DE10144346A1

DE10144346A1 - TT virus sequences in human tumor tissues, means for their detection and tumor therapy

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Publication number: DE10144346A1
Application number: DE2001144346
Authority: DE
Inventors: Zur Hausen Ethel-Mich Villiers; Hausen Harald Zur
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2003-04-03
Also published as: AU2002340728A1; WO2003023027A2; WO2003023027A3

Abstract

Beschrieben werden DNA-Sequenzen, die das Genom eines Tumor-assoziierten TT-Virus umfassen, oder Fragmente davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner von diesen DNA-Sequenzen kodierte Proteine, gegen diese Proteine gerichtete Antikörper sowie gegen mRNAs gerichtete Ribozyme und Antisense-RNAs und schließlich deren Verwendung in Diagnose und Therapie. Die vorliegende Erfindung betrifft auch zur Diagnose geeignete Reagenzien enthaltende Kits, z. B. Antikörper enthaltende Kits.Described are DNA sequences which comprise the genome of a tumor-associated TT virus or fragments thereof. The present invention further relates to proteins encoded by these DNA sequences, antibodies directed against these proteins and ribozymes and antisense RNAs directed against mRNAs and finally their use in diagnosis and therapy. The present invention also relates to kits containing reagents suitable for diagnosis, e.g. B. Antibody containing kits.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die das Genom eines Tumor-assoziierten TT-Virus umfassen, oder Fragmente davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner von diesen DNA-Sequenzen kodierte Proteine, gegen diese Proteine gerichtete Antikörper sowie gegen mRNAs gerichtete Ribozyme und Antisense-RNAs und schließlich deren Verwendung in Diagnose und Therapie. Die vorliegende Erfindung betrifft auch zur Diagnose geeignete Reagenzien enthaltende Kits, z. B. Antikörper enthaltende Kits. The present invention relates to DNA sequences that Genome of a tumor-associated TT virus include, or Fragments of it. The present invention further relates to proteins encoded in these DNA sequences, against these proteins directed antibodies as well as ribozymes directed against mRNAs and antisense RNAs and finally their use in Diagnosis and therapy. The present invention also relates to Kits containing reagents suitable for diagnosis, e.g. B. Kits containing antibodies.

Es wird davon ausgegangen, dass global etwa 15% der Krebsfälle einer Virusinfektion zugeschrieben werden können. Dazu tragen insbesondere Papillomavirusinfektionen bei anogenitalen Krebsarten und Hepatitis B- und C-Viren bei hepatozellulären Krebsarten bei. Während der letzten zehn und vor allem der letzten drei Jahre wurde eine ganze Reihe von weiteren Viren beschrieben, die mit humanen Krebsarten oder der Stimulation des Wirtszellwachstums in Verbindung gebracht wurden, neben dem Hepatitis C-Virus und dem humanen Herpesvirus Typ 8 hauptsächlich neue Typen "kutaner" Papillomaviren. Dies nährt den Verdacht, dass weitere infektiöse Agenzien existieren dürften, die in einem möglichen Zusammenhang mit der Entwicklung humaner Tumore stehen. It is believed that around 15% of cancer cases worldwide can be attributed to a viral infection. Papilloma virus infections with anogenital cancers and hepatitis B and C viruses with hepatocellular cancers contribute to this. Over the past ten and especially the past three years, a number of other viruses have been described which have been linked to human cancers or the stimulation of host cell growth, in addition to the hepatitis C virus and the human herpes virus type 8, mainly new types " cutaneous papillomavirus. This raises the suspicion that other infectious agents may exist that may be related to the development of human tumors.

Eine weitere Gruppe erst kürzlich entdeckter Viren, die bisher allerdings nicht in Zusammenhang mit Tumoren gebracht wurde, ist die Familie der sogenannten TT-Viren (wobei die Abkürzung "TT" von den Initialen des ersten Patienten stammt, aus dem die DNA isoliert wurde). Diese wurden ursprünglich bei der Analyse von Posttransfusions-Seren von non-B-non-C-Hepatitis- Patienten nachgewiesen. Aufgrund des Sedimentationsverhaltens des ersten Isolats im Saccharose-Dichtegradienten und der DNAse I-Sensitivität der Nukleinsäure dieser Viren wurde davon ausgegangen, dass die klonierte Nukleinsäure von einem einzelsträngigen DNA-Virus stammte. TT-Viren, die aus Isolaten aus den verschiedensten geographischen Regionen stammten, zeigten eine beträchtliche Heterogenität (bezogen auf den Typ und Subtyp). Es wurde eine große Anzahl von Subtypen und unterschiedlichen Typen beschrieben, wobei sich ein Teil davon stark hinsichtlich der Nukleinsäurezusammensetzung unterscheidet. Im Prinzip enthalten die TT-Virusgenome drei offene Leserahmen und einen langen nicht-kodierenden Bereich (Erker et al., J. Gen. Virol. 80 (1999), 1743-1750). Es konnte gezeigt werden, dass von einem das gesamte TT-Virusgenom enthaltenden Plasmid in COS1-Zellen drei gespleißte mRNAs transkribiert wurden (Kamahora et al., J. Virol. 74 (2000), 9980-9986). Die verschiedenen TT-Isolate weisen eine Genomlänge im Bereich von 2800 bis 3800 Nukleotiden auf. Another group of recently discovered viruses, the so far but has not been associated with tumors, is the family of the so-called TT viruses (the abbreviation "TT" comes from the initials of the first patient from whom the DNA was isolated). These were originally from the Analysis of post-transfusion sera from non-B-non-C hepatitis Patients demonstrated. Because of the sedimentation behavior the first isolate in the sucrose density gradient and the DNAse I sensitivity of the nucleic acid of these viruses was revealed assumed that the cloned nucleic acid from a single-stranded DNA virus. TT viruses derived from isolates came from different geographic regions, showed considerable heterogeneity (based on type and subtype). There have been a large number of subtypes and different types are described, part of which strong in terms of nucleic acid composition different. In principle, the TT virus genomes contain three open reading frames and a long non-coding area (Erker et al., J. Gen. Virol. 80 (1999), 1743-1750). It could be shown that the whole of the TT virus genome containing plasmid in COS1 cells three spliced mRNAs were transcribed (Kamahora et al., J. Virol. 74 (2000), 9980-9986). The different TT isolates have one Genome length in the range from 2800 to 3800 nucleotides.

Ein überraschender Aspekt einer TT-Virusinfektion ist die hohe Häufigkeit bei normalen Blutspendern, wobei diese entsprechend des geographischen Bereichs variiert und zwischen 7 und 100% schwankt. Aufgrund der bisherigen Befunde wurde davon ausgegangen, dass diese Viren über einen langen Zeitraum im peripheren Blut persistieren und dass hohe geographisch bedingte Unterschiede hinsichtlich der TT-Virus-Häufigkeit bestehen. Es gibt Hinweise darauf, dass TT-Infektionen mit dem Alter, bei Bluttransfusionen, bei Immunsuppression und chronischen Lebererkrankungen zunehmen. Bisher wurde allerdings nicht von irgendeiner Pathogenität dieser inzwischen ansatzweise als Circinoviren bezeichneten Virenfamilie ausgegangen. Es war bisher trotz zahlreicher Versuche nicht möglich, eine TT-Virusinfektion mit pathologischen Leberbefunden in Verbindung zu bringen und bisher wurde auch nicht deren mögliche Beteiligung an humanen Tumoren in Betracht gezogen bzw. untersucht. A surprising aspect of a TT virus infection is the high one Frequency with normal blood donors, this correspondingly the geographical area varies and between 7 and 100% fluctuates. Based on the previous findings, assumed that these viruses in the long term peripheral blood persist and that high geographically contingent differences in the frequency of TT virus consist. There is evidence that TT infections with the Age, blood transfusions, immunosuppression and chronic liver disease increase. So far but not of any pathogenicity now known as circinoviruses Virus family run out. So far it has been numerous Trying not possible to have a TT virus infection to connect pathological liver findings and So far, their possible participation in human Tumors considered or examined.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, weitere Viren zu identifizieren, die mit einem humanen Tumor oder einer Prädisposition dafür in Zusammenhang stehen und damit (a) Marker bereitzustellen, die zur Tumordiagnose oder zur Diagnose einer Prädisposition für einen Tumor geeignet sind und (b) für eine Therapie oder Prophylaxe geeignete Mittel. Thus, the present invention has a technical problem to identify other viruses that are infected with a human tumor or a predisposition to it stand and thus (a) to provide markers for Tumor diagnosis or to diagnose a predisposition for one Tumor are suitable and (b) for therapy or prophylaxis appropriate means.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. In einer zu der vorliegenden Erfindung führenden Pilotstudie wurden 162 Biopsien von verschiedenen humanen Karzinomen und von Kolonpolypen hinsichtlich der Anwesenheit von TT-Virus-Sequenzen bzw. TT- Virus-ähnlichen Sequenzen mittels der PCR unter Verwendung von drei Sätzen an "nested" Primern untersucht. Alle Gele mit den PCR-Produkten wurden über Southern-Blot-Hybridisierung untersucht und die DNA der hybridisierenden Banden wurde kloniert und sequenziert. Insgesamt 54,3% aller Tumorproben enthielten identifizierbare TT-Virus-ähnliche Sequenzen. Biopsien von Hypopharynx-, Larynx-, Endometrium-, Ovar- und Blasenkarzinomen waren zwischen 15-35% positiv, während gastrointestinale Karzinome (Ösophagus, Magen, Kolon und Rektum) und Kolonpolypen zwischen 57-100% positiv waren. Lungenkarzinome (68,4%), Brustkarzinome (60%), multiple Myelome (85,7%) und humane Leukämien (53,3%) zeigten ebenfalls eine hohe Anwesenheit von TT-Virus-ähnlichen Sequenzen. Besonders auffallend ist die Heterogenität der von den getesteten Biopsien erhaltenen TT-Virus-Klone. Es konnten 66 neue Sequenzen identifiziert werden, die vermutlich zu neuen Genotypen gehören. Nur 16 Klone entsprachen hinsichtlich ihrer Sequenz zu über 97% etablierten Prototypen. Jeder individuelle Tumor enthielt üblicherweise Sequenzen, die sich hinsichtlich der Nukleinsäurezusammensetzung wesentlich unterschieden. Innerhalb der individuellen Tumore konnten so insgesamt bis zu fünf unterschiedliche "Genotypen" identifiziert werden. Angesichts dieser hohen Variabilität dieser Virustypen kann davon ausgegangen werden, dass die Rate an TT-Virus-Sequenzen bzw. TT-Virus-ähnlichen Sequenzen in Tumoren tatsächlich noch höher ist, was durch die Verwendung weiterer Primerkombinationen für die PCR nachweisbar sein sollte. Es können auch durch Verwendung entsprechender Primer über Long- PCR die jeweiligen Gesamtgenome identifiziert werden, wobei in dem nachstehenden Beispiel 3 die Charakterisierung eines Gesamt-TT-Virus-Genoms beschrieben wird. The solution to this technical problem is provided by Provision of those identified in the claims Embodiments achieved. In one to the present Invention leading pilot study were 162 biopsies from various human carcinomas and colon polyps with regard to the presence of TT virus sequences or TT Virus-like sequences using PCR using three sets of "nested" primers were examined. All gels with the PCR products were via Southern blot hybridization examined and the DNA of the hybridizing bands was cloned and sequenced. A total of 54.3% of all tumor samples contained identifiable sequences similar to TT virus. Biopsies of hypopharynx, larynx, endometrium, ovary and Bladder carcinomas were between 15-35% positive, though gastrointestinal carcinomas (esophagus, stomach, colon and Rectum) and colon polyps were between 57-100% positive. Lung carcinoma (68.4%), breast carcinoma (60%), multiple Myeloma (85.7%) and human leukemia (53.3%) also showed a high presence of TT virus-like sequences. The heterogeneity of those is particularly striking tested biopsies obtained TT virus clones. There were 66 new sequences are identified that are believed to be new Include genotypes. Only 16 clones matched in terms of their Sequence to over 97% established prototypes. Everyone individual Tumor usually contained sequences related to each other the nucleic acid composition significantly differentiated. Within the individual tumors, a total of up to five different "genotypes" can be identified. Given this high variability, these virus types can assume that the rate of TT virus sequences or TT virus-like sequences in tumors is higher what by using more Primer combinations for the PCR should be detectable. It can also be achieved by using appropriate primers PCR the respective total genomes are identified, whereby in Example 3 below characterizes a Whole TT virus genome is described.

Aufgrund der Ergebnisse wird davon ausgegangen, dass die klonierte DNA der TT-Virus-ähnlichen Sequenzen nicht von die Tumorproben kontaminierenden Blutzellen oder Plasmabestandteilen stammt, sondern von den Krebszellen der entsprechenden Biopsien, die virale DNA zumindest temporär beherbergen. Dies wird durch das starke Ausmaß der innerhalb individueller Tumortypen beobachteten genetischen Diversität nahegelegt, die die bekannte Diversität von TT-Virus-Sequenzen in Proben peripheren Bluts übersteigt. Dies wird vor allem auch durch den hohen Grad an divergierenden Klonen von Ösophagus-, Lungen- und Rektumkarzinomen unterstrichen. Außerdem deuten die beobachteten Unterschiede hinsichtlich des Prozentsatzes der verschiedenen für TT-Virus-Sequenzen bzw. TT-Virus-ähnliche Sequenzen positiven Tumortypen darauf hin, dass der Tumortyp den Grad der Positivität beeinflußt. Based on the results, it is assumed that the cloned DNA of the TT virus-like sequences not from that Tumor samples contaminating blood cells or Plasma components comes from the cancer cells of the corresponding biopsies, the viral DNA at least temporarily accommodate. This is due to the strong scale of the inside individual tumor types observed genetic diversity which suggested the well-known diversity of TT virus sequences in peripheral blood samples. Above all, this will also due to the high degree of divergent clones of Underlined esophageal, lung and rectal carcinomas. In addition, the observed differences in terms of Percentage of the different for TT virus sequences or TT virus-like sequences suggest positive tumor types that the type of tumor affects the degree of positivity.

Zusammengefaßt ergibt sich aufgrund der zu dieser Erfindung führenden Experimente, dass TT-Virus-Sequenzen diagnostische Marker für Tumore oder eine Prädisposition dafür sind, insbesondere für Ösophaguskarzinome, Karzinome des Gastrointestinaltrakts, Lungen- und Brusttumore sowie für bösartige Erkrankungen des hämatopoietischen Systems. Das hohe Ausmaß der Sequenzvariation und das Fehlen eines spezifischen Musters TT-Virus-ähnlicher Sequenzen innerhalb individueller Tumorgruppen spricht nicht gegen eine mögliche Beteiligung dieser Viren an der Entwicklung von Tumorarten, die hinsichtlich TT-Virus-ähnlichen Sequenzen positiv sind, da davon ausgegangen werden kann, dass das hohe Ausmaß an Variabilität gelegentlich zu dem zufälligen Auftreten von Genotypen führt, die schließlich onkogen werden und sich zwischen den individuellen Tumoren unterscheiden können. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Hemmung der Expression der erfindungsgemäßen TT-Virus-Sequenzen von therapeutischem Nutzen ist. In summary, this results from the to this invention leading experiments that TT virus sequences are diagnostic Markers for tumors or a predisposition for them especially for esophageal carcinomas, carcinomas of the Gastrointestinal tract, lung and breast tumors and for malignant diseases of the hematopoietic system. The high Extent of sequence variation and the lack of a specific Patterns of TT virus-like sequences within individual Tumor groups do not speak against possible involvement of these viruses in the development of tumor types that are positive with regard to TT virus-like sequences since it can be assumed that the high level Variability occasionally to the random occurrence of Leads to genotypes that eventually become oncogenic and themselves distinguish between individual tumors. Consequently can be assumed that the inhibition of expression of the inventive TT virus sequences of therapeutic Benefit is.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA- Sequenz, die ein Genom eines Tumor-assoziierten TT-Virus umfaßt, oder ein Fragment davon, wobei die DNA-Sequenz eine in einem der Plasmide der Tabelle 3 enthaltene DNA-Sequenz umfaßt, oder eine davon durch eine oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA-Sequenz, die eine Homologie von höchstens 97%, vorzugsweise höchstens 95% und noch mehr bevorzugt höchstens 90% zu einer DNA-Sequenz eines bekannten TT-Virus aufweist und aus einer Tumor-Biopsie erhältlich ist. The present invention thus relates to a DNA Sequence that is a genome of a tumor-associated TT virus comprises, or a fragment thereof, wherein the DNA sequence one in one of the plasmids of Table 3 contained DNA sequence comprises, or one of them by one or more base pairs different DNA sequence that has a homology of at most 97%, preferably at most 95% and even more preferred at most 90% of a DNA sequence from a known TT virus and is available from a tumor biopsy.

Zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen TT-Virus-Genome oder Teilen davon kann nach üblichen Verfahren, z. B. wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, vorgegangen werden. Vorteilhaft ist ein Verfahren, das folgende Verfahrensschritte umfaßt: (a) Isolierung von Gesamt-DNA aus einer Tumorprobe, (b) Nachweis der TT-Virus-DNA-Sequenz über Hybridisierung oder Verfahren wie PCR, und (c) Klonierung der das TT-Virus-Genom oder einen Teil davon umfassenden DNA-Sequenz in einen Vektor. Die verwendeten Proben bzw. Primer können von DNA-Sequenzen der bekannten TT-Viren oder den hinterlegten DNA-Sequenzen (siehe nachstehende Tabelle 3) abgeleitet werden. To provide the TT virus genomes or Parts of which can be made by conventional methods, e.g. B. as in the The following examples are described. A method that has the following method steps is advantageous comprises: (a) isolation of total DNA from a tumor sample, (b) Detection of the TT virus DNA sequence via hybridization or Methods such as PCR, and (c) cloning the TT virus genome or a part of it comprising DNA sequence into a vector. The samples or primers used can be from DNA sequences the known TT viruses or the stored DNA sequences (see Table 3 below).

Die erfindungsgemäßen Genome der TT-Viren oder Fragmente davon können integriert in chromosomaler DNA oder extrachromosomal vorliegen. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, um dies abklären zu können. Auch kennt er Verfahren, die zur Klonierung dieser Genome oder Teilen davon besonders geeigneten Restriktionsschnittstellen zu bestimmen, wobei er sich an den Genomen bekannter TT-Viren orientieren kann. The inventive genomes of the TT viruses or fragments thereof can be integrated into chromosomal DNA or extrachromosomal available. Methods to do this are known to those skilled in the art to clarify. He also knows the procedures for Cloning of these genomes or parts thereof in particular determine appropriate restriction sites, where he can be based on the genomes of known TT viruses.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind für verschiedene Zwecke von Nutzen. So können sie, wie nachstehend näher beschrieben, zur rekombinanten Herstellung eines TT-Virus- Proteins, z. B. eines Kapsidproteins, für Analysezwecke, zur weiteren Charakterisierung, zur Erzeugung von Antikörpern für therapeutische Zwecke etc. verwendet werden. Sie können auch als Marker für Tumorgewebe dienen, in denen TT-Viren vorhanden sind. Sie können darüber hinaus als Hybridisierungs-Sonden zur Identifizierung neuer, verwandter DNA-Sequenzen dienen oder als Informationsquelle zur Entwicklung von PCR-Primern, beispielsweise für genetisches "fingerprinting". Schließlich können sie zur Auswahl und Herstellung von Oligonukleotiden zur Beschichtung eines "Genchips" oder eines anderen Trägers dienen, zur Erzeugung von anti-Protein-Antikörpern, beispielsweise mittels DNA-Immunisierungsverfahren, und als Antigen zur Erzeugung von anti-DNA-Antikörpern oder zur Auslösung einer weiteren Immunantwort. The DNA sequences according to the invention are different Purposes useful. So they can, as detailed below described for the recombinant production of a TT virus Proteins, e.g. B. a capsid protein, for analysis purposes, for further characterization, for the production of antibodies for therapeutic purposes etc. can be used. You can also serve as markers for tumor tissue in which TT viruses are present are. They can also be used as hybridization probes Identification of new, related DNA sequences serve or as a source of information for the development of PCR primers, for example for genetic "fingerprinting". Finally can be used to select and produce oligonucleotides for coating a "gene chip" or another carrier serve to generate anti-protein antibodies, for example by means of DNA immunization methods, and as Antigen for the generation of anti-DNA antibodies or for Triggering another immune response.

Durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen kann die Synthese von Proteinen von Tumor-assoziierten TT-Viren verringert oder eliminiert werden, was beispielsweise zur Tumortherapie wünschenswert sein kann. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie zu einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem Fragment davon komplementär ist und an die davon transkribierte RNA spezifisch binden kann und die Synthese des von diesen DNA- Sequenzen kodierten Proteins verringern oder hemmen kann, und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es zu einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem Fragment davon komplementär ist und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen kodierten Proteins ebenfalls verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer kodierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen und den DNA- Sequenzen der bekannten TT-Viren, geeignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB-B1 0 223 399 oder EP-A1 0 458 beschrieben. Zu den erfindungsgemäßen Antisense-RNAs zählen auch Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), die aufgrund der Resistenz gegenüber einem Abbau durch Nukleasen den Vorteil einer höheren Halbwertszeit aufweisen. Die Synthese von PNAs ist dem Fachmann bekannt und z. B. auch in Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500, beschrieben. By lowering or inhibiting the expression of the DNA sequences described above can be the synthesis of Proteins from tumor-associated TT viruses decreased or be eliminated, for example for tumor therapy may be desirable. Hence concerns another preferred embodiment of the present invention Antisense RNA, which is characterized by being too a DNA sequence according to the invention or a fragment thereof is complementary and to the RNA transcribed from it can bind specifically and the synthesis of the DNA Can reduce or inhibit sequences of encoded protein, and a ribozyme that is characterized in that it becomes a DNA sequence according to the invention or a fragment thereof is complementary and to those of these DNA sequences can specifically bind transcribed RNA and cleave it, whereby the synthesis of the encoded by these DNA sequences Protein is also reduced or inhibited. Preferably these antisense RNAs and ribozymes are to be encoded Region of the mRNA complementary. The expert is able to based on the disclosed DNA sequences and the DNA Sequences of the known TT viruses, suitable antisense RNAs to manufacture and use. Appropriate approaches are for example in EB-B1 0 223 399 or EP-A1 0 458 described. The antisense RNAs according to the invention include also peptide nucleic acids (PNAs), due to resistance the advantage of a degradation by nucleases have a longer half-life. The synthesis of PNAs is that Known expert and z. B. also in Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500.

Ribozyme sind RNA-Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA- Strang. Diese können andere RNAs intermolekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Diese Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und, (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel- RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es inzwischen möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (siehe beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426). Ribozymes are RNA enzymes and consist of a single RNA Strand. These can cleave other RNAs intermolecularly, for example those of the DNA sequences according to the invention transcribed mRNAs. In principle, these ribozymes must have two domains, (1) a catalytic domain and, (2) a domain that is complementary to and to the target RNA can bind what the prerequisite for a split of the target Is RNA. Starting from those described in the literature Approaches are now possible, specific To construct ribozymes that have a desired RNA on a cut certain, preselected point (see for example, Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).

Vorzugsweise hybridisieren die vorstehenden Ribozyme oder Antisense-RNAs über einen Bereich von mindestens 15, mehr bevorzugt mindestens 25 und am meisten bevorzugt mindenstens 50 Basen mit der von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transkribierten RNA. The above ribozymes or preferably hybridize Antisense RNAs over a range of at least 15, more preferably at least 25 and most preferably at least 50 bases with the DNA sequences of the invention transcribed RNA.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. die die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme kodierenden DNAs können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA- Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf jeden zur Klonierung von chromosomaler DNA bzw. extrachromosomaler DNA geeigneten Vektor, z. B. auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die deren Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryoten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryoten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-,SV40-,RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40- Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E. coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Detivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4. Zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A. The DNA sequences according to the invention or those above described antisense RNAs or DNAs encoding ribozymes can also be inserted into a vector or expression vector become. The present invention thus also encompasses these DNA Vectors or expression vectors containing sequences. The The term "vector" refers to anyone for cloning chromosomal DNA or extrachromosomal DNA suitable Vector, e.g. B. on a plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), on a virus or other suitable vehicle. In a preferred embodiment are those according to the invention DNA sequences in vector with regulatory elements functionally linked, their expression in prokaryotic or allow eukaryotic host cells. Such vectors contain in addition to the regulatory elements, for example a promoter, typically an origin of replication, and specific genes that determine the phenotypic selection of a allow transformed host cell. To the regulatory Elements for expression in prokaryotes, for example E. coli, count the lac, trp promoter or T7 promoter, and for expression in eukaryotes of the AOX1 or GAL1 promoter in Yeast and the CMV, SV40, RVS-40 promoter, CMV or SV40 Enhancer for expression in animal cells. Further Examples of suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter. To suitable expression vectors for E. coli, pGEMEX, pUC detects, pGEX-2T, pET3b and pQE-8, the latter being preferred. To those for vectors suitable for expression in yeast include pY100 and Ycpad1, for expression in mammalian cells pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4. To the invention Expression vectors also include those derived from baculovirus Vectors for expression in insect cells, for example pAcSGHisNT-A.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden, so dass die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können. General methods known in the art can be used to Construction of expression vectors that the DNA sequences according to the invention and suitable Control sequences included can be used. To this For example, methods count in vitro Recombination techniques, synthetic processes, as well as in vivo recombination method, as described for example in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). The invention DNA sequences can also be combined with one for one another protein or peptide coding DNA is inserted, so that the DNA sequences according to the invention, for example in Form of a fusion protein can be expressed.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9- Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. The present invention also relates to the above described host-containing vectors. To this Host cells count bacteria (for example the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 and SG13009), yeast, preferably S. cerevisiae, insect cells, preferably sf9- Cells, and animal cells, preferably mammalian cells. preferred Mammalian cells are CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 and WI38 cells. Procedures to transform this Host cells, for phenotypic selection of transformants and for expression of the DNA molecules according to the invention under Use of the vectors described above are on the Known in the field.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodiertes Protein eines Tumorassoziierten TT-Virus, vorzugsweise ein Kapsidprotein, sowie Verfahren zu dessen rekombinanten Herstellung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Dem Fachmann sind Bedingungen bekannt, transformierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivieren. Geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind ebenfalls allgemein bekannt. Das erfindungsgemäße Protein kann u. a. zur Erzeugung von Antikörpern oder zur Erzeugung einer anderen Immunantwort nützlich sein, als Reagenz (beispielsweise in markierter Form) in kompetitiven Assays zur quantitativen Bestimmung des Proteins in biologischen Flüssigkeiten, als Marker für Tumorgewebe, in denen das entsprechende Protein bevorzugt erzeugt wird (entweder konstitutiv oder während eines bestimmten Stadiums hinsichtlich der Entwicklung eines Tumors etc.). Schließlich kann das erfindungsgemäße Protein auch zur Isolierung von Inhibitoren, Antagonisten oder Agonisten verwendet werden, wobei es sich beispielsweise um Peptide oder sonstige kleine Moleküle handeln kann. The present invention further relates to one of the DNA sequences of a protein encoded according to the invention Tumor-associated TT virus, preferably a capsid protein, as well Process for its recombinant production using of the expression vectors according to the invention. The The inventive method comprises the cultivation of host cells described above under conditions that allow the expression of the protein (or fusion protein) (preferably stable expression), and the extraction of the Proteins from culture or from host cells. The specialist conditions are known, transformed or transfected Cultivate host cells. Suitable cleaning procedures (e.g. preparative chromatography, Affinity chromatography, for example Immunoaffinity chromatography, HPLC etc.) are also well known. The protein of the invention can u. a. to Generation of antibodies or to produce another Immune response may be useful as a reagent (e.g. in marked form) in competitive assays for quantitative Determination of the protein in biological liquids, as Markers for tumor tissue in which the corresponding protein is generated preferentially (either constitutively or during a certain stage in the development of a Tumor etc.). Finally, the protein of the invention also for the isolation of inhibitors, antagonists or Agonists are used, for example Peptides or other small molecules can act.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine bzw. gegen ein Tumorassoziiertes TT-Viruspartikel. Diese Antikörper können beispielsweise in diagnostischen Assays verwendet werden oder für therapeutische Zwecke, wobei es nach Anlagerung an das Zielmolekül zu dessen Hemmung kommt. Diese Antikörper können monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoklonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise ein von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Another preferred embodiment of the present Invention relates to antibodies against the above described proteins according to the invention or against Tumor-associated TT virus particles. These antibodies can used for example in diagnostic assays or for therapeutic purposes, after being attached to the Target molecule comes to its inhibition. These antibodies can monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments of it. In this context, the means Term "fragment" means all parts of the monoclonal antibody (e.g. Fab, Fv or "single chain Fv" fragments) which the same epitope specificity as the complete antibody exhibit. The production of such fragments is known to the person skilled in the art known. It is preferably the antibodies according to the invention around monoclonal antibodies. The Antibodies according to the invention can according to standard methods are produced, preferably one of the DNA sequences according to the invention encoded protein or synthetic fragment thereof serve as an immunogen. method to obtain monoclonal antibodies are the expert also known.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoklonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel im wesentlichen nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor- Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper, (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. In a particularly preferred embodiment, the called monoclonal antibodies from an animal (e.g. mouse) derived antibody, a humanized antibody or a chimeric antibody or a fragment thereof. Chimera, Human antibody-like or humanized antibodies have a reduced potential antigenicity, however their affinity for the goal is essentially not reduced. The production of chimeric and humanized Antibodies or similar to human antibodies Antibodies have been described in detail (see for example, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanized immunoglobulins have variable Basic scaffolding areas that are essentially of a human Immunoglobulin (called acceptor Immunoglobulin) and the complementarity of determinants Areas essentially by a non-human Immunoglobulin (e.g. from the mouse) originate (labeled Donor immunoglobulin). The constant area (s) comes from (originate), if available, also essentially from one human immunoglobulin. When administered to human patients offer humanized (as well as the human) antibodies over a number of advantages Antibodies from mice or other species: (a) the human immune system should be the backbone or the constant range of the humanized antibody is not as recognize foreign and therefore the antibody response against such an injected antibody is less than against a completely foreign mouse antibody or one partially foreign chimeric antibody, (b) since the Effector area of the humanized antibody is human, it interacts better with other parts of the human Immune system, and (c) injected humanized antibodies have a half-life substantially equal to that of equivalent to naturally occurring human antibodies is what allows smaller and less frequent doses in the To be administered compared to antibodies of other species.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise auch zur Immunpräzipitation eines erfindungsgemäßen Proteins, zur Isolierung verwandter Proteine, z. B. aus cDNA- Expressionsbanken, oder für diagnostische Zwecke (siehe unten) verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoklonalen Antikörper erzeugt. The antibodies according to the invention can also, for example for immunoprecipitation of a protein according to the invention, for Isolation of related proteins, e.g. B. from cDNA Expression banks, or for diagnostic purposes (see below) be used. The present invention also relates to a Hybridoma that the monoclonal described above Antibody generated.

Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Durchführung therapeutischer oder präventiver Maßnahmen bei Tumoren, die mit TT-Viren in Zusammenhang stehen, d. h. die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Antisense- RNAs, Ribozyme, Vektoren und Antikörper können auch zur Herstellung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Kontrolle der Expression eines TT-Virus-Proteins verwendet werden. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, Antisense-RNA oder Ribozym in Säuger, insbesondere den Menschen, eingebracht und exprimiert werden. Für therapeutische und diagnostische Zwecke ist die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beschränkt, sondern sie umfaßt auch DNA-Sequenzen bekannter TT-Viren sowie davon abgeleitete Verbindungen (Ribozyme, Antisense-RNAs, Sonden/Primer, Antikörper etc.). The present invention also allows implementation therapeutic or preventive measures for tumors that are related to TT viruses, d. H. the above described DNA sequences according to the invention, antisense RNAs, ribozymes, vectors and antibodies can also be used Production of a drug, for example for control purposes expression of a TT virus protein can be used. For example, a DNA sequence according to the invention, Antisense RNA or ribozyme in mammals, especially the People who are brought in and expressed. For The present is for therapeutic and diagnostic purposes However, the invention does not apply to those described above, limited DNA sequences according to the invention, but includes them also DNA sequences of known TT viruses and those derived from them Compounds (ribozymes, antisense RNAs, probes / primers, Antibodies etc.).

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das die vorstehend beschriebene Antisense-RNA, das Ribozym, den Vektor oder Antikörper enthält. Dieses Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Tumorerkrankung, der Art der Verabreichung etc.. The present invention thus also relates to a Medicinal product containing the antisense RNA described above, contains the ribozyme, vector or antibody. This Medicines may also contain one pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and the Formulation of such drugs are known to those skilled in the art known. Suitable carriers include, for example Phosphate buffered saline, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile Solutions, etc. The administration of the drugs can be oral or parenterally. The procedures for parenteral Administration include topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal or intranasal administration. The appropriate dosage is from the attending doctor determines and depends on various Factors such as age, gender, age Weight of the patient, the stage of the tumor disease, the Method of administration etc.

Vorzugsweise werden für die vorstehend beschriebenen therapeutischen Zwecke die vorstehenden, z. B. Ribozyme oder Antisense-RNAs kodierende DNA-Sequenzen in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die DNA-Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Retrovirus, Adenovirus, adenoassoziiertes Virus oder Vaccinia-Virus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Preferably for those described above therapeutic purposes the above, e.g. B. Ribozymes or DNA sequences encoding antisense RNAs into a for the Gene therapy suitable vector inserted, for example under Control of a tissue-specific promoter, and into the Cells smuggled in. In a preferred embodiment the vector containing the DNA sequences is a virus, for example a retrovirus, adenovirus, adeno-associated Virus or vaccinia virus. Are particularly preferred Retroviruses. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. For gene therapy purposes the DNA sequences according to the invention can also be in the form of colloidal dispersions transported to the target cells become. These include, for example, liposomes or lipoplexes (Mannino et al., 1988 Biotechniques 6: 682).

Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Diagnostik hinsichtlich Tumoren, die mit TT-Viren in Zusammenhang stehen bzw. bei denen TT-Viren den Krankheitsauslöser darstellen, wobei eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz bzw. davon abgeleitete Sonden oder Primer verwendet werden können. Dazu kann der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkription, PCR, RT-PCR, LCR, Hybridisierung und Sequenzierung durchführen. Auch die erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragmente davon eignen sich für die Diagnostik, d. h. beispielsweise zum Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Konzentration eines TT-Virus-Proteins in einer Probe. Ähnliches gilt für ein erfindungsgemäßes TT-Virus-Protein oder ein (synthetisches) Fragment davon, die zum Nachweis von Antikörpern gegen TT- Virus-Proteine, die sich u. U. in der Wirtszelle gebildet haben, geeignet sind. Die Antikörper (bzw. TT-Virus-Proteine oder Fragmente davon) können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können diese auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immungssays sind ELISA, "capture"-ELISA und RIA. The present invention also enables diagnostics regarding tumors associated with TT viruses or where TT viruses are the cause of the disease, wherein a DNA sequence according to the invention or derived therefrom Probes or primers can be used. In addition, the Techniques customary in the art, such as reverse transcription, PCR, Perform RT-PCR, LCR, hybridization and sequencing. The antibodies or fragments thereof according to the invention are suitable for diagnostics, d. H. for example Evidence of the presence and / or concentration of a TT virus protein in a sample. The same applies to a TT virus protein according to the invention or a (synthetic) Fragment thereof used for the detection of antibodies against TT- Virus proteins, which u. U. formed in the host cell have, are suitable. The antibodies (or TT virus proteins or fragments thereof) can, for example, in immunoassays Liquid phase or be bound to a solid carrier. These can be marked in different ways his. Suitable markers and marking methods are on the Known in the field. Examples of immunization assays are ELISA, "capture" ELISA and RIA.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen zur Diagnose eines mit TT-Viren bzw. TT-Virus-DNA-Sequenzen in Zusammenhang stehenden Tumors. The present invention thus also relates to the use of the compounds according to the invention described above for the diagnosis of a with TT viruses or TT virus DNA sequences in Related tumor.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Fragment davon, ein erfindungsgemäßes Protein oder Fragment davon oder einen vorstehend beschriebenen Antikörper enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können die DNA-Sequenz bzw. das Protein oder der Antikörper immobilisiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Kits mindestens zwei Nukleinsäureprimer, die an TT-Virus-Sequenzen binden. Weitere Substanzen können in den erfindungsgemäßen Kits ebenfalls enthalten sein, dazu gehören Enzyme (z. B. reverse Transkriptasen, DNA-Polymerasen, Ligasen), Puffer und Reagenzien (Markierungen, dNTPs). Der Antikörper des Kits kann auch an eine weitere Einheit konjugiert sein, beispielsweise eine Markierung. Der Kit kann auch einen zweiten Antikörper zum Nachweis von Peptid/Antikörper-Komplexen enthalten. Finally, the present invention relates to one diagnostic kit for performing the above described diagnostic method, which is an inventive DNA sequence or a fragment thereof, an inventive Protein or fragment thereof or one above contains antibodies described. Depending on the design of the diagnostic kits can be the DNA sequence or the protein or the antibody can be immobilized. In a preferred one Embodiments contain the kits according to the invention at least two nucleic acid primers linked to TT virus sequences tie. Other substances can be used in the invention Kits are also included, which include enzymes (e.g. reverse transcriptases, DNA polymerases, ligases), buffers and Reagents (labels, dNTPs). The kit's antibody can also be conjugated to another unit, for example a marker. The kit can also contain a second antibody for the detection of peptide / antibody complexes.

Der Antikörper, das Protein oder die DNA-Sonden/Primer können frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten, die die Verwendung des Antikörpers etc. in einem Assay zum Nachweis einer Prädisposition oder des Vorhandenseins eines Tumors beschreiben. Der Kit kann weiterhin geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten. The antibody, protein or DNA probe / primer can freely available or immobilized on a solid support, for example a test tube, a microtiter plate Test sticks etc. The kit may also contain instructions that the use of the antibody etc. in an assay for Evidence of a predisposition or the presence of one Describe tumor. The kit can still be suitable Reagents for the detection of markings or for marking positive and negative controls, wash solutions, Dilution buffer etc. included.

Die vorliegende Erfindung eignet sich bevorzugt zur Diagnostik/Prävention/Therapie von Ösophagustumoren, Tumoren des Gastrointestinaltrakts, Lungentumoren, Brusttumoren oder bösartigen Erkrankung des hämatopoietischen Systems. The present invention is preferably suitable for Diagnostics / prevention / therapy of esophageal tumors, tumors of the gastrointestinal tract, lung tumors, breast tumors or malignant disease of the hematopoietic system.

Brief description of the figures Fig. 1 results of a PCR analysis of a sample of lung tumor 32

Die linke Seite des Gels zeigt Molekulargewichtsmarker, wobei die Markerbanden mit den Längen 3000, 3500 und 4000 angezeigt sind. Die rechte Spur enthält die Amplifikationsprodukte (Länge: 3749 bzw. 3268 bp) einer "Long-PCR", die TT Virus- Gesamtgenome darstellen. Bezüglich näherer Angaben siehe Beispiel 3. The left side of the gel shows molecular weight markers, where the marker bands with the lengths 3000, 3500 and 4000 are displayed are. The right lane contains the amplification products (Length: 3749 or 3268 bp) of a "Long-PCR", the TT virus Represent entire genomes. See for more information Example 3.

Fig. 2 PCR products of esophageal and breast carcinomas

Im oberen Teil des Southern Blot sind die PCR-Produkte aus Speiseröhrenkrebs aufgezeigt, während im unteren Teil jene aus Brustkrebs zu finden sind. The PCR products are off in the upper part of the Southern blot Esophageal cancer was shown, while in the lower part, those from Breast cancer are found.

Fig. 3-53 DNA sequences of TT viruses in human tumors

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: The following examples illustrate the invention:

example 1 General procedures (A) Samples and DNA extraction

Tumorproben wurden über einen Zeitraum von 25 Jahren von verschiedenen Kliniken und geographischen Gebieten gesammelt. Zu den untersuchten Proben zählten Kehlkopfkarzinome (20), Hypopharynxkarzinome (13), Lungenkarzinome (19), Brustkarzinome (10), Speiseröhrenkarzinome (14), Magenkarzinome (19), Kolonkarzinome (13), Mastdarmkarzinome (7), Blasenkarzinome (12), Ovarkarzinome (9), Gebärmutterschleimhautkarzinome (7) sowie eine Reihe von Myelomen (7), Leukämien (15) und Kolonpolypen (7); siehe Tabelle 1. Alle Biopsien wurden eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C eingefroren. Die DNA wurde gemäß dem Verfahren von Tanaka et al., Leuk. Lymphoma 38 (2000), 411-417 extrahiert. Tabelle 1 TT-Virus-ähnliche Sequenzen im Menschen

Tumor samples were collected from various clinics and geographical areas over a period of 25 years. The samples examined included larynx carcinoma ( 20 ), hypopharyngeal carcinoma ( 13 ), lung carcinoma ( 19 ), breast carcinoma ( 10 ), esophageal carcinoma ( 14 ), gastric carcinoma ( 19 ), colon carcinoma ( 13 ), rectal carcinoma ( 7 ) ( 12 ), bladder carcinoma Ovarian cancer ( 9 ), endometrial cancer ( 7 ) and a number of myelomas ( 7 ), leukemia ( 15 ) and colon polyps ( 7 ); see Table 1. All biopsies were frozen and frozen at -70 ° C until further use. The DNA was obtained according to the method of Tanaka et al., Leuk. Lymphoma 38 (2000), 411-417. Table 1 TT virus-like sequences in humans

(B) PCR analysis and cloning

Zelluläre Gesamt-DNA (100 ng/Probe) wurde mittels PCR amplifiziert. Die für die anfängliche Amplifikation und die "nested" Amplifikation verwendeten Amplifikationsbedingungen sind in Leary et al., J. Gen. Virol. 80 (1999), 2115-2120, beschrieben. Die 3 "nested" Primerpaare (Sätze A, B, C) hybridisieren an den nicht-kodierenden Bereich des TT- Virusgenoms (Leary et al., 1999).
Satz A
vorwärts 1 : 5'-GCT GCA CTT CCG AAT GGC TGA G-3'
rückwärts 1 : 5'-CCA CCA GCC ATA GGC CAT GGT G-3'
vorwärts 2 : 5'-GAG TTT TCC ACG CCC GTC CGC-3'
rückwärts 2 : 5'-CCA GCC ATA GGC CAT GGT GCT C-3'
Satz B
vorwärts 1 : 5'-GTG GGA CTT TCA CTT GTC GGT GTC-3'
rückwärts 1 : 5'-GAC AAA TGG CAA GAA GAT AAA GGC C-3'
vorwärts 2 : 5'-AGG TCA CTA AGC ACT CCG AGC G-3'
rückwärts 2 : 5'-GCG AAG TCT GGC CCC ACT CAC-3' Satz C
vorwärts 1 : 5'-CAG ACT CCG AGT TGC CAT TGG AC-3'
rückwärts 1 : 5'-CAC GTG TCG GGG CCT ACT TCC G-3'
vorwärts 2 : 5'-GCA ACG AAA GTG AGT GGG GCC AG-3'
rückwärts 2 : 5'-GGT TTC CGC CGA GGA TGA CCT-3' Total cellular DNA (100 ng / sample) was amplified by PCR. The amplification conditions used for the initial amplification and the "nested" amplification are described in Leary et al., J. Gen. Virol. 80 (1999), 2115-2120. The 3 "nested" primer pairs (sets A, B, C) hybridize to the non-coding region of the TT virus genome (Leary et al., 1999).
Sentence A
forward 1: 5'-GCT GCA CTT CCG AAT GGC TGA G-3 '
reverse 1: 5'-CCA CCA GCC ATA GGC CAT GGT G-3 '
forward 2: 5'-GAG TTT TCC ACG CCC GTC CGC-3 '
reverse 2: 5'-CCA GCC ATA GGC CAT GGT GCT C-3 '
Sentence B
forward 1: 5'-GTG GGA CTT TCA CTT GTC GGT GTC-3 '
reverse 1: 5'-GAC AAA TGG CAA GAA GAT AAA GGC C-3 '
forward 2: 5'-AGG TCA CTA AGC ACT CCG AGC G-3 '
backwards 2: 5'-GCG AAG TCT GGC CCC ACT CAC-3 'set C
forward 1: 5'-CAG ACT CCG AGT TGC CAT TGG AC-3 '
reverse 1: 5'-CAC GTG TCG GGG CCT ACT TCC G-3 '
forward 2: 5'-GCA ACG AAA GTG AGT GGG GCC AG-3 '
reverse 2: 5'-GGT TTC CGC CGA GGA TGA CCT-3 '

Aliqots der Produkte der "nested" Amplifikation wurden mittels Elektrophorese (2% Agarosegele) aufgetrennt und auf Nylonmembran geblottet. Die Hybridisierung wurde in 50% Formamid, 5 × SSC, 1% SDS und Denhardts Lösung bei 42°C unter Verwendung des vollständigen TT-Virus Genoms P/1C1 (Zugangsnummer AF298585, EMBL Datenbank) als radioaktiv markierte Probe verwendet. Die Waschschritte wurden bei 68°C in Gegenwart von 2 × SSC und 0,1% SDS durchgeführt. Den Hybridisierungssignalen entsprechende PCR-Produkte wurden eluiert und in den "pMOSBlue"-Vektor von Invitrogen (Groningen, Niederlande) in die EcoRV-Restriktionsstelle ligiert und in "TOP10F' OneShot^TM"-Bakterien (von K12 stammend) (Invitrogen) transformiert. Bis zu 6 Insertionen jedes PCR- Produkts wurden mittels des "Sequenase 2.0 DNA Sequencing Kit" (USB, Cleveland) sequenziert. Die Sequenzen beider Stränge wurden auf einem "ABI"-Sequenziergerät unter Verwendung der "Big Dye Terminator"-Reagenzien (Perkin Elmer Applied Biosystems Division Invitrogen (Groningen, Niederlande) bestimmt. Aliqots of the products of the "nested" amplification were separated by means of electrophoresis (2% agarose gels) and blotted on a nylon membrane. The hybridization was used in 50% formamide, 5 × SSC, 1% SDS and Denhardt's solution at 42 ° C. using the complete TT virus genome P / 1C1 (accession number AF298585, EMBL database) as a radiolabelled sample. The washing steps were carried out at 68 ° C. in the presence of 2 × SSC and 0.1% SDS. PCR products corresponding to the hybridization signals were eluted and ligated into the "pMOSBlue" vector from Invitrogen (Groningen, the Netherlands) into the EcoRV restriction site and transformed into "TOP10F 'OneShot ^TM " bacteria (derived from K12) (Invitrogen). Up to 6 insertions of each PCR product were sequenced using the "Sequenase 2.0 DNA Sequencing Kit" (USB, Cleveland). The sequences of both strands were determined on an "ABI" sequencer using the "Big Dye Terminator" reagents (Perkin Elmer Applied Biosystems Division Invitrogen (Groningen, The Netherlands).

sequence analysis

Die Sequenzen wurden mit den in der EMBL- und GenBank- Datenbank verfügbaren TT-Virussequenzen mittels der "HUSAR"- Software (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland) verglichen. Plasmide mit neuen Sequenzen des TT- Virustyps wurden am 1. Dezember 2000 bei der DSMZ, Braunschweig, Deutschland, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Tabelle 2 Heterogenität von TT-Virus-ähnlichen Sequenzen in menschlichen Tumoren

Tabelle 3 Hinterlegte Plasmide

The sequences were compared with the TT virus sequences available in the EMBL and GenBank database using the "HUSAR" software (German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany). Plasmids with new sequences of the TT virus type were deposited on December 1, 2000 with the DSMZ, Braunschweig, Germany, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty. Table 2 Heterogeneity of TT virus-like sequences in human tumors

Table 3 Deposited plasmids

Example 2 evaluation of results

Insgesamt wurde DNA von 162 Tumorbiopsien (einschließlich DNA von 22 haematopoietischen malignen Tumoren) hinsichtlich der Anwesenheit von TT-Virus-ähnlichen Sequenzen unter Verwendung von drei unterschiedlichen Primersätzen (siehe Beispiel 1) untersucht. In Präparationen mit prominenten Banden oder Banden, die innerhalb eines komplexen Bandenmuster mittels Southern-Blot-Hybridisierung identifiziert wurden, wurden die entsprechenden Bereiche nach Gelelektrophorese der PCR- Produkte ausgeschnitten, die DNA wurde kloniert und anschließend sequenziert. Die vorstehende Tabelle 1 zeigt die nach Southern-Blot-Hybridisierung erhaltenen Daten. Insgesamt 54,3% aller untersuchten Tumor-DNA-Proben zeigten positive Hybridisierungssignale. Eine nähere Untersuchung der einzelnen Tumorgruppen ergab beachtliche Unterschiede in der Anzahl positiver Signale. Während Hypopharynx-, Larynx-, Endometrium-, Ovar- und Blasenkrebse bei 14 bis 35% der positiven Blots lagen, zeigten Tumore des Ösophagus und des Gastronintestinaltrakt 57 bis 100% positive Ergebnisse. Außerdem waren bösartige Tumore der Lunge, Brust und des haematopoietischen Systems zu 53 bis 86% positiv. Der Vergleich der unterschiedlichen Tumorgruppen zeigte, dass sich die Hybridisierungssignale zwischen den verschiedenen Tumortypen wesentlich unterschieden: Während PCR-Produkte von Brust-, Larynx- und Mastdarmkrebsen vergleichsweise scharfe Banden ergaben, zeigten insbesondere die von Speiseröhrenkrebs und einer Reihe von Myelomen ein bemerkenswert heterogenes Muster (Fig. 2). Hybridisierungssignale der PCR-Produkte von anderen Tumortypen zeigten ein gemischtes Muster, einige mit scharfen Banden, andere mit Signalen, die hinsichtlich der Länge beträchtlich variierten. Dabei kann allerdings nicht ganz ausgeschlossen werden, dass dieses Muster u. U. auf PCR- Artefakten beruht. In total, DNA from 162 tumor biopsies (including DNA from 22 haematopoietic malignant tumors) was examined for the presence of TT virus-like sequences using three different sets of primers (see Example 1). In preparations with prominent bands or bands that were identified within a complex band pattern by means of Southern blot hybridization, the corresponding regions were cut out after gel electrophoresis of the PCR products, the DNA was cloned and then sequenced. Table 1 above shows the data obtained after Southern blot hybridization. A total of 54.3% of all examined tumor DNA samples showed positive hybridization signals. A closer examination of the individual tumor groups revealed considerable differences in the number of positive signals. While hypopharynx, larynx, endometrial, ovary and bladder cancers were 14 to 35% of the positive blots, tumors of the esophagus and gastrointestinal tract showed 57 to 100% positive results. In addition, malignant tumors of the lungs, breast and haematopoietic system were 53 to 86% positive. The comparison of the different tumor groups showed that the hybridization signals differed significantly between the different tumor types: While PCR products of breast, laryngeal and rectum cancers showed comparatively sharp bands, those of esophageal cancer and a number of myelomas in particular showed a remarkably heterogeneous pattern ( Fig. 2). Hybridization signals from PCR products from other tumor types showed a mixed pattern, some with sharp bands, others with signals that varied considerably in length. However, it cannot be completely ruled out that this pattern may occur. U. based on PCR artifacts.

Von verschiedenen positiven Tumoren wurde hybridisierende DNA kloniert und sequenziert. Von 123 TT-Virus-ähnliche DNA- Sequenzen enthaltenden Klonen enthielten 50 von festen Tumoren erhaltenen Klonen neue Sequenzen, die sich von den etablierten, in Datenbanken verfügbaren Prototyp-Sequenzen zu mindestens 3% unterscheiden (Tabelle 2). Außerdem wurden 16 neue Klone aus bösartigen haematopoietischen Tumoren (akute Leukämien und Myeloid-Leukämien, multiple Myelome) isoliert. Hybridizing DNA was obtained from various positive tumors cloned and sequenced. From 123 TT virus-like DNA Sequences-containing clones contained 50 solid tumors clones obtained new sequences that differ from the established prototype sequences available in databases distinguish at least 3% (Table 2). In addition, 16 new clones from malignant haematopoietic tumors (acute Leukemia and myeloid leukemia, multiple myeloma) isolated.

Aus den einzelnen Tumor-Biopsien wurden insgesamt bis zu fünf unterschiedliche TT-Virus-ähnliche Sequenzen erhalten, was die Heterogenität diese Agenzien innerhalb des gleichen Läsionstyps unterstreicht. Die einzelnen TT-Virus-Sequenzen bzw. TT-Virus-ähnlichen Sequenzen und deren Verwandschaftsgrad zu etablierten, in Datenbanken verfügbaren TT-Virus-Sequenzen sind in Tabelle 2 gezeigt. A total of up to five were obtained from the individual tumor biopsies get different TT virus-like sequences what the Heterogeneity these agents within the same Lesion type underlines. The individual TT virus sequences or TT virus-like sequences and their degree of relationship to established TT virus sequences available in databases are shown in Table 2.

Example 3 Characterization of the entire genome of a TT virus from one lung tumor

Das Gesamtgenom eines TT-Virus wurde mittels inverser PCR mit nested Primer amplifiziert. Als Primer wurden Sequenzen aus dem nicht-kodierenden Bereich des TT-Virusgenoms ausgewählt. Diese waren wie folgt:
Satz A
vorwärts: 5'-cggactacaaaaaccgccattttagtg-3'
rückwarts: 5'-ctaaaaccgagcccgaagcctatgg-3'
Satz B
vorwärts: 5'-aaaaccgccattttagtgacgtcac-3'
rückwärts: 5'-agaagataaaggccttatggcgaag-3' The entire genome of a TT virus was amplified by means of inverse PCR with nested primers. Sequences from the non-coding region of the TT virus genome were selected as primers. These were as follows:
Sentence A
forward: 5'-cggactacaaaaaccgccattttagtg-3 '
backwards: 5'-ctaaaaccgagcccgaagcctatgg-3 '
Sentence B
forward: 5'-aaaaccgccattttagtgacgtcac-3 '
backwards: 5'-agaagataaaggccttatggcgaag-3 '

Eine Long-PCR wurde mittels TaKaRa LA Taq Polymerase in Gegenwart eines GC Puffers (TaKaRa Shuzo, Shiga, Japan) durchgeführt. Zelluläre DNA (850-1000 ng/Ansatz) wurde in der ersten Runde mit dem Primer-Satz A in 40 Zyklen amplifiziert (50 Sek. bei 95°C, 45 Sek. bei 60°C, 8 Min. bei 72°C), zunächst für 5 Minuten bei 95°C und anschließend für 5 Min. bei 72°C. Ein Aliquot von 5 Mikroliter aus der ersten Runde wurde in einer zweiten Runde unter gleichen Bedingungen mittels Primer- Satz B amplifiziert. Ein Aliquot der zweiten Runde wurde mittels Elektrophorese (1% Agarosegel) aufgetrennt (Fig. 1). Die 2 Fragmente im Bereich von 3500 bp wurden ausgeschnitten und in den Vektor pCR^R2.1-TOPO^R (Invitrogen, Groningen) kloniert. Die Sequenzen wurden auf einem ABI-Sequenziergerät unter Verwendung der Big Dye Terminator-Reagenzien (Perkin Elmer Applied Biosystems Division Invitrogen, Groningen, Niederlande) bestimmt. Es wurden die Klone 32C2 und 32B8 enthalten, die 3749 Bp bzw. 3268 Bp aufweisen (Fig. 52 und 53). A long PCR was carried out using TaKaRa LA Taq polymerase in the presence of a GC buffer (TaKaRa Shuzo, Shiga, Japan). Cellular DNA (850-1000 ng / batch) was amplified in the first round with primer set A in 40 cycles (50 seconds at 95 ° C, 45 seconds at 60 ° C, 8 minutes at 72 ° C) , first for 5 minutes at 95 ° C and then for 5 minutes at 72 ° C. An aliquot of 5 microliters from the first round was amplified in a second round under the same conditions using primer set B. An aliquot of the second round was separated by means of electrophoresis (1% agarose gel) ( FIG. 1). The 2 fragments in the range of 3500 bp were cut out and cloned into the vector pCR ^R 2.1-TOPO ^R (Invitrogen, Groningen). The sequences were determined on an ABI sequencer using the Big Dye Terminator reagents (Perkin Elmer Applied Biosystems Division Invitrogen, Groningen, The Netherlands). Clones 32C2 and 32B8 containing 3749 bp and 3268 bp, respectively, were included ( Figs. 52 and 53).

Claims

1. DNA sequence comprising the genome of a tumor-associated TT virus, or a fragment thereof, the DNA sequence comprising a DNA sequence shown in FIGS. 3-53, or one of them by one or more base pairs different DNA sequence which has a homology of at most 97% to a DNA sequence of a known TT virus and is obtainable from a tumor biopsy.

2. Ribozyme, characterized in that it is a DNA Sequence according to claim 1 or a fragment thereof is complementary and to that of this DNA sequence can specifically bind transcribed RNA and cleave it, whereby the synthesis of the encoded by this DNA sequence Protein is reduced or inhibited.

3. Antisense RNA, characterized in that it becomes a DNA sequence according to claim 1 or a fragment thereof is complementary and to that of this DNA sequence can specifically bind transcribed RNA, making the Synthesis of the protein encoded by this DNA sequence is reduced or inhibited.

4. vector, a DNA sequence according to claim 1 or a fragment thereof or which the ribozyme according to claim 2 or the antisense Containing RNA encoding DNA according to claim 3.

5. host cell containing the vector of claim 4 is transformed.

6. Protein encoding a DNA sequence according to claim 1 becomes.

7. A method for producing a protein according to claim 6, that the cultivation of the host cell according to claim 5 under suitable conditions and the extraction of the protein from the Cell or the growth medium comprises.

8. Antibody specific to a protein of claim 6 binds.

9. Medicament containing (a) a ribozyme, thereby characterized that it becomes a DNA sequence that the genome of a tumor-associated TT virus, or a fragment of which is complementary and to that of this DNA sequence can specifically bind transcribed RNA and cleave it, whereby the synthesis of the encoded by this DNA sequence Protein is reduced or inhibited, (b) an antisense RNA, characterized in that it leads to a DNA sequence that the Genome of a tumor-associated TT virus, or a Fragment of which is complementary and to which of this DNA Sequence can specifically bind transcribed RNA, thereby the Synthesis of the protein encoded by this DNA sequence is reduced or inhibited, or (c) an antibody which to a tumor virus-associated TT virus genome specifically encodes encoded protein.

10. Medicament comprising a ribozyme according to claim 2, a Antisense RNA according to claim 3, a vector according to claim 4 or contains an antibody according to claim 8.

11. Use (a) of a DNA sequence that encompasses the genome of a TT Virus comprises, or a fragment thereof, (b) one of the DNA sequence of (a) encoded protein or (c) one attached to the Protein from (b) specific binding antibody for tumor Diagnosis.

12. Use (a) of a ribozyme, characterized in that that it becomes a DNA sequence that is the genome of a Tumor-associated TT virus comprises, or a fragment thereof is complementary and to that of this DNA sequence can specifically bind transcribed RNA and cleave it, whereby the synthesis of the encoded by this DNA sequence Protein is reduced or inhibited, (b) an antisense RNA, characterized in that it becomes a DNA sequence, which comprises the genome of a tumor-associated TT virus, or a fragment of which is complementary and to which of this DNA Sequence can specifically bind transcribed RNA, thereby the Synthesis of the protein encoded by this DNA sequence is reduced or inhibited, or (c) an antibody which to a tumor virus-associated TT virus genome specifically binds encoded protein, for prevention or Treatment of with a TT virus or a TT virus similar sequence related tumor.

13. Diagnostic kit that (a) a DNA sequence that the Genome of a TT virus, or a fragment thereof, (b) a protein encoded by the DNA sequence of (a) and / or (c) an antibody that specifically binds to the protein of (b) contains.

14. Use according to claim 11 or 12 or kit according to claim 13, wherein the DNA sequence, the DNA sequence according to claim 1, the ribozyme, the ribozyme according to claim 2 , the antisense RNA, the antisense RNA according to claim 3, the vector of The vector of claim 4, the protein is the protein of claim 6 and the antibody is the antibody of claim 8.

15. Use according to claim 11, 12 or 14, wherein the tumor an esophageal tumor, a tumor of the gastrointestinal tract Lung tumor, a breast tumor or a malignant disease of the hematopoietic system is.