DE10117234A1 - Poröse und nichtporöse Matrices auf Basis von Chitosan und Hydroxycarbonsäuren - Google Patents
Poröse und nichtporöse Matrices auf Basis von Chitosan und HydroxycarbonsäurenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft biokompatible Matrices auf Basis von Chitosan und Hydroxycarbonsäuren, diese Matrices enthaltende mehrschichtige Systeme und Anwendungen solcher Matrices.
Description
Die Erfindung betrifft biokompatible Matrices auf Basis von Chitosan und
Hydroxycarbonsäuren, diese Matrices enthaltende mehrschichtige Systeme
und Anwendungen solcher Matrices.
Auf dem Gebiet der Transplantationsmedizin sind in den letzten Jahren
erhebliche Erfolge erzielt worden. Probleme bereiten jedoch die geringen
verfügbaren Mengen an Spenderorganen sowie durch heterologe
Spenderorgane verursachte Abstoßungsreaktionen. Ein weiteres Problem
besteht darin, dass mit heterologen Spenderorganen auch
Krankheitserreger übertragen werden können. Es sind daher Versuche
unternommen worden, künstliche Organe aus Zellkulturen auf einer
dreidimensionalen Matrix zu züchten, die entsprechend den Bedürfnissen
geformt werden kann, beispielsweise als Ohr. Dieses künstliche Organ oder
Körperteil kann dann transplantiert werden, wobei bei Verwendung
körpereigener Zellen keine Abstoßungsreaktion eintritt.
Als vielversprechendes Matrixmaterial hat Chitosan ein immer größeres
Interesse gefunden. Chitosan ist ein teilweise deacetyliertes Chitin und
wird aus den Exoskeletten von Arthropoden gewonnen. Es ist ein
Aminopolysaccharid (Poly-1-4-glucosamin), das beispielsweise im
Medizinbereich als Nahtmaterial oder zur Verkapselung von Pharmaka
verwendet wird. Sein Vorteil liegt darin, dass es vom Körper vollständig
resorbiert werden kann. Chitosan kann im leicht Sauren (pH < 6) durch
Protonierung der freien Aminogruppen in Wasser gelöst werden. Im
Alkalischen (pH < 7) fällt es aus der wässrigen Lösung wieder aus. Durch
diesen pH-abhängigen Mechanismus kann Chitosan unter milden
Bedingungen gereinigt und verarbeitet werden.
In der US 5,871,985 wird ein Träger für die Transplantation in einen
Patienten vorgeschlagen, der aus einer Matrix besteht, in die Zellen
eingewachsen sind. Dazu wird zunächst eine Lösung aus Chitosan
hergestellt, in der lebende Zellen enthalten sind. Diese Lösung wird dann in
eine semipermeable Membran eingeschlossen, um den Träger auszubilden.
Das Chitosan wird präzipitiert und bildet eine unvernetzte Matrix aus, in der
die Zellen verteilt sind.
Madihally et al. (Biometerials 1999; 20(12), S. 1133-1142) beschreibt eine
Matrix für die Gewebegeneration. Chitosan, das zu 85-90% deacetyliert
ist, wird dazu in 0,2 M Essigsäure gelöst, so dass Lösungen mit einem
Gehalt von 1 bis 3 Gew.-% Chitosan erhalten werden. Die Lösung wird
eingefroren und das Wasser und die überschüssige Essigsäure durch
Lyophilisieren entfernt.
Die Deutsche Patentanmeldung 199 48 120.2 offenbart ein Verfahren zur
Herstellung einer biokompatiblen dreidimensionalen Matrix, wobei eine
wässrige Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden
Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, eingefroren wird und das
Wasser bei vermindertem Druck absublimiert wird, wobei die überschüssige
Säure vor dem Einfrieren oder nach dem Absublimieren des Wassers
entfernt, insbesondere neutralisiert wird. Weiterhin wird eine durch das
Verfahren erhältliche Matrix offenbart, die zur Herstellung von Implantaten
verwendet werden kann.
Ausgehend von dieser Erkenntnis war es die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, neue Matrixformen oder/und Anwendungen einer Matrix auf
Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer
Hydroxycarbonsäure bereitzustellen.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine
biokompatible nichtporöse Matrix auf Basis von Chitosan und einer Säure,
insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, die beispielsweise in Form einer
Folie oder eines dreidimensionalen Körpers, z. B. eines Hohlkörpers oder
einer Rolle, sein kann. Die nichtporöse Matrix ist erhältlich durch:
- - Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
- - Trocknen der Lösung ohne Einfrieren und
- - Entfernen von überschüssigen Säuren vor oder/und nach dem Trocknen, vorzugsweise durch Neutralisation.
Die nichtporöse Matrix kann als Träger für eine poröse dreidimensionale
Matrix verwendet werden. Somit können biokompatible Matrixsysteme
bereitgestellt werden, die mindestens eine biokompatible poröse Matrix,
wie zuvor beschrieben, und mindestens eine biokompatible poröse Matrix
umfassen. Die biokompatible poröse Matrix ist vorzugsweise auf Basis von
Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure
aufgebaut. Es können jedoch auch andere poröse biokompatible Matrices
verwendet werden.
Besonders bevorzugt ist eine biokompatible poröse Matrix gemäß der
Deutschen Anmeldung 199 48 120.2, die erhältlich ist durch:
- - Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
- - Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
- - Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren, insbesondere durch Neutralisation mit einer geeigneten Base, z. B. NaOH.
Bei erfindungsgemäßen Matrixsystem können nichtporöse Matrices und
poröse Matrices jeweils abwechselnd in Schichten angordnet sein. Beispiele
für derartige Mehrschichtsysteme sind in Fig. 1A, 1 B und 1 C dargestellt.
Alternativ kann eine nichtporöse Matrix auch zwischen zwei porösen
Matrices angeordnet sein.
Die erfindungsgemäße nichtporöse Matrix oder das darauf basierende
Matrixsystem kann zur in vitro Kultivierung von Zellen verwendet werden.
Dabei kann das Matrixsystem zusätzliche Faktoren zum Zellwachstum, z. B.
Zytokine, enthalten.
Beispielsweise können die Matrix oder das Matrixsystem eingesetzt werden
zur Züchtung von Knorpelgewebe, zur Rekonstruktion von
Knochengewebe, als Füllmaterial für Bioreaktoren zur Produktion von
Zellen, Proteinen oder Viren, als Mikrocarrier von Füllmaterial für
Bioreaktoren, zur Erzeugung von Kapillaren und Blutgefäßen, zur Erzeugung
von gegebenenfalls mehrschichtigen Hautsystemen, zur Kultivierung von
Blutstammzellen, zur Regeneration von Nervengeweben, zur Erzeugung
künstlicher Organe.
Eine besonders bevorzugte Anwendung des mehrschichtigen
Matrixsystems ist die Herstellung eines Basismaterials zur Erzeugung eines
mehrschichtigen künstlichen Hautsystems. Dabei kann das Matrixsystem
mit Keratinocyten sowie gegebenenfalls zusätzlich mit Fibroblasten
besiedelt werden. Weiterhin kann ein vaskularisiertes Hautsystem erzeugt
werden, wobei in die porösen Schichten des Matrixsystems Röhren
eingezogen werden, die nach Besiedelung mit Epithelzellen zur
Vaskularisierung der künstlichen Haut beitragen.
Eine weitere besonders bevorzugte Anwendung des mehrschichtigen
Matrixsystems ist die Erzeugung einer künstlichen Herzklappe, wobei eine
nichtporöse Struktur zur Erhöhung der mechanischen Stabilität zwischen
zwei porösen Strukturen eingebaut und dann zur Kultivierung von
Muskelzellen verwendet wird.
Weiterhin kann die nichtporöse Matrix und das darauf basierende
Matrixsystem auch als Implantat ohne vorherige Zellbesiedelung, z. B. bei
Knorpel- und Knochendefekten, zum Ersatz von Mikro kapillaren oder als
chirurgisches Füllmaterial, z. B. für die rekonstruktive Chirurgie oder die
Schönheitschirurgie eingesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine biokompatible
Matrix auf Basis von Chitosan und einer Säure, insbesondere einer
Hydroxycarbonbsäure mit anisotropen Strukturen, beispielsweise parallel
ausgerichteten Fasern oder/und Kammern. In dieser Ausführungsform ist
die Matrix vorzugsweise porös. Die anisotrope Matrix ist erhältlich durch:
- - Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
- - anisotropes Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimation bei verringertem Druck und
- - Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
Das anisotrope Einfrieren umfasst vorzugsweise ein Einfrieren unter
Verwendung von strukturierten Kälteelementen, z. B. Rohren in direktem
oder indirektem Kontakt mit der Matrix während des Einfrierprozesses. Die
Kältelemente können langgestreckt sein, um beispielsweise parallel
ausgerichtete Fasern oder Kammern in der Matrix zu erhalten. Es können
jedoch auch gekrümmte Strukturen, z. B. Nachbildungen des zu formenden
Organs, als Kälteelemente verwendet werden.
Die anisotrope poröse Matrix kann in einem biokompatiblen Matrixsystem
zusammen mit einer anderen Matrix, beispielsweise mit einer
biokompatiblen nichtporösen Matrix eingesetzt werden. Die anisotrope
Matrix bzw. das darauf basierende Matrixsystem kann zur in vitro
Kultivierung von Zellen oder als Implantat ohne vorherige Zellbesiedlung,
entsprechend den zuvor genannten Anwendungen, eingesetzt werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer
biokompatiblen Matrix auf Basis von Chitosan und einer Säure,
insbesondere einer Hydroxycarbonsäure, wie in DE 199 48 120.2
beschrieben, zur Züchtung von Knorpelgewebe, zur Rekonstruktion von
Knochengewebe, als Füllmaterial für Bioreaktoren zur Produktion von
Zellen, Proteinen oder Viren, als Mikrocarrier von Füllmaterial für
Bioreaktoren, zur Erzeugung von Kapillaren und Blutgefäßen, zur Erzeugung
von gegebenenfalls mehrschichtigen Hautsystemen, zur Kultivierung von
Blutstammzellen, zur Regeneration von Nervengeweben, zur Erzeugung
künstlicher Organe.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Zellen in einer Dichte 10 6
oder mehr Zellen pro cm2 Matrix kultiviert werden können. Dabei handelt es
sich um eine im Vergleich zur Kultivierung in einer Kulturschale mehr als
10fache Erhöhung der Zelldichte.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices auf Basis von Chitosan
und Säuren erfolgt im Wesentlichen nach dem in der Deutschen
Anmeldung 199 48 120.2 angegebenen Verfahren, sofern nichts anderes
angegeben ist. Vorzugsweise wird zunächst eine wässrige Lösung eines
teilweise deacetylierten Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden
Säure hergestellt. Unter Überschuss wird dabei verstanden, dass der pH
der wässrigen Lösung im Sauren liegt, vorzugsweise unterhalb von pH ≦ 4.
Dadurch sind die freien Aminogruppen des Chitosans zumindest teilweise
protoniert, wodurch die Löslichkeit in Wasser gesteigert wird. Die
Säuremenge ist nicht kritisch. Sie muss lediglich so gewählt sein, dass das
Chitosan in Lösung geht. Eine übermäßige Säurezugabe wird nach
Möglichkeit vermieden, da überschüssige Säure wieder entfernt werden
muss, und dadurch die Aufarbeitung bei großen Säuremengen erschwert
wird. Günstig sind Säuremengen, die eine 0,05 bis 1 N, vorzugsweise 0,1
bis 0,5 N, insbesondere 0,1 bis 0,3 N Lösung ergeben. Die Chitosanmenge
wird vorzugsweise so gewählt, dass sich eine 0,01 bis 0,5 M,
vorzugsweise 0,1 bis 0,3 M Lösung ergibt. Durch die Konzentration der
Chitosanlösung kann Einfluss auf die Struktur der Matrix, insbesondere
deren Porengröße genommen werden. Auf diese Weise lässt sich die
Porengröße der Matrix auf den jeweiligen Zelltypus abstimmen, mit dem die
Matrix besiedelt werden soll.
Chitosan hat wegen seiner Herstellung aus natürlichen Quellen kein
einheitliches Molekulargewicht. Je nach Quelle und Aufbereitungsverfahren
kann das Molekulargewicht zwischen 20 kDa bis über 1000 kDa betragen.
Für die Herstellung der dreidimensionalen Matrix ist das Chitosan
hinsichtlch seines Molekulargewichts keinen Beschränkungen unterworfen.
Für die Herstellung der wässrigen Chitosanlösung wird eine Säure
verwendet, bei der es sich um eine anorganische Säure oder vorzugsweise
um eine organische Säure, besonders bevorzugt um eine Alkyl- oder Aryl-
Hydroxycarbonsäure handelt. Geeignet sind insbesondere
Hydroxycarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder
mehrere Hydroxylgruppen sowie eine oder mehrere Carboxylgruppen im
Molekül vorhanden sein können. Spezifische Beispiele sind Glycolsäure,
Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und Mandelsäure.
Besonders bevorzugt ist Milchsäure.
Bei Herstellung einer porösen Matrix wird die Lösung aus Chitosan und
Säure zunächst durch Zugabe von Base zumindest teilweise neutralisiert
und dann eingefroren oder ohne vorherige Neutralisation direkt eingefroren.
Die Neutralisation vor dem Einfrieren ist bevorzugt. Der pH-Wert nach der
Neutralisation beträgt im Allgemeinen 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,5 bis
7,0 und insbesondere 6,0 bis 7,0.
Nach dem Einfrieren wird das Wasser unter vermindertem Druck
absublimiert, beispielsweise im Druckbereich von 0,001 bis 3 hPa.
Zur Herstellung einer nichtporösen Matrix wird die Lösung nicht gefroren
und absublimiert, sondern ohne Einfrieren bei gegebenenfalls erhöhter
Temperatur oder/und verringertem Druck getrocknet und vorzugsweise
nach Trocknung neutralisiert. Die entstehende nichtporöse Matrix ist in
feuchtem Zustand stark belastbar und dehnbar.
Durch die große Anzahl von Amino- und Hydroxygruppen ist die Matrix
beliebig modifizierbar. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der
dreidimensionalen Matrix sind Liganden kovalent oder nicht kovalent an die
Chitosanmatrix gebunden, vorzugsweise an die freien Aminogruppen des
Chitosans. Als Liganden können z. B. Wachstumsstoffe, Proteine, Hormone,
Heparin, Heparansulfate, Chondroitsulfate, Dextransulfate oder eine
Mischung dieser Substanzen verwendet werden. Die Liganden dienen
vorzugsweise zur Kontrolle und Verbesserung der Zellproliferation.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
Nukleinsäuren, z. B. RNA oder DNA, als Liganden in der Matrix verwendet.
Die Nukleinsäuren können über chemische Kopplung an die im Chitosan
vorhandenen Amino- oder/und Hydroxygruppen immobilisiert werden. Mit
einer Nukleinsäure-beladenen Matrix kann eine lokal begrenzte transiente
Expression heterologer Gene im Körper erreicht werden. Wird eine derart
gekoppelte Matrix nämlich im Körper implantiert und von körpereigenen
Zellen besiedelt, die die Matrix auflösen, nehmen die Zellen auch die darauf
immobilisierten Nukleinsäuren auf und sind in der Lage, diese zu
exprimieren.
Das Zellwachstum auf der Matrix wird weiter verbessert, wenn die Matrix
mit autologem Fibrin beschichtet ist.
Die erfindungsgemäße dreidimentsionale Matrix kann als Festphase in
einem Kulturreaktor (Cell Factory) verwendet werden. Die Matrix zeigt eine
sehr hohe Beständigkeit im Kulturmedium. Ferner hat sich gezeigt, dass die
Matrix das Zellwachstum fördert.
Die Matrix eignet sich ferner zur Verwendung als Zellimplantat,
insbesondere für knorpelbildende Zellen. Es müssen dabei keine
gentechnisch veränderten Zellen verwendet werden. Die Zellen werden
bevorzugt durch Biopsie dem Patienten entnommen, auf der Zellmatrix
angezüchtet und das Zellimplantat dann dem Patienten eingepflanzt. Durch
die Besiedlung der dreidimensionalen Matrix mit körpereigenen Stammzellen
(Knochenersatz), die sich erst am Ort des Transplantats differenzieren,
angeregt durch die jeweiligen Wachstumsfaktoren des umliegenden
Gewebes, oder mit Knorpelzellen zur erneuten Bildung hyalinen Knorpels,
sind Abstoßungsreaktionen des Transplantats weitgehend ausgeschlossen.
Die dreidimensionale Matrix kann sowohl mit humanen als auch mit
animalischen Zellen (beispielsweise vom Pferd, Hund oder Hai) besiedelt
werden. Besonders geeignet sind Haizellen, da diese beim Empfänger keine
wesentliche immunologische Antwort auslösen. Haizellen werden bereits
als Organersatz verwendet, z. B. für Augenlinsen. Beispiele für Zellen, mit
denen die erfindungsgemäßen Matrices bzw. Matrixsysteme besiedelt
werden können, sind Chondrocyten, Osteocyten, Keratinocyten,
Hepatocyten, Knochenmarksstammzellen oder neuronale Zellen.
Die Matrices oder Matrxsysteme, wie zuvor beschrieben, können im
humanmedizinischen und im tiermedizinischen Bereich eingesetzt werden.
Weitere Einsatzgebiete sind die Verwendung als Einmalartikel als in vitro
Testsystem zur Untersuchung von pharmazeutischen Wirkstoffen. Hierzu
können beispielsweise Blutstammzellen oder Hepatocyten auf der Matrix
kultiviert werden. Dieses System kann zur Untersuchung der Wirksamkeit
von Testsubstanzen aus einer chemischen oder/und biologischen
Substanzenbibliothek, gegebenenfalls in einem Hochdurchsatzverfahren,
verwendet werden.
Die Matrix und das Matrixsystem werden vor Einsatz in der Zellkultur
sterilisiert, um Keimfreiheit zu garantieren. Die Sterilisation kann durch
Temperaturbehandlung, z. B. durch Autoklavieren, Dampfbehandlung etc.
oder/und durch Bestrahlung, z. B. Gammastrahlenbehandlung, erfolgen.
Vorzugsweise erfolgt die Sterilisation in einer physiologisch verträglichen
gepufferten Lösung, z. B. in PBS, um eine vollständige Benetzung der Matrix
mit Flüssigkeit und die Abwesenheit größerer Lufteinschlüsse
sicherzustellen.
Bei Kultivierung der Zellen wird die Matrix in einem Zeitraum von ca. 5-8
Wochen abgebaut. Die Abbauzeiten können über den Deacetylierungsgrad
des Chitosans und die Konzentration des Materials eingestellt werden.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert
werden.
Nach dem im Beispiel 3 von DE 199 48 120.2 beschriebenen Verfahren
wird eine Mischung aus Chitosan und Milchsäure hergestellt. Die Lösung
wird in eine Petrischale gegossen, bei 50°C getrocknet und nach
Entstehen eines glasklaren Filmes mit 1 M Natronlauge auf einen pH-Wert
von 7 neutralisiert. Die entstehende Folie ist im feuchten Zustand stark
belastbar und dehnbar.
Zwei definierte Anfangsmengen, 1 × 105 bzw. 1 × 106, Hep-G2-
Hepatocyten wurden in ein 1,5 cm2 großes Stück poröse Matrix (hergestellt
nach Beispiel 3 von DE 199 48 120.2) eingespritzt und das Zellwachstum
zu vier Zeitpunkten, maximal 33 Tage lang beobachtet. Dabei konnte ein
kontinuierliches Zellwachstum beobachtet werden.
Nach 33 Tagen lag die maximale Zellzahl pro Matrix bei 1,6 × 107 Zellen
(Fig. 2). Das bedeutet, dass sich die Zellzahl auf der geringen Grundfläche
von 1,5 cm2 noch um eine Zehnerpotenz vermehren konnte. Die Zelldichte
einer konfluenten, konventionellen Kulturschale mit einer Grundfläche von
80 cm2 wird beim der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ) mit 2,5-3,0 × 10' für Hep-G2 angegeben. Diese Menge
ist, wenn die auf die Grundfläche der Matrix umgelegt wird, etwa 25fach
geringer als die Zellzahl, die nach 33 Tagen in der Matrix nachgewiesen
werden konnte.
Bei diesem Versuch sollte gezeigt werden, ob sich Substanzen, die sich in
der Matrix befinden, das Zellwachstum ungünstig beeinflussen. Dabei sollte
nicht das Wachstum der Zellen auf der Matrix begutachtet werden,
sondern nur der Einfluss potenzieller, löslicher Substanzen, die
möglicherweise an das Medium abgegeben werden. Dazu wurde 6 Tage
lang ein 1,5 cm2 großes Stück einer Matrix (hergestellt nach Beispiel 3 von
DE 199 48 120.2) in 3 ml Zellkulturmedium bei 37°C und 5% CO2
vorinkubiert. Das Medium wurde anschließend zusammen mit ebenfalls
vorinkubierten Kontrollmedien in einem Standard-Proliferationstest (XTT)
analysiert. Bei diesem Test werden durch metabolisch aktive Zellen ein
Tetrazoliumsalz in ein farbiges Formazansalz umgesetzt, welches
anschließend photometrisch nachgewiesen werden kann. Dabei konnte
keine Beeinflussung des Zellwachstums beobachtet werden. Als Zelllinie
wurde Hep-G2 verwendet und als Positivkontrolle wurde dem Medium 5%
DMSO zugesetzt. Der Test wurde dreifach wiederholt und lieferte in allen
drei Fällen das gleiche Ergebnis.
Neben Hep-G2 wurden zwei weitere Zelllinien auf die Matrix ausgesät, um
zu beobachten, ob sie in der Matrix wachsen. Sowohl Hela als auch die
Zelllinie CHO-K1 lässt sich in der Matrix vermehren.
Bei allen drei Zelllinien lässt sich eine veränderte Morphologie im Vergleich
zu Zellen, die in normalen Zellkulturschalen wachsen, beobachten. Die
Zellen sind deutlich abgerundet und wachsen auch in die dritte Dimension
und ähneln somit mehr Zellen in natürlichen dreidimensionalen Geweben.
Als Beispiel sind in Fig. 3 zwei Abbildungen der Leberzelllinie Hep-G2
dargestellt, wobei Fig. 3A die Zellen nach Kultivierung aus einer
Zellkulturschale und Fig. 3B die Zellen nach Kultivierung in einer Matrix
zeigt.
Claims (24)
1. Biokompatible nichtporöse Matrix auf Basis von Chitosan und einer
Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure.
2. Nichtporöse Matrix nach Anspruch 1 in Form einer Folie, eines
Hohlkörpers oder einer Rolle.
3. Nichtporöse Matrix nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass de Hydroxycarbonsäure ausgewählt ist aus Glycolsäure,
Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und
Mandelsäure, insbesondere Milchsäure.
4. Nichtporöse Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhältlich
durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung einers Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
Trocknen der Lösung ohne Einfrieren und
Entfernen von überschüssigen Säuren vor oder/und nach dem Trocknen.
Bereitstellen einer wässrigen Lösung einers Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
Trocknen der Lösung ohne Einfrieren und
Entfernen von überschüssigen Säuren vor oder/und nach dem Trocknen.
5. Biokompatibles Matrixsystem umfassend mindestens eine
biokompatible nichtporöse Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4
und mindestens eine biokompatible poröse Matrix.
6. Matrixsystem nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass mindestens eine biokompatible poröse Matrix auf Basis von
Chitosan und einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure
aufgebaut ist.
7. Matrixsystem nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass die biokompatible poröse Matrix erhältlich ist durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
dass die biokompatible poröse Matrix erhältlich ist durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
8. Matrixsystem nach einem der Ansprüche 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass nichtporöse Matrices und poröse Matrices jeweils abwechselnd
in Schichten angeordnet sind.
9. Verwendung einer nichtporösen Matrix nach einem der Ansprüche 1
bis 4 oder eines Matrixsystems nach einem der Ansprüche 5 bis 8
zur in vitro Kultivierung von Zellen.
10. Verwendung nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Matrixsystem Liganden, z. B. Faktoren zum Wachstum von
Zellen, enthält.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10 zur Züchtung von
Knorpelgewebe, zur Rekonstruktion von Knochengewebe, als
Füllmaterial für Bioreaktoren zur Produktion von Zellen, Proteinen
oder Viren, als Mikrocarrier von Füllmaterial für Bioreaktoren, zur
Erzeugung von Kapillaren und Blutgefäßen, zur Erzeugung von
gegebenenfalls mehrschichtigen Hautsystemen, zur Kultivierung von
Blutstammzellen, zur Regeneration von Nervengeweben und zur
Erzeugung künstlicher Organe.
12. Verwendung einer nichtporösen Matrix nach einem der Ansprüche 1
bis 4 oder eines Matrixsystems und einem der Ansprüche 5 bis 8 als
Implantat ohne vorherige Zellbesiedlung.
13. Verwendung nach Anspruch 12 bei Knorpel- und Knochendefekten,
als Mikrokapillaren oder als chirurgisches Füllmaterial.
14. Biokompatible Matrix auf Basis von Chitosan und einer Säure,
insbesondere einer Hydroxycarbonsäure mit anisotropen Strukturen.
15. Matrix nach Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie parallel ausgerichtete Fasern oder Kammern enthält.
16. Matrix nach Anspruch 14 oder 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie porös ist.
17. Matrix nach einem der Ansprüche 14 bis 16, erhältlich durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
anisotropes Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimation bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
anisotropes Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimation bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
18. Biokompatibles Matrixsystem umfassend mindestens eine
biokompatible anisotrope poröse Matrix nach einem der Ansprüche
14 bis 17 und mindestens eine biokompatible nichtporöse Matrix.
19. Verwendung einer anisotropen Matrix nach einem der Ansprüche 14
bis 17 oder eines Matrixsystems nach Anspruch 18 zur in vitro
Kultivierung von Zellen oder als Implantat ohne vorherige
Zellbesiedelung.
20. Biokompatible Matrix auf Basis von Chitosan und einer Säure,
insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie Nukleinsäuren in chemisch angekoppelter Form enthält.
21. Verwendung einer biokompatiblen Matrix auf Basis von Chitosan und
einer Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure zur Züchtung
von Knorpelgewebe, zur Rekonstruktion von Knochengewebe, als
Füllmaterial für Bioreaktoren zur Produktion von Zellen, Proteinen
oder Viren, als Mikrocarrier von Füllmaterial für Bioreaktoren, zur
Erzeugung von Kapillaren und Blutgefäßen, zur Erzeugung von
gegebenenfalls mehrschichtigen Hautsystemen, zur Kultivierung von
Blutstammzellen, zur Regeneration von Nervengeweben und zur
Erzeugung künstlicher Organe.
22. Verwendung nach Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Matrix erhältlich ist durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
dass die Matrix erhältlich ist durch:
Bereitstellen einer wässrigen Lösung eines Chitosans und einer im Überschuss vorliegenden Säure, insbesondere einer Hydroxycarbonsäure,
Einfrieren und Trocknen der Lösung, insbesondere durch Absublimieren bei verringertem Druck und
Entfernen von überschüssiger Säure vor oder/und nach dem Einfrieren.
23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Matrix sterilisiert wird.
24. Verwendung nach Anspruch 21 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass Zellen in einer Dichte von 106 oder mehr Zellen pro cm2 auf
bzw. in der Matrix kultiviert werden.
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