DE102007045092A1 - Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons - Google Patents

Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons Download PDF

Info

Publication number
DE102007045092A1
DE102007045092A1 DE102007045092A DE102007045092A DE102007045092A1 DE 102007045092 A1 DE102007045092 A1 DE 102007045092A1 DE 102007045092 A DE102007045092 A DE 102007045092A DE 102007045092 A DE102007045092 A DE 102007045092A DE 102007045092 A1 DE102007045092 A1 DE 102007045092A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
protein
activity
compounds
monooxygenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102007045092A
Other languages
German (de)
Inventor
Roland H. Dr. Müller
Uta Dr. Breuer
Martin von Dr. Bergen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Original Assignee
Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ filed Critical Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Priority to DE102007045092A priority Critical patent/DE102007045092A1/en
Priority to EP08804177A priority patent/EP2205726A1/en
Priority to PCT/EP2008/062216 priority patent/WO2009037216A1/en
Publication of DE102007045092A1 publication Critical patent/DE102007045092A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Proteine und Enzymgemische mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase und seine Verwendung in enzymatischen Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen in aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Verbindungen mit Methylgruppen in verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen oxidiert, welche insbesondere acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen darstellen bzw. Verbindungen mit Methylgruppen an am C2-Atom mono- oder disubstituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffe, wobei die Substituenten gleich oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise betrifft die Erfindung einen biotechnologischen Prozess zur Oxidation von Methylgruppen in den verzweigtkettigen Strukturen, wobei Mikroorganismen, die die gewünschte Monooxygenase-Aktivität besitzen oder produzieren, in einem wässrigen System kultiviert werden und zu entsprechenden Zielprodukten umgewandelt werden.The invention relates to novel proteins and enzyme mixtures having the enzymatic activity of a monooxygenase and its use in enzymatic processes for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons. According to the invention, compounds with methyl groups in branched-chain aliphatic hydrocarbons are preferably oxidized, which in particular represent acyclic compounds and / or aliphatic compounds with functional groups or compounds with methyl groups on aliphatic or disubstituted aliphatic hydrocarbons on the C2 atom, where the substituents are the same or different can. Preferably, the invention relates to a biotechnological process for the oxidation of methyl groups in the branched-chain structures wherein microorganisms possessing or producing the desired monooxygenase activity are cultured in an aqueous system and converted to corresponding target products.

Description

Die Erfindung betrifft neue Proteine und Enzymgemische mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase und seine Verwendung in enzymatischen Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen in aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Verbindungen mit Methylgruppen in verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen oxidiert, welche insbesondere acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen darstellen, bzw. Verbindungen mit Methylgruppen an am C2-Atom mono- oder disubstituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffe, wobei die Substituenten gleich oder unterschiedlich sein können. Vorzugsweise betrifft die Erfindung einen biotechnologischen Prozess zur Oxidation von Methylgruppen in den verzweigtkettigen Strukturen, wobei Mikroorganismen, die die gewünschte Monooxygenase-Aktivität besitzen oder produzieren, in einem wässrigen System kultiviert werden und zu entsprechenden Zielprodukten umgewandelt werden.The The invention relates to novel proteins and enzyme mixtures with the enzymatic Activity of a monooxygenase and its use in enzymatic Process for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons. According to the invention, compounds are preferred with methyl groups in branched-chain, aliphatic hydrocarbons oxidized, which in particular acyclic compounds and / or aliphatic Represent compounds with functional groups, or compounds with methyl groups on the C2 atom mono- or disubstituted aliphatic Hydrocarbons wherein the substituents are the same or different could be. Preferably, the invention relates to a biotechnological process for the oxidation of methyl groups in the branched-chain structures, wherein microorganisms containing the desired Possess or produce monooxygenase activity in one aqueous system to be cultivated and to appropriate Target products are converted.

2-Methyl-1,2-dihydroxypropan und Folgeprodukte bzw. in C2-substituierte Propanole und Folgeprodukte sind von großem Interesse als Synthesezwischenprodukte von Arzneimitteln, Feinchemikalien und dergleichen. Z. B. durch Veresterung und/oder Veretherung einer oder beider Hydroxy-Gruppen von Propan-1,2-diol lassen sich zahlreiche als Lösemittel, Weichmacher, Verdickungsmittel oder Emulgatoren verwendbare Produkte gewinnen. Auch die Herstellung von optisch aktiven Verbindungen ist von großer Bedeutung ( EP1 550 730 A1 ). Die optisch aktiven (R)-(–)- und (S)-(+)-Formen finden als chiraler Baustein in organischen Synthesen Verwendung und sind Testsubstrate für die Entwickung von Trennmethoden für Enantiomere. (R)-(–)- und (S)-(+)- Formen von C2-substituierten Propanolen und Folgeprodukten in Form der korrespondierenden Säure z. B. sind wirkstoffaktiv und kommen im pharmazeutischen Bereich oder im Pflanzenschutz und der Landwirtschaft zum Einsatz.2-Methyl-1,2-dihydroxypropane and derived products or in C2-substituted propanols and secondary products are of great interest as synthetic intermediates of drugs, fine chemicals and the like. For example, by esterification and / or etherification of one or both hydroxy groups of propane-1,2-diol, it is possible to obtain numerous products which can be used as solvents, plasticizers, thickeners or emulsifiers. The preparation of optically active compounds is also of great importance ( EP1 550 730 A1 ). The optically active (R) - (-) and (S) - (+) - forms are used as chiral building block in organic syntheses and are test substrates for the development of separation methods for enantiomers. (R) - (-) - and (S) - (+) - forms of C2-substituted propanols and secondary products in the form of the corresponding acid z. B. are active ingredient and are used in the pharmaceutical sector or in crop protection and agriculture.

Eine Quelle für Enzymaktivitäten zur Oxidation von verzweigtkettigen Alkanderivaten wird in Bakterien-Stämmen gesehen, die Methyl-tert.butylether (MTBE) und verwandte Verbindungen wie Ethyl-tert-butylether (ETBE) und tert.-Amyl-methylether (TAME) abzubauen vermögen. Diese Verbindungen werden seit den 80-iger Jahren des vorigen Jahrhunderts als sog. Oxygenate zur Erhöhung der Oktanzahl in Kraftstoffen eingesetzt. Der intensive Umgang mit diesen Verbindungen hat zu einer Belastung der Umwelt geführt. Möglichkeiten für eine Entlastung von Kontaminationen werden wegen seiner Universalität und Versatilität im Allgemeinen im metabolischen Potenzial von Mikroorganismen gesehen. MTBE und verwandte Substanzen erweisen sich allerdings als rekalzitrant.A Source of enzyme activities for the oxidation of Branched-chain alkane derivatives are found in bacterial strains seen, the methyl tert-butyl ether (MTBE) and related compounds such as ethyl tert-butyl ether (ETBE) and tert-amyl methyl ether (TAME) able to degrade. These compounds have been around since the 80's Years of the last century as so-called oxygenates to increase the octane number used in fuels. The intensive dealing with These compounds have led to pollution of the environment. Possibilities for a discharge of contaminations because of its universality and versatility generally seen in the metabolic potential of microorganisms. MTBE and related substances, however, prove to be recalcitrant.

Der Stoffwechsel von MTBE ist allerdings nur teilweise aufgeklärt. Der Abbau beginnt prinzipiell mit einer Spaltung der Etherbindung, dafür kommt ein Monooxygenase-Mechanismus in Frage. Für Rhodococcus ruber IFP2001 bzw. A. tertiaricarbonis L108 wird dieser Schritt durch ein P450-abhängiges Enzym katalysiert, codiert durch die Gene ethABCD. Das aus der Spaltung resultierende tert-Butoxymethanol führt über chemische Dismutation oder eine entspr. Dehydrogenase zu tert-Butylalcohol (TBA). Dieses Intermediat findet man häufig in MTBE abbauenden Kulturen, d. h., dass der Schritt in der weiteren Metabolisierung dieser Verbindung unter diesen Umständen geschwindigkeitsbestimmend ist.Of the However, metabolism of MTBE is only partially elucidated. The degradation begins in principle with a cleavage of the ether bond, for this, a monooxygenase mechanism comes into question. For Rhodococcus ruber IFP2001 or A. tertiaricarbonis L108 becomes this Step catalyzed by a P450-dependent enzyme through the genes ethABCD. The resulting from the cleavage tert-butoxymethanol leads via chemical dismutation or a corr. Dehydrogenase to tert-butyl alcohol (TBA). This intermediate finds commonly found in MTBE degrading crops, d. h., that the Step in the further metabolization of this compound under is speed-limiting in these circumstances.

Kürzlich konnte in Mycobacterium austroafricanum IFP2012 gezeigt werden, dass AlkB, die typische und weit verbreitet n-Alkan Monooxygenase in Gegenwart von MTBE indiziert wird ( Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909–919 ). AlkB als allgemeine n-Alkan Monooxygenase verfügt bekanntlich über ein weites Substratspektrum. Die Substratspezifität von AlkB-typischen Enzymen ist allerdings variabel, aber besonders hoch für n-Alkanstrukturen, während verzweigtkettige Verbindungen von diesen Monooxygenasen eher langsam oder gar nicht umgesetzt werden. Das zeigt sich auch im Falle von Stamm IFP2012, der maximale spezifische Wachstumsrate μmax auf TBA von nur 0.039 h–1 aufweist. Die Tatsache, dass die Umsatzraten so klein sind, spricht dafür, dass es sich auch hierbei um eine unspezifische Reaktion des Enzyms handelt. Für einen anderen grampositiven Stamm konnte μmax von 0.032 h–1 ermittelt werden, zu den beteiligten Enzymen gibt es keine Angaben. Für Variovorax paradoxus CL-8 werden ähnlich kleine Raten von max = 0.042 h-1 erhalten (Zaitsev et al. 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:1092). Auch hier ist das den initialen Schritt katalysierende Enzym unbekannt. Für andere Stämme gibt es bezüglich des beteiligten Enzyms keine und betreffs der realisierten Substratumsätze wenige weitere verwertbare Angaben.Recently, it has been shown in Mycobacterium austroafricanum IFP2012 that AlkB, the typical and widely used n-alkane monooxygenase, is indicated in the presence of MTBE ( Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909-919 ). AlkB as general n-alkane monooxygenase is known to have a broad substrate spectrum. However, the substrate specificity of AlkB-typical enzymes is variable, but particularly high for n-alkane structures, while branched-chain compounds are reacted rather slowly or not at all by these monooxygenases. This is also evident in the case of strain IFP2012, which has a maximum specific growth rate μ max to TBA of only 0.039 h -1 . The fact that the conversion rates are so low suggests that this is also a non-specific reaction of the enzyme. For another gram-positive strain μ max of 0.032 h -1 could be determined, for the enzymes involved there is no information. For Variovorax paradoxus CL-8, similarly small rates of max = 0.042 h-1 are obtained (Zaitsev et al., 2007, Appl. Microbiol., Biotechnol., 74: 1092). Again, the enzyme catalyzing the initial step is unknown. For other strains, there are no further useful data concerning the enzyme involved and, with regard to the realized substrate conversions, only a few further useful data.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, nach weiteren Proteinen und Enzymsystemen zu suchen, die in der Lage sind, verzweigtkettige aliphatische Verbindungen zu nutzen und in Zielprodukte umzuwandeln, die als Zwischen- oder Endprodukte von industriellem Interesse sind.Of the The invention was therefore based on the object for other proteins and to look for enzyme systems that are capable of branched-chain to use aliphatic compounds and convert them into target products, which are of intermediate interest or end products of industrial interest.

Der Erfindung liegt dabei die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass im Stamm L108 (DSM 18260) aufgrund seiner hohen Wachstumsraten auf TBA von 0.1 h–1 und der daraus resultierenden hohen spezifische TBA Umsatzraten, die sich auf bis zu 210 mmol/h·g Biomasse belaufen, ein Enzymsystem gefunden wurde, das auf Verbindungen mit tertiärem Kohlenstoffatom induziert wurde. Ein Protein konnte nach massenspektrometrischen Untersuchungen und Sequenanalyse als nominelle Phthalatdioxygenase ausgewiesen werden. Ein weiteres Protein konnte als Fe/S-Oxidoreduktase diagnostiziert werden. Beide zusammen stellen ein Enzymsstem dar, wobei die Phthalatdioxygenase eine große Untereinheit und Fe/S-Oxidoreduktase eine kleine Untereinheit dieses Enzymkomplexes darstellen. Die Bestätigung der Funktion des Enzyms bzw. seiner beiden Komponenten im Stoffwechsel von TBA wurde durch Ausschalten der betreffenden Gene gezeigt. Das Enzymsystem wirkt im vorliegenden Fall überraschenderweise als Monooxygenase.The invention is based on the surprising finding that in strain L108 (DSM 18260) due to its high growth rates on TBA of 0.1 h -1 and the resulting high specific TBA conversion rates, which amount to up to 210 mmol / h · g biomass, an enzyme system was found which was induced on compounds with a tertiary carbon atom. A protein could be identified as a nominal phthalate dioxygenase by mass spectrometry and sequencing analysis. Another protein could be diagnosed as Fe / S-oxidoreductase. Together, they represent an enzyme that phthalate dioxygenase is a large subunit and Fe / S oxidoreductase is a small subunit of this enzyme complex. The confirmation of the function of the enzyme or its two components in the metabolism of TBA was shown by switching off the relevant genes. The enzyme system surprisingly acts as monooxygenase in the present case.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase, welches ein Protein mit Hydroxylase-Aktivität und ein Protein mit Oxidoreduktase-Aktivität aufweist. Dieses Enzymsystem ist zur Oxidation einer Methylgruppe an verzweigtkettigen, aliphatischen Strukturen befähigt, wobei die Oxidation an einem tertiären oder sekundären C-Atom stattfinden kann, sowie an Methylgruppen in Verbindungen, die am C2-Atom substituiert sind, so dass nach Oxidation auch Verbindungen mit einem optisch aktiven C-Atom gewonnen werden.object Therefore, the invention is an enzyme system with the enzymatic Activity of a monooxygenase containing a protein with Hydroxylase activity and a protein with oxidoreductase activity having. This enzyme system is for the oxidation of a methyl group capable of branched-chain, aliphatic structures, the oxidation being at a tertiary or secondary C atom, as well as methyl groups in compounds, which are substituted at the C2 atom, so that after oxidation also compounds be obtained with an optically active carbon atom.

Unter verzweigtkettigen, aliphatischen Strukturen werden im Sinne der Erfindung insbesondere acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen verstanden, welche die Reaktivität erhöhen und eine charakteristische Reaktionsweise induzieren. Dazu gehören Kohlenwasserstoffverbindungen (KW), wie z. B. Alkane, Alkene und Alkine. Aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen sind z. B. KW mit C,C-Doppelbindung (Alkene), C,C-Dreifachbindung (Alkine), mit Halogengruppe (FKW, CKW, BKW, IKW), Hydroxy-Gruppe (Alkohole), Alkoxy-Gruppe (Ether), Thiol-Gruppe, Carbonylgruppe (Aldehyde, Ketone), Thiocarbonyl-Gruppe (Thioaldehyde, Thioketone), Carboxy-Gruppe (Carbonsäuren), Amino-, Imino-, Carboxamid-Gruppe (Amine, Imine, Amide), Alkoxycarbonyl-Gruppe (Ester), Nitril-Gruppe, Nitro-Gruppe und Sulfonsäure-Gruppe.Under Branched-chain, aliphatic structures are used in the sense of Invention, in particular acyclic compounds and / or aliphatic Compounds with functional groups understood the reactivity increase and induce a characteristic reaction. These include hydrocarbon compounds (HC), such as. Alkanes, alkenes and alkynes. Aliphatic compounds with functional Groups are z. B. KW with C, C double bond (alkenes), C, C triple bond (Alkynes), with halogen group (HFC, CHC, BKW, IKW), hydroxy group (Alcohols), alkoxy group (ethers), thiol group, carbonyl group (Aldehydes, ketones), thiocarbonyl group (thioaldehydes, thioketones), Carboxy group (carboxylic acids), amino, imino, carboxamide group (Amines, imines, amides), alkoxycarbonyl group (esters), nitrile group, Nitro group and sulfonic acid group.

Das bevorzugte Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase umfasst mindestens ein Protein mit der SEQ ID NO: 1, sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Hydroxylase-Aktivität aufweisen. Weiterhin umfasst es ein Protein mit der SEQ ID NO: 2, sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen.The preferred enzyme system with the enzymatic activity a monooxygenase comprises at least one protein having the SEQ ID NO: 1, as well as mutants, variants and parts thereof, which have a sequence homology of have at least 50% and have hydroxylase activity. Furthermore, it comprises a protein with the SEQ ID NO: 2, as well as mutants, Variants and parts thereof that have a sequence homology of at least Have 50% and have oxidoreductase activity.

Besonders bevorzugt ist ein Enzymsystem, das als große Untereinheit Proteinsequenz SEQ ID NO: 1 und als kleine Untereinheit SEQ ID NO: 2 umfasst sowie deren zu mindestens 50% Homologen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.Especially preferred is an enzyme system that acts as a large subunit Protein sequence SEQ ID NO: 1 and as a small subunit SEQ ID NO: 2 and their at least 50% homologs, which are the same Have properties.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein oligomeres Protein, das aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 besteht.object The invention is also an oligomeric protein derived from the Sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 consists.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist das Protein mit der SEQ ID NO: 1 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Hydroxylase-Aktivität aufweisen. Bevorzugt weist das Protein mit der SEQ ID NO: 1 und deren zu mindestens 50% Homologe die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 auf, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 für die Bindung des Rieske-Typ Cys2His2[2Fe-2S] Clusters und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 für die Bindung eines singulären Fe2+ stehen.Likewise provided by the invention is the protein having SEQ ID NO: 1 and its at least 50% homologs having hydroxylase activity. The protein with SEQ ID NO: 1 and its at least 50% homologues preferably has the conserved motifs SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10, the conserved motifs SEQ ID NO: 3 for binding the Rieske-type Cys 2 His 2 [2Fe-2S] cluster and SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 for the binding of a singular Fe 2+ .

Gegenstand der Erfindung ist auch das Protein mit der SEQ ID NO: 2 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen. Bevorzugt weist das Protein SEQ ID NO: 2 die konservierten Motive SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 auf, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 5 für die Bindung von FMN bzw. FAD, SEQ ID NO: 6 für die Bindung eines pflanzentypischen Cys4[2Fe-2S] Clusters sowie SEQ ID NO: 7 für die Bindung von Ferredoxin stehen.The invention also relates to the protein having the SEQ ID NO: 2 and its at least 50% homologs having oxidoreductase activity. Preferably, the protein SEQ ID NO: 2 has the conserved motifs SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, wherein the conserved motifs SEQ ID NO: 5 for the binding of FMN or FAD, SEQ ID NO: 6 for the binding of a plant-specific Cys 4 [2Fe-2S] cluster and SEQ ID NO: 7 for the binding of ferredoxin.

Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäuremolekül codierend ein Enzym mit der Aktivität einer Monooxygenase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

  • a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist;
  • b) Nukleinsäuremoleküle, die die unter SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 9 dargestellte Nukleotidsequenzen aufweisen.
The invention also relates to a nucleic acid molecule encoding an enzyme having the activity of a monooxygenase selected from the group consisting of
  • a) nucleic acid molecules encoding a protein having the amino acid sequences given under SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2;
  • b) Nucleic acid molecules which have the nucleotide sequences shown under SEQ ID NO: 8 and / or SEQ ID NO: 9.

Es hat sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Enzymsystem bevorzugt ein heterodimeres Protein darstellt, welches die unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 beschriebenen Untereinheiten umfasst und so eine hervorragende Enzymaktivität besitzt.It has been found that the enzyme system according to the invention is preferably a heterodimeric protein which comprises the subunits described under SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and thus has excellent enzyme activity.

Ein bevorzugtes Nukleinsäuremolekül codiert ein Protein, das als oligomeres Enzym zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Untereinheiten die unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.One preferred nucleic acid molecule encodes a protein, that as an oligomeric enzyme composed of two different Subunits indicated under SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 Has amino acid sequences.

Ein Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-Molekül, vorzugsweise cDNA oder genomische DNA und/oder ein RNA-Molekül sein. Sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugsweise aus Bakterienstamm HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) oder Methylibium sp. R8 (DSM 19669).One Nucleic acid molecule can be a DNA molecule, preferably cDNA or genomic DNA and / or an RNA molecule be. Both nucleic acids and proteins can be isolated from natural sources, preferably from Bacterial strain HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) or methylibium sp. R8 (DSM 19669).

Die Proteine können aber auch nach an sich bekannten Verfahren chemisch z. B. mittels Festphasensynthese, gentechnisch mittels eines prokaryotischen Wirts synthetisiert oder im weitesten Sinne durch gerichtete Mutagenese respektive Enzym- Design erzeugt werden.The But proteins can also according to known methods chemically z. B. by solid phase synthesis, by genetic engineering of a prokaryotic host synthesized or in the broadest sense be generated by directed mutagenesis or enzyme design.

In den erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuremolekülen können mittels an sich bekannter molekularbiologischer Techniken Mutationen erzeugt werden, was ermöglicht, dass weitere Enzyme mit analogen oder ähnlichen Eigenschaften synthetisiert werden können, die ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden können. Mutationen können Deletionsmutationen sein, die zu verkürzten Enzymen führen. Durch andere molekulare Mechanismen wie z. B. Insertionen, Duplikationen, Transpositionen, Genfusion, Nukleotidaustausch oder auch Gentransfer und Kombination von Genen („gene-shuffling") zwischen verschiedenen Mikroorganismenstämmen können ebenfalls modifizierte Enzyme mit ähnlichen oder analogen Eigenschaften erzeugt werden.In the nucleic acid molecules used in the invention can by means of known molecular biological Techniques mutations are generated, which allows that other enzymes with analog or similar properties can be synthesized, which also used according to the invention can be. Mutations can be deletion mutations which lead to shortened enzymes. By other molecular mechanisms such. B. insertions, duplications, Transpositions, gene fusion, nucleotide exchange or gene transfer and gene-shuffling between different genes Microorganism strains can also be modified Generates enzymes with similar or analogous properties become.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäuremoleküle kann unter Verwendung der Nukleinsäuremoleküle oder Teilen davon erfolgen. Die mit den Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäß verwendbares Enzym codieren. Unter Fragmente werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um das beschriebene Enzym zu codieren. Unter Derivat werden Sequenzen dieser Moleküle verstanden, die sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%, 95%, 97% oder 99% auf Nukleinsäureebene. Dabei weisen die codierten Enzyme eine Sequenzidentität zu den angegebenen Aminosäuresequenzen von mindestens 50% oder mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt mindestens 97% bzw. mindestens 99% auf Aminosäureebene auf. Die Abweichungen können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Es kann sich dabei um natürlich auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise auftreten können oder durch gezielte Mutagenese (UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, chemische Mittel oder weitere). Ferner kann es sich bei den Varianten um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Diese Varianten weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie z. B. Enzymaktivität, aktive Enzymkonzentration, Untereinheiten, funktionelle Gruppen, immunologische Reaktivität, Konformation und/oder physikalische Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophorese, chromatographisches Verhalten, Löslichkeit, Sedimentationskoeffizienten, pH-Wert-Optimum, Temperatur-Optimum, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität und/oder andere.The Identification and Isolation of Such Nucleic Acid Molecules can be done using the nucleic acid molecules or parts thereof. The with the nucleic acid molecules hybridizing molecules also include fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules described above encode an enzyme useful in the invention. Fragments include fragments of the nucleic acid molecules long enough to encode the enzyme described. By derivative are meant sequences of these molecules different from the sequences of the above-described nucleic acid molecules differ at one or more positions, but a high one Have degree of homology to these sequences. Homology means while a sequence identity of at least 40%, in particular one Identity of at least 60%, preferably over 80% and more preferably over 90%, 95%, 97% or 99% at the nucleic acid level. In this case, the coded enzymes a sequence identity to the indicated amino acid sequences at least 50% or at least 60%, preferably at least 80%, more preferably at least 95%, most preferably at least 97% or at least 99% at the amino acid level on. The deviations may be due to deletion, substitution, Insertion or recombination may have arisen. It can work to deal with naturally occurring variations, for example to sequences from other organisms, or to mutations, these Mutations can occur naturally or by targeted mutagenesis (UV rays, X-rays, chemical agents or more). Furthermore, it may be in the variants to act synthetically produced sequences. These variants have certain common characteristics, such as B. enzyme activity, active enzyme concentration, subunits, functional groups, immunological reactivity, conformation and / or physical Properties, such as the running behavior in gel electrophoresis, chromatographic Behavior, solubility, sedimentation coefficients, pH optimum, Temperature optimum, spectroscopic properties, stability and / or others.

Das erfindungsgemäße Enzymsystems mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase wird bevorzugt dadurch hergestellt, dass die Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Homologe in einem prokaryontischen Wirt einzeln oder gemeinsam kloniert und exprimiert werden und nach ihrer Expression in geeigneter Weise einzeln oder kombiniert gewonnen werden.The Enzyme system according to the invention with the enzymatic Activity of a monooxygenase is preferably prepared by that the proteins having the SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 or their homologues in a prokaryotic host individually or together be cloned and expressed and after their expression in a suitable Be won individually or in combination.

Das erfindungsgemäße Enzymsystem wird bevorzugt in einem Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen, die an einer verzweigtkettigen, aliphatischen Struktur lokalisiert sind, oder an Verbindungen, die nach Oxidation ein optisch aktives C-Atom besitzen, verwendet, wobei die Oxidation an am sec oder tert C-Atom lokalisierten Methylgruppen stattfindet bzw. endständige Methylgruppen in am C2-substituierten Alkanderivaten betrifft. So werden einer wässrigen Reaktionslösung, die ein erfindungsgemäßes Enzymsystem bzw. Protein aufweist oder einen diese produzierenden Mikroorganismus, mit den Methylgruppen-tragenden Verbindungen inkubiert und anschließend die entsprechend umgewandelte Zielverbindung gewonnen, welche als Zwischen- oder Endprodukt bzw. als sog. „building block" fungiert. Mögliche Zwischen- bzw. Zielprodukte bzw. „building blocks" sind Oxidationsprodukte, z. B. im weitesten Sinne Propanderivate, wobei darunter sowohl eigentliche Propanderivate verstanden werden, die am C2-Atom substituiert sind und nach der Oxidation optisch aktive Verbindungen ergeben, die z. B. als R- bzw. S-Enantiomere als Wirkstoffformen in der pharmazeutischen Industrie (bevorzugt das S-Enantiomer), z. B. Profene, bzw. im Pflanzenschutz und der Landwirtschaft (bevorzugt das R-Enantiomer), z. B. Phenoxyalkanoate, eingesetzt werden. Darunter werden aber auch 2-Methyl-Alkanstrukturen verstanden, die hier im Sinne des enzymatischen Mechanismus synonym für an C2 substituierten Propanderivaten verstanden werden.The enzyme system according to the invention is preferably used in a process for the oxidation of methyl groups which are located on a branched-chain, aliphatic structure, or on compounds which have an optically active carbon atom after oxidation, the oxidation being carried out on sec or tert-C. Atom localized methyl groups takes place or terminal methyl groups in the C2-substituted alkane derivative is concerned. Thus, an aqueous reaction solution which has an enzyme system or protein according to the invention or a microorganism producing it, is incubated with the compounds carrying methyl groups, and then the correspondingly converted target compound is obtained, which Intermediate or end product or as a so-called "building block." Possible intermediate or target products or "building blocks" are oxidation products, eg. B. in the broadest sense propane derivatives, which are understood to include both actual propane derivatives, which are substituted on the C2 atom and after the oxidation give optically active compounds, the z. B. as R- or S-enantiomers as drug forms in the pharmaceutical industry (preferably the S-enantiomer), z. As Profene, or in crop protection and agriculture (preferably the R-enantiomer), z. As phenoxyalkanoates, are used. However, this also means 2-methyl-alkane structures, which in the sense of the enzymatic mechanism are understood to be synonymous with propane derivatives substituted on C2.

Strukturen mit tertiären Kohlenstoffatomen sind folglich als an C2 di-substituierte Propanderivate zu interpretieren.structures with tertiary carbon atoms are therefore as at C2 to interpret di-substituted propane derivatives.

In einer bevorzugten Ausführung wird eine Hydroxylierung von Methylgruppen an aliphatischen Verbindungen, vorzugsweise Alkane oder Kohlenwasserstoffe mit funktionellen Gruppen, vorzugsweise mit 3 bis 10 C-Atomen mit sekundären und tertiären C-Atomen, durchgeführt. Das betrifft z. B. 2,2-Dimethylhexan als einem mittelkettigen verzweigtkettigen Vertreten mit tertiärem C-Atom oder 2,4- bzw. 2,5-Dimethylhexan mit einem oder zwei sekundären C-Atomen.In In a preferred embodiment, hydroxylation of Methyl groups on aliphatic compounds, preferably alkanes or hydrocarbons having functional groups, preferably with 3 to 10 C atoms with secondary and tertiary C atoms, performed. This concerns z. B. 2,2-dimethylhexane as a medium-chain branched-chain representative with tertiary C atom or 2,4- or 2,5-dimethylhexane with one or two secondary C-atoms.

In einer weiteren Ausführungsvariante werden die Methylgruppen an einem sekundären C-Atom (C2) oxidiert, wobei bevorzugt Verbindungen eingesetzt werden, die nach Oxidation der am sekundären C-Atom lokalisierten Methylgruppe zu Verbindungen mit einem optisch aktiven Zentrum am sekundären C-Atom führen. Das betrifft z. B. 2,5-Dimethylhexan bzw. -hexen als einem mittelkettigen verzweigtkettigen Vertreten in gesättigter bzw. ungesättigter Form oder z. B. 2-Chlorpropan als dem Vertreter mit der kürzesten hier relevanten Kette.In In another embodiment, the methyl groups oxidized at a secondary carbon atom (C2), with preference Compounds are used after oxidation of the secondary C atom localized methyl group to compounds with an optical active center at the secondary carbon atom. The concerns z. B. 2,5-dimethylhexane or hexene as a medium-chain Branched-chain representatives in saturated or unsaturated Shape or z. B. 2-Chloropropane as the representative with the shortest here relevant chain.

Das erfindungsgemäß Verfahren ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus oder ein Rohextrakt davon eingesetzt wird. Als natürliche Quellen werden vorzugsweise Bakterienstamm HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) oder Methylibium sp. R8 (DSM 19669) genutzt. Mit diesen Stämmen wurden bevorzugte geeignete biologische Systeme gefunden. Stamm HCM-10 wurde gemäß Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, DE unter der Nummer DSM 18028 am 03.03.2006 hinterlegt; Stamm Ideonella sp. L108 wurde am 28.04.2006 bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig, DE unter der Nummer DSM 18260 hinterlegt, und Stamm Methylibium sp. R8 wurde am 04.09.2007 bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig, DE unter der Nummer DSM 19669 hinterlegt. Stamm Methylibium sp. R8 (DSM 19669) ist neu.The The method according to the invention is characterized in particular characterized in that a microorganism or a crude extract thereof is used. As natural sources are preferred Bacterial strain HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) or methylibium sp. R8 (DSM 19669) used. With these tribes preferred suitable biological systems have been found. tribe HCM-10 was under the Budapest Treaty on the deposit of microorganisms for the purpose of Patent proceedings at the German Collection of Microorganisms and Zellkulturen GmbH, Braunschweig, DE under the number DSM 18028 am 03.03.2006 deposited; Strain Ideonella sp. L108 was on 28.04.2006 at the German strain collection for microorganisms and Cell cultures in Braunschweig, DE under the number DSM 18260 deposited, and strain Methylibium sp. R8 was on 04.09.2007 at the German Strain collection for microorganisms and cell cultures in Braunschweig, DE under the number DSM 19669 deposited. Strain Methylibium sp. R8 (DSM 19669) is new.

Bevorzugt wird das Verfahren so durchgeführt, dass gegebenenfalls Substrate zugeführt werden, die das Wachstum der Mikroorganismen gewährleisten und so eine Stabilität bzw. Stabilisierung des Enzymsystems garantieren bzw. Reduktionsäquivalente für die Monooxygenase bereitstellen. Vorzugsweise handelt es sich dabei um heterotrophe Substrate, die von unveränderten Mikroorganismus als Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum und Vermehrung genutzt werden können. In einer weiter bevorzugten Variante wird die Vor-Kultivierung der Zellen so durchgeführt, dass Produkte oder Speicherstoffe, z. B. Polyhydroxybuttersäure (PHB) akkumuliert werden, indem z. B. die Stickstoffquelle im Medium das Wachstum limitiert, und die polymeren Speicherstoffe während der Produktbildung zur Bereitstellung und Regenerierung von Reduktionsäquivalenten genutzt werden. In einer weiteren bevorzugten Variante werden die Zellen der Mikroorganismen gegebenenfalls in Gegenwart eines auxiliaren Substrates inkubiert, das zur Bereitstellung bzw. zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten geeignet ist. Vorzugsweise wird als auxiliares Substrat Ameisensäure oder seine Salze verwendet. Gegebenenfalls wird dazu das Gen für eine Formiat-Dehydrogenase kloniert und exprimiert. Es können auch zellfreie Rohextrakte der Mikroorganismen eingesetzt werden, vorzugsweise zellfreie Rohextrakte des Mikroorganismus HCM-10.Prefers the procedure is carried out so that, if necessary Substrates are fed to the growth of microorganisms ensure stability and stabilization of the enzyme system guarantee or reduction equivalents provide for the monooxygenase. Preferably these are heterotrophic substrates, that of unchanged Microorganism as carbon and energy source for Growth and propagation can be used. In a further preferred variant is the pre-cultivation of the cells performed so that products or storage materials, eg. As polyhydroxybutyrate (PHB) are accumulated by z. B. the nitrogen source in the medium limits growth, and the polymeric storage materials during product formation for the provision and regeneration of reduction equivalents be used. In a further preferred variant, the Cells of the microorganisms optionally in the presence of an auxiliary Substrate incubated, the provision or for regeneration of reduction equivalents is suitable. Preferably used as an auxiliary substrate formic acid or its salts. Optionally, this will be the gene for a formate dehydrogenase cloned and expressed. It can also cell-free crude extracts the microorganisms are used, preferably cell-free crude extracts of the microorganism HCM-10.

Dabei wird das Verfahren so gesteuert, dass das Protein mit der Oxidoreduktase-Aktivität zum Transfer von Reduktionsäquivalenten aus reduzierten Coenzymen zum Protein mit Hydroxylase-Aktivität führt. Reduzierte Coenzyme sind in der Regel NADH + H+ bzw. NADPH + H+.The process is controlled so that the protein with the oxidoreductase activity leads to the transfer of reducing equivalents from reduced coenzymes to the protein with hydroxylase activity. Reduced coenzymes are usually NADH + H + and NADPH + H +, respectively.

In einer anderen Ausführungsvariante werden Zellextrakte und/oder Enzymsystem mit Monooxygenase-Aktivität nach teilweiser oder vollständiger Isolierung aus den Mikroorganismen, ggf. in gereinigter Form und ggf. unter Zusatz weiterer Enzyme, z. B. für die Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt.In In another embodiment, cell extracts and / or Enzyme system with monooxygenase activity after partial or complete isolation from the microorganisms, if appropriate in a purified form and optionally with the addition of further enzymes, z. B. for the regeneration of reduction equivalents used.

Ein Mikroorganismus kann nach Klonierung und Expression der Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 als ganze Zelle, unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert eingesetzt werden. In Kombination zu Enzymsystem und Proteinen können dabei weitere Enzyme oder Enzymsysteme zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt werden, welche in Lösung oder trägerfixiert eingesetzt werden können.One Microorganism can after cloning and expression of proteins with SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 as a whole cell, unchanged, be used permeabilized or carrier-fixed. In combination Enzyme system and proteins can be further enzymes or enzyme systems for the regeneration of reduction equivalents can be used, which in solution or carrier-fixed can be used.

Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme produzieren bevorzugt die Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 bzw. umfassen die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 9 oder deren zu mindestens 50% Homologen. Im Sinne der Erfindung können die genannten Proteine auch in angereicherter, isolierter oder synthetisch hergestellter Form eingesetzt werden.The produce strains used in the invention prefers the proteins with the sequences SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 or comprise the nucleic acid sequences SEQ ID NO: 8 and / or SEQ ID NO: 9 or at least 50% homologs thereof. For the purposes of the invention, the proteins mentioned can also in enriched, isolated or synthetically produced form be used.

Wie bereits ausgeführt werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung insbesondere Mikroorganismen, Rohextrakte, Teile davon und/oder die angereicherten oder isolierten Enzyme immobilisiert eingesetzt. Durch die Immobilisierung werden Enzyme, Zellorganellen und Zellen in einen unlöslichen und reaktionsraumbegrenzten Zustand versetzt. So können sie z. B. in einer Polymer-Matrix immobilisiert werden (z. B. Alginat-, Polyvinylalkohol- oder Polyacrylamid-Gele). Eine Immobilisierung kann auch auf gelösten oder ungelösten Trägermaterialien (z. B. Celit) zur Erleichterung der Katalysator-Wiedergewinnung und -benutzung erfolgen. Methoden zur Zell-Immobilisierung in einer Polymer-Matrix oder auf einem gelösten oder ungelösten Träger sind dem Fachmann bekannt und bereits ausführlich beschrieben worden. Die Enzymaktivitäten können ebenfalls aus den mikrobiellen Zellen isoliert werden. Diese können dann direkt als Katalysator oder in einer Polymer-Matrix oder auf einem gelösten oder ungelösten Träger immobilisiert eingesetzt werden. Die dazu nötigen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beschrieben z. B. in Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997 .As already stated, in a further preferred embodiment variant of the invention, in particular microorganisms, crude extracts, parts thereof and / or the enriched or isolated enzymes are immobilized. Immobilization places enzymes, cell organelles and cells in an insoluble and reaction-space limited state. So they can z. B. immobilized in a polymer matrix (eg., Alginate, polyvinyl alcohol or polyacrylamide gels). Immobilization may also be carried out on dissolved or undissolved carrier materials (eg celite) to facilitate catalyst recovery and use. Methods for cell immobilization in a polymer matrix or on a dissolved or undissolved carrier are known to the person skilled in the art and have already been described in detail. The enzyme activities can also be isolated from the microbial cells. These can then be used directly immobilized as a catalyst or in a polymer matrix or on a dissolved or undissolved carrier. The necessary methods are known in the art and described z. In Methods in Biotechnology, Vol. 1: Immobilization of enzymes and cells, publisher: GF Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997 ,

Die Umwandlung zum Zielprodukt erfolgt bevorzugt im Rahmen eines kontinuierlichen Verfahrens, welches in einem durchströmten Reaktor durchgeführt werden kann, in dem mikrobielles Wachstum und somit die Produktbildung stattfindet. Unter einem kontinuierlichen Verfahren kann jedoch auch jedes System wachsender Zellen und katalysierender Enzyme verstanden werden, dem einerseits Nährlösung zugeführt wird und aus dem andererseits Kulturlösung, einschließlich enzymatisch gebildeten Zielprodukts abgezogen wird. Erfindungsgemäß kann das Verfahren auch als semikontinuierliches oder Batch-Verfahren durchgeführt werden.The Conversion to the target product is preferably carried out in the context of a continuous Process, which is carried out in a flow-through reactor can be in the microbial growth and thus product formation takes place. However, under a continuous process can also understood every system of growing cells and catalyzing enzymes be fed to the one hand nutrient solution and on the other hand, culture solution, including is subtracted enzymatically formed target product. According to the invention the method also as a semi-continuous or batch process be performed.

Im Zusammenhang mit der Erfindung kommen neben der Monooxygenase gegebenenfalls Enzyme zum Einsatz, welche im Mikroorganismus vorhanden sind oder zugegeben werden. Dabei erfolgt die Umwandlung zum Zielprodukt gegebenenfalls in einem einzigen Verfahrensschritt, d. h. die Umwandlung der Ausgangssubstrate laufen gleichzeitig oder leicht zeitversetzt in ein und derselben Reaktionslösung ab.in the In connection with the invention, in addition to the monooxygenase optionally Enzymes are used, which are present in the microorganism or be added. If necessary, the conversion to the target product takes place in a single process step, i. H. the conversion of the starting substrates run at the same time or slightly delayed in one and the same Reaction solution from.

Das Verfahren kann aerob, vorzugsweise beim Einsatz ganzer Zellen, durchgeführt werden oder auch micro-aerob, z. B. unter Stickstoffbegasung, vorzugsweise wenn Extrakte oder gereinigte Enzyme verwendet werden, wobei in diesem Falle die Sauerstoffbereitstellung im Sinne einer Substratzufuhr gesteuert wird.The Method can be carried out aerobically, preferably when using whole cells be or micro-aerobic, z. B. under nitrogen, preferably when extracts or purified enzymes are used, in In this case, the provision of oxygen in the sense of a substrate supply is controlled.

Die erfindungsgemäß hergestellten Zielprodukte können durch Behandlung des Kulturmediums (nach Entfernung von ungelösten Bestandteilen wie mikrobiellen Zellen) mit bereits bekannten Methoden isoliert werden. Solche Verfahren sind neben weiteren z. B. Konzentrierung, Ionenaustausch, Destillation, Elektrodialyse, Extraktion und Kristallisation.The Target products prepared according to the invention can by treatment of the culture medium (after removal of undissolved Components such as microbial cells) with already known methods be isolated. Such methods are in addition to other z. B. concentration, Ion exchange, distillation, electrodialysis, extraction and crystallization.

SEQ ID NO: 1 zeigt die Phthalatdioxygenase mit Hydroxylase-Aktivität mit 470 Aminosäuren (große Untereinheit des Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase) aus DSM 18028.SEQ ID NO: 1 shows the phthalate dioxygenase having hydroxylase activity with 470 amino acids (large subunit of the enzyme system with the enzymatic activity of a monooxygenase) DSM 18028.

SEQ ID NO: 2 zeigt die 337 AS umfassende Sequenz mit Fe/S-Oxidoreduktase-Aktivität (kleine Untereinheit des Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase) aus DSM 18028.SEQ ID NO: 2 shows the 337-a sequence comprising Fe / S-oxidoreductase activity (small subunit of the enzyme system with the enzymatic activity a monooxygenase) from DSM 18028.

SEQ ID NO: 3 zeigt die konservierten Motive für die Bindung des Rieske-Typ Cys2His2[2Fe-2S] Clusters.SEQ ID NO: 3 shows the conserved motifs for the binding of the Rieske-type Cys 2 His 2 [2Fe-2S] cluster.

SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 10 zeigen die konservierten Motive für die Bindung eines singulären Fe2+.SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 10 show the conserved motifs for the binding of a singular Fe 2+ .

SEQ ID NO: 5 zeigt die konservierten Motive für die Bindung von FMN bzw. FAD.SEQ ID NO: 5 shows the conserved motifs for binding from FMN or FAD.

SEQ ID NO: 6 zeigt die konservierten Motive für die Bindung eines pflanzentypischen Cys4[2Fe-2S] Clusters.SEQ ID NO: 6 shows the conserved motifs for the binding of a plant-typical Cys 4 [2Fe-2S] cluster.

SEQ ID NO: 7 zeigt die konservierten Motive für die Bindung von Ferredoxin.SEQ ID NO: 7 shows the conserved motifs for binding of ferredoxin.

SEQ ID NO: 8 zeigt 1413 bp der codierenden Nukleotidsequenz für die Phthalatdioxygenase aus DSM 18028.SEQ ID NO: 8 shows 1413 bp of the coding nucleotide sequence for the phthalate dioxygenase from DSM 18028.

SEQ ID NO: 9 zeigt 1014 bp der codierenden Nukleotidsequenz für die Fe/S-Oxidoreduktase aus DSM 18028.SEQ ID NO: 9 shows 1014 bp of the coding nucleotide sequence for the Fe / S-oxidoreductase from DSM 18028.

Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher beschrieben, auf die sie jedoch nicht beschränkt werden soll.Subsequently The invention will be closer to exemplary embodiments to which they are not limited should.

Ausführungsbeispielembodiment

Beispiel 1example 1

Der Stamm DSM 18028 wurde auf Mineralsalzmedium (MSM) in Gegenwart einer Vitaminmischung kultiviert. Das Medium enthielt (in mg/l): NH4Cl, 350; KH2PO4, 340; K2HPO4, 485; CaCl2·6H2O, 27; MgSO4·7H2O, 71.2, und 1 ml/l Spurensalz-Stammlösung. Die Spurensalz-Stammlösung enthielt (in g/l): FeSO4·7H2O, 4.98; CuSO4·5H2O, 0.785; CoCl2, 5; MnSO4·4H2O, 0.81; ZnSO4·7H2O, 0.44; Na2MoO4·2H2O, 0.25. Die Konzentration der Vitamin im Medium betrug (in μg/l): Biotin, 20; Folsäure, 20; Pyridoxin-HCl, 100; Thiamin-HCl, 50; Riboflavin, 50; Nikotinsäure, 50; DL-Ca-Pantothenat, 50; p-Aminobenzoesäure, 50; Liponsäure, 50, und Cobalamin, 50. Als Wachstumssubstrat diente Succinat in einer Konzentration von 3 g/l. Die Kultivierung erfolgte kontinuierlich oder diskontinuierlich. Bei kontinuierlicher Kultivierung wurde zusätzlich tert.-Butylakohol (TBA) in einer Konzentration von 0,2 g/l zugeführt. Bei diskontinuierlicher Kultivierung wurde der Kultur TBA im Anschluss an das Wachstum auf Succinat zur Induktion der Monooxygenase-Aktivität zugesetzt und die Kultur für weitere 5 h inkubiert.The strain DSM 18028 was cultured on mineral salt medium (MSM) in the presence of a vitamin mixture. The medium contained (in mg / l): NH 4 Cl, 350; KH 2 PO 4 , 340; K 2 HPO 4 , 485; CaCl 2 .6H 2 O, 27; MgSO 4 .7H 2 O, 71.2, and 1 ml / l trace salt stock solution. The trace salt stock solution contained (in g / l): FeSO 4 .7H 2 O, 4.98; CuSO 4 .5H 2 O, 0.785; CoCl 2 , 5; MnSO 4 .4H 2 O, 0.81; ZnSO 4 .7H 2 O, 0.44; Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 0.25. The concentration of vitamin in the medium was (in μg / l): biotin, 20; Folic acid, 20; Pyridoxine HCl, 100; Thiamine HCl, 50; Riboflavin, 50; Nicotinic acid, 50; DL-Ca-pantothenate, 50; p-aminobenzoic acid, 50; Lipoic acid, 50, and cobalamin, 50. The growth substrate used was succinate at a concentration of 3 g / l. The cultivation was continuous or discontinuous. In the case of continuous cultivation, tert-butyl alcohol (TBA) was additionally fed in a concentration of 0.2 g / l. In the case of discontinuous culture, culture TBA was added following growth on succinate to induce monooxygenase activity, and the culture was incubated for an additional 5 hours.

Nach kontinuierlicher bzw. diskontinuierlicher Kultivierung wurden die Zellen abgetrennt, gewaschen und mit Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) auf eine Biomassekonzentration von 0,5 g/l eingestellt. Dieser Suspension wurde 2,2-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C inkubiert. Das Verhältnis von Flüssig- zu Gasvolumen lag bei 4 zu 1. Als Ausgangsgas diente Raumluft. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen und unter Einsatz diskontinuierlich kultivierter Zellen 6,8 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan gebildet, bei Einsatz kontinuierlich kultivierter Zellen wurden nach 24 h Inkubationszeit 7,1 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan erhalten.To continuous or discontinuous cultivation were the Cells were separated, washed and washed with phosphate buffer (50 mM, pH 7.0) adjusted to a biomass concentration of 0.5 g / l. This suspension 2,2-dimethylhexane was added at a concentration of 10 mM and the approach in a gas-tight vessel at Incubated at 30 ° C. The ratio of liquid to gas volume was 4 to 1. The starting gas was room air. To 24 h were discontinuous under these conditions and using cultured cells formed 6.8 mM 2-hydroxymethyl-2-methylhexane, when continuously cultivated cells were used after 24 h Incubation time 7.1 mM 2-hydroxymethyl-2-methylhexane.

Beispiel 2Example 2

Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert, allerdings in Gegenwart von 760 mg/l NH4Cl. Nach der Kultivierung wurde die Suspension für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.The strain DSM 18028 was pre-cultured on a medium as indicated in Example 1, but in the presence of 760 mg / l NH 4 Cl. After culturing, the suspension was prepared for subsequent product formation phase as indicated above in phosphate buffer.

Dieser Suspension wurde 2,2-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM sowie 1 g/l Succinat zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 5,4 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan gebildet.This Suspension was 2,2-dimethylhexane in a concentration of 10 mM and 1 g / l succinate added and the approach in a gas-tight sealed vessel at 30 ° C under the Incubated in Example 1 conditions. After 24 h were 5.4 mM 2-hydroxymethyl-2-methylhexane formed under these conditions.

Beispiel 3Example 3

Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.Of the Strain DSM 18028 was indicated on a medium as in Example 1 pre-cultivated and after cultivation for a subsequent Product formation phase as stated above in phosphate buffer prepared accordingly.

Dieser Suspension wurde 2,5-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 4,2 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexan und 3,8 mM 2,5-Dihydroxymethylhexan gebildet. Nach 48 h lagen die Konzentrationen bei 2,7 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexan und 5,9 mM 2,5-Dihydroxymethylhexan.This Suspension was 2,5-dimethylhexane in a concentration of 10 mM added and the approach in a gas-tight vessel at Incubated at 30 ° C under the conditions given in Example 1. After 24 h, 4.2 mM 2-hydroxymethyl-5-methylhexane were obtained under these conditions and 3.8 mM 2,5-dihydroxymethylhexane. After 48 hours were the Concentrations at 2.7 mM 2-hydroxymethyl-5-methylhexane and 5.9 mM 2,5-dihydroxymethylhexane.

Beispiel 4Example 4

Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.Of the Strain DSM 18028 was indicated on a medium as in Example 1 pre-cultivated and after cultivation for a subsequent Product formation phase as stated above in phosphate buffer prepared accordingly.

Dieser Suspension wurde 2-Chlorpropan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 5,8 mM 2-Chlorpropanol gebildet.This Suspension was 2-chloropropane in a concentration of 10 mM added and the approach in a gas-tight container at Incubated at 30 ° C under the conditions given in Example 1. After 24 h under these conditions, 5.8 mM 2-chloropropanol educated.

Beispiel 5Example 5

Der Stamm DSM 18028 wurde auf einem Medium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.Of the Strain DSM 18028 was indicated on a medium as in Example 1 pre-cultivated and after cultivation for a subsequent Product formation phase as stated above in phosphate buffer prepared accordingly.

Dieser Suspension wurde 2,5-Dimethyl-2,4-hexadien in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 3,3 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexadien und 3,1 mM 2,5-Dihydroxymethylhexadien gebildet. Nach 48 h lagen die Konzentrationen bei 1,9 mM 2-Hydroxymethyl-5-methylhexadien und 6,4 mM 2,5-Dihydroxymethylhexadien.This Suspension was 2,5-dimethyl-2,4-hexadiene in a concentration of 10 mM added and the batch in a gas-tight Vessel at 30 ° C below that in example 1 incubated conditions. After 24 h were among these Conditions 3.3 mM 2-hydroxymethyl-5-methylhexadiene and 3.1 mM 2,5-dihydroxymethylhexadiene educated. After 48 h, the concentrations were 1.9 mM 2-hydroxymethyl-5-methylhexadiene and 6.4 mM 2,5-dihydroxymethylhexadiene.

Beispiel 6Example 6

Der Stamm DSM 19669 wurde auf Mineralsalzmedium wie in Beispiel 1 angegeben vorkultiviert und nach der Kultivierung für eine nachfolgende Produktbildungsphase wie oben angeführt in Phosphatpuffer entsprechend aufbereitet.Of the Strain DSM 19669 was indicated on mineral salt medium as in Example 1 pre-cultivated and after cultivation for a subsequent Product formation phase as stated above in phosphate buffer prepared accordingly.

Dieser Suspension wurde 2,2-Dimethylhexan in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt und der Ansatz in einem gasdicht verschlossenen Gefäß bei 30°C unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen inkubiert. Nach 24 h wurden unter diesen Bedingungen 5,3 mM 2-Hydroxymethyl-2-methylhexan gebildet.This Suspension was 2,2-dimethylhexane in a concentration of 10 mM added and the approach in a gas-tight vessel at Incubated at 30 ° C under the conditions given in Example 1. After 24 h, 5.3 mM 2-hydroxymethyl-2-methylhexane were obtained under these conditions educated.

Abbildungenpictures

SEQ ID NO: 1 (gr UE)

Figure 00130001
SEQ ID NO: 1 (gr UE)
Figure 00130001

SEQ ID NO: 2 (kl UE)

Figure 00130002
SEQ ID NO: 2 (CLU UE)
Figure 00130002

SEQ ID NO: 3 (Rieske)

Figure 00130003
SEQ ID NO: 3 (Rieske)
Figure 00130003

SEQ ID NO: 4 (D) oder SEQ ID NO: 10 (E) (singul. Fe)

Figure 00130004
SEQ ID NO: 4 (D) or SEQ ID NO: 10 (E) (singular Fe)
Figure 00130004

SEQ ID NO: 5 (FMN)

Figure 00130005
SEQ ID NO: 5 (FMN)
Figure 00130005

SEQ ID NO: 6 (NAD)

Figure 00130006
SEQ ID NO: 6 (NAD)
Figure 00130006

SEQ ID NO: 7 (Ferredoxin)

Figure 00140001
SEQ ID NO: 7 (ferredoxin)
Figure 00140001

SEQ ID NO: 8 (gr UE)

Figure 00140002
SEQ ID NO: 8 (gr UE)
Figure 00140002

SEQ ID NO: 9 (kl. UE)

Figure 00150001
SEQ ID NO: 9 (small UE)
Figure 00150001

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform of the DPMA become.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list The documents listed by the applicant have been automated generated and is solely for better information recorded by the reader. The list is not part of the German Patent or utility model application. The DPMA takes over no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • - EP 1550730 A1 [0002] EP 1550730 A1 [0002]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • - Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909–919 [0005] - Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909-919 [0005]
  • - Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997 [0033] - Methods in Biotechnology, Vol. 1: Immobilization of enzymes and cells, publisher: GF Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997 [0033]

Claims (44)

Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase, welches ein Protein mit Hydroxylase-Aktivität und ein Protein mit Oxidoreduktase-Aktivität aufweist und das zur Oxidation einer Methylgruppe an verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen befähigt ist.Enzyme system with enzymatic activity a monooxygenase, which is a protein with hydroxylase activity and a protein having oxidoreductase activity, and that for the oxidation of a methyl group to branched-chain, aliphatic Hydrocarbons is capable. Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass verzweigtkettige, aliphatische Kohlenwasserstoffe acyclische Verbindungen und/oder aliphatische Verbindungen mit funktionellen Gruppen sind, vorzugsweise Alkane, Alkene, Alkine, Verbindungen mit Halogengruppe, Alkohole, Ether, Thiole, Aldehyde, Ketone, Thioaldehyde, Thioketone, Carbonsäuren, Amine, Imine, Amide, Ester, Nitrile, Nitroverbindungen und Sulfonsäuren.Enzyme system with enzymatic activity a monooxygenase according to claim 1, characterized in that branched-chain, aliphatic hydrocarbons acyclic compounds and / or aliphatic compounds having functional groups, preferably alkanes, alkenes, alkynes, compounds with halogen group, Alcohols, ethers, thiols, aldehydes, ketones, thioaldehydes, thioketones, Carboxylic acids, amines, imines, amides, esters, nitriles, nitro compounds and sulfonic acids. Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach Anspruch 1 oder 2, welches ein Protein mit der SEQ ID NO: 1 umfasst sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Hydroxylase-Aktivität aufweisen.Enzyme system with enzymatic activity A monooxygenase according to claim 1 or 2 which is a protein comprising SEQ ID NO: 1 and mutants, variants and parts of which have a sequence homology of at least 50% and Have hydroxylase activity. Enzymsystem mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches ein Protein mit der SEQ ID NO: 2 umfasst sowie Mutanten, Varianten und Teile davon, die eine Sequenzhomologie von mindestens 50% besitzen und Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen.Enzyme system with enzymatic activity a monooxygenase according to any one of claims 1 to 3, which a protein comprising SEQ ID NO: 2 and mutants, variants and parts thereof that have a sequence homology of at least 50% and oxidoreductase activity. Enzymsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es als große Untereinheit Proteinsequenz SEQ ID NO: 1 und als kleine Untereinheit SEQ ID NO: 2 umfasst sowie deren zu mindestens 50% Homologen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen.Enzyme system according to one of claims 1 to 4, characterized in that it as a large subunit Protein sequence SEQ ID NO: 1 and as a small subunit SEQ ID NO: 2 and their at least 50% homologs, which are the same Have properties. Enzymsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es ein oligomeres Protein ist, das aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 besteht.Enzyme system according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is an oligomeric protein, the consists of the sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Protein mit der SEQ ID NO: 1 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Hydroxylase-Aktivität aufweisen.Protein with the SEQ ID NO: 1 as well as its at least 50% homologs that have hydroxylase activity. Protein nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 aufweist, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 für die Bindung von Eisen- und Schwefelabkömmlingen in einem Rieske-Typ Cys2His2[2Fe-2S] Cluster und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 für die Bindung eines singulären Fe2+ stehen.A protein according to claim 7, characterized in that it has the conserved motifs SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, wherein the conserved motifs SEQ ID NO: 3 for the binding of iron and sulfur derivatives in a Rieske type Cys 2 His 2 [2Fe-2S] cluster and SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 10, respectively, represent the binding of a singular Fe 2+ . Protein nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 50% Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 1 hat und die konservierten Motive SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 10 aufweist.Protein according to one of claims 7 or 8, characterized in that it has at least 50% sequence homology to SEQ ID NO: 1 and the conserved motifs SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 10, respectively. Protein mit der SEQ ID NO: 2 sowie seine zu mindestens 50% Homologen, die Oxidoreduktase-Aktivität aufweisen.Protein with the SEQ ID NO: 2 as well as its at least 50% homologs that have oxidoreductase activity. Protein nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die konservierten Motive SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 aufweist, wobei die konservierten Motive SEQ ID NO: 5 für die Bindung von FMN bzw. FAD, SEQ ID NO: 6 für die Bindung von Eisen- und Schwefelabkömmlingen in einem pflanzentypischen Cys4[2Fe-2S] Cluster sowie SEQ ID NO: 7 für die Bindung von Ferredoxin stehen.A protein according to claim 10, characterized in that the protein has the conserved motifs SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, wherein the conserved motifs SEQ ID NO: 5 for the binding of FMN or FAD , SEQ ID NO: 6 for the binding of iron and sulfur derivatives in a plant-typical Cys 4 [2Fe-2S] cluster and SEQ ID NO: 7 for the binding of ferredoxin. Protein nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 50% Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 hat und die konservierten Motive SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 aufweist.A protein according to any one of claims 10 or 11, characterized in that it has at least 50% sequence homology to SEQ ID NO: 2 and the conserved motifs SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. Nukleinsäuremolekül codierend ein Enzym mit der Aktivität einer Monooxygenase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist; b) Nukleinsäuremoleküle, die die unter SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 9 dargestellte Nukleotidsequenzen aufweisen.Nucleic acid molecule coding an enzyme with the activity of a monooxygenase selected consisting of the group a) nucleic acid molecules, which encode a protein having the sequence shown under SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 has indicated amino acid sequences; b) Nucleic acid molecules which have the meanings shown under SEQ ID NO: 8 and / or SEQ ID NO: 9 have shown nucleotide sequences. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein codiert, das als oligomeres Enzym zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Untereinheiten die unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.Nucleic acid molecule according to claim 13, characterized in that it encodes a protein composed as an oligomeric enzyme composed of two different subunits which are listed under SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 has indicated amino acid sequences. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13 oder 14, das ein DNA-Molekül ist.Nucleic acid molecule according to claim 13 or 14, which is a DNA molecule. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das eine cDNA oder genomische DNA ist.Nucleic acid molecule according to claim 15, which is a cDNA or genomic DNA. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder 14, das ein RNA-Molekül ist.Nucleic acid molecule according to claim 12 or 14, which is an RNA molecule. Mikroorganismus, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 enthält, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Enzymsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Protein gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12 produziert.Microorganism containing a nucleic acid molecule according to one of claims 13 to 17, characterized in that it comprises an enzyme system according to a of claims 1 to 6 or a protein according to one of claims 7 to 12 produced. Mikroorganismus nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Protein codiert, das als oligomeres Enzym zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Untereinheiten die unter SEQ. ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist.Microorganism according to claim 18, characterized in that that he encodes a protein that is composed as an oligomeric enzyme from two different subunits which under SEQ. ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 has indicated amino acid sequences. Mikroorganismus nach Anspruch 18 oder 19 gekennzeichnet durch Bakterienstamm HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) oder Methylibium sp. R8 (DSM 19669).Microorganism according to claim 18 or 19 by bacterial strain HCM-10 (DSM 18028), Ideonella sp. L108 (DSM 18260) or methylibium sp. R8 (DSM 19669). Verfahren zur Herstellung eines Enzymsystems mit der enzymatischen Aktivität einer Monooxygenase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 in einem prokaryontischen Wirt einzeln oder gemeinsam kloniert und exprimiert werden und die Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 nach der Expression in geeigneter Weise einzeln oder kombiniert gewonnen werden.Process for the preparation of an enzyme system with the enzymatic activity of a monooxygenase after a of claims 1 to 6 or a protein according to one of claims 7 to 12, characterized in that the Proteins with SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 in a prokaryotic Host individually or jointly cloned and expressed and the Proteins with SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 after expression be recovered individually or in combination as appropriate. Verfahren zur Oxidation von Methylgruppen an verzweigtkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wobei die Oxidation an einem tertiären oder sekundären C-Atom stattfindet oder an Methylgruppen in Strukturen, die am C2-Atom derivatisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wässrigen Reaktionslösung, die ein Enzymsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Protein gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12 oder einen Mikroorganismus gemäß Anspruch 18 oder 19 aufweist, mit Methylgruppen-tragenden Verbindungen inkubiert wird und anschließend die entsprechend umgewandelte Zielverbindung gewonnen wird.Process for the oxidation of methyl groups on branched-chain, aliphatic hydrocarbons, wherein the oxidation of a tertiary or secondary carbon atom takes place or on methyl groups in structures derivatized at the C2 atom, characterized in that in an aqueous reaction solution, which is an enzyme system according to any one of claims 1 to 6 or a protein according to one of the claims 7 to 12 or a microorganism according to claim 18 or 19, incubated with methyl group-carrying compounds and then the correspondingly converted target connection is won. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hydroxylierung von Methylgruppen an Alkanverbindungen oder Alkanverbindungen mit mindestens einer funktionellen Gruppe, vorzugsweise mit 3 bis 10 C-Atomen mit sekundären und tertiären C-Atomen oder an Methylgruppen in Strukturen, die am C2-Atom derivatisiert sind, durchgeführt wird.Method according to claim 21, characterized that hydroxylation of methyl groups on alkane compounds or alkane compounds having at least one functional group, preferably having 3 to 10 carbon atoms with secondary and tertiary C atoms or to methyl groups in structures that derivatized at the C2 atom are performed. Verfahren nach Anspruch 22 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylgruppen an einem sekundären C-Atomen (C2) oxidiert werden, wobei bevorzugt Verbindungen eingesetzt werden, die nach Oxidation der am sekundären C-Atom lokalisierten Methylgruppe zu Verbindungen mit einem optisch aktiven Zentrum am sekundären C-Atom führen.Method according to claim 22 or 22, characterized that the methyl groups on a secondary carbon atom (C2) be oxidized, preferably compounds are used, which after oxidation of the secondary carbon atom located Methyl group to compounds with an optically active center on secondary C atom lead. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylgruppen einer Verbindung an einem tertiären C-Atomen oxidiert werden.Method according to claim 22 or 23, characterized that the methyl groups of a compound at a tertiary C atoms are oxidized. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylgruppen einer Verbindung oxidiert werden, bei der ein oder 2 H-Atome am C2-Kohlenstoff substituiert sind.Method according to claim 22 or 23, characterized that the methyl groups of a compound are oxidized, in which one or 2 H atoms are substituted on the C2 carbon. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus gemäß einem Anspruch 18 bis 20 oder ein Rohextrakt davon eingesetzt wird.Method according to one of claims 22 to 26, characterized in that a microorganism according to a Claim 18 to 20 or a crude extract thereof is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass ganze Zellen der Mikroorganismen, unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert eingesetzt werden.Method according to one of claims 22 to 27, characterized in that whole cells of the microorganisms, unchanged, permeabilized or carrier-fixed be used. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Mikroorganismen in Gegenwart eines auxiliaren Substrates inkubiert werden, das zur Bereitstellung bzw. zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten geeignet ist.Method according to one of claims 22 to 28, characterized in that the cells of the microorganisms incubated in the presence of an auxiliary substrate, which is used for Provision or regeneration of reduction equivalents suitable is. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass als auxiliare Substrate Ameisensäure oder seine Salze eingesetzt werden.Method according to claim 29, characterized that as auxiliary substrates formic acid or its salts be used. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die auxiliaren Substrate heterotrophe Substrate sind, welche von unveränderten Mikroorganismen als Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum und Vermehrung genutzt werden.Method according to claim 29, characterized that the auxiliary substrates are heterotrophic substrates which of unchanged microorganisms as carbon and Energy source used for growth and propagation. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die auxiliaren Substrate als Quelle zur Bereitstellung bzw. Regenerierung von Reduktionsequivalenten eingesetzt werden.Method according to one of claims 29 to 31, characterized in that the auxiliary substrates as a source for the provision or regeneration of reduction equivalents be used. Verfahren nach Anspruch 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen auf einem heterotrophen Substrat zur Akkumulation von Produkten kultiviert werden.Method according to claims 27 and 28, characterized that the cells accumulate on a heterotrophic substrate to be cultivated by products. Verfahren nach Anspruch 27, 28 und 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte intrazelluläre Speicherstoffe sind.Method according to claims 27, 28 and 33, characterized that the products are intracellular storage substances. Verfahren nach Anspruch 27, 28, 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass als intrazellulärer Speicherstoff Polyhydroxybuttersäure gebildet wird.The method of claim 27, 28, 33 and 34, characterized characterized in that as intracellular storage material Polyhydroxybutyric acid is formed. Verfahren nach Anspruch 27, 28, 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten für die Monooxygenase Reaktion genutzt werden.The method of claim 27, 28, 33 to 35, characterized characterized in that the products for the regeneration of reduction equivalents be used for the monooxygenase reaction. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass zellfreie Rohextrakte der Mikroorganismen eingesetzt werden, vorzugsweise zellfreie Rohextrakte des Mikroorganismus DSM18028.Method according to one of claims 22 to 36, characterized in that cell-free crude extracts of the microorganisms are used, preferably cell-free crude extracts of the microorganism DSM18028. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit der Oxidoreduktase-Aktivität zum Transfer von Reduktionsäquivalenten aus reduzierten Coenzymen zum Protein mit Hydroxylase-Aktivität führt.Method according to one of claims 22 to 37, characterized in that the protein with the oxidoreductase activity for the transfer of reduction equivalents from reduced Coenzymes leads to protein with hydroxylase activity. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die reduzierten Coenzyme NADH + H+ bzw. NADPH + H+ sind.A method according to claim 38, characterized in that the reduced coenzymes are NADH + H + and NADPH + H + , respectively. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass Zellextrakte und/oder die Enzymsysteme mit Monooxygenase-Aktivität nach teilweiser oder vollständiger Isolierung aus den Mikroorganismen, ggf. in gereinigter Form, und ggf. unter Zusatz weiterer Enzyme, für die Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt werden.Method according to one of claims 22 to 39, characterized in that cell extracts and / or the enzyme systems with monooxygenase activity after partial or complete Isolation from the microorganisms, if necessary in purified form, and if necessary with the addition of further enzymes, for regeneration of reduction equivalents are used. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus nach Klonierung und Expression der Proteine mit der SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 als ganze Zelle, unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert eingesetzt wird.Method according to one of claims 22 to 40, characterized in that the microorganism after cloning and expressing the proteins having SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 as a whole cell, unchanged, permeabilized or carrier fixed is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass in Kombination zu Enzymsystem und Proteinen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 weitere Enzyme oder Enzymsysteme zur Regenerierung von Reduktionsäquivalenten eingesetzt werden.Method according to one of claims 22 to 41, characterized in that in combination to enzyme system and Proteins according to one of claims 1 to 12 other enzymes or enzyme systems for the regeneration of reduction equivalents be used. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die weiteren Enzyme und Protein in Lösung oder trägerfixiert eingesetzt werden.Method according to claim 42, characterized that the other enzymes and protein are in solution or carrier fixed be used. Bakterienstamm Methylibium sp. R8 (DSM 19669).Bacterial strain Methylibium sp. R8 (DSM 19669).
DE102007045092A 2007-09-17 2007-09-17 Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons Withdrawn DE102007045092A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007045092A DE102007045092A1 (en) 2007-09-17 2007-09-17 Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons
EP08804177A EP2205726A1 (en) 2007-09-17 2008-09-15 Method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons using an enzyme system with the activity of a monooxygenase
PCT/EP2008/062216 WO2009037216A1 (en) 2007-09-17 2008-09-15 Method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons using an enzyme system with the activity of a monooxygenase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007045092A DE102007045092A1 (en) 2007-09-17 2007-09-17 Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102007045092A1 true DE102007045092A1 (en) 2009-03-19

Family

ID=40329340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102007045092A Withdrawn DE102007045092A1 (en) 2007-09-17 2007-09-17 Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2205726A1 (en)
DE (1) DE102007045092A1 (en)
WO (1) WO2009037216A1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1550730A1 (en) 2004-01-05 2005-07-06 Daiso Co., Ltd. Method for producing optically active 3-chloro-2-methyl-1,2-propanediol taking advantage of microorganism

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1550730A1 (en) 2004-01-05 2005-07-06 Daiso Co., Ltd. Method for producing optically active 3-chloro-2-methyl-1,2-propanediol taking advantage of microorganism

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbankeintrag Genbank YP_001023559 Eisen-Schwefel Oxidoreduktase-Untereinheit aus Methylibium petroleiphilum PM1 (29.01.2007) und Sequenzvergleich mit Sequenz SEQ ID No. 2 *
Datenbankeintrag Genbank YP_001023560 Phthalate 4, 5-Dioxygenase aus Methylibium petroleiphilum PM1 ( 29.01.2007) und Sequenzvergleich mit Sequenz SEQ I D No. 1; Datenbankeintrag Genbank YP_001023559 Eis en-Schwefel Oxidoreduktase-Untereinheit aus Methyl ibium petroleiphilum PM1 (29.01.2007) und Sequenzv ergleich mit Sequenz SEQ ID No. 2; KANE S.R. u.a.: Whole-genome analysis of the methyl tert-butyl et her-degrading beta-Proteobacterium Methylibium pet roleiphilum PM1 (2007) Journal of Bacteriology, Vo l. 189 (5), S. 1931-1945
Datenbankeintrag Genbank YP_001023560 Phthalate 4, 5-Dioxygenase aus Methylibium petroleiphilum PM1 (29.01.2007) und Sequenzvergleich mit Sequenz SEQ I D No. 1 *
KANE S.R. u.a.: Whole-genome analysis of the methyl tert-butyl et her-degrading beta-Proteobacterium Methylibium pet roleiphilum PM1 (2007) Journal of Bacteriology, Vol. 189 (5), S. 1931-1945 *
Lopez Ferreira et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75, 909-919
Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009037216A1 (en) 2009-03-26
EP2205726A1 (en) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1999264B1 (en) Method for the enzymatic production of 2-hydroxy-2-methyl carboxylic acids
AT503017A4 (en) METHOD FOR THE ENANTIOSELECTIVE ENZYMATIC REDUCTION OF HYDROXYKETOVER BINDINGS
WO2008148640A1 (en) Microbiological production of aldehydes, especially of 3-hydroxypropionaldehyde
EP1285962B1 (en) NADH oxidase from Lactobacillus
EP2977444A1 (en) Recombinant microorganism with increased productivity of 2,3-butanediol, and method for producing 2,3-butanediol using same
DE60128640T2 (en) Process for the preparation of optically active 4-halo-3-hydroxybutanoate
EP2089530A2 (en) Method for the production of (4s)-3, 4-dihydroxy-2,6, 6-trimethyl-cyclohex-2-enone and derivatives thereof
DE102007059248A1 (en) Recombinant cell capable of converting bicarbonate to organic compounds utilizes a 16-step metabolic pathway starting with acetyl coenzyme A
WO2010050231A1 (en) Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells
EP1313870B1 (en) Method for the improved production and isolation of trans-dihydroxycyclohexadiene carboxylic acids and/or derivatives thereof and a genetically modified organism suitable for the above
DE102006039189B4 (en) Enantioselective preparation of aliphatic acyclic esters and ketones
WO1996037620A2 (en) Process for obtaining acyloins, pyruvate decarboxylases suitable therefor and their production and dna sequences of the pdc gene coding them
DE102007045092A1 (en) Enzyme system with the activity of a monooxygenase and method for the oxidation of methyl groups in aliphatic hydrocarbons
DE102017210944B4 (en) Alcohol dehydrogenases and methods for the stereoselective reduction of carbonyl compounds
DE10247147A1 (en) Production of D-mannitol, useful e.g. as sweetener and plasma extender, by culturing organisms that express mannitol-2-dehydrogenase and where substrate is introduced by a non-phosphorylating pathway
EP2193194B1 (en) Method for producing 2-methyl-1,2-dihydroxypropane
DE102013211075B9 (en) Biotechnological process for the preparation of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and ketones with enzymes of microbial styrene degradation
DE10220848A1 (en) Nucleotide sequence coding for a mannitol-2-dehydrogenase and method for producing D-mannitol
JP3747640B2 (en) Process for producing optically active 1,2-diol cyclic carbonate
WO2010070086A2 (en) Method for the enzymatic reaction of alkanes
EP1959019A1 (en) Method for enzymatic reduction of alkene derivates
JP2002281991A (en) Method for producing (r)-2-hydroxy-1-phenoxypropane derivative with producing of rearranged side-product reduced

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20130403