellen Abtastung mit M Zeilenmustern, die es ermöglicht, anstelle der M Zeilenbilder ein einziges Bild einzuziehen und dennoch konfokale Detektion zu ermöglichen, soll im folgenden beschrieben werden. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, dass beim Linienscanner das Objekt sequentiell zeilenweise abgetastet wird. Das ermöglicht, im Detektionsstrahlengang durch ein weiteres Element eine diskrete, zeilenweise Ablenkung des Detektionslichts zu realisieren, so dass auf dem Detektor ein Zeilenmuster wie in 3 entsteht, obwohl das Objekt ohne Zwischenräume abgescannt wird. Um ein gesamtes Bild derart auf dem Detektor abzubilden ist die Voraussetzung, dass dieser M mehr Zeilen hat als für das Bild erforderlich. Ein typischer Wert sind 500 Zeilen pro Bild. Mit M = 5 ergibt sich eine erforderliche Detektorenzeilenzahl von 2500. Als Element zur Zeilenablenkung könnte z. B. eine Galvoscanner vor dem Detektor zur Anwendung kommen (siehe 6, Scanner (24)). Wenn die Pixelgröße auf der Kamera 5 μm beträgt, so ergibt sich der maximale Ablenkungswinkel so, dass in dem oben aufgeführten Beispiel auf der Kamera ein Versatz von (2500 – 500) × 5 μm = 10 mm entsteht. Dies entspricht bei einem Abstand der Kamera zum Scanner von 50 mm einem Scanwinkel von 5 Grad (für eine Ablenkung von 10 Grad). Um die im Objekt abgetastete Zeile nicht über die Zwischenräume zwischen den Zeilen zu verschmieren ist ein Ausschalten der Belichtung (z. B. durch den AOM bzw. AOTF) während der diskreten Ablenkung von Scanner (24) zweckmäßig. Es ist aber auch denkbar, eine kontinuierliche Belichtung zu realisieren. Da die Scangeschwindigkeit von Scanner (24) sehr hoch im Vergleich zu der des Scanners (9) sein muß, kann man die Belichtung während der Bewegung des Scanners (24) vernachlässigen. Beispielsweise erzeugt der Scanner (24) mit derselben Ablenkachse wie der Scanner (9), der wie oben beschrieben für die Ablenkung in Y Richtung verantwortlich ist, beispielsweise 10 versetzte diskrete Scansprünge innerhalb einer Zeilenposition der sequentiellen Zeilenabtastung des Scanners (9), bevor dieser in die nächste detektierte Zeilenposition vorrückt. Der Scanner (9) kann dabei auch kontinuierlich scannen, während Scanner (24) immer diskret, mit einer hohen Ablenkgeschwindigkeit betrieben werden muß. Die Zeit t_i zwischen den Scansprüngen mit einer Zeit t_d entspricht dabei der effektiven Zeilenintegrationszeit auf der Kamera. Es muß mindestes M·t_d < t_i gelten.
Diese Scansprünge erzeugen auf dem Flächendetektor voneinander beabstandete Signale der beleuchteten Probe, die sinngemäß den voneinander beabstandeten Bereichen des Detektors entsprechen wie sie anhand insbesondere 3 weiter oben ausführlich erläutert wurden.
6 zeigt den schematischen Aufbau des Mikroskops mit alternativer Detektion und einem zusätzlichen Galvo-Scanner (24) mit einer Rotationsachse senkrecht zur Zeichenebene Um eine strukturierte Beleuchtung mit möglichst hohem Kontrast der Strukturierung in der Objektebene zu erhalten ist bei der Verwendung von Optiken mit höheren numerischen Aperturen, wie sie in der Mikroskopie üblich sind, die Polarisation zu beachten. Ein maximaler Kontrast ist nur dann möglich, wenn die Polarisation des Beleuchtungslichtes senkrecht zur Verbindungslinie der Beugungsordnungen in der Pupillenebene (d. h. senkrecht zur Lage der Linie in einer Bildebene) steht, wie in 4 dargestellt. Die entsprechende Polarisation des Beleuchtungslichtes muss daher synchron mit der Rotation der Strahlformungseinheit (8) zur Rotation der Blende mitgedreht werden. Ersteres kann bevorzugt durch die Rotation einer λ/2-Platte im Strahlengang des linear polarisierten Anregungslichts erzeugt werden, wobei der Rotationswinkel der Wellenplatte halb so groß wie die der Strahlformungseinheit ist. Entsprechend ist eine rotierbare Wellenplatte im Strahlengang von 1 und 6 zwischen Quelle (3) und Hauptfarbteiler (19) vorzusehen. Alternativ kann die Strahlformungseinheit auch mit einem Polarisator versehen werden, der nur korrekt orientiertes, linear polarisiertes Licht transmittiert. Dies hat einen rotationsabhängigen Lichtverlust zur Folge, siehe 7, der durch eine geeignet synchronisierte Lichtmodulation kompensiert werden kann.
7 zeigt den Lichtverlust durch Rotation eines Polarisators zusammen mit der Strahlformungseinheit (8) und Kompensation des Verlusts durch Leistungsanpassung
Die Erfindung ist nicht nur an die beschriebenen Ausführungen gebunden.
Im fachmännischen Rahmen können Modifikationen und Veränderungen von den erfinderischen Gedanken erfasst sein,
Beispielsweise ist die Erfindung sinngemäß auf andere Beleuchtungsverteilungen wie Multipunktanordnungen ( US 6028306 ) und anderen Punktanordnungen, auch Nipkowscheiben und bei Detektion im Weitfeld anwendbar.
Literatur:

[1] Neil M.A.A., Juskaitis R., Wilson T.: „Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope", Opt. Lett. 22 (24): 1905–1907, 1997
[2] Lukosz W., Marchand M., "Optische Auflösung unter Überschreitung der beugungsbedingten Auflösungsgrenze", Optica Acta 16, 241–255, 1963
[3] Heintzmann R., Cremer C., "Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating", in Proc. of SPIE 3568: 185–196, 1998
[4] Neil M.A.A., Juskaitis, A., Wilson, T., "Real time 3D fluorescence microscopy by two beam interference illumination", Opt. Comm. 153: 1–4, 1998
[5] US Patent 6,947,127 B2 , 2005
[6] Heintzmann R., Jovin T.M., Cremer C., "Saturated patterned excitation microscopy – a concept for optical resolution improvement" JOSA A, 19 (8): 1599–1609, 2002
[7] Gustafsson, M.G.L., Agard, D.A., Sedat, J.W., "Doubling the lateral resolution of widefield fluorescence microscopy by structured illumination", in Proc. of SPIE 3919: 141–150, 2000
[8] Gustafsson M.G.L., "Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution", PNAS 102: 13081–13086, 2005

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 10155002 A1 [0004, 0013, 0032]
- US 6028306 [0038]
- US 6947127 B2 [0038]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Neil M.A.A., Juskaitis R., Wilson T.: „Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope", Opt. Lett. 22 (24): 1905–1907, 1997 [0038]
- Lukosz W., Marchand M., "Optische Auflösung unter Überschreitung der beugungsbedingten Auflösungsgrenze", Optica Acta 16, 241–255, 1963 [0038]
- Heintzmann R., Cremer C., "Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating", in Proc. of SPIE 3568: 185–196, 1998 [0038]
- Neil M.A.A., Juskaitis, A., Wilson, T., "Real time 3D fluorescence microscopy by two beam interference illumination", Opt. Comm. 153: 1–4, 1998 [0038]
- Heintzmann R., Jovin T.M., Cremer C., "Saturated patterned excitation microscopy – a concept for optical resolution improvement" JOSA A, 19 (8): 1599–1609, 2002 [0038]
- Gustafsson, M.G.L., Agard, D.A., Sedat, J.W., "Doubling the lateral resolution of widefield fluorescence microscopy by structured illumination", in Proc. of SPIE 3919: 141–150, 2000 [0038]
- Gustafsson M.G.L., "Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution", PNAS 102: 13081–13086, 2005 [0038]

Claims

Verfahren zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, bei dem eine Probe oder ein Teil davon mittels linienförmiger Beleuchtung abgetastet wird, – die Beleuchtung der Probe im Fokus in mindestens einer Raumrichtung periodisch strukturiert wird, – von der Probe kommendes Licht detektiert und Bilder der Probe erzeugt werden, – und aus den Bildern mittels mindestens ein optisches Schnittbild und/oder ein Bild mit erhöhter Auflösung berechnet wird durch die Probe berechnet wird, – dadurch gekennzeichnet dass – eine Bildaufnahme und Schnittbildverrechnung mehrfach unter Veränderung der Orientierung der linienförmigen Beleuchtung zur Probe erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Drehung der Linie um die optische Achse erfolgt und bei unterschiedlichen Drehwinkeln eine Bilderzeugung und Schnittbildberechnung erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine gemeinsame Drehung einer Strahlformeinheit zur Linienerzeugung mit Mitteln zur Strukturierung des Beleuchtungslichtes erfolgt.
Verfahren zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, bei dem eine Probe oder ein Teil davon mittels vorzugsweise linienförmiger Beleuchtung abgetastet wird, – die Beleuchtung der Probe im Fokus in mindestens einer Raumrichtung periodisch strukturiert wird, – von der Probe kommendes Licht detektiert und Bilder der Probe erzeugt werden, – und aus den Bildern mittels mindestens ein optisches Schnittbild und/oder ein Bild mit erhöhter Auflösung berechnet wird durch die Probe berechnet wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem Flächendetektor oder einer Kamera zur zeilenweisen nicht descannten Detektion zwischen mit Detektionslicht aus dem beleuchteten Probenbereich belichteten Zeilen Zwischenräume erzeugt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei der vorzugsweise linienweisen Beleuchtung und Detektion die Beleuchtung mehrfach an- und ausgeschaltet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine wiederholte Lichtunterbrechung bei der Probenabtastung derart erfolgt, dass zwischen zwei beleuchteten Probenteilen ein Zwischenraum besteht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, zur konfokalen Bilderzeugung, wobei eine Berechnung eines Bildes durch teilweise oder vollständige Maskierung der Zwischenräume zwischen den belichteten Probenbereichen zugeordneten Kamerabereichen und Verrechnung der so gewonnenen Bilder erfolgt.
Verfahre nach Anspruch 7, wobei die Verrechnung derart erfolgt, benachbart abgetastete Probenbereiche im verrechneten Bild richtig skaliert benachbart zugeordnet sind.
Verfahren zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, bei dem eine Probe oder ein Teil davon mittels vorzugsweise linienförmiger Beleuchtung abgetastet wird, – die Beleuchtung der Probe im Fokus in mindestens einer Raumrichtung periodisch strukturiert wird, – von der Probe kommendes Licht detektiert und Bilder der Probe erzeugt werden, – und aus den Bildern mittels mindestens ein optisches Schnittbild und/oder ein Bild mit erhöhter Auflösung berechnet wird durch die Probe berechnet wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei während eines Scanvorgangs vor dem Detektor eine weitere Lichtablenkung in Richtung der Abtastung der Probe durch die Linie erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Geschwindigkeit der Lichtablenkung größer als die Geschwindigkeit der Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtungslicht ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Lichtablenkung schrittweise erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Lichtablenkung kontinuierlich erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei einer Drehung der Beleuchtungslinie die Polarisation des Beleuchtungslichtes synchron mit der Rotation gedreht wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine mehrfache Abtastung erfolgt und die Lager der periodischen Strukturierung auf der Probe und/oder die Lage des Beleuchtungslichtes auf der Probe verschoben wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mehrere Bilder mit verschiedenen Bildphasen aufgezeichnet und daraus Schnittbilder berechnet werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aufnahme der Bilder mit verschiedenen Bildphasen mit konstantem Zwischenraum zwischen beleuchteten/detektierten Abschnitten erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Lage des Zwischenraums verändert wird und jeweils für eine Lage mehrere Bilder mit verschiedenen Bildphasen aufgezeichnet und daraus Schnittbilder berechnet werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zunächst die Lage des Zwischenraums bei einer Lage der Strukturierung verändert wird und Probenbilder aufgenommen werden und dieser Vorgang dann für eine weitere Lage der Strukturierung wiederholt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Lage des Zwischenraums derart verändert wird dass nacheinander im Wesentlichen alle Probenbereiche linienförmig beleuchtet und das Probenlicht detektiert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Lichtunterbrechung durch Verringerung der Intensität durch einen elektrooptischen und/oder akustooptischen Modulator erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zur periodischen Strukturierung der Beleuchtung ein Lichtstrahl in mehrere Teillichtstrahlen zerlegt wird, diese interferometrisch überlagert und zu einer Linie geformt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das aus einer nichtlinearen Wechselwirkung der Beleuchtung mit der Probe oder eines Teils der Probe resultierende Licht und detektiert wird.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine linienförmige Abtastung mit mehreren Linien simultan erfolgt.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Schnittdicke oder optische Auflösung variiert wird, indem Strukturen mit verschiedenen Modulationsfrequenzen abgebildet werden.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei Beleuchtung mit mehreren Wellenlängen die Schnittdicke durch eine Anpassung der jeweiligen Modulationsfrequenz gleich eingestellt wird.
Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, umfassend – Mittel zur vorzugsweise linienförmigen Beleuchtung der Probe mit mindestens einer Wellenlänge, – Mittel zur räumlichen Strukturierung des Beleuchtungslichtes in mindestens einer Ebene, – Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtungslicht, – Mittel zur Abbildung des von der Probe beeinflussten Lichtes auf mindestens einen Detektor, sowie – Mittel zur Berechnung mindestens eines optischen Schnittbildes und/oder eines Bildes mit erhöhter Auflösung aus der Ortsinformation des von der Probe beeinflussten Lichts, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Veränderung der Orientierung der linienförmigen Beleuchtung zur Probe vorgesehen sind.
Anordnung nach Anspruch 26 , wobei eine gemeinsam drehbare Einheit aus einer Strahlformeinheit zur Linienerzeugung und Mitteln zur Strukturierung des Beleuchtungslichtes im Strahlengang vorgesehen ist
Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, umfassend – Mittel zur vorzugsweise linienförmigen Beleuchtung der Probe mit mindestens einer Wellenlänge, – Mittel zur räumlichen Strukturierung des Beleuchtungslichtes in mindestens einer Ebene, – Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtungslicht, – Mittel zur Abbildung des von der Probe beeinflussten Lichtes auf mindestens einen Detektor, sowie – Mittel zur Berechnung mindestens eines optischen Schnittbildes und/oder eines Bildes mit erhöhter Auflösung aus der Ortsinformation des von der Probe beeinflussten Lichts, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Flächendetektor oder eine Kamera zur nichtdescannten Detektion des Probenlichtes vorgesehen ist und wobei Mittel zur Lichtunterbrechung während des Abtastvorgangs vorgesehen sind, um zwischen beleuchteten Probenbereichen einen Zwischenraum zu erzeugen und/oder auf dem Flächendetektor zwischen mit Detektionslicht aus dem beleuchteten Probenbereich belichteten Zeilen Zwischenräume zu erzeugen.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei Intensitätssteuerungsmittel im Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen sind.
Anordnung nach Anspruch 28 oder 29, wobei ein elektro- oder akustooptischer Modulator zur Lichtunterbrechung vorgesehen ist.
Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, umfassend – Mittel zur vorzugsweise linienförmigen Beleuchtung der Probe mit mindestens einer Wellenlänge, – Mittel zur räumlichen Strukturierung des Beleuchtungslichtes in mindestens einer Ebene, – Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtungslicht, – Mittel zur Abbildung des von der Probe beeinflussten Lichtes auf mindestens einen Detektor, sowie – Mittel zur Berechnung mindestens eines optischen Schnittbildes und/oder eines Bildes mit erhöhter Auflösung aus der Ortsinformation des von der Probe beeinflussten Lichts, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Scanner im Detektionsstrahlengang vorgesehen ist um während des linienweisen Abtastvorgangs das Probenlicht auf dem Detektor linienweise diskret oder kontinuierlich auf dem Detektor aufzuspreizen.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zur Erzeugung der Relativbewegung mindestens ein Scanner vorgesehen ist.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zur Strukturierung der Beleuchtung ein vorzugsweise um die optische Achse drehbares, bezüglich seiner Transparenz strukturiertes optisches Element vorgesehen ist.
Anordnung nach einem der einem der vorangehenden Ansprüche Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Einstellung verschiedener Bildphasen der Strukturierung die Lage mindestens eines Scanners verstellbar ist.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, dass zur Einstellung verschiedener Frequenzstrukturen in den Strahlengang einschwenkbare Gitter verschiedener Periodizität vorgesehen sind.
Anordnung oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, in einem Mikroskop, vorzugsweise einem Laser-Scanning-Mikroskop