DE102005044071A1 - Method for measuring the permeation of a substance through a barrier - Google Patents

Method for measuring the permeation of a substance through a barrier

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DE102005044071A1
DE102005044071A1 DE200510044071 DE102005044071A DE102005044071A1 DE 102005044071 A1 DE102005044071 A1 DE 102005044071A1 DE 200510044071 DE200510044071 DE 200510044071 DE 102005044071 A DE102005044071 A DE 102005044071A DE 102005044071 A1 DE102005044071 A1 DE 102005044071A1
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characterized
particular
probe
permeation
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DE200510044071
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German (de)
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Thorsten Dr. Hartmann
Antje Konrad
Thomas Müller
Joachim Dr. Nöller
Johannes Dr. Schmitt
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Permeation mindestens einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Permeationsbarriere und/oder zur Bestimmung permeationsbeeinflussender Parameter, insbesondere zur Bestimmung der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde, umfassend The present invention relates to a method of measuring the permeation of at least one substance contained in a solvent by a permeation and / or to determine permeationsbeeinflussender parameters, in particular for determining the permeability of the barrier for the at least one substance using at least one luminescent probe comprising
- die Bereitstellung der mindestens einen Substanz auf einer Seite der Permeationsbarriere, - providing the at least one substance on one side of the permeation barrier,
- Inkubation der Permeationsbarriere mit der mindestens einen, im Lösungsmittel enthaltenen Substanz und - incubation of the permeation barrier to the at least one substance contained in the solvent and
- Messung von Lumineszenzsignalen der Sonde auf mindestens einer Seite der Permeationsbarriere, welche in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration der Substanz moduliert sind, - Measurement of luminescence of the probe on at least one side of the permeation barrier, which are modulated in dependence on the concentration of the substance,
wobei das Anregungs- und/oder Emissionsspektrum der mindestens einen Sonde mit dem Absorptionsspektrum der mindestens einen Substanz überlappt und einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren. wherein the excitation and / or emission spectrum of the at least one probe with the absorption spectrum overlaps at least one substance and a kit for use in this process.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Permeation mindestens einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Barriere und/oder zur Bestimmung permeationsbeeinflussender Parameter, insbesondere zur Bestimmung der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, sowie Einzelkomponenten und einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren. The present invention relates to a method of measuring the permeation of at least one substance contained in a solvent by a barrier and / or for determining permeationsbeeinflussender parameters, in particular for determining the permeability of the barrier for the at least one substance, as well as individual components and a kit for use in this process.
  • In der pharmazeutischen Industrie werden potentielle Wirkstoffe unter anderem auf ihre Eigenschaften im ADME-Bereich (Absorption, Distribution, Metabolismus, Exkretion) getestet. In the pharmaceutical industry potential drugs among other things, their properties in ADME range (absorption, distribution, metabolism, excretion) are tested. Insbesondere die Aufnahme von Wirkstoffen in einen Organismus wie den menschlichen Körper ist Gegenstand intensiver Untersuchungen. In particular, the inclusion of active substances into an organism such as the human body is the subject of intense investigation. Im Fall von oral applizierten Medikamenten spielt beispielsweise die Permeation des im Medikament enthaltenen Wirkstoffs durch die Darmwand als natürliche Permeationsbarriere eine wichtige Rolle. In the case of orally administered drugs, permeation of the drug contained in the drug, for example, plays an important role through the intestinal wall as natural permeation barrier. In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um die Aufnahme eines Wirkstoffes in den menschlichen Körper zu messen. In recent years, a variety of methods have been developed to measure the inclusion of a substance in the human body. Insbesondere folgende Vorgehensweisen sind in der Literatur einschlägig beschrieben: In particular, the following procedures are described in the art in the literature:
    In Humanversuchen sind direkte Messungen der Permeation im menschlichen Körper vorgenommen worden. In human trials, direct measurements of the permeation in the human body have been made. Dabei wurden drei verschiedene klinische Methoden verwendet, nämlich der sogenannte offene Ansatz (dh ohne Blockierung eines Darmabschnittes), der sogenannte halboffene Ansatz (dh mit einem Blockierballon auf der proximalen Seite eines Darmabschnittes) und der sogenannte geschlossene Ansatz (mit zwei Blockierballons zur Schließung beider Seiten eines Darmabschnittes). Three different clinical methods were used, namely the so-called open approach (that is, without blocking a part of the intestine), the so-called semi-open approach (ie with a blocking balloon on the proximal side of a part of the intestine) and the so-called closed approach (with two blocking balloon to close both sides an intestinal section). In allen Fällen wurde über ein Drainagesystem der Wirkstoff appliziert, woraufhin in definierten Entfernungen Proben entnommen und auf ihren Wirkstoffgehalt hin untersucht wurden (Lennernäs H., Human intestinal permeability, J. Pharm. Sci. 1998, 87, 403–410; Lennernäs H., Human jejunal effective permeability and its correlation with preclinical drug absorption models, J. Pharm. Pharmacol. 1997, 49, 627–638). In all cases, the active ingredient, 87, 403-410 was a drainage system applied, then removed at defined distances and samples were analyzed for drug content towards (Lennernäs H., human intestinal permeability, J. Pharm Sci 1998;.. Lennernäs H. , human jejunal effective permeability and its correlation with preclinical drug absorption models, J. Pharm. Pharmacol. 1997, 49, 627-638).
  • In vitro Ansätze nutzen dagegen häufig Permeationseinrichtungen, in denen die Permeation einer Substanz durch eine Barriere beobachtet wird. In vitro approaches, however often use Permeationseinrichtungen in which the permeation of a substance is observed by a barrier. Durch die Barriere wird die Permeationseinrichtung in zwei voneinander getrennte Raumeinheiten geteilt, die sogenannten Kompartimente. Through the barrier the Permeationseinrichtung is divided into two separate room units, the so-called compartments. Zur Durchführung einer Permeationsmessung wird die zu untersuchende Substanz üblicherweise auf einer Seite der Permeationsbarriere (im Donor-Kompartiment) vorgelegt. To carry out a permeation to the substance under investigation is usually presented on one side of the permeation barrier (in the donor compartment). Mit beginnender Permeation sinkt allmählich die Konzentration der Substanz im Donor-Kompartiment, während sich die Substanz im Akzeptorkompartiment anreichert. With incipient permeation gradually the concentration of the substance in the donor compartment is lowered, while the substance accumulates in the acceptor compartment. Das Fortschreiten des Permeationsvorgangs kann entsprechend über Konzentrationsmessungen beobachtet werden, zumindest bis sich ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen den beiden Kompartimenten eingestellt hat. The progress of the permeation process can be observed via corresponding concentration measurements has set at least a concentration equilibrium between the two compartments until.
  • Neben speziellen Permeationskammern (z. B. der sogenannten Ussing Kammer), die under anderem mit isolierten Membranvesikeln oder mit Organgewebepräparationen als Barriereschicht betrieben werden, finden auch Perfusionseinrichtungen eine Verwendung, die mit präparierten Darmbereichen von toten Tieren arbeiten (Karlsson J. und Arthursson P., A new diffusion chamber system for the determination of drug permeability coefficients across the human intestinal epithelium that are independent of the unstirred water layer, Biochim. Biophys. Acta 1992, 1111, 204–210; Soderholm JD, Hedman L., Arthursson P., Franzen L., Larsson J., Pantzar N., Permert J., Olaison G., Integrity and metabolism of human mucosa in vitro in the ussing chamber, Acta Physiol. Scand. 1998, 162, 47–56; Lennernäs H., Nylander S., Ungell AL, Jejunal permeability: a comparison between the ussing chamber technique and the single-pass perfusion in humans, Pharm. Res. 1997, 14, 667–71; Arthursson P., Ungell AL, Lofroth J In addition to special Permeationskammern (z. B. the so-called Ussing chamber), which are under operated other with isolated membrane vesicles or organ tissue preparations as a barrier layer, and perfusion devices find a use that work with prepared bowel areas of dead animals (Karlsson J. and Arthursson P. , A new diffusion chamber system for the determination of drug permeability Coefficients across the human intestinal epithelium did are independent of the unstirred water layer, Biophys Acta Biochim 1992, 1111, 204-210;.. Soderholm JD, Hedman L., P. Arthursson Franzen L., Larsson J., N. Pantzar, Permert J., G. Olaison, Integrity and metabolism of human mucosa in vitro in the ussing chamber, Acta Physiol Scand 1998, 162, 47-56;.. Lennernäs H. , Nylander S., Ungell AL, jejunal permeability: a comparison between the ussing chamber technique and the single-pass perfusion in humans, Pharm Res 1997, 14, 667-71; Arthursson P., Ungell AL, Lofroth J.. E, Selective paracellular permeability in two models of intestinal absorption: cultured monolayers human intestinal epithelial cells and rat intestinal segments, Pharm. Res. 1993, 10, 1123–1129). E, Selective paracellular permeability in two models of intestinal absorption: cultured intestinal epithelial cells monolayers human and rat intestinal segments, Res Pharm 1993, 10, 1123 to 1129)...
  • Diese Vorgehensweisen sind sehr umständlich und zeitintensiv und darüber hinaus nur für die Messung weniger Substanzen geeignet. These procedures are very cumbersome and time-consuming and furthermore suitable only for measuring less substances. Eine einfachere und vielseitigere Möglichkeit zur Bestimmung bzw. Abschätzung der Aufnahme von Substanzen in einen Organismus bietet die Messung der Permeation von Substanzen durch künstliche Permeationsbarrieren. A simpler and more versatile way of determining or estimating the intake of substances into an organism provides the measurement of the permeation of substances through artificial permeation barriers. So ist in den letzten Jahren beispielsweise der Einsatz von Zellmonolagen als Permeationsbarriere intensiv in der Literatur beschrieben worden (Ungell AL and Karlsson J. (2003), Cell Cultures in drug discovery: an industrial perspective. In Drug bioavailability; Estimation of Solubility, Permeability, Absorption and Bioavailability, Van de Waterbeemd H., Lennerrnäs H., Arthursson P., eds., 90–131, Wiley-VCH). So in recent years, such as the use of cell monolayers been described as a permeation barrier extensively in the literature (Ungell AL and Karlsson J. (2003) Cell Cultures in drug discovery: an industrial perspective Add Drug bioavailability; Estimation of Solubility, Permeability. absorption and Bioavailability, Van de Waterbeemd H., H. Lennerrnäs, Arthursson P., eds., 90-131, Wiley). Dabei finden insbesondere Caco-2-Zellen und MDCK-Zellen Anwendung (Arthursson P., Epithelial Transport of Drug in Cell Culture I: A Model for Studying the passive Diffusion of Drugs over Intestinal absorptive (Caco-2) Cells. J. Pharm. Sci. 1990; 79: 476–482; Arthursson P., Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 175, 880–885; Cho MJ, Thompson DP, Cramer CT, Vidmar TJ, and Scieszka JF, The madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cell monolayer as a model cellular transport Barrier, Pharm. Res. 1989, 6, 71–77). absorptive (Caco-2) Cells J. Pharm A Model for Studying the passive diffusion of drugs over Intestinal. In particular, Caco-2 cells and MDCK cells are used (Arthursson P., epithelial transport of Drug in Cell Culture I. Sci 1990; 79:.. 476-482; Arthursson P., Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability Coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells Biochem Biophys Res Commun 1991, 175, 880.... -885 Cho MJ, Thompson DP, Cramer CT, Vidmar TJ, and Scieszka JF, The madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cell monolayers as a model cellular transport Barrier, Res Pharm 1989, 6, 71-77).. ,
  • Die Zellen werden auf permeablen Trägermaterialien in speziellen Mikrotiterplatten für eine bestimmte Zeitdauer kultiviert. The cells are cultured on permeable support materials in particular microtiter plates for a certain period of time. Nach Ausbildung einer monolagigen Zellschicht läßt man die Zellen sich über einen bestimmten Zeitraum ausdifferenzieren und nimmt anschließend die eigentlichen Permeationsmessungen vor. After formation of a monolayer cell layer allows the cells to differentiate over a certain period and then performs the actual permeation. Je nach Zelltyp und Kultivierungsbedingungen beträgt dieser Zeitraum ca. 3 bis 21 Tage. Depending on the cell type and culture conditions, this period is about 3 to 21 days. Anschließend werden die Zellen gewaschen und der eigentliche Meßpuffer auf beiden Seiten der Zellschicht vorgelegt. The cells are then washed and submitted to the actual measurement buffer on both sides of the cell layer. Nach Zugabe der zu messenden Substanz auf einer Seite der Zellschicht werden Proben auf der anderen Seite entnommen und darin die Konzentration der zu untersuchenden Substanz analysiert (s. After addition of the substance to be measured on one side of the cell layer samples are taken on the other side and in the concentration of the substance under investigation is analyzed (s. 1 1 ). ).
  • Die Konzentrationsmessungen erfolgen üblicherweise über ein HPLC- oder ein LC/MS-Verfahren. The concentration measurements are usually carried out on a HPLC or LC / MS method. Die Permeation kann sowohl von der apica len zur basolateralen Seite als auch umgekehrt gemessen werden. The permeation can be measured by both the APICA len to the basolateral side and vice versa. Bedingt durch die Morphologie der Zellen erlaubt diese Vorgehensweise Rückschlüsse auf eine Beteiligung von aktiven Transporterproteinen an der Permeation des Stoffes, da diese Transporterproteine in der basolateralen Zellmembran lokalisiert sind. Due to the morphology of the cells, this approach allows conclusions to a share of active transporter proteins at the permeation of the substance, because these transporter proteins are localized in the basolateral cell membrane. Aus diesen Daten läßt sich der sogenannte Permeationskoeftizient berechnen, der wiederum mit in vivo Daten aus dem menschlichen Körper korreliert. From these data, the so-called Permeationskoeftizient can be calculated, which in turn correlates with in vivo data from the human body.
  • Neben Zellmonolagen werden in den letzten Jahren zunehmend auch weitere künstliche Permeationsbarrieren wie z. In addition to cell monolayers, other artificial permeation barriers such are increasingly in recent years. B. artifizielle Lipidsysteme verwendet. B. artificial lipid systems used. So wurde von Kansy und Mitarbeitern 1998 das sogenannte PAMPA-Verfahren beschrieben (PAMPA = Parallel Artificial Membrane Permeation Assay), bei dem die Permeation von chemischen Substanzen mit Hilfe poröser Filtermembranen gemessen wird (Kansy M. et al. (1998), Physicochemical high throughput screening: parallel artificial membrane permeability assay in the description of passive absorption process, J. Med. Chem. 41, 1007–1010). As described by Kansy et al, 1998, the so-called PAMPA method (PAMPA = Parallel Artificial Membrane Permeation Assay) in which the permeation of chemical substances with the help of porous filter membranes is measured (Kansy M. et al. (1998) Physicochemical high throughput screening:.. parallel artificial membrane permeability assay in the description of passive absorption process, J. Med Chem 41, 1007-1010). Die Filtermembranen werden dabei mit Mischungen von 1–20 % Lecithin in organischen Lösungsmitteln (z. B. Dodekan, Hexadekan, 1,9-Dekadien) imprägniert, so daß eine lipophile Trennschicht (Barriere) entsteht. The filter membranes are impregnated case with mixtures of 1-20% of lecithin in organic solvents (eg. B. dodecane, hexadecane, 1,9-decadiene), so that a lipophilic separating layer (barrier) is formed.
  • 2001 wurde eine Modifikation des PAMPA-Verfahrens von Wohnsland und Faller (Wohnsland F. und Faller B., High-Throughput Permeability pH Profile and High-Throughput Alkane/Water log P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001, 923–930) beschrieben, bei der eine Hexadekanschicht zwischen zwei Wasserkompartimenten als Permeationsbarriere benutzt wird. 2001 was a modification of the PAMPA method of residential land and Faller (country of residence F. and Faller example, high-throughput permeability pH profiles and high-throughput alkanes / Water log P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001 923-930) described in which a Hexadekanschicht between two water compartments is used as a permeation barrier. Dieses Verfahren reduziert den Durchmesser der Permeationsbarriere bei gleichzeitiger Verwendung von Polycarbonat-Filtermembranen mit größeren Porendurchmessern (3 μm vs. 0,22 bzw. 0,45 μm bei Kansy) von 120 μm bei Kansy auf etwa 10 μm und erhöht dadurch den möglichen Durchsatz an Substanzen pro Zeiteinheit. This procedure reduces the diameter of the permeation barrier (3 microns vs. 0.22 and 0.45 microns in Kansy) of 120 microns in Kansy to about 10 micrometers, thereby increasing the possible throughput with a simultaneous use of polycarbonate filter membranes with larger pore diameters substances per unit of time.
  • In einer weiteren Modifikation des Verfahrens von Kansy werden an Stelle von Lecithin komplexe Lipidmischungen eingesetzt (Sugano K. et al., Optimized conditions of biomimetic artificial membrane permeability assay, Int. J. Pharm. 2001, 228, 181–188). In a further modification of the method of Kansy complex lipid mixtures are used in place of lecithin (Sugano K. et al., Optimized conditions of biomimetic artificial membrane permeability assay, Int. J. Pharm. 2001, 228, 181-188). Eine solche spezielle Lipidzusammensetzung simuliert besser den gastrointestinalen Trakt und sorgt so für eine höhere biologische Relevanz der Meßmethode. Such a special lipid composition better simulates the gastrointestinal tract, thus ensuring a higher biological relevance of the measurement method. Diese Modifikation ist als biometrisches PAMPA- oder auch BAMPA-Verfahren (Biometric Artificial Membrane Permeation Assay) in die Literatur eingegangen (Miret S., Abrahamse L., De Groene EM, Comparison of in vitro models for the prediction of compound absorption across the human instestinal mucosa, J. Biomolec. Screen 2004, 9, 598–606). This modification is as a biometric PAMPA or Bampa process (Biometric Artificial Membrane Permeation Assay) in the chemical literature (Miret S., Abrahamse L., De Groene EM, Comparison of in vitro models for the prediction of compound absorption across the human instestinal mucosa, J. Biomolec. Screen 2004, 9, 598-606).
  • Alle beschriebenen Vorgehensweisen zur Untersuchung der Permeation haben gemeinsam, daß die Konzentrationsbestimmung der Substanz in der Probe nur diskontinuierlich vorgenommen werden kann. All procedures for the investigation of permeation described have in common that the concentration determination of the substance in the sample can be carried out discontinuously. Um zu beurteilen, ob und inwieweit eine Substanz durch eine Barriere permeiert, ist die mindestens einmalige Entnahme einer Probe aus dem Akzeptorkompartiment hinter der Barriere erforderlich, gefolgt von einem Transfer zu einem externen Analysegerät, in dem die Bestimmung der Substanzkonzentration in der Probe erfolgt. In order to assess whether and to what extent a substance permeates through a barrier, at least once, taking a sample from the acceptor compartment behind the barrier is required, followed by transfer to an external analysis device, in which the determination of the substance concentration in the sample is performed. Insbesondere Messungen von Permeationskinetiken sind so nur unter großem Aufwand durchzuführen. In particular, measurements of permeation kinetics must be performed only at great expense. Für den Einsatz im Rahmen eines automatisierten, modernen Hochdurchsatzverfahrens, das gegebenenfalls die Untersuchung der Permeation von hunderten bis tausenden von Substanzen täglich und insbesondere dabei auch die Messung der Permeationskinetiken ermöglichen soll, sind die beschriebenen Untersuchungsmethoden gänzlich ungeeignet. For use in the context of an automated, modern high-throughput method, which is to optionally allow the study of the permeation of hundreds to thousands of substances daily, and especially the possibility to measure the permeation kinetics, the examination methods described above are completely unsuitable.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, neue und verbesserte Mittel und Wege zur Untersuchung und Messung der Permeation einer Substanz durch eine Barriere bereitzustellen, die die genannten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen. The present invention accordingly has an object to provide new and improved ways and means for examining and measuring the permeation of a substance through a barrier that does not have the said disadvantages of the prior art. Die Untersuchungen bzw. Messungen sollen ohne großen Aufwand und möglichst anwenderfreundlich durchführbar sein und insbesondere auch auf einen hohen Probendurchsatz auslegbar sein. The investigations and measurements are without great effort and be user-friendly as possible practicable and in particular be interpretable to a high sample throughput.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und einen Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 34. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 25 dargestellt. This object is achieved by the method having the features of claim 1 and a kit for carrying out a method according to the invention with the features of claim 34. Preferred embodiments of the method according to the invention are illustrated in the dependent claims 2 to 25th Die Ansprüche 26 bis 33 betreffen die Verwendungen bestimmter Einzelkomponenten in einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung. The claims 26 to 33 relate to the uses of certain components in one method according to the present invention. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into this specification.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist zur Untersuchung der Permeation einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Barriere vorgesehen. An inventive method is intended for examination of the permeation of a substance contained in a solvent by a barrier. Auch die gleichzeitige Untersuchung der Permeation mehrerer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanzen wird durch ein erfindungsgemäßes Verfahren ermöglicht. The simultaneous study of the permeation of several substances contained in a solvent is made possible by a method of the invention. Insbesondere eignet sich ein erfindungsgemäßes Verfahren hervorragend zur Bestimmung permeationsbeeinflussender Parameter wie beispielsweise der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, worauf später noch näher eingegangen wird. In particular, an inventive method is ideal for determining permeationsbeeinflussender parameters such as the permeability of the barrier to the at least one substance, which will be discussed in more detail later. Auch Permeationskinetiken lassen sich ohne großen Aufwand mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmen. Also permeation kinetics can be determined without much effort with the inventive method.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß die Permeation der mindestens einen Substanz unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde untersucht wird. An inventive method is characterized in particular by the fact that the permeation of the at least one substance is analyzed using at least one luminescent probe. Der Begriff „lumineszierend" wird dabei als Oberbegriff insbesondere für Fluoreszenz und Phosphoreszenz, aber auch beispielsweise für Elektro-, Thermo- und Chemolumineszenz verwendet. The term "luminescent" is used here as a generic term in particular for fluorescence and phosphorescence, but also, for example, electrical, thermal and chemiluminescence.
  • Die mindestens eine zu untersuchende Substanz wird in einem ersten Schritt in einem Lösungsmittel auf mindestens einer Seite einer Permeationsbarriere bereitgestellt. The at least one substance to be examined is provided in a first step in a solvent on at least one side of a permeation barrier. Dies schließt unter anderem auch die Möglichkeit ein, verschiedene Substanzen auf beiden Seiten der Barriere und/oder eine oder mehrere gleiche Substanzen auf beiden Seiten der Barriere bereitzustellen, wobei in letzterem Fall zwischen den beiden Seiten der Barriere bezüglich der zu untersuchenden Substanz bzw. der zu untersuchenden Substanzen jeweils eine Konzentrationsdifferenz zwischen den beiden Seiten der Barriere bestehen muß. This includes, inter alia, the possibility of one or provide various substances on both sides of the barrier and / or more of the same substances on both sides of the barrier, in the latter case between the two sides of the barrier with respect to the to the substance under investigation or to test substances in each case a difference in concentration between the two sides of the barrier must be made.
  • Danach läßt man die mindestens eine Substanz und die Permeationsbarriere über einen gewissen Zeitraum aufeinander einwirken. Then allowed to interact with each other at least one substance and the permeation over time. Auf diese Inkubation der Permeationsbarriere mit der mindestens einen im Lösungsmittel enthaltenen Substanz folgt in einem weiteren Schritt eine Messung von Lumineszenzsignalen der mindestens einen Sonde auf mindestens einer Seite der Permeationsbarriere. In this incubation, the permeation of the at least one substance contained in the solvent in a further step, a measurement of luminescence of the at least one probe on at least one side of the permeation barrier follows. Die gemessenen Lumineszenzsignale sind in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration der Substanz moduliert, wobei dafür zwingend erforderlich ist, daß die Absorptionsspektren der mindestens einen Substanz mit Anregungs- und/oder Emissionsspektren der mindestens einen Sonde überlappen. The measured luminescence signals are modulated in dependence on the concentration of the substance, it is imperative that the absorption spectra of the at least overlap a substance having excitation and / or emission spectra of the at least one probe.
  • Auf diese Weise lassen sich Aussagen über die Konzentration der zu untersuchenden Substanz auf einer oder auf beiden Seiten der Permeationsbarriere gewinnen, was wiederum direkte Rückschlüsse auf die Permeation der Substanz durch die Barriere sowie auf die diversen permeationsbeeinflussenden Parameter zuläßt. In this way, statements about the concentration of the test substance on one or both sides of the permeation barrier can be gained, which in turn allows direct conclusions about the permeation of the substance through the barrier and to the various permeationsbeeinflussenden parameters.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt damit den sogenannten inneren Filtereffekt aus, bei welchem die Lichtabsorption von Substanzen auf indirektem Wege über eine Abschwächung von Lumineszenzintensitäten geeigneter Sonden bestimmbar ist. thus the method of the invention utilizes the so-called inner filter effect, wherein the light absorption of substances can be determined indirectly through an attenuation of luminescence intensities appropriate probes. Dieses Phänomen beruht darauf, daß die Intensität von Lichtstrahlen, die auf dem Weg zu einer geeigne ten Sonde bzw. auf dem Weg von der Sonde zu einem Detektor von anderen gelösten Substanzen absorbiert werden, das heißt also abgeschwächt werden. This phenomenon is due to the fact that the intensity of light rays, which are absorbed on the way to an appro priate probe or on the path from the probe to a detector of other dissolved substances, so that is to be attenuated. Die Überlappung von Anregungs- beziehungsweise Emissionswellenlängen mit der Absorptionsbande der zu untersuchenden Substanz führt bei der Messung bei geeigneten Wellenlängen (das heißt im Bereich der Absorptionsbande der Substanz) zu einer Modulation bzw. Abschwächung der Lumineszenzintensität, die proportional der Konzentration der zu untersuchenden Substanzen vor und/oder hinter der Barriere ist. The overlap of the excitation or emission wavelengths of the absorption band of the test substance results in the measurement at appropriate wavelengths (i.e. in the range of the absorption band of the substance) to a modulation or attenuation of the luminescence intensity, which is proportional against the concentration of the test substances and or / behind the barrier. Bei einer Messung durchquert das Anregungslicht die Probe und wird im Fall einer Überlappung des Absorptionsspektrums der zu untersuchenden Substanz mit dem Anregungsspektrum der Sonde abgeschwächt bevor es zur Sonde gelangt. In a measurement the excitation light passes through the sample and, in the case of an overlap of the absorption spectrum of the test substance attenuated with the excitation spectrum of the probe before it reaches the probe. Diese wird zur Lumineszenz angeregt und emittiert Licht, das wiederum die Probe durchquert und im Fall einer Überlappung des Absorptionsspektrums der Substanz mit dem Emissionsspektrum der Sonde abgeschwächt wird. This excited to luminesce and emit light, which in turn passes through the sample and weakened in the case of an overlap of the absorption spectrum of the substance with the emission spectrum of the probe. Die Gesamtabschwächung des Signals ist proportional zur Substanzkonzentration in der Probe. The total attenuation of the signal is proportional to the substance concentration in the sample.
  • Der innere Filtereffekt wurde bereits für verschiedene analytische Methoden ausgenutzt. The inner filter effect was being exploited for various analytical methods. Beispielsweise beschreibt die WO 94/17388 die Nutzung des inneren Filtereffekts zur Bestimmung von Ionen in Flüssigkeiten mit Hilfe einer Sensormembran. For example, WO 94/17388 describes the use of the inner filter effect for the determination of ions in liquids with the aid of a sensor membrane. Die The US 4,822,746 US 4,822,746 befaßt sich allgemein mit der Nutzung des inneren Filtereffekts zur Bestimmung einer Ligandenbindung, wobei hier unter Liganden Ionen, Stoffe oder Ähnliches zu verstehen sind. relates generally to the use of the inner filter effect for the determination of ligand binding, wherein ions, substances, or the like are to be understood here under ligands. Der nachzuweisende Ligand wird durch eine geeignete (Farb-)Reaktion einer Analyse zugänglich gemacht. The ligand to be detected is made available by a suitable (color) reaction of an analysis. Weiterhin beschreibt die Further describes the US 4,654,300 US 4,654,300 die Nutzung eines derartigen Quencheffektes in Immunoassays. the use of such Quencheffektes in immunoassays. In jedem dieser genannten Fälle wird der innere Filtereffekt zu analytischen Zwecken genutzt. In each of these cases referred to the inner filter effect is used for analytical purposes. Dieser Effekt wird jedoch in keinem Fall direkt oder ausschließlich durch die zu untersuchende Substanz hervorgerufen, wie es in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen ist. This effect is caused in no case directly or only by the substance to be examined, as it is provided in a method according to the present invention.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren ermöglicht eine kontinuierliche Beobachtung und Messung eines Permeationsvorgangs und eignet sich somit insbesondere auch für die Messung von Permeationskinetiken. An inventive method allows for continuous monitoring and measuring a permeation process and is thus particularly suitable for the measurement of permeation kinetics. Neben der kontinuierlichen Messung können natürlich auch Einzelmessungen zu einem gegebenen Zeitpunkt vorgenommen werden. In addition to the continuous measurement of course individual measurements can be made at a given time. Auf Verfahrensschritte wie beispielsweise Probenentnahme und Probentransfer zum Zwecke externer Konzentrationsbestimmungen kann mit besonderem Vorteil verzichtet werden. In process steps such as sampling and sample transfer for the purpose of external concentration determinations can be dispensed with particular advantage. Durch einen Permeationsvorgang bedingte Konzentrationsänderungen bezüglich einer zu untersuchenden Substanz können somit problemlos auf einer Seite oder auch auf beiden Seiten einer Permeationsbarriere zugleich verfolgt werden. By a permeation process-related changes in concentration with respect to an examinee substance can thus be easily tracked on one side or on both sides of a permeation barrier at the same time. Damit eignet sich ein Verfahren nach der vorliegenden Erfindung insbesondere auch für den Einsatz im Rahmen eines automatisierten, modernen Hochdurchsatzverfahrens. Thus a method is according to the present invention, in particular for use as part of an automated, modern high-throughput method.
  • Die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise bei konstanter Temperatur, insbesondere in einem Temperaturbereich zwischen ca. 5 °C und ca. 40 °C. The carrying out of a method according to the invention preferably at a constant temperature, in particular in a temperature range between about 5 ° C and 40 ° C. In dem genannten Temperaturbereich kann weiter eine Temperatur von ca. 37 °C (also Körpertemperatur) besonders bevorzugt sein. In said temperature range the temperature (body temperature so) may be further more preferably from about 37 ° C. In den meisten Fällen sind allerdings Messungen bei ca. 20 °C (Raumtemperatur) bevorzugt. In most cases, however, measurements (room temperature) are preferred at about 20 ° C. Erfindungsgemäß wird das Verfahren vorzugsweise in wäßriger Lösung durchgeführt. According to the invention the process is preferably carried out in aqueous solution.
  • Eine in einem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Permeationsbarriere umfaßt in einer bevorzugten Ausführungsform eine artifizielle Membran. An insertable in a method of the invention comprises an artificial membrane permeation barrier in a preferred embodiment. Die artifizielle Membran umfaßt in Weiterbildung bevorzugt ein poröses Trägermaterial, insbesondere eine Filtermembran. The artificial membrane comprises in further preferably a porous support material, in particular a filter membrane. Die Beschaffenheit des Trägermaterials ist dabei grundsätzlich nicht kritisch, so lassen sich beispielsweise poröse Kunststoffe, Silikate, Glas, Keramik und Metalle einsetzen. The nature of the support material is generally not critical so porous plastics, silicates, glass, ceramics and metals can be used, for example.
  • Weiter ist es bevorzugt, daß die artifizielle Membran organisches Material umfaßt. Further, it is preferred that the artificial membrane comprises organic material. In bevorzugten Ausführungsformen bildet das organische Material eine Schicht auf der Oberfläche des porösen Trägermaterials aus und/oder liegt in den Poren des porösen Trägermaterials vor. In preferred embodiments, the organic material forms a layer on the surface of the porous carrier material and / or is in the pores of the porous carrier material prior.
  • Das organische Material ist erfindungsgemäß vorzugsweise lipophil bzw. hydrophob. The organic material is according to the invention preferably lipophilic or hydrophobic. Insbesondere handelt es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um mindestens einen Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder um mindestens einen Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen. In particular, the organic material consists essentially of at least one hydrocarbon with a preferred chain length of 8 or more carbons and / or at least one alcohol with a preferred chain length of 4 or more carbons. Kohlenwasserstoffe mit Kettenlängen von mehr als 12 Kohlenstoffen, insbesondere mit 14–16 Kohlenstoffen, sind unter den genannten weiter bevorzugt. Hydrocarbons having chain lengths of more than 12 carbons, particularly 14-16 carbons, more preferably under the above.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um ein Lipid oder um eine Lipidmischung. In a further preferred embodiment, the organic material is essentially a lipid or a lipid mixture. Hierbei kann es sich um eine einfache Lipidschicht, einen sogenannten Monolayer, oder um eine doppelte Lipidschicht, einen sogenannten Bilayer, handeln. This may be a simple lipid layer, called a monolayer, or a double lipid layer, a so-called bilayer act. Die Zusammensetzung derartiger Lipidschichten kann je nach gewünschter Anwendung frei gewählt werden. The composition of such lipid layers can be chosen depending on the desired application. Beispielsweise können derartige Lipidschichten weitgehend homogen aufgebaut sein, oder es können beispielsweise verschiedene Lipide als Bestandteile der Membranschichten eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel die Gegebenheiten einer nativen Membran nachgestellt werden können. For example, such lipid layers can be built up substantially homogeneously, or for example, various lipids are used as components of the membrane layers, whereby for example, the conditions of a native membrane can be adjusted. Unter den Lipiden oder den Lipidmischungen sind solche weiter bevorzugt, die membranständige, membranintegrale und/oder transmembrane Proteine aufweisen. Among the lipids or lipid mixtures are those more preferably, the membrane-associated, membrane-integral and / or transmembrane proteins.
  • Auch Zellen und/oder Zellfragmente können als organisches Material bevorzugt sein, wobei die Zellen dann insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht vorliegen. Also, cells and / or cell fragments may be preferred as organic material, wherein the cells are then present in particular in the form of a Zellmono- or cell multilayer. Besonders bevorzugt ist eine Monoschicht aus CACO-2-Zellen oder aus MDCK-Zellen. Particularly preferred is a monolayer of Caco-2 cells or MDCK cells.
  • In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es bevorzugt sein, daß die Permeationsbarriere an Stelle einer artifiziellen Membran eine nicht-artifizielle Membran umfaßt, insbesondere eine Membran aus Organgewebe. In certain embodiments of the method according to the invention it may be preferred that the permeation barrier comprising a non-artificial membrane in place of an artificial membrane, especially a membrane of organ tissue. Bevorzugt sind dann aus Darmgewebe präparierte Barrieren, wobei in weiteren Fällen auch aus Hautgewebe präparierte Barrieren bevorzugt sein können. prepared from intestinal tissue barriers, wherein also prepared from skin tissue barriers may be preferred in other cases, then, are preferred.
  • Die mindestens eine lumineszierende Sonde ist in bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise Bestandteil der Permeationsbarriere. The at least one luminescent probe is in preferred embodiments of the inventive method is preferably part of the permeation barrier. In diesen Fällen ist es bevorzugt, daß das poröse Trägermaterial einer artifiziellen Membran, insbesondere die Filtermembran, sondenmarkiert ist. In these cases, it is preferable that the porous carrier material of an artificial membrane, in particular the filter membrane is probed. Die Sonde kann dabei sowohl im Trägermaterial enthalten als insbesondere auch an dieses, vorzugsweise kovalent, gebunden sein. The probe can contain both the carrier material and in particular also on this, preferably covalently, bound.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann die mindestens eine Sonde auch Bestandteil des organischen Materials sein, das, wie oben bereits erwähnt, insbesondere als Schicht auf der Oberfläche des porösen Trägermaterials und/oder in den Poren des porösen Trägermaterials vorliegt. In further preferred embodiments, the at least one probe may also be part of the organic material, which, as already mentioned above, in particular as a layer on the surface of the porous carrier material and / or is present in the pores of the porous support material.
  • Neben der Möglichkeit, die mindestens eine Sonde als Bestandteil der Barriere einzusetzen, kann es allerdings auch bevorzugt sein, die mindestens eine Sonde auf die Barriere aufzubringen, insbesondere in Form eines sedimentierenden, sondenmarkierten Feststoffs. Besides being able to use at least one probe as part of the barrier, it may also be preferred, however, to apply the at least one probe to the barrier, especially in the form of a sedimenting, probe labeled solid. Als solcher eignen sich beispielsweise mit einer Sonde versehene Silikatkügelchen besonders gut, es sind aber auch sedimentierbare Feststoffe aus Glas-, Keramik-, Silikat-, Metall- und/oder Polymermaterial oder aus Kombinationen dieser Materialien denkbar. As such, for example, provided silicate beads are particularly well suited to a probe, but there are also sedimentable solids from glass, ceramic, silicate, metal and / or polymeric material, or combinations of these materials conceivable.
  • Weiterhin kann es auch bevorzugt sein, daß die mindestens eine Sonde im Lösungsmittel enthalten ist. Furthermore, it may also be preferred that the at least one probe is contained in the solvent. In diesen Fällen wird die Sonde auf einer oder auf beiden Seiten der Barriere entweder in gelöster Form eingesetzt oder, was besonders bevorzugt sein kann, in Form eines dispergierbaren, nicht-sedimentierenden Feststoffs. In these cases, the probe is used on one or both sides of the barrier, either in dissolved form or, which can be particularly preferably, in the form of a dispersible, non-sedimenting solid. Als nicht sedimentierender Feststoff sind insbesondere sondenmarkierte Polymerkügelchen einsetzbar. As a non-sedimenting solid probe labeled polymer beads are particularly applicable.
  • In weiteren Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, daß die mindestens eine Sonde Bestandteil eines Gels ist, das ebenfalls auf einer oder auf beiden Seiten der Barriere angeordnet sein kann. In further embodiments, it may be preferred that the at least one probe element of a gel can also be arranged on one or both sides of the barrier.
  • Selbstverständlich sind die genannten Möglichkeiten der Sondenanordnung in einem erfindungsgemäßen Verfahren auch miteinander kombinierbar. Of course, the possibilities of the probe assembly mentioned are also combined with each other in an inventive method.
  • Die Sonde selbst kann sowohl anorganischer als auch organischer Natur sein. The probe itself can be both inorganic and organic. Beispiele sind hier anorganische Nanopartikel, sogenannte „Quantumdots", farbstoffhaltige, dispergierbare oder sedimentierbare und/oder lumineszente Silikat- oder Keramikpartikel, organische Farbstoffe wie Rhodamin oder Fluoreszein, farbstoffhaltige, dispergierbare oder sedimentierbare und/oder lumineszente Polymerlatices. Organische Farbstoffe sind unter den genannten Sonden bevorzugt. Es sind als Sonden aber auch lumineszente Proteine wie beispielsweise GFP oder lumineszente Proteine, deren Lumineszenzeigenschaften sich durch Bindung von Substanzen ändert, wie es beispielsweise bei HSA und AGP der Fall ist, denkbar. Examples are inorganic nanoparticles, so-called "quantum dots", dye-containing, dispersible or sedimentable and / or luminescent silicate or ceramic particles, organic dyes such as rhodamine or fluorescein, dye-containing, dispersible or sedimentable and / or luminescent polymer latexes. Organic dyes are among said probes preferred. There are as probes as well as luminescent proteins such as GFP or luminescent proteins whose luminescence is changed by binding of substances, as is the case for example with HSA and AGP conceivable.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren wird besonders bevorzugt in mindestens einer Permeationseinrichtung durchgeführt. An inventive method is particularly preferably carried out in at least one Permeationseinrichtung. Eine solche umfaßt vorzugsweise mindestens ein Donorkompartiment, in dem die mindestens eine Substanz bereitgestellt wird, mindestens eine Barriere und mindestens ein Akzeptorkompartiment, in das die Substanz permeieren kann. Such preferably comprises at least a donor compartment in which the at least one substance is provided, at least one barrier and at least one acceptor, in which the substance can permeate. Die Messung der Lumineszenzsignale kann entweder nur im Do nor- oder nur im Akzeptorkompartiment erfolgen oder in beiden Kompartimenten gleichzeitig. The measurement of the luminescence can be effected either only in the do normal or only acceptor simultaneously in both compartments.
  • Insbesondere in einer Permeationseinrichtung besteht neben den bereits genannten Variationen der Sondenanordnung zusätzlich oder stattdessen auch die Möglichkeit, die mindestens eine Sonde in Form eines sondenmarkierten Einsatzes in das mindestens eine Donor- und/oder Akzeptorkompartiment einzubringen. Especially in a Permeationseinrichtung the probe assembly is additionally addition to the aforementioned variations or instead of the possibility of introducing at least one probe in the form of a probe labeled insert into the at least one donor and / or acceptor. Ein solcher Einsatz ist bevorzugt in Form und Größe auf eine Permeationseinrichtung bzw. ein Kompartiment einer Permeationseinrichtung abgestimmt, so daß die mindestens eine Sonde wiederholbar in einer definierten Position im jeweiligen Kompartiment plaziert werden kann. Such an insert is preferably adapted in shape and size to a Permeationseinrichtung or a compartment of a Permeationseinrichtung so that the at least one probe can be repeatably placed in a defined position in the respective compartment. Auch diese Art der Sondenanordnung kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren der bereits genannten Möglichkeiten der Sondenanordnung kombiniert werden. This type of probe assembly can optionally be combined with one or more of the aforementioned possibilities of the probe assembly.
  • Grundsätzlich ist ein erfindungsgemäßes Verfahren auch in nicht abgeschlossenen, kompartimentierten Systemen einsetzbar. In principle, an inventive method can also be used in non-terminated, compartmentalized systems. So ist es beispielsweise möglich, eine Dialysemembran mit einer Sonde zu versehen und das Fortschreiten eines Dialysevorgangs kontinuierlich zu verfolgen. So it is for example possible to provide a dialysis membrane with a probe and to follow the progress of a dialysis procedure continuously. Insbesondere kann so leicht erkannt werden, wann ein Dialysevorgang abgeschlossen ist. In particular, it can be seen easily when a dialysis process is complete.
  • In besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses parallelisiert durchgeführt, was insbesondere auch in Kompartimenten benachbarter Permeationseinrichtungen möglich ist. In particularly preferred embodiments of the method according to the invention this is carried out parallelized, which is possible in particular also in adjacent compartments Permeationseinrichtungen. Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere eines parallelisiert durchgeführten Verfahrens, sind Mikrotiterplatten besonders gut geeignet. For performing a method according to the invention, in particular a parallelization process carried out, microtiter plates are particularly well suited. Die Kavitäten von Mikrotiterplatten eignen sich hervorragend als Kompartimente einer Permeationseinrichtung. The wells of microtiter plates are very useful as compartments of a Permeationseinrichtung. Einsetzbar sind beispielsweise Mikrotiterplatten mit 24, 48, 96, 384 und 1536 Kavitäten. Usable are, for example microtiter plates 24, 48, 96, 384 and 1536 wells. Bevorzugt wird ein System aus zwei aufeinander abgestimmten Mikrotiterplatten verwendet, wobei die Kavitäten einer ersten Platte jeweils eine Filtermembran aufweisen (die wie oben ausgeführt in einem erfindungsgemäßen Verfahren als Bestandteil einer artifiziellen Membran dienen können) und die zweite Platte mit der ersten durch Aufeinanderstellen sandwichartig kombinierbar ist. a system is preferred for two coordinated microtiter plates used, wherein the wells of a first plate each having a filter membrane (in a process of this invention can serve as a component of an artificial membrane as stated above) and the second plate with the first combined sandwiched by stacking sites is , Im kombinierten Zustand ist die zweite Platte bevorzugt die untere Platte. In the combined state, the second plate is preferably the lower plate. Vorzugsweise ist dann jeder Kavität der oberen Platte eine sich senkrecht darunter befindliche Kavität der unteren Platte zugeordnet (bzw. umgekehrt). Preferably, each cavity of the upper plate is then a cavity of the lower plate associated with (or vice versa) vertically underneath. Das System aus den beiden Platten bildet somit eine Permeationseinrichtung mit einer Vielzahl benachbarter Donor- und Akzeptorkompartimente. The system of the two plates thus forms a Permeationseinrichtung with a plurality of adjacent donor and Akzeptorkompartimente.
  • Die Permeationsrichtung, also die Richtung, in der die permeierende Substanz die Permeationsbarriere durchdringt, ist dabei allerdings grundsätzlich frei wählbar (so kann z. B. die obere Platte mit den Filtermembranen Donor- oder Akzeptorplatte sein, gegebenenfalls aber auch beides zugleich). The permeating direction, ie the direction in which the permeating substance penetrates the permeation barrier here is, however, in principle freely selectable (so it can be the upper plate with the filter membranes donor or acceptor plate z. B., optionally also both at once). In den folgenden angegebenen Ausführungsformen ist grundsätzlich von einer Permeation von unten nach oben auszugehen, sofern es nicht anders angegeben ist. In the following embodiments given is to start from the bottom up principle of permeation, unless otherwise indicated. In den entsprechenden Abbildungen ist die Permeationsrichtung durch schwarze Pfeile markiert. In the corresponding figures, the permeation direction is marked by black arrows.
  • Bei der Messung von Lumineszenzsignalen in Mikrotiterplatten ist es möglich, die Messung in verschiedenen Meßanordnungen vorzunehmen. In the measurement of luminescence in microtiter plates, it is possible to perform the measurement in different measuring arrangements. Zum einen kann es bevorzugt sein, das Anregungslicht aus Richtung der Plattenunterseite an die Sonde heranzuführen und das Emissionslicht aus Richtung der Plattenunterseite zu detektieren. For one, it may be preferable to introduce the excitation light from the direction of the plate bottom to the probe, and to detect the emission light coming from the plate base. Diese Anordnung wird im folgenden als Messung „von unten" bezeichnet werden. Die andere Möglichkeit besteht in einer Messung „von oben", bei der das Anregungslicht von der Plattenoberseite zur Sonde gelangt und das Emissionslicht aus Richtung der Plattenoberseite detektiert wird. This arrangement will be hereinafter referred to as measurement "from below". The other possibility is a measurement of "top", wherein the excitation light from the plate upper side reaches to the probe and the emission light is detected from the direction of the plate upper side.
  • Das dabei meßbare Lumineszenzsignal ist proportional zur Substanzkonzentration. The case measurable luminescence is proportional to the concentration of substance. Diese kann in weiteren Schritten, bei Bedarf unter Ver wendung von Kalibrierungen, direkt in die korrespondierenden Konzentrationen umgerechnet werden. This may in further steps, if necessary under Ver application of calibration, directly into the corresponding concentrations are converted.
  • Die Grundlage zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c' liefert das Lambert-Beersche-Gesetz The basis for determining the concentration proportional size c 'provides the Beer-Lambert Law c' = log I 0 /I = ε·c·d (1) c '= log I 0 / I = ε · c · d (1)
  • I 0 ist dabei die Lumineszenzintensität einer Referenz ohne Substanz (in der Regel also nur mit Pufferlösung) und I die Lumineszenzintensität in Gegenwart der zu untersuchenden Substanz. I 0 is the intensity of luminescence of a reference without substance (usually so only with buffer solution), and I is the luminescence intensity in the presence of the test substance. Die zur Konzentration c konzentrationsproportionale Größe c' kann damit zu jedem Zeitpunkt t durch Messung zweier Lumineszenzintensitäten bestimmt werden. The concentration proportional to the concentration c Size c 'can therefore be at any time t is determined by measuring two luminescence intensities. Dies ist schematisch in This is shown schematically in 2 2 wiedergegeben. played.
  • Die Permeabilität P läßt sich mit Hilfe von Gleichung (2) bestimmen (Wohnsland F. und Faller B., High-Throughput Permeability pH Profile and High-Throughput Alkane/Water log P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001, 923–930). The permeability P can be determined (country of residence F. and Faller example, using equation (2) high-throughput permeability pH profiles and high-throughput alkanes / Water log P with Artificial Membranes, J. Med. Chem. 44, 2001 , 923-930).
  • Figure 00170001
  • Hierbei sind V D und V A die Volumina von Donor- bzw. Akzeptorkompartiment, A ist die zugängliche Permeationsoberfläche (errechnet durch Multiplikation der Gesamtoberfläche der verwendeten Barriere mit deren Porosität), t ist die gewählte Inkubationszeit und c Akzeptor und c Gleichgewicht sind die Substanzkonzentrationen im Akzeptorkompartiment nach einer Inkubationszeit t sowie nach Gleichgewichtseinstellung, also nachdem sich die Substanz gleichmäßig in Donor- und Akzeptorkompartiment verteilt hat. Here, V D and V A, the volumes of donor and acceptor, A is the accessible Permeationsoberfläche (calculated by multiplying the total surface of the barrier used with its porosity), t is the selected incubation time and c acceptor and c are balanced, the substance concentrations in acceptor t after an incubation period and after equilibration, that is, after the substance has uniformly distributed in the donor and acceptor.
  • V D , V A und A sind grundsätzlich frei wählbar, in der Praxis allerdings in der Regel durch den Meßaufbau fest vorgegeben. V D, V, A and A are basically arbitrary, but fixed in practice usually by the measurement setup. t ergibt sich aus der gewählten Dauer der Inkubation. t is obtained from the selected time of incubation. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren zu ermittelnden Größen sind damit die Konzentrationen c Akzeptor und c Gleichgewicht . The to be determined by the inventive method sizes are thus the concentrations c and c acceptor balance.
  • Der Quotient der beiden Konzentrationen c Akzeptor und c Gleichgewicht In Gleichung (2) läßt sich durch den Quotienten aus den beiden unmittelbar durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmbaren konzentrationsproportionalen GrÖßen c' Akzeptor und c' Gleichgewicht ersetzen, was ZU Gleichung (3) führt. The quotient of the two concentrations c and c acceptor equilibrium In equation (2) can be replaced by the quotient of the two immediately detectable by the inventive method sizes proportional concentration c 'acceptor and c' balance, which leads to equation (3).
  • Figure 00170002
  • Zur Ermittlung der Permeabilität müssen damit aus den Größen c' Akzeptor und c' Gleichgewicht nicht erst die tatsächlichen Substanzkonzentrationen ermittelt werden, was (wie oben bereits erwähnt) z. Need to determine the permeability thus be determined from the quantities c 'acceptor and c' balance not only the actual substance concentrations, which (as mentioned above) z. B. mit Hilfe von Kalibriertunktionen erfolgen kann. can be done as rogue Kalibriertunktionen. Die zu bestimmende Größe c' Akzeptor läßt sich einfach zu einem beliebig bestimmbaren Zeitpunkt t durch Messung der Lumineszenzaktivität problemlos ermitteln. The quantity to be determined c 'acceptor can be determined easily t simply by measuring the luminescence to a freely determinable time. Zur Ermittlung der verbleibenden unbekannten Größe c' Gleichgewicht stehen eine Reihe von Vorgehensweisen zur Verfügung. To determine the remaining unknown quantity c 'balance, a number of procedures are available.
  • In einem Fall wartet man nach Bestimmung der Größe c' Akzeptor einfach ausreichend lange, bis sich ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen Donor- und Akzeptorkavität eingestellt hat und mißt dann die Lumineszenzintensität I und I 0 . In one case, one waits after determining the size c 'acceptor just long enough to set a concentration has equilibrium between donor and Akzeptorkavität and then measures the luminescence intensity I and I 0th Aus Gleichung (1) ergibt sich die gesuchte Größe c' Gleichgewicht analog zur bereits bestimmten Größe c' Akzeptor . From equation (1), the desired quantity c gives 'balance analogous to the already determined size c' acceptor.
  • Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung von c' Gleichgewicht kann insbesondere dann bevorzugt sein, wenn die Bindung der Substanz an die Permeationsbarriere vernachlässigbar ist. Another possibility for the determination of c 'balance may be preferred in particular if the binding of the substance is negligible to the permeation barrier. In diesem Fall läßt sich die Gleichgewichtskonzentration mindestens näherungsweise aus dem volumengemittelten Wert von Akzeptor- und Donorkonzentration errechnen. In this case, the equilibrium concentration can be at least approximately calculated from the volume-averaged value of acceptor and donor concentration. Bei beispielsweise gleichen Volumina Lösungsmittel in Donor- und Akzeptorkompartiment sollte sich beim Bereitstellen einer Substanz im Donorkompartiment in 1 M Konzentration nach einer gewissen Zeit eine Konzentration von jeweils 0,5 M im Akzeptor- und im Donor-Kompartiment eingestellt haben. For example, with equal volumes of solvent in the donor and acceptor should have adjusted a concentration of 0.5 M in the acceptor and the donor compartment in providing a substance in the donor compartment at 1 M concentration after a certain time. Zur Bestimmung von c' Gleichgewicht befüllt man Donor- und/oder Akzeptorkompartiment mit einer Lösung mit der rechnerischen Gleichgewichtskonzentration. To determine c 'balance is filled donor and / or acceptor with a solution with the calculated equilibrium concentration. Aus einfacher Messung der Lumineszenzintensität der befüllten Kompartimente und einem Referenzwert ergibt sich dann wiederum gemäß Gleichung (1) die gesuchte Größe c' Gleichgewicht . For easier measurement of the luminescence intensity of the filled compartments and a reference value, the desired quantity c 'balance is then obtained in turn in accordance with equation (1).
  • Eine dritte, besonders bevorzugte Möglichkeit zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen GrÖße c' Gleichgewicht besteht darin, die konzentrationsproportionalen Größen c' Akzeptor und c' Donor durch gleichzeitige Messung der Fluoreszenzintensitäten einer Referenz und einer Probe in Akzeptor- und Donorkompartiment sowohl „von oben" als auch „von unten" zu bestimmen, wobei bei unterschiedlichen Weglängen des Anregungs- und Emissionslichts durch die Probe gegebenenfalls die konzentrationsproportionalen Größen auf diese normiert werden müssen. A third, particularly preferred way of determining the concentration proportional variable c 'balance is the concentration proportional sizes c' acceptor and c 'donor by simultaneous measurement of the fluorescence intensities of a reference and a sample in the acceptor and donor compartment both "top" and " to determine from below ", optionally the concentration proportional sizes must be normalized to this at different path lengths of excitation and emission light through the sample. Bei vernachlässigbarer Bindung der Substanz an die Permeationsbarriere ergibt sich c' Gleichgewicht aus der Massenbilanz, also dem volumengemittelten Wert von Akzeptor- und Donorkonzentration. With negligible bonding of the substance to the permeation barrier to 'c resulting balance of the mass balance, that the volume-averaged value of the acceptor and donor concentration. Dies ist schematisch in This is shown schematically in 3 3 wiedergegeben. played.
  • Ersetzt man entsprechend in Gleichung (3) die Größe c' Gleichgewicht durch den volumengemittelten Wert von Akzeptor- und Donorkonzentration, so erhält man Gleichung (4), mit deren Hilfe die Permeabilität einer Barriere komfortabel bestimmt werden kann. Is replaced in accordance with equation (3) the size c 'balance by the volume-averaged value of the acceptor and donor concentration, one obtains equation (4), with the aid of the permeability of a barrier can be easily determined.
  • Figure 00190001
  • Diese Vorgehensweise ermöglicht auch eine quasisimultane Bestimmung der Anreicherung in der Akzeptor- und der Verarmung in der Donorkavität und erlaubt damit auch Aussagen über den eigentlichen Permeationskoeffizienten hinaus. This approach also allows for quasi-simultaneous determination of the concentration in the acceptor and the depletion in the donor cavity and therefore also allows statements about the actual permeation coefficient addition. So können auch Prozesse wie die bei der Permeation einer Substanz durch eine Barriere auftretende Membranretention zeitaufgelöst verfolgt werden. Including processes such as membrane retention in the permeation of a substance occurring through a barrier can be tracked with time resolution.
  • Dies ist auch gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, nach der die Messung der Lumineszenz ausschließlich „von oben" erfolgt. Es werden dazu Messungen in 3 Permeationseinrichtungen (bei Verwendung eines Systems aus Mikrotiterplatten in drei Kavitäten) durchgeführt, was in This is also possible in accordance with another preferred embodiment of the inventive method, after the measurement of luminescence is carried out exclusively "from above". It is to measurements in 3 Permeationseinrichtungen (using a system of microtiter plates in three wells) performed, which in 4 4 schematisch illustriert ist. is schematically illustrated. Eine Referenzkavität dient zur Bestimmung der Lumineszenzintensität I 0 einer Referenz ohne Substanz (die Referenzkavität in A reference cavity is used for the determination of luminescence intensity I 0 of a reference with no substance (the reference cavity in 4 4 rechts oben). top right). Die Referenzkavität enthält dabei nur Pufferlösung. The reference cavity thereby contains only buffer solution. Eine zweite Kavität (die Akzeptorkavität in A second cavity (which in Akzeptorkavität 4 4 links oben) dient zur Bestimmung der Lumineszenzintensität I Akzeptor In ihr reichert sich Substanz an, die von unten durch eine Barriere permeiert. on the top left) is used for the determination of luminescence intensity I acceptor In it accumulates substance permeating from below by a barrier. Eine dritte Kavität (die Donorkavität in A third cavity (the donor cavity in 4 4 Mitte oben) dient zur Bestimmung der Lumineszenzintensität I Donor . Top center) is used to determine the luminescence intensity I donor. In ihr wurde Substanz bereitgestellt, die durch die Barriere nach unten permeiert. In their substance was provided that permeates through the barrier down.
  • Die konzentrationsproportionalen Größen werden in dieser Anordnung wie üblich gemäß c' Akzeptor = log I 0 /I Akzeptor und c' Donor = log I 0 /I Donor bestimmt. The concentration proportional sizes are as usual in accordance with c 'acceptor = log I 0 / I acceptor, and c' = log donor determined I 0 / I donor in this arrangement. Dabei wird vorausgesetzt, daß die Anreicherung in der Akzeptor- und der Verarmung in der Donorkavität proportional zueinander verlaufen. It is assumed that the accumulation in the acceptor and the depletion in the donor cavity extend proportional to each other.
  • In einem erfindungsgemäßen Verfahren ist es allgemein bevorzugt, daß die Messung der Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Wellenlängen, insbesondere Anregungs- und Emissionswellenlängen erfolgt. In an inventive process, it is generally preferred that the measurement of luminescence is carried out at one or more discrete wavelengths, especially the excitation and emission wavelengths. Andererseits können jedoch auch gesamte Spektren gemessen werden und hieraus Rückschlüsse auf die Modulation der jeweiligen Signale bestimmter Wellenlängen gezogen werden. On the other hand, all spectra can be measured, and conclusions on the modulation of the respective signals of certain wavelengths thereof are drawn.
  • Die mindestens eine lumineszierende Sonde weist bevorzugt fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften auf. The at least one luminescent probe preferably has fluorescent and / or phosphorescent properties. Hierbei erfolgt die Anregung der jeweiligen Fluoreszenz oder Phosphoreszenz entweder mit einer oder mehreren definierten Wellenlängen, oder es werden Anregungsspektren aufgenommen. Here, the excitation of the respective fluorescence or phosphorescence is carried out either with one or more defined wavelengths or excitation spectra will be recorded. Weiterhin kann als Sonde auch eine lumineszierende Sonde eingesetzt werden, welche ein Signal ohne vorherige Lichtanregung abstrahlt. Further, a luminescent probe can be used as a probe which emits a signal without light excitation. Beispielsweise kann hierfür eine Sonde mit Elektro-, Thermo- und/oder Chemolumineszenz verwendet werden. For example, a probe with electrical, thermal and / or chemiluminescence can be used for this purpose. Die Verwendung von Sonden mit Fluoreszenz und Phosphoreszenz ist jedoch besonders bevorzugt, da es sich hierbei um in der Laborpraxis etablierte Vorgehensweisen handelt, die sehr gut handhabbar sind. However, the use of probes with fluorescence and phosphorescence is particularly preferred since this is established procedures are in laboratory practice that are very easy to handle.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Einzelsonde bzw. eine einzelne Sondenart eingesetzt. In a further preferred embodiment of the inventive method, a single probe or a single probe type is used. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, daß eine Kombination verschiedener Sonden verwendet wird. On the other hand, it may also be preferred that a combination of different probes is used. Eine solche Kombination von Sonden kann in einer bevorzugten Ausführungsform über den sogenannten Förster-Energietransfer miteinander gekoppelt sein. Such a combination of probes can be coupled in a preferred embodiment, via the so-called Förster energy transfer with each other.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt neben dem bereits beschriebenen Verfahren auch die Verwendung verschiedener Einzelkomponenten in einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung. The present invention comprises in addition to the method already described the use of various individual components in a method according to the present invention. Dazu zählen These include
    • – die Verwendung von mindestens einer Mikrotiterplatte, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationseinrichtung, - the use of at least one microtiter plate, in particular as part of at least one Permeationseinrichtung,
    • – die Verwendung von mindestens einem Farbstoff, insbesondere als mindestens eine lumineszierende Sonde, - the use of at least one dye, in particular as at least one luminescent probe,
    • – die Verwendung eines Einsatzes zum Einbringen einer lumineszierenden Sonde in ein Kompartiment einer Permeationseinrichtung, - the use of an insert for the introduction of a luminescent probe in a compartment of a Permeationseinrichtung,
    • – die Verwendung mindestens eines porösen Trägermaterials, bevorzugt mindestens einer Filtermembran, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere, - the use of at least one porous carrier material, preferably at least one filter membrane, in particular as part of at least one permeation barrier,
    • – die Verwendung mindestens eines Lipids oder einer Lipidmischung, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere, - the use of at least one lipid or a lipid mixture, in particular as part of at least one permeation barrier,
    • – die Verwendung mindestens eines Kohlenwasserstoffs mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens eines Alkohols mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere, - the use of at least one hydrocarbon with a preferred chain length of 8 or more carbons and / or at least one alcohol with a preferred chain length of 4 or more carbons, in particular as part of at least one permeation barrier,
    • – die Verwendung von Zellen, vorzugsweise in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere, - the use of cells, preferably in the form of a Zellmono- or cell multi-layer, in particular as part of at least one permeation barrier,
    • – die Verwendung von Zellfragmenten, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere und - the use of cell fragments, in particular as part of at least one permeation barrier and
    • – die Verwendung mindestens einer Membran aus Organgewebe, insbesondere als Permeationsbarriere. - the use of at least one membrane of organ tissue, in particular as a permeation barrier.
  • Alle angeführten, bevorzugt verwendbaren Komponenten wurden bereits oben ausführlich erläutert. All the above mentioned, preferably usable components were explained in detail above. Auf die entsprechenden Stellen der Beschreibung wird hiermit verwiesen und Bezug genommen. To the corresponding locations of the description is hereby incorporated by reference and reference.
  • Weiterhin umfaßt die Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Furthermore, the invention also includes a kit for carrying out a method according to the invention. Ein erfindungsgemäßer Kit umfaßt mindestens 2 Mitglieder aus der Gruppe mit A kit of the invention comprises at least two members of the group
    • – mindestens einer Mikrotiterplatte, - at least a microtiter plate,
    • – mindestens einer lumineszierenden Sonde, - at least one luminescent probe,
    • – mindestens einem Einsatz zum Einbringen einer lumineszierenden Sonde in mindestens ein Kompartiment einer Permeationseinrichtung, insbesondere in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte, - at least one insert for the introduction of a luminescent probe in at least one compartment of a Permeationseinrichtung, in particular in the wells of a microtiter plate,
    • – mindestens einem porösen Trägermaterial, insbesondere mindestens einer Filtermembran, - at least one porous carrier material, in particular at least one filter membrane,
    • – mindestens einem Lösungsmittel, - at least one solvent,
    • – mindestens einem geeigneten Puffersystem, - at least a suitable buffer system,
    • – mindestens einem Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens einem Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen, - at least one hydrocarbon with a preferred chain length of 8 or more carbons and / or at least one alcohol having a preferred chain length of 4 or more carbons,
    • – mindestens einem Lipid oder einer Lipidmischung, - at least one lipid or a lipid mixture,
    • – Zellen, insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht, - cells, in particular in the form of a Zellmono- or cell multilayer,
    • – Zellfragmenten und - cell fragments and
    • – mindestens einer nicht-artifiziellen Membran, insbesondere mindestens einer Membran aus Organgewebe. - at least one non-artificial membrane, in particular at least one membrane of organ tissue.
  • Auch die Einzelkomponenten des Kits wurden oben bereits ausführlich erläutert. The individual components of the kit have already been explained in detail above. Auf die entsprechenden Stellen der Beschreibung wird entsprechend hiermit verwiesen und Bezug genommen. To the appropriate places in the specification is hereby made accordingly and reference.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit kann Einzelkomponenten separat als „Bausatz" enthalten, um dem Anwender die Möglichkeit zu geben, diese gezielt für eine ganz bestimmte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens miteinander zu kombinieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits sind einzelne Bestandteile des Kits allerdings bereits für eine oder mehrere bestimmte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens anwendungsfertig enthalten. So kann es beispielsweise bevorzugt sein, daß der Kit eine Filtermembran aufweist, die bereits sondenmarkiert und/oder mit einer organischen Schicht z. B. aus Kohlenwasserstoffen versehen ist und unmittelbar in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. A kit of the invention may include individual components separately as a "kit" to give the user the ability to combine these targeted for a specific embodiment of a method according to the invention with each other. In a particularly preferred embodiment of the inventive kit individual components of the kit are, however, already for contain one or more specific embodiments of the method according to the invention ready for use. for example, it may be preferred that the kit comprises a filter membrane which have already been probed and / or is provided with an organic layer, for. example, of hydrocarbons and directly used in a process of this invention can be.
  • Mit einem Verfahren und/oder einem Kit nach der vorliegenden Erfindung kann grundsätzlich die Permeation von Substanzen aus beliebigen Stoffklassen untersucht werden. With a method and / or a kit according to the present invention, the permeation of substances can be examined from any substance classes generally. Insbesondere können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens potentielle Wirkstoffe, insbesondere potentielle pharmazeutische und/oder biologische Wirkstoffe, untersucht werden, die für Therapie und/oder Diagnostik verschiedener Krankheiten einsetzbar sind. In particular, potential drugs, particularly potential pharmaceutical and / or biological agents can be studied with the aid of the inventive method that can be used for therapy and / or diagnosis of various diseases. Es kann sich hierbei beispielsweise auch um Peptide oder Proteine handeln. It can also be peptides or proteins here, for example. Insbesondere können auch niedermolekulare Stoffe, wie häufig bei potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen vorkommend, untersucht werden. In particular, low molecular weight substances, such as frequently occurring among potential pharmaceutical agents examined can.
  • Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Zeichnungen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Further features of the invention will become apparent from the drawings and from the following description of preferred embodiments taken in conjunction with the subclaims. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander bei einer Ausführungsform der Erfindung verwirklicht sein. Here, the individual features can be implemented individually or as a plurality in combination with each other in one embodiment of the invention. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen. The particular embodiments described serve merely for illustration and for better understanding of the invention and should in no way be construed as limiting. Auch die nachstehend beschriebenen Zeichnungen sind Bestandteil der vorliegenden Beschreibung, was hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme bekräftigt wird. Also, the drawings described below are part of the present description, which is hereby confirmed by express reference.
  • In den Zeichnungen zeigen: In the drawings:
  • 1 1 : Korrelation der Messwerte aus den Beispielen 6 und 7 Correlation of the measured values ​​of Examples 6 and 7
  • 2 2 : Verlauf der gemäß Beispiel 8 ermittelten, konzentrationsproportionalen Größen für die Substanzen Warfarin, Propanolol und Carbamazepin : Course of Example 8 calculated in accordance concentration proportional sizes of the substances warfarin, propranolol and carbamazepine
  • Beispiel 1 : Herstellung eines passivierten, sondenmarkierten, fluoreszenzaktiven Trägers Example 1: Preparation of a passivated, probe labeled, fluorescence-active carrier
  • 2 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleoprep 300-12 von Macherey-Nagel, Düren) werden in eine Silanlösung, bestehend aus 9,2 ml N-(2-Aminoethyl)-3Aminopropyltrimethoxysilan (EDA) und 243 μl konzentrierter Essigsäure in 450 ml entionisiertem Wasser gegeben und drei Stunden langsam rotiert. 2 g of a porous silicate material (Nucleoprep 300-12 from Macherey-Nagel, Duren) are in a silane solution consisting of 9.2 ml of N- (2-aminoethyl) -3Aminopropyltrimethoxysilan (EDA) and 243 .mu.l of concentrated acetic acid in 450 ml deionized water mixture was rotated slowly for three hours. Danach wird das Silikatmaterial sedimentiert, dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und bei 80 °C getrocknet. Thereafter, the silicate material is sedimented, washed three times with deionized water and dried at 80 ° C.
  • Der Träger wird in 18 ml Carbonatpuffer (pH 9,5) dispergiert und mit 2 ml einer Lösung von Rhodamin-Isothiocyanat (RITC) in Carbonatpuffer (Endkonzentration 40 μmol/l) versetzt und über Nacht rotiert. The carrier is dispersed in 18 ml of carbonate buffer (pH 9.5) and (RITC) in carbonate buffer mixed with 2 ml of a solution of rhodamine isothiocyanate (final concentration of 40 .mu.mol / l) and rotated overnight. Zur Entfernung von nicht umgesetztem RITC wird zunächst zweimal mit Carbonatpuffer und abschließend dreimal mit PBS (phosphate buffered sa line, 10 mM Natriumphosphat, 0,9 % Natriumchlorid, pH 7,4) gewaschen. To remove unreacted RITC (0.9% sodium chloride, pH 7.4 phosphate buffered sa line, 10 mM sodium phosphate) is first washed twice with carbonate buffer and finally washed three times with PBS.
  • Zur Passivierung wird der Träger mit 20 ml einer Lösung von Polyethylenglykolbisglycidylether (Mm ~ 526 g/mol) in PBS (3 % (w/v)) versetzt und über Nacht auf einem Überkopfrotierer gedreht, woraufhin drei mal mit PBS gewaschen wird. To passivate the support with 20 ml of a solution of polyethyleneglycolbisglycidyl ether is (Mm ~ 526 g / mol) in PBS (3% (w / v)) was added and rotated overnight on a Überkopfrotierer, then washed three times with PBS. Die Suspension wird abschließend auf einen 20 %igen Festkörpergehalt (200 mg Festkörper pro 1 ml Suspension) eingestellt. The suspension is finally adjusted to a 20% solids content (200 mg solids per 1 ml of suspension).
  • Beispiel 2: Herstellung sondenmarkierterter Filterplatten Example 2: Preparation sondenmarkierterter filter plates
  • Die einzelnen Kavitäten eines kommerziell erhältlichen Systems aus zwei aufeinander abgestimmten Mikrotiterplatten (96well Permeation von Millipore mit einer Donor- und einer Akzeptorplatte) werden zunächst für eine Stunde mit 150 μl einer Polyethyleniminlösung (1 mg/ml in entionisiertem Wasser) befüllt. The individual wells of a commercially available system of two coordinated microtiter plates (96well permeation of Millipore with a donor and an acceptor plate) are (1 mg / ml in deionized water) filled initially for one hour with 150 ul of a polyethyleneimine. Die beiden Platten werden ineinander gestellt, um den Filter zu inkubieren. The two plates are placed into each other to incubate the filter. Anschließend werden die Kavitäten 3 mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und in Carbonatpuffer umgepuffert. Subsequently, the wells are washed 3 times with deionized water and re-buffered in carbonate buffer. In einem weiteren Schritt werden die Kavitäten von Donor und Akzeptorplatte mit 150 μl einer 10 μmol/l Lösung von Rhodamin-Isothiocyanat in Carbonatpuffer (pH 9,5) befüllt und für zwei Stunden ineinander gestellt. In another step, the cavities of the donor and acceptor plate with 150 ul of a 10 mol / l solution of rhodamine isothiocyanate to be filled in carbonate buffer (pH 9.5) and placed for two hours into each other. Anschließend wird einmal mit Carbonatpuffer und danach mit entionisiertem Wasser gewaschen. Then, once with carbonate and then washed with deionized water. Abschließend werden die Kavitäten getrocknet. Finally, the wells are dried.
  • Beispiel 3: Herstellung sondenmarkierter Filterplatten mit einer Hexadecanmembran Example 3: Preparation of labeled probe filter plates with a Hexadecanmembran
  • In die einzelnen Kavitäten einer farbstoffbeschichteten Filterplatte aus Beispiel 2 werden 15 μl einer 5 %igen Lösung von Hexadecan in Heptan auf die Membranen gegeben. In the individual wells of a dye-coated filter plate from Example 2 15 .mu.l of a 5% solution of hexadecane is added to heptane to the membranes. Man beläßt die Filterplatte so lange unter ständigem Luftabzug, bis die Heptanlösung verdampft ist. It leaves the filter plate so long under constant air extraction until the heptane solution is evaporated. Es resultiert eine sondenmarkierte Filterplatte mit einer Schicht Hexadecan auf den Membranen (hier auch als Hexadecanmembran bezeichnet). The result is a probe labeled filter plate with a layer of hexadecane on the membranes (also referred to herein as Hexadecanmembran).
  • Beispiel 4: Bestimmung der Substanzpermeation durch eine Hexadecanmembran einer sondenmarkierten Filterplatte Example 4: Determination of the substance permeation through a Hexadecanmembran a probe labeled filter plate
  • In mehrere Kavitäten der Filterplatte (in diesem Beispiel Akzeptorplatte) aus Beispiel 3 werden jeweils 150 μl PBS-Puffer pH 7,4, welcher 1 % DMSO enthält, pipettiert. In several cavities of the filter plate (in this example, acceptor plate) of Example 3 are 150 ul PBS buffer containing pH 7.4 containing 1% DMSO, is pipetted. Die korrespondierenden Kavitäten der Donorplatte werden mit jeweils 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung in PBS Puffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt. The corresponding cavities of the donor sheet are each with 135 .mu.l of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v) filled. Weitere Kavitäten der Donorplatte als auch der Akzeptorplatte werden nur mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt und dienen als Referenz zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität I 0 . More cavities of the donor sheet and the acceptor plate only be filled with a 1% solution of DMSO in PBS and used as a reference for determining the fluorescence intensity I 0th
  • Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c' Gleichgewicht werden sowohl einige Kavitäten der Donor- als auch die korrespondierenden Kavitäten der Akzeptorplatte mit 5E-5 molaren Lösungen (der rechnerischen Konzentrati on im Gleichgewicht) der zu untersuchenden Substanzen befüllt. To determine the concentration proportional variable c 'balance both some cavities of the donor and the corresponding cavities of the acceptor plate 5E-5 molar solutions (the computational concentra on at equilibrium) of the test substances to be filled.
  • Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. The permeation of the substances is started by the joining of the two plates. Nach 4 Stunden werden in einer Meßanordnung „von oben" in den Kavitäten der Akzeptorplatte die Fluoreszenzintensitäten gemessen. Aus den gemessenen Intensitäten wurden gemäß der oben beschriebenen Vorgehensweise die konzentrationsproportionalen Größen c' Akzeptor und c' Gleichgewicht der permeierten Substanzen ermittelt. After 4 hours, the fluorescence intensities in a measuring arrangement "top" in the cavities of the acceptor plate measured. The concentration proportional sizes c 'acceptor and c' balance the permeated substances were determined from the measured intensities according to the procedure described above.
  • Die untersuchten Substanzen im Versuch waren Warfarin und Carbamazepin, für welche mit Hilfe von Gleichung (3) die folgenden Permeabilitäten bestimmt werden konnten: The substances tested in the experiment were warfarin and carbamazepine, for which the following permeabilities could be determined using equation (3): logP Warfarin = –4,3 und logP = -4.3 and warfarin logP Carbamazepin = –3,9. logP = -3.9 carbamazepine.
  • Beispiel 5: Herstellung einer Mikrotiterplatte mit Hexadecanmembranen Example 5: Preparation of a microtiter plate with Hexadecanmembranen
  • In die mit Filtermembranen versehenen Kavitäten einer Mikrotiterplatte eines kommerziell erhältlichen Systems aus zwei aufeinander abgestimmten Mikrotiterplatten, wie es auch in Beispiel 2 eingesetzt wurde, werden 15 μl einer 5 %igen Hexadecan-Lösung in Heptan auf die Membranen gegeben und die Filterplatte so lange unter ständigem Luftabzug belassen, bis die Heptanlösung verdampft ist. In the provided with filter membranes wells of a microtiter plate of a commercially available system of two coordinated microtiter plates, as was also used in Example 2, 15 .mu.l of a 5% hexadecane solution in heptane are added to the membranes and the filter plate so long under continuous air exhaust left until the heptane has evaporated. Man erhält eine Mikrotiterplatte mit einer Schicht Hexadecan auf den Membranen. This gives a microtiter plate with a layer of hexadecane on the membranes.
  • Beispiel 6: Bestimmung der Substanzpermeation durch die Hexadecanmembranen einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, ausgelesen durch UV-Detektion Example 6: Determination of the substance permeation through the Hexadecanmembranen a microtiter plate of Example 5, read out by UV detection
  • In die mit Filtermembranen versehenen Kavitäten der Mikrotiterplatte (fungiert hier als Akzeptorplatte) aus Beispiel 5 werden jeweils 135 μl PBS-Puffer pH 7,4 und 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer pipettiert. In the filter membranes provided with cavities of a microtiter plate (acts as acceptor plate) of Example 5 are 135 ul of PBS buffer pH 7.4, and pipetted 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO in PBS buffer. Die Kavitäten der korrespondierenden Donorplatte werden mit jeweils 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt. The wells of the donor sheet corresponding to each 135 ul of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v) filled. Weitere 4 Kavitäten der Donorplatte als auch der Akzeptorplatte werden nur mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer befüllt und dienen als Referenz. More 4 wells of the donor sheet and the acceptor plate only be filled with a 1% solution of DMSO in PBS buffer and used as a reference.
  • Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. The permeation of the substances is started by the joining of the two plates. Nach 4 Stunden werden Donor- und Akzeptorplatte getrennt, und ein Aliquot von 50 μl wird aus den Kavitäten der beiden Platten in eine UV-transparente Mikrotiterplatte überführt. After 4 hours, the donor and acceptor plate are separated and an aliquot of 50 ul is transferred from the wells of the two plates in a UV-transparent microtiter plate. In einem UV-Plattenleser (SpektraMax plus 384 von Molecular Devices) wird die Konzentration der Substanzen bestimmt. In a UV plate reader (Molecular Devices SpektraMax plus 384) the concentration of substances is determined.
  • Die untersuchten Substanzen waren Desipramin, Quinidin, Testosteron, Furosemid, Terbutalin, Acyclovir, Ketoprofen, Carbamazepin, Amilorid, Metoprolol, Imipramin, Chloramphenicol, Propranolol, Corticosterone, Naproxen, Sulfasalazin, Verapamil, Progesteron und Warfarin. The substances studied were desipramine, quinidine, testosterone, furosemide, terbutaline, acyclovir, ketoprofen, carbamazepine, amiloride, metoprolol, imipramine, chloramphenicol, propranolol, corticosterone, naproxen, sulfasalazine, verapamil, progesterone and warfarin. Die gemäß Gleichung (2) ermittelten logarithmierten Permeabilitäten der Substanzen sind in Korrelation zu den gemessenen Werten der Messung aus Beispiel 7 in In accordance with Equation (2) determined logarithmic permeabilities of substances are correlated with the measured values ​​of the measurement of Example 7 in 1 1 dargestellt. shown.
  • Beispiel 7: Bestimmung der Substanzpermeation durch die Hexadecanmembranen einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, ausgelesen durch sondenmarkierte Silikatkügelchen Example 7: Determination of the substance permeation through the Hexadecanmembranen a microtiter plate of Example 5, read out by probe labeled silicate beads
  • Analog zu dem in Analogous to the 4 4 dargestellten Vorgehen wird hier eine Anordnung gewählt, in der die konzentrationsproportionalen Größen durch simultane Messung der Fluoreszenzintensitäten in Akzeptor- und Donorkavitäten „von oben" bestimmt werden. Procedure illustrated an arrangement is adopted here in which to determine the concentration proportional sizes by simultaneous measurement of the fluorescence intensities of the acceptor and in Donorkavitäten "from above".
  • Dazu werden in mehrere der mit Filtermembranen versehenen Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 115 μl PBS-Puffer, 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension (mit 200 mg Festkörper pro 1 ml Suspension) und 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer pipettiert. For this purpose into a plurality of cavities provided with filter membranes of the microtiter plate from example be 5115 ul of PBS buffer, 20 .mu.l of the support suspension prepared in Example 1 (containing 200 mg solids per 1 ml of suspension) and 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO in PBS buffer pipette. Die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren Mikrotiterplatte (ohne Filtermembranen) werden mit 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt. The corresponding wells of another microtiter plate (without filter membranes) with 135 ul of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v) filled.
  • In weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 werden 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension, 115 μl PBS-Puffer sowie 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) pipettiert. In other wells of the microtiter plate of Example 5, 20 .mu.l of the support suspension prepared in Example 1, 115 ul of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v) is pipetted. In die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren Mikrotiterplatte (ohne Filtermembranen) werden 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer und 135 μl PBS-Puffer pipettiert. Into the corresponding wells of another microtiter plate (without filter membranes) 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO in PBS-buffer and 135 ul of PBS buffer is pipetted.
  • Einige Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 fungieren hier also als Akzeptorkavitäten, andere als Donorkavitäten. Some wells of the microtiter plate from Example 5 thus acting as facilitators Akzeptorkavitäten, other than Donorkavitäten.
  • Weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 werden als Referenz wie ihre korrespondierenden Kavitäten in der weiteren Mikrotiterplatte mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt. Other wells of the microtiter plate of Example 5 are filled as a reference as their corresponding cavities in the further plate with a 1% solution of DMSO in PBS.
  • Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. The permeation of the substances is started by the joining of the two plates. Nach 4 Stunden werden in allen befüllten Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 die Fluoreszenzintensitäten in der Meßanordnung „von oben" bestimmt. Aus diesen Intensitäten wurden die konzentrationsproportionalen Größen der permeierten Substanz ermittelt. After 4 hours in all filled cavities of the microtiter plate of Example 5 to determine the fluorescence intensities in the measuring arrangement "from above". From these intensities, the concentration proportional sizes of the permeated substance were determined.
  • Die untersuchten Substanzen waren Desipramin, Quinidin, Testosteron, Furosemid, Terbutalin, Acyclovir, Ketoprofen, Carbamazepin, Amilorid, Metoprolol, Imipramin, Chloramphenicol, Propranolol, Corticosterone, Naproxen, Sulfasalazin, Verapamil, Progesteron und Warfarin. The substances studied were desipramine, quinidine, testosterone, furosemide, terbutaline, acyclovir, ketoprofen, carbamazepine, amiloride, metoprolol, imipramine, chloramphenicol, propranolol, corticosterone, naproxen, sulfasalazine, verapamil, progesterone and warfarin. Die ermittelten logarithmierten Permeabilitäten der Substanzen sind in Korrelation zu den gemessenen Werten der Messung aus Beispiel 6 in The determined logarithmic permeabilities of substances are correlated with the measured values ​​of the measurement of Example 6 in 1 1 dargestellt. shown.
  • Beispiel 8: Bestimmung der Substanzpermeation durch eine Hexadecanmembran auf einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, kontinuierlich ausgelesen durch farbstoffbeschichtete Silikatkugeln Example 8: Determination of the substance permeation through a Hexadecanmembran on a microtiter plate of Example 5, is continuously read out by dye-coated silicate spheres
  • Auch in Beispiel 8 sind zwei Permeationsrichtungen zu beachten. In Example 8 two Permeationsrichtungen be observed. Im Fall 1 permeiert die Substanz von „unten nach oben" in die Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 (Akzeptor), im Fall 2 permeiert die Substanz aus der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 (Donor) von „oben nach unten". In case 1, the substance permeates from "bottom to top" in the microtiter plate of Example 5 (acceptor), in case 2 the substance permeates from the microtiter plate of Example 5 (donor) from "top to bottom".
  • Für den Fall 1 werden in einige Kavitäten der Filterplatte aus Beispiel 5 115 μl PBS-Puffer pH 7,4, 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension und 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer pipettiert. For case 1 in some wells of the filter plate of Example 5115 ul of PBS buffer pH 7.4, 20 ul of the support suspension prepared in Example 1 and 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO are added to PBS buffer. Die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren Platte werden mit 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) gefüllt. The corresponding wells of another plate with 135 ul of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v) filled.
  • Für den Fall 2 werden in weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 20 μl der in Beispiel 1 hergestellten Trägersuspension, 115 μl PBS-Puffer sowie 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung pipettiert. For the case 2 in more cavities of the microtiter plate is pipetted 5 20 ul of the support suspension prepared in Example 1, 115 ul of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM solution of substance example. In die korrespondierenden Kavitäten der weiteren Platte werden 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer und 135 μl PBS-Puffer pipettiert. Into the corresponding cavities of the further plate 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO in PBS-buffer and 135 ul of PBS buffer is pipetted.
  • Weitere Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 werden als Referenz wie ihre korrespondierenden Kavitäten in der weiteren Mikrotiterplatte mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt. Other wells of the microtiter plate of Example 5 are filled as a reference as their corresponding cavities in the further plate with a 1% solution of DMSO in PBS.
  • Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. The permeation of the substances is started by the joining of the two plates. In diskreten Zeitintervallen von 5 min über eine Gesamtzeit von 4 Stunden hinweg wurden die Fluoreszenzintensitäten in der Messgeometrie „von oben" in allen befüllten Kavitäten der Mikrotiterplatte aus Beispiel 5 gemessen. Aus diesen Intensitäten wurden für jeden gemessenen diskreten Zeitpunkt die konzentrationsproportionalen Größen der permeierten Substanz ermittelt. In discrete time intervals of 5 min for a total time of 4 hours, the fluorescence intensities in the measurement geometry "top" were measured in all filled cavities of the microtiter plate of Example 5. Fig. From these intensities, the concentration proportional sizes of the permeated substance were determined for each measured discrete time ,
  • Die untersuchten Substanzen waren Warfarin, Carbamazepin und Propranolol. The substances studied were warfarin, carbamazepine and propranolol. Die erhaltenen mittleren Permeabilitäten der Substanzen betrugen: The resulting average permeabilities of the substances were: logP Warfarin = –4,7 logP = -4.7 warfarin logP Carbamazepin = –3,9 logP = -3.9 carbamazepine logP Propanolol = –3,8 logP = -3.8 propranolol
  • Die ermittelten Verläufe der konzentrationsproportionalen Größen der permeierenden Substanzen sind in The determined concentration profiles of the proportional sizes of the permeating substances are 2 2 dargestellt, wobei jeweils die obere Meßkurve die Abnahme der Substanzkonzentration in einer Donorkavität und die untere Meßkurve die Zunahme der Substanzkonzentration in einer Akzeptorkavität illustriert. shown, wherein each of the upper trace the decrease in substance concentration in a donor cavity and the lower trace illustrates the increase in the concentration of substance in a Akzeptorkavität.
  • Beispiel 9: Bestimmung der Substanzpermeation durch eine Hexadecanmembran auf einer Mikrotiterplatte aus Beispiel 5, ausgelesen durch farbstoffbeladene dispergierbare Polymerpartikel. Example 9: Determination of the substance permeation through a Hexadecanmembran on a microtiter plate of Example 5, read out by dye-loaded polymer particles dispersible.
  • In mehrere Kavitäten einer als Akzeptorplatte dienenden, gemäß Beispiel 5 hergestellten Mikrotiterplatte werden 120 μl PBS-Puffer, 15 μl einer 10 %igen Lösung von DMSO in PBS-Puffer und 15 μl einer Suspension von farbstoffbeladenen Polystyrolpartikeln (1 μm, 0,05 %, Hersteller Estapor) gegeben. In several cavities serving a as acceptor plate, according to Example 5 prepared microtiter plate 120 .mu.l of PBS buffer, 15 .mu.l of a 10% solution of DMSO in PBS buffer and 15 .mu.l of a suspension of dye-loaded polystyrene particles are (1 micron, 0.05%, Manufacturer Estapor®) given. Die korrespondierenden Kavitäten einer weiteren, als Donorplatte dienenden Mikrotiterplatte werden mit 135 μl PBS-Puffer und 15 μl einer 1,0 mM Substanzlösung in PBS-Puffer/DMSO (90:10 v:v) befüllt. The corresponding cavities of a further serving as a donor sheet microtiter plate with 135 ul of PBS buffer and 15 .mu.l of a 1.0 mM substance solution in PBS buffer / DMSO (90:10 v: v) filled. Weitere Kavitäten der Donorplatte (und die korrespondierenden auf der Akzeptorplatte) werden nur mit einer 1 %igen Lösung von DMSO in PBS befüllt und dienen als Referenz zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität I 0 . More cavities of the donor sheet (and corresponding to the acceptor plate) be filled with a 1% solution of DMSO in PBS and used as a reference for determining the fluorescence intensity I 0th
  • Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c' Gleichgewicht werden sowohl einige Kavitäten der Donor- als auch die korrespondierenden Kavitäten der Akzeptorplatte mit 5E-5 molaren Lösungen (der rechnerischen Konzentration im Gleichgewicht) der zu untersuchenden Substanzen befüllt. To determine the concentration proportional variable c 'balance both some cavities of the donor and the corresponding cavities of the acceptor plate 5E-5 molar solutions (the theoretical concentration at equilibrium) of the test substances to be filled.
  • Die Permeation der Substanzen wird durch das Zusammenfügen der beiden Platten gestartet. The permeation of the substances is started by the joining of the two plates. Nach 4 Stunden werden in allen befüllten Kavitäten der Akzeptorplatte die Fluoreszenzintensitäten der farbstoffbeladenen Polystyrolpartikel in der Messgeometrie „von oben" gemessen. Aus diesen Intensitäten wurden die konzentrationsproportionalen Größen der permeierten Substanz ermittelt. After 4 hours in all filled cavities of the acceptor plate, the fluorescence intensities of the dye-loaded polystyrene particles in the measuring geometry can be measured "from above". From these intensities, the concentration proportional sizes of the permeated substance were determined.
  • Untersucht wurde ua die Substanz Warfarin. The investigation was based, inter alia, the substance warfarin. Die Permeabilität von Warfarin wurde mit logP Warfarin = –4,5 bestimmt. The permeability of warfarin = logP with warfarin -4,5 determined.
  • Abbildungsbeschreibung Figure Description
  • 1 1 : Schematischer Aufbau einer Permeationsmessung mit einer Zellmonolage als Permeationsbarriere. : Schematic structure of a permeation measurement with a cell monolayer as a permeation barrier.
  • 2 2 : Schematische Darstellung einer Meßanordnung „von oben". Die Permeationsrichtung ist durch den schwarzen Pfeil markiert. In der linken Permeationseinrichtung befindet sich die permeierende Substanz während die Messung in der rechten Permeationseinrichtung als Referenz dient. : Schematic representation of a measuring arrangement "top" The permeating direction is marked by the black arrow in the left Permeationseinrichtung is the permeating substance during the measurement in the right Permeationseinrichtung serves as a reference...
  • 3 3 : Schematische Darstellung einer Meßanordnung zur gleichzeitigen Messung „von oben" und „von unten" zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen c' Akzeptor und c' Donor . : Schematic representation of a measuring device for simultaneous measurement of "top" and "bottom" for determining the concentration proportional sizes c 'acceptor and c' donor. Die Permeationsrichtung ist durch den schwarzen Pfeil markiert. The permeation is indicated by the black arrow.
  • 4 4 : Schematische Darstellung einer Lumineszenzmessung ausschließlich „von oben" zur simultanen Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen c' Akzeptor und c' Donor Die Permeationsrichtungen sind durch die schwarzen Pfeile markiert. : Schematic representation of a luminescence measurement only "top" for the simultaneous determination of the concentration proportional sizes c 'acceptor and c' donor The Permeationsrichtungen are marked by the black arrows.

Claims (34)

  1. Verfahren zur Messung der Permeation mindestens einer in einem Lösungsmittel enthaltenen Substanz durch eine Permeationsbarriere und/oder zur Bestimmung permeationsbeeinflussender Parameter, insbesondere zur Bestimmung der Permeabilität der Barriere für die mindestens eine Substanz, unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde, umfassend – die Bereitstellung der mindestens einen Substanz auf einer Seite der Permeationsbarriere, – Inkubation der Permeationsbarriere mit der mindestens einen, im Lösungsmittel enthaltenen Substanz und – Messung von Lumineszenzsignalen der Sonde auf mindestens einer Seite der Permeationsbarriere, welche in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentration der Substanz moduliert sind, wobei das Anregungs- und/oder das Emissionsspektrum der mindestens einen Sonde mit dem Absorptionsspektrum der mindestens einen Substanz überlappt. A method of measuring the permeation of at least one substance contained in a solvent by a permeation and / or to determine permeationsbeeinflussender parameters, in particular for determining the permeability of the barrier for the at least one substance using at least one luminescent probe, comprising: - providing the at least one substance on one side of the permeation barrier, - incubation of the permeation barrier to the at least one substance contained in the solvent, and - measurement of luminescence of the probe on at least one side of the permeation barrier, which are modulated depending on the relative concentrations of the substance, the excitation and / or overlaps the emission spectrum of at least one probe with the absorption spectrum of at least one substance.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere eine artifizielle Membran umfaßt. A method according to claim 1, characterized in that the permeation barrier comprising an artificial membrane.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die artifizielle Membran ein poröses Trägermaterial, insbesondere eine Filtermembran, umfaßt. A method according to claim 2, characterized in that the artificial membrane comprises a porous carrier material, in particular a filter membrane.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die artifizielle Membran organisches Material umfaßt, insbesondere als Schicht auf der Oberfläche des porösen Trägermaterials und/oder in den Poren des porösen Trägermaterials. A method according to any one of claims 2 or 3, characterized in that the artificial membrane comprises organic material, in particular as a layer on the surface of the porous carrier material and / or in the pores of the porous support material.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um mindestens einen Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder um mindestens einen Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen handelt. A method according to claim 4, characterized in that it is in the organic material is essentially a hydrocarbon with a preferred chain length of 8 or more carbons and / or an alcohol with a preferred chain length of 4 or more carbons is at least a minimum.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um ein Lipid oder eine Lipidmischung handelt. A method according to claim 4, characterized in that it is in the organic material is essentially a lipid or a lipid mixture.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid oder die Lipidmischung membranständige, membranintegrale und/oder transmembrane Proteine aufweist. A method according to claim 6, characterized in that the lipid or lipid mixture membrane-bound, membrane-integral and / or has transmembrane proteins.
  8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um Zellen handelt, wobei die Zellen insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht vorliegen. A method according to claim 4, characterized in that it substantially is in the organic material to cells, wherein the cells are present in particular in the form of a Zellmono- or cell multilayer.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zellmonoschicht um eine CACO-2- oder um eine MDCK-Monoschicht handelt. A method according to claim 8, characterized in that it is in the cell monolayer by a CACO-2 or a MDCK monolayer.
  10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem organischen Material im wesentlichen um Zellfragmente handelt. A method according to claim 4, characterized in that it substantially is in the organic material to cell fragments.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere eine nicht-artifizielle Membran umfaßt, insbesondere eine Membran aus Organgewebe. A method according to claim 1, characterized in that the permeation barrier comprising a non-artificial membrane, especially a membrane of organ tissue.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere aus einem Darmgewebe präpariert ist. Method according to one of claims 1 or 11, characterized in that the permeation barrier is prepared from an intestinal tissue.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Permeationsbarriere aus Hautgewebe präpariert ist. Method according to one of claims 1 or 11, characterized in that the permeation barrier is prepared from skin tissue.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde Bestandteil der Permeationsbarriere ist. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the at least one probe component of the permeation barrier.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Trägermaterial einer artifiziellen Membran sondenmarkiert ist. A method according to claim 14, characterized in that the porous carrier material of an artificial membrane is probed.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Material einer artifiziellen Membran sondenmarkiert ist. A method according to any one of claims 14 or 15, characterized in that the organic material of an artificial membrane is probed.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde auf die Permeationsbarriere aufgebracht ist, insbesondere in Form eines auf die Permeationsbarriere sedimentierten, sondenmarkierten Feststoffs. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the at least one probe is applied to the permeation barrier, in particular in the form of a sediment on the permeation barrier, probe labeled solid.
  18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde im Lösungsmittel enthalten ist. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the at least one probe is contained in the solvent.
  19. Verfahren einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde in einem Gel enthalten ist. The method of any preceding claim, characterized in that the at least one probe is contained in a gel.
  20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in mindestens einer Permeationseinrichtung durchgeführt wird, die mindestens ein Donorkompartiment, in dem die mindestens eine Substanz bereitgestellt wird, die Permeationsbarriere und mindestens ein Akzeptorkompartiment, in das die Substanz gegebenenfalls mindestens teilweise permeiert, umfaßt. Method according to one of the preceding claims, characterized in that it is carried out in at least one Permeationseinrichtung, at least in said at least one substance is provided a donor compartment, the permeation and at least one acceptor, in which the substance optionally permeates at least partially comprises ,
  21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Sonde in Form eines sondenmarkierten Einsatzes in das mindestens eine Donor- und/oder in das mindestens eine Akzeptorkompartiment eingebracht wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the at least one probe in the form of a probe labeled insert at least one donor and / or is introduced into the at least one acceptor in the.
  22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es parallelisiert durchgeführt wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that it is carried out in parallel.
  23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Wellenlängen und/oder als Spektrum gemessen werden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the luminescence can be measured as spectrum at one or more discrete wavelengths and / or.
  24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine lumineszierende Sonde fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften aufweist. Method according to one of the preceding claims, characterized in that said at least one luminescent probe fluorescent and / or phosphorescent properties.
  25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzelne Sonde oder eine Kombination von Sonden verwendet wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that a single probe or a combination of probes is used.
  26. Verwendung von mindestens einer Mikrotiterplatte in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationseinrichtung. Use of at least a microtiter plate in a method according to any one of the preceding claims, in particular as part of at least one Permeationseinrichtung.
  27. Verwendung von mindestens einem Farbstoff in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als mindestens eine lumineszierende Sonde. Using at least one dye in a method according to any one of claims 1 to 25, in particular as at least one luminescent probe.
  28. Verwendung mindestens eines porösen Trägermaterials, insbesondere mindestens einer Filtermembran, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere. Using at least one porous carrier material, in particular at least one filter membrane, in a method according to any one of claims 1 to 25, in particular as part of at least one permeation barrier.
  29. Verwendung mindestens eines Lipids oder einer Lipidmischung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere. Using at least one lipid or a lipid mixture in a process according to any one of claims 1 to 25, in particular as part of at least one permeation barrier.
  30. Verwendung mindestens eines Kohlenwasserstoffs mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens eines Alkohols mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere. Using at least one hydrocarbon with a preferred chain length of 8 or more carbons and / or at least one alcohol with a preferred chain length of 4 or more carbons in a method according to any one of claims 1 to 25, in particular as part of at least one permeation barrier.
  31. Verwendung von Zellen, insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere. Use of cells, in particular in the form of a multilayer Zellmono- or cell, in a method according to any one of claims 1 to 25, in particular as part of at least one permeation barrier.
  32. Verwendung von Zellfragmenten in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Bestandteil mindestens einer Permeationsbarriere. Use of cell fragments in a method according to any one of claims 1 to 25, in particular as part of at least one permeation barrier.
  33. Verwendung mindestens einer Membran aus Organgewebe in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, insbesondere als Permeationsbarriere. Using at least one membrane of organ tissue in a method according to any one of claims 1 to 25, in particular as a permeation barrier.
  34. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, umfassend mindestens 2 Mitglieder aus der Gruppe mit – mindestens einer Mikrotiterplatte, – mindestens einer lumineszierenden Sonde, – mindestens einem porösen Trägermaterial, – mindestens einem sondenmarkierten Einsatz, – mindestens einem Lösungsmittel, – mindestens einem geeigneten Puffersystem, – mindestens einem Kohlenwasserstoff mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8 oder mehr Kohlenstoffen und/oder mindestens einem Alkohol mit einer bevorzugten Kettenlänge von 4 oder mehr Kohlenstoffen, – mindestens einem Lipid oder einer Lipidmischung, – Zellen, insbesondere in Form einer Zellmono- oder einer Zellmultischicht, – Zellfragmenten und – mindestens einer nicht-artifiziellen Membran, insbesondere mindestens einer Membran aus Organgewebe. Kit for carrying out a method according to any one of claims 1 to 25, comprising at least 2 members from the group comprising - at least a microtiter plate, - at least one luminescent probe, - at least a porous carrier material, - at least one probe labeled insert, - at least one solvent, - at least one suitable buffer system, - at least one hydrocarbon with a preferred chain length of 8 or more carbons and / or at least one alcohol having a preferred chain length of 4 or more carbons, - at least one lipid or a lipid mixture, - cells, in particular in the form of a cell monolayer - a cell or multi-layer, - cell fragments, and - at least one non-artificial membrane, in particular at least one membrane of organ tissue.
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