DE10100587C1 - Inhibiting expression of target genes, e.g. oncogenes, in cells, by introduction of complementary double-stranded oligoribonucleotide, after treating the cell with interferon - Google Patents

Inhibiting expression of target genes, e.g. oncogenes, in cells, by introduction of complementary double-stranded oligoribonucleotide, after treating the cell with interferon

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DE10100587C1 DE2001100587 DE10100587A DE10100587C1 DE 10100587 C1 DE10100587 C1 DE 10100587C1 DE 2001100587 DE2001100587 DE 2001100587 DE 10100587 A DE10100587 A DE 10100587A DE 10100587 C1 DE10100587 C1 DE 10100587C1
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Abstract

Inhibiting expression of a target gene (I) by introducing into the cell that contains (I) at least one oligoribonucleotide (dsRNAI) that has a double-stranded (ds) structure of not more than 49 consecutive nucleotides (nt), where at least a segment of one strand of the ds structure is complementary with (I) and the cells are treated with interferon before introduction of dsRNAI, is new. An Independent claim is also included for a kit comprising dsRNAI and interferon.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung und ei nen Kit zur Hemmung der Expression eines Zielgens. The invention relates to a method, a use and ei NEN kit for inhibiting expression of a target gene.

Aus der WO 99/32619 und der WO 00/44895 sind Verfahren zur Hemmung der Expression von medizinisch oder biotechnologisch interessanten Genen mit Hilfe eines doppelsträngigen Oligori bonukleotids (dsRNA) bekannt. A method for inhibiting the expression of medically or biotechnologically interesting genes using a double Oligori bonukleotids (dsRNA) are known from WO 99/32619 and WO 00/44895. Die bekannten Verfahren sind nicht besonders effektiv. The known methods are not very effective.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. The object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art. Es sollen insbesondere ein möglichst wirksames Verfahren, eine möglichst wirksame Verwendung und ein Kit angegeben werden, mit denen eine noch effizientere Hemmung der Expression eines Zielgens erreichbar ist. It should be particularly pointed out an effective method possible, the most efficient use and to a kit with which a more efficient inhibition of the expression of a target gene can be achieved.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 36 und 71 gelöst. This object is solved by the features of claims 1, 36 and 71st Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 35, 37 bis 70 und 72 bis 99. Advantageous embodiments result from the features of claims 2 to 35, 37 to 70 and 72 to the 99th

Mit den erfindungsgemäß beanspruchten Merkmalen wird überra schenderweise eine drastische Erhöhung der Effektivität der Hemmung der Expression eines Zielgens erreicht. With the invention claimed features drastically increase the effectiveness of the inhibition of the expression of a target gene is überra ingly achieved. Die genauen Umstände dieses Effekts sind noch nicht geklärt. The exact circumstances of this effect are not yet clear.

Nach einem Ausgestaltungsmerkmal weist zumindest ein Ende des Oligoribonukleotids zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleotid auf. After a design feature has at least one end of the oligoribonucleotide to at least one unpaired by Watson & Crick nucleotide. Es wird angenommen, dass durch die besondere Ausbildung zumindest des einen Endes des Oligoribo nukleotids die Stabilität desselben erhöht wird. It is believed that by the special design of at least the one end of the nucleotide oligoribo the stability thereof is increased. Durch die Erhöhung der Stabilität wird die wirksame Konzentration in der Zelle erhöht. By increasing the stability of the effective concentration is increased in the cell. Die Effektivität ist gesteigert. The effectiveness is increased.

Die Effektivität kann weiter gesteigert werden, wenn das Ende einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einsträngigen Ab schnitt und/oder ungepaarte Nukleotide aufweist. The effectiveness can be further enhanced when the end of a cut stranded From formed from 1 to 4 nucleotides, and / or having unpaired nucleotides. Eine beson dere Erhöhung der Stabilität des erfindungsgemäßen Oligoribo nukleotids ist beobachtet worden, wenn das Ende das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträngigen Struktur ist. A 'specific increase the stability of the inventive oligoribo nucleotide has been observed when the end is the 3' end of a strand of the double-stranded structure.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal wird die Effektivi tät des Verfahrens erhöht, wenn zumindest ein weiteres, vor zugsweise nach den vorangegangenen Merkmalen ausgebildetes, Oligoribonukleotid in die Zelle eingeführt wird, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der doppel strängigen Struktur des Oligoribonukleotids komplementär zu einem ersten Bereich des Zielgens ist, und wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt des Strangs der doppelsträngigen Struktur des weiteren Oligoribonukleotids komplementär zu ei nem zweiten Bereich des Zielgens ist. According to a further embodiment feature, the Effektivi is ty increased if at least one further, formed preferably added after the previous features, oligoribonucleotide is introduced into the cell of the method, wherein one strand or at least a portion of the strand of the double-stranded structure of the oligoribonucleotide complementary to a is the first region of the target gene, and wherein one strand or at least a portion of the strand of the double-stranded structure further oligoribonucleotide complementary to ei nem second region of the target gene. Die Hemmung der Expres sion des Zielgens ist in diesem Fall deutlich gesteigert. Inhibition of Expres sion of the target gene is significantly increased in this case.

Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, wenn das weitere Oligoribonukleotid eine doppelsträngige, aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur auf weist. It has further proved to be advantageous if the further oligoribonucleotide has a double formed from at least 49 successive nucleotide structure. Nach einem weiteren besonders bevorzugten Ausgestal tungsmerkmal kann das Oligoribonukleotid und/oder das weitere Oligoribonukleotid eine doppelsträngige aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur auf weisen. According to another particularly preferred characteristic, the oligoribonucleotide Ausgestal processing and / or the further oligoribonucleotide may have a double of less than 25 successive nucleotide structure formed.

Der erste und der zweite Bereich können abschnittsweise über lappen, aneinandergrenzen oder auch voneinander beabstandet sein. The first and second regions may partially overlap each other, adjacent to each other or be spaced apart from each other.

Die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide können dann beson ders einfach in die Zelle eingeschleust werden, wenn sie in micellare Strukturen, vorteilhafterweise in Liposomen, einge schlossen werden. The oligoribonucleotides according to the invention can then special DERS easily be introduced into the cell when they are in micellar structures, most advantageously in liposomes is closed. Es ist auch möglich das/die Oligoribonu kleotid/e in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen einzuschließen. It is also possible that / the Oligoribonu kleotid / e in viral natural capsid or in prepared chemically or enzymatically produced artificial capsids or structures derived therefrom include.

Das Zielgen kann nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal eine der in dem anhängenden Sequenzprotokoll wiedergegebenen Sequenzen SQ001-SQ140 aufweisen. The target gene may comprise according to a further embodiment feature of a reproduced in the attached sequence protocol sequences SQ001-SQ140. Es kann auch aus der fol genden Gruppe ausgewählt sein: Onkogen, Cytokin-Gen, Id- Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen. It can also be selected from the fol lowing group: oncogene, cytokine gene, Id-protein gene, development gene, prion gene.

Das Zielgen wird zweckmäßigerweise in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmodien, exprimiert. The target gene is expressed conveniently in pathogenic organisms, preferably in plasmodia. Es kann Bestandteil eines Virus oder Viroids, insbesondere eines humanpathogenen Virus oder Viroids, sein. It may be part of a virus or viroid, particularly a human pathogenic virus or viroid. Das Virus oder Viroid kann auch ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid sein. The virus or viroid can also be an animal or plant pathogenic virus or viroid.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist vorgesehen, dass die ungepaarten Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substituiert sind. According to a further embodiment feature is envisaged that the unpaired nucleotides are substituted by nucleoside thiophosphates.

Die doppelsträngige Struktur der erfindungsgemäßen Oligoribo nukleotide kann weiter durch eine chemische Verknüpfung der beiden Stränge stabilisiert werden. The double-stranded structure of the inventive oligoribo nucleotides can be further stabilized by chemical linkage of the two strands. Die chemische Verknüpfung kann durch eine kovalente oder ionische Bindung, eine Wasser stoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswechselwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet werden. The chemical linkage may be through a covalent or ionic bond, a hydrogen bonding of water, hydrophobic interactions, preferably van-der-Waals or stacking interactions, or may be formed by metal-ion coordination. Es hat sich weiter als zweckmäßig und die Stabilität erhöhend erwiesen, wenn die chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe der beiden Enden des erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids gebildet ist. It has further proved to be expedient and the stability-increasing, when the chemical linkage in the vicinity of one or formed in the vicinity of the two ends of the oligoribonucleotide according to the invention. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen hinsicht lich der chemischen Verknüpfung können den Merkmalen der An sprüche 23 bis 29 entnommen werden, ohne dass es dafür einer näheren Erläuterung bedarf. Further advantageous embodiments respects Lich the chemical linkage may be claims 23 to 29 taken from the characteristics of An, without the need for any further explanation.

Zum Transport des/der erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids/e hat es sich ferner als vorteilhaft erwiesen, dass diese an mindestens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebun den, damit assoziiert oder davon umgeben werden. For transporting the / the oligoribonucleotide / e according to the invention it has further proved to be advantageous in that they are surrounded on at least one derived from a virus, is derived or a synthetic viral coat protein TIALLY to, associated with, or thereof. Das Hüllpro tein kann vom Polyomavirus abgeleitet sein. The Hüllpro ton may be derived from polyomavirus. Das Hüllprotein kann insbesondere das Virus-Protein 1 und/oder das Virus- Protein 2 des Polyomavirus enthalten. The coat protein may contain, in particular, the virus protein 1 and / or Virus Protein 2 of the polyoma virus. Nach einer weiteren Ausgestaltung ist vorgesehen, dass bei Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem Hüllprotein die eine Sei te zum Inneren des Kapsids oder kapsidartigen Gebildes ge wandt ist. In a further embodiment it is provided that upon formation of a capsid or capsid-like structure from the coat protein is a te Be to the interior of the capsid or capsid-like structure ge Wandt. Ferner ist es von Vorteil, dass das/die Oligoribo nukleotid/e zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist/sind. Further, it is advantageous that the / the oligoribo nucleotide / e is complementary to the primary or processed RNA transcript of the target gene / are. Die Zelle kann eine Ver tebratenzelle oder eine menschliche Zelle sein. The cell can tebratenzelle a United or a human cell.

Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung eines Oligoribo nukleotids zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle vorgesehen, wobei das Oligoribonukleotid eine doppel strängige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaa ren gebildete Struktur aufweist, wobei ein Strang oder zumin dest ein Abschnitt des Strangs der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist, in Kombination mit einer vorherigen Behandlung der Zelle mit Interferon. According to the invention the use of oligoribo is further nucleotide are provided for inhibiting the expression of a target gene in a cell, wherein the oligoribonucleotide a double-stranded from more than 49 consecutive Nukleotidpaa ren structure formed, wherein one strand or at a portion of the strand of the double-stranded structure least complementary to the is the target gene, in combination with a prior treatment of the cell with interferon. Hinsichtlich der Vorteile und der vorteilhaften Ausgestaltungen wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. With regard to the advantages and the advantageous embodiments, reference is made to the previous versions.

Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird die Aufgabe außerdem gelöst durch einen Kit mit mindestens einem Oligoribonukleo tid mit einer doppelsträngigen aus höchstens 49 aufeinander folgenden Nukleotidpaaren gebildeten Struktur, wobei ein Strang oder zumindest ein Abschnitt eines Strangs der doppel strängigen Struktur komplementär zum Zielgen ist, und Inter feron. In further accordance with the invention, the object is also solved by a kit comprising at least one Oligoribonukleo tid formed with a double of a maximum of 49 successive nucleotide structure, wherein one strand or at least a portion of one strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene, and Inter feron. Hinsichtlich der Vorteile und der vorteilhaften Ausge staltungen wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwie sen. With regard to the advantages and the advantageous Starting staltungen is verwie to the previous versions sen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen bei spielhaft erläutert. The invention is explained below with reference to the drawings, in way of example. Es zeigen: Show it:

Fig. 1a - c schematisch ein erstes, zweites und drittes Oligoribonukleotid und Fig. 1a - c shows schematically a first, second and third oligoribonucleotide and

Fig. 2 schematisch ein Zielgen. Fig. 2 shows schematically a target gene.

Die in den Fig. 1a bis c gezeigten Oligoribonukleotide dsRNA I, dsRNA II und dsRNA III weisen jeweils ein erstes Ende E1 und ein zweites Ende E2 auf. The oligoribonucleotides shown in Figs. 1a to c dsRNA I, II and dsRNA dsRNA III each have a first end E1 and a second end E2. Das erste Oligoribonukleotid dsRNA I und das dritte Oligoribonukleotid dsRNA III weisen an ihren Enden E1 und E2 einzelsträngige aus etwa 1 bis 4 unge paarten Nukleotiden gebildete Abschnitte auf. The first oligoribonucleotide dsRNA I and third III dsRNA oligoribonucleotide have at their ends E1 and E2 single from about 1 to 4 unge paired nucleotides portions formed on. Beim zweiten Oligoribonukleotid dsRNA II handelt es sich um ein langes Oligoribonukleotid mit mehr als 49 Nukleotidpaaren. In the second oligoribonucleotide dsRNA II is a long oligoribonucleotide having more than 49 nucleotide pairs.

In Fig. 2 ist schematisch ein auf einer DNA befindliches Zielgen gezeigt. In FIG. 2, a befindliches on a target gene DNA is shown schematically. Das Zielgen ist durch einen schwarzen Balken kenntlich gemacht. The target gene is indicated by a black bar. Es weist einen ersten Bereich B1, einen zweiten Bereich B2 und einen dritten Bereich B3 auf. It has a first portion B1, a second section B2 and a third region B3.

Jeweils ein Strang S1, S2 und S3 des ersten dsRNA I, zweiten dsRNA II und dritten Oligoribonukleotids dsRNA III ist kom plementär zum entsprechenden Bereich B1, B2 und B3 auf dem Zielgen. Each one strand S1, S2 and S3 of the first dsRNA I, second II and third dsRNA dsRNA oligoribonucleotide III is com plement to the corresponding region B1, B2 and B3 on the target gene.

Die Expression des Zielgens wird dann besonders wirkungsvoll gehemmt, wenn die kurzkettigen ersten dsRNA I und dritten Oligoribonukleotide dsRNA III an ihren Enden E1, E2 einzel strängige Abschnitte aufweisen. The expression of the target gene is inhibited then particularly effective when the short chain dsRNA having first I and third III oligoribonucleotides dsRNA at their ends E1, E2 single-stranded portions. Die einzelsträngigen Ab schnitte können sowohl am Strang S1, S3 als auch am Ge genstrang oder am Strang S1, S3 und am Gegenstrang ausgebil det sein. The single from sections may be ausgebil det both on the line S1, S3 and at the Ge gens trang or on the line S1, S3, and on the opposite strand. Es hat sich weiter gezeigt, dass ab einer bestimm ten Länge der Oligoribonukleotide, z. It has also been found that from a limited hours th length of the oligoribonucleotides such. B. ab einer Länge von mehr als 49 Nukleotidpaaren, eine einzelsträngige Ausbildung der Enden E1, E2 weniger stark zur Unterdrückung der Expres sion des Zielgens beiträgt. B. from a length of more than 49 nucleotide pairs, a single-stranded form of the ends E1, E2 less for suppressing the Expres sion of the target gene contributes. Bei langen Oligoribonukleotiden, hier beim zweiten Oligoribonukleotid dsRNA II, ist eine ein zelsträngige Ausbildung an den Enden E1, E2 nicht unbedingt erforderlich. For long oligoribonucleotides, oligoribonucleotide here the second dsRNA II, a one-stranded form at the ends E1, E2 is not necessarily required.

Die Bereiche B1, B2 und B3 können, wie in Fig. 2 gezeigt, von einander beabstandet sein. The areas B1, B2 and B3, as shown in Fig. 2, may be spaced from each other. Sie können aber auch an einander grenzen oder überlappen. but you can also border on each other or overlap.

Im Falle der einzelsträngigen Ausbildung der Enden E1, E2 sind alle denkbaren Permutationen möglich, dh es können ein Ende oder beide Enden des Strangs S1, S2, S3 oder ein Ende oder beide Enden des Gegenstrangs überstehen. In the case of the single-stranded form of the ends E1, E2, all conceivable permutations are possible, ie able to withstand one end or both ends of the strand S1, S2, S3 or one end or both ends of the opposite strand. Der einzel strängige Abschnitt kann 1 bis 4 gepaarte Nukleotide aufwei sen. The single stranded portion may sen 1 to 4 paired nucleotides aufwei. Es ist auch möglich, dass ein Ende oder beide Enden E1, E2 mindestens ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleo tidpaar aufweisen. It is also possible that one end or both ends E1, E2 have at least one unpaired by Watson & Crick nucleo tidpaar.

Soweit es sich bei der vorliegenden Erfindung um menschliche Zellen handelt, sind menschliche embryonale Stammzellen oder menschliche Keimzellen ausgeschlossen. As far as in the present invention are human cells, human embryonic stem cells or human germ cells are excluded.

Ausführungsbeispiel embodiment

Es wurden Fibroblasten mit Interferon-γ vorbehandelt. There were pre-treated fibroblasts with interferon-γ. An schließend wurden aus Sequenzen des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) der Alge Aequoria victoria abgeleitete doppel strängige RNAs (dsRNAs) zusammen mit dem GFP-Gen in Fibrobla sten mikroinjiziert. At closing of the alga Aequoria victoria were derived double-stranded RNAs (dsRNAs) together with the GFP gene microinjected into Fibrobla most of sequences of the green fluorescent protein (GFP). Schließlich wurde die Fluoreszenzabnahme gegenüber Zellen ohne dsRNA ausgewertet. Finally, the decrease in fluorescence was evaluated against cells without dsRNA.

Versuchsprotokoll experimental protocol

Mittels eines RNA-Synthesizer (Typ Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlicher che mischer Verfahren wurden die aus den Sequenzprotokollen SQ141 und SQ142 ersichtlichen RNA-Einzelstränge und die zu ihnen komplementären Einzelstränge synthetisiert. By means of an RNA synthesizer (Expedite 8909 type, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) and conventional mixers che methods have been synthesized shown in these protocols sequence SQ141 and SQ142 RNA single strands and complementary to them, single strands. Die Hybridisie rung der komplementären Einzelstränge zum Doppelstrang er folgte durch Aufheizen des stöchiometrischen Gemischs der Einzelstränge in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 100 mM NaCl, auf 90°C und nachfolgendes langsames Abkühlen über 6 Stunden auf Raumtemperatur. The hybridization tion of the complementary single strands of the double strand, it was followed by heating the stoichiometric mixture of the single strands in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8, 100 mM NaCl, at 90 ° C and subsequent slow cooling over 6 hours at room temperature. Anschließend erfolgte Reinigung mit Hilfe der HPLC. Cleaning followed by using HPLC.

Als Testsystem für diese in vivo-Experimente diente die muri ne Fibroblasten-Zellinie NIH/3T3. As a test system for these in vivo experiments the muri ne fibroblast cell line NIH / 3T3 served. Mit Hilfe der Mikroinjekti on wurde das GFP-Gen in die Zellen eingebracht. With the help of Mikroinjekti on the GFP gene was introduced into the cells. Die Expressi on des GFP in mit Interferon-γ vorbehandelten Zellen wurde unter dem Einfluß gleichzeitig mittransfizierter sequenzhomo loger dsRNA untersucht. The Expressi on the GFP in interferon-γ-pretreated cells was simultaneously mittransfizierter under the influence of sequence homo loger dsRNA examined. Die Auswertung unter dem Fluoreszenz mikroskop erfolgte 3 Stunden nach Injektion anhand der grünen Fluoreszenz des gebildeten GFP. The evaluation was carried out under the fluorescence microscope 3 hours after injection using the green fluorescence of GFP formed.

Vorbereitung der Zellkulturen Preparation of cell cultures

Die Zellen wurden in DMEM mit 4,5 g/l Glucose, 10% fötalem Rinderserum unter 7,5% CO 2 -Atmosphäre bei 37°C in Kultur schalen inkubiert und vor Erreichen der Konfluenz passagiert. The cells were incubated dishes in DMEM with 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum under 7.5% CO 2 atmosphere at 37 ° C in culture and passaged prior to reaching confluence. Das Ablösen der Zellen erfolgte mit Trypsin/EDTA. The detachment of the cells was performed with trypsin / EDTA. Zur Vorbe reitung der Mikroinjektion wurden die Zellen in Petrischalen überführt und bis zu Bildung von Mikrokolonien weiter inku biert. For Vorbe microinjection reitung the cells were transferred into Petri dishes and to form microcolonies further biert INKU. Anschließend wurde murines Interferon-γ (mIFN-γ) in einer Konzentration von 500 IU/ml zugegeben. Subsequently, murine interferon-γ (mIFN-γ) at a concentration of 500 IU / ml was added. Nach 20 Minuten wurde das Interferon-haltige Medium durch Interferon-freies Medium ausgetauscht. After 20 minutes, the interferon-containing medium was replaced with interferon-free medium. Die Mikroinjektion wurde nach weiteren 20 Minuten durchgeführt. Microinjection was carried out after a further 20 minutes.

Mikroinjektion microinjection

Die Kulturschalen wurde zur Mikroinjektion für ca. 10 Minuten aus dem Inkubator genommen. The culture dishes were taken for microinjection for about 10 minutes from the incubator. Es wurde in ca. 50 Zellen pro An satz innerhalb eines markierten Bereiches unter Verwendung des Mikroinjektionssystems FemtoJet der Firma Eppendorf, Deutschland, einzeln injiziert. It was in about 50 cells per set to within a marked area using the microinjection system FemtoJet Eppendorf, Germany, injected separately. Anschließend wurden die Zel len weitere drei Stunden inkubiert. Then the Zel len were incubated for an additional three hours. Für die Mikroinjektion wurden Borosilikat-Glaskapillaren der Firma Eppendorf mit ei nem Spitzeninnendurchmesser von 0,5 µm verwendet. For microinjection, borosilicate glass capillaries Eppendorf were used with egg nem tip inner diameter of 0.5 microns. Die Mikro injektion wurde mit dem Mikromanipulator 5171 der Firma Ep pendorf durchgeführt. The micro-injection was carried out with the micro Pendorf 5171 the company Ep. Die Injektionsdauer betrug 0,8 Sekun den, der Druck ca. 80 hPa. Die in die Zellkerne injizierten Proben enthielten 0,01 µg/µl pGFP-C1 (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, Deutschland) sowie an Dextran-70000 gekop peltes Texas-Rot in 14 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM KPO 4 , pH 7,5. The injection time was 0.8-seconds, the pressure of about 80 hPa. The injected into the nuclei samples contained 0.01 ug / ul pGFP-C1 (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, Germany) and peltes to dextran-Texas 70000 gekop red in 14 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM KPO 4, pH 7.5. Zusätzlich wurden in ca. 100 pl folgende dsRNAs zugegeben: Ansatz 1: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ141); Additionally, the following dsRNAs were added in 100 pl: Approach 1: 10 .mu.M dsRNA (Sequence Listing SQ141); Ansatz 2: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ142); Approach 2: 10 .mu.M dsRNA (Sequence Listing SQ142); Ansatz 3: 10 µM dsRNA (Se quenzprotokoll SQ141; mit Interferon vorinkubierte Zellen); Approach 3: 10 .mu.M dsRNA (Se quenzprotokoll SQ141; interferon preincubated cells); Ansatz 4: 10 µM dsRNA (Sequenzprotokoll SQ142; mit Interferon vorinkubierte Zellen); Run 4: 10 .mu.M dsRNA (sequence SQ142 protocol; interferon preincubated cells); Ansatz 5: ohne dsRNA (mit Interferon vorinkubierte Zellen). Approach 5: dsRNA without (pre-incubated with interferon cells).

Die Zellen wurden bei Anregung mit Licht der Anregungswellen länge von Texas-Rot, 568 nm, bzw. von GFP, 513 nm, mittels eines Fluoreszenzmikroskops untersucht. The cells were examined upon excitation with light of the excitation wave length of Texas red, 568 nm, or of GFP, 513 nm, using a fluorescence microscope. Die Fluoreszenz aller Zellen im Gesichtsfeld wurde bestimmt und in Relation zur Zelldichte (ausgedrückt durch deren Gesamtproteinkonzentrati on) gesetzt. The fluorescence of all cells in the visual field was determined, and in relation to cell density (expressed by their Gesamtproteinkonzentrati on) are set.

Ergebnis und Schlußfolgerung Result and Conclusion

Bei beiden dsRNAs konnte bei vorangegangener Inkubation der Zellen mit Interferon-γ ein deutlich stärkerer hemmender Ef fekt auf die Expression des GFP-Gens in Fibroblasten beobach tet werden als bei den nicht mit Interferon behandelten Zel len (Tabelle 1). In both dsRNAs with previous incubation of the cells with interferon-γ was a significantly greater inhibitory ef fect on the expression of the GFP gene in fibroblasts are obser tet than the not treated with interferon cell h len (Table 1). Darüber hinaus war bei vorbehandelten Zellen bereits bei einer Konzentration von 10 µM eine Hemmung der Genexpression zu erreichen, was ohne Vorbehandlung nicht mög lich war. In addition, inhibition of gene expression could be reached, which was not possible, please include without pretreatment in pretreated cells even at a concentration of 10 uM. Auch eine geringfügige Hemmung der Genexpression durch Interferon allein wurde beobachtet, die allerdings nicht Gen-spezifisch ist. Even a slight inhibition of gene expression by interferon alone was observed that is not gene-specific, however.

Die vor der Applikation von dsRNAs durchgeführte Behandlung mit Interferon-γ ermöglicht somit eine stärkere Hemmung der Genexpression in Säugerzellen bereits bei niedrigeren Konzen trationen als dies nur mit dsRNA allein erreichbar ist. The front of the application carried out by dsRNA treatment with interferon-γ thus enables a greater inhibition of gene expression in mammalian cells at lower concentrations Konzen than is accessible only by dsRNA alone.

Tabelle 1 Table 1

Die Symbole geben den relativen Anteil an nicht oder schwach fluoreszierende Zellen an (+++ < 90%; ++ 60-90%; + 30-60%; - < 10%) The symbols do not indicate the relative portion of or weakly fluorescent cells (+++ <90%; 60-90% ++; 30-60% + - <10%)

Literatur literature

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Claims (99)

  1. 1. Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle umfassend die folgenden Schritte: 1. A method for inhibiting the expression of a target gene in a cell comprising the steps of:
    Einführen mindestens eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) in einer zur Hemmung der Expression des Zielgens ausreichenden Menge, Introducing at least one oligoribonucleotide (dsRNA I) in an amount sufficient to inhibit expression of the target gene amount
    wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebil dete Struktur aufweist, und wobei ein Strang (S1) oder zumin dest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur komplementär zum Zielgen ist, wherein the oligoribonucleotide (dsRNA I) having a double of a maximum of 49 successive nucleotide gebil finished structure, and wherein one strand (S1) or at a portion of the strand (S1) least the double-stranded structure is complementary to the target gene is
    wobei vor dem Einführen des Oligoribonukleotids die Zelle mit Interferon behandelt wird. wherein the cell is treated with interferon prior to insertion of the oligoribonucleotide.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Ende (E1) des Oligoribonukleotids (dsRNA I) zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleotid aufweist. 2. The method of claim 1, wherein at least one end (E1) of the oligoribonucleotide (dsRNA I) has at least one unpaired by Watson & Crick nucleotide.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ende (E1) einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Ab schnitt aufweist. includes 3. The method of claim 1 or 2, wherein the end (E1) cut from a single-stranded formed from 1 to 4 nucleotides.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ende (E1) ungepaarte Nukleotide aufweist. 4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the end (E1) unpaired nucleotides.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ende (E1) das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträngigen Struktur ist. 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the end (E1) is the 3 'end of a strand of the double-stranded structure.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein weiteres, vorzugsweise nach einem der vorherge henden Ansprüche 2-5 ausgebildetes, Oligoribonukleotid (dsRNA II) in die Zelle eingeführt wird, 6. The method according to any one of the preceding claims, wherein at least one further, preferably in the form of any of vorherge Henden claims 2-5, oligoribonucleotide (dsRNA II) is introduced into the cell,
    wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur des Oligoribonu kleotids (dsRNA I) komplementär zu einem ersten Bereich (B1) des Zielgens ist, wherein one strand (S1) or at least a portion of the strand (S1) is the double-stranded structure of the Oligoribonu kleotids (dsRNA I) complementary to a first region (B1) of the target gene,
    und wobei ein Strang (S2) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S2) der doppelsträngigen Struktur des weiteren Oli goribonukleotids (dsRNA II) komplementär zu einem zweiten Be reich (B2) des Zielgens ist. and wherein one strand (S2) or at least a portion of the strand (S2) of the double-stranded structure further Oli goribonukleotids (dsRNA II) complementary to a second Be rich (B2) of the target gene.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das weitere Oligoribonukleotid (dsRNA II) eine doppelsträngi ge aus mindestens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren ge bildete Struktur aufweist. 7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the further oligoribonucleotide (dsRNA II) having a doppelsträngi ge formed from at least 49 successive nucleotide ge structure.
  8. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) und/oder das weitere Oligo ribonukleotid (dsRNA II) eine doppelsträngige aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweist/en. 8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the oligoribonucleotide (dsRNA I) and / or the further oligo ribonucleotide (dsRNA II) having a double-stranded from less than 25 successive nucleotide structure formed / s.
  9. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste (B1) und der zweite Bereich (B2) abschnittsweise überlappen oder aneinandergrenzen. 9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (B1) and the second region (B2) overlap segmentally or adjoin each other.
  10. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste (B1) und der zweite Bereich (B2) voneinander beab standet sind. 10. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (B1) and the second region (B2) from each other are beab standet.
  11. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in micellare Strukturen, vorzugsweise in Liposomen, eingeschlossen wird/werden. 11. The method according to any one of the preceding claims, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is enclosed in micellar structures, preferably in liposomes, included / are.
  12. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen wird/werden. 12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is enclosed in viral natural capsid or in prepared chemically or enzymatically produced artificial capsids or structures derived therefrom / are.
  13. 13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielgen eine der Sequenzen SQ001 bis SQ140 des Sequenzprotokolls aufweist. 13. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target gene comprises one of the sequences SQ001 to SQ140 of the Sequence Listing.
  14. 14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielgen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Onkogen, Cytokin-Gen, Id-Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen. 14. A method according to any one of the preceding claims, wherein the target gene is selected from the following group: oncogene, cytokine gene, Id-protein gene, development gene, prion gene.
  15. 15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielgen in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmo dien, exprimiert wird. 15. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target gene is expressed in pathogenic organisms, preferably in Plasmo diene.
  16. 16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielgen Bestandteil eines Virus oder Viroids ist. 16. The method according to any one of the preceding claims, wherein the target gene is part of a virus or viroid.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Virus ein humanpa thogenes Virus oder Viroid ist. 17. The method of claim 16, wherein the virus is a virus or viroid humanpa thogenes.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Virus oder Viroid ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid ist. 18. The method according to claim 17, wherein the virus or viroid is a animal or plant pathogenic virus or viroid.
  19. 19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ungepaarte Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substitu iert sind. 19. A method according to any one of the preceding claims, wherein unpaired nucleotides are substitu ated by nucleoside thiophosphates.
  20. 20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die doppelsträngige Struktur durch eine chemische Verknüpfung der beiden Stränge stabilisiert wird. 20. The method according to any one of the preceding claims, wherein the double-stranded structure is stabilized by chemical linkage of the two strands.
  21. 21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung durch eine kovalente oder ionische Bindung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechsel wirkungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswech selwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet wird. 21. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage by a covalent or ionic bond, a hydrogen bond, hydrophobic effects changes, preferably van-der-Waals or Stapelungswech selwirkungen, or is formed by metal-ion coordination.
  22. 22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe der beiden Enden (E1, E2) gebildet ist. 22. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage near the one or near the two ends (E1, E2) is formed.
  23. 23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbin dungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vor zugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propandiol)- und/oder Polyethylenglycol-Ketten sind. 23. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage is formed by one or more groups Verbin dung, wherein the compound groups preferably before poly (oxyphosphinicooxy-1,3-propanediol) - and / or polyethylene glycol chains.
  24. 24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung durch Purinanaloga gebildet wird. 24. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage is formed by purine analogs.
  25. 25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung durch Azabenzoleinheiten gebildet wird. 25. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage is formed by azabenzene units.
  26. 26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung durch anstelle von Nukleotiden be nutzte verzweigte Nukleotidanaloga gebildet wird. 26. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage is formed by, instead of nucleotides be used branched nucleotide analogs.
  27. 27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylenblau; 27. The method according to any one of the preceding claims, wherein for generating the chemical linkage at least one of the following groups is used: methylene blue; bifunktio nelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; bifunktio nelle groups, preferably bis (2-chloroethyl) -amine; N- acetyl-N'-(p-glyoxyl-benzoyl)-cystamin; N- acetyl-N '- (p-glyoxyl-benzoyl) -cystamine; 4-Thiouracil; 4-thiouracil; Psora len. Psora len.
  28. 28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1, E2) des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thiophosphoryl- Gruppen gebildet wird. 28. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage attached by in the vicinity of the ends (E1, E2) of the double-stranded region thiophosphoryl groups is formed.
  29. 29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1, E2) befindliche Tripelhelix-Bindungen hergestellt wird. 29. The method according to any one of the preceding claims, wherein the chemical linkage is generated by in the vicinity of the ends (E1, E2) triple-helix bonds is prepared.
  30. 30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) an minde stens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden, damit assoziiert oder davon umgeben wird/werden. are 30. A method according to any one of the preceding claims, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) least originating at minde a of a virus bound derived therefrom or a synthetic viral coat protein, associated with, or surrounded by it is / ,
  31. 31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hüllprotein vom Polyomavirus abgeleitet ist. 31. A method according to any one of the preceding claims, wherein the coat protein is derived from polyomavirus.
  32. 32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus- Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthält. 32. The method according to any one of the preceding claims, wherein the coat protein contains the virus protein 1 (VP1) and / or the virus protein 2 (VP2) of the polyomavirus.
  33. 33. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem Hüllprotein die eine Seite zum Inneren des Kapsids oder kap sidartigen Gebildes gewandt ist. 33. The method according to any one of the preceding claims, wherein at the formation of a capsid or capsid-like structure from the coat protein, which faces a side toward the interior of the capsid or kap sidartigen structure.
  34. 34. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist/sind. 34. The method according to any one of the preceding claims, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is complementary to the primary or processed RNA transcript of the target gene / are.
  35. 35. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine Vertebratenzelle oder eine menschliche Zelle ist. 35. The method according to any one of the preceding claims, wherein the cell is a vertebrate cell or a human cell.
  36. 36. Verwendung eines Oligoribonukleotids (dsRNA I) zur Hem mung der Expression eines Zielgens in einer Zelle, wobei das Oligoribonukleotid (dsRNA I) eine doppelsträngige aus höch stens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweist, wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) des doppelsträngigen Bereichs kom plementär zum Zielgen ist, in Kombination mit einer vorheri gen Behandlung der Zelle mit Interferon. 36. Use of an oligoribonucleotide (dsRNA I) for Hem mung expression of a target gene in a cell, wherein the oligoribonucleotide (dsRNA I) double-stranded having from Hoch least 49 successive nucleotide structure formed wherein one strand (S1) or at least a portion of the strand (S1) of the double-stranded region com plement to the target gene is, in combination with a gene vorheri treating the cell with interferon.
  37. 37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei zumindest ein Ende (E1) des Oligoribonukleotids (dsRNA I) zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleotid aufweist. 37. Use according to claim 36, wherein at least one end (E1) of the oligoribonucleotide (dsRNA I) has at least one unpaired by Watson & Crick nucleotide.
  38. 38. Verwendung nach Anspruch 36, wobei das Ende (E1) einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Abschnitt aufweist. 38. Use according to claim 36, wherein the end (E1) has a formed from 1 to 4 nucleotides single-stranded portion.
  39. 39. Verwendung nach einem der Ansprüche 37 oder 38, wobei das Ende (E1) ungepaarte Nukleotide aufweist. 39. Use according to any one of claims 37 or 38, wherein the end (E1) unpaired nucleotides.
  40. 40. Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei das Ende (E1) das 3'-Ende eines Strangs der doppelsträngigen Struktur ist. 37 to 39, wherein the end (E1) is 40. Use according to any one of claims 3 'end of a strand of the double-stranded structure.
  41. 41. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 40, wobei zu mindest ein weiteres, vorzugsweise nach einem der vorherge henden Ansprüche ausgebildetes, Oligoribonukleotid (dsRNA II) in die Zelle eingeführt wird, wobei ein Strang (S1) oder zu mindest ein Abschnitt des Strangs (S1) des doppelsträngigen Bereichs des Oligoribonukleotids komplementär zu einem ersten Bereich (B1) des Zielgens ist, und wobei ein Strang (S2) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S2) des doppelsträngigen Bereichs des weiteren Oligoribonukleotids (dsRNA II) komple mentär zu einem zweiten Bereich (B2) des Zielgens ist. 41. Use according to any one of claims 36 to 40, wherein at least another, preferably in the form of any one of claims vorherge Henden, oligoribonucleotide (dsRNA II) is introduced into the cell, where one strand (S1) or at least a portion of the strand (S1) of the double-stranded region of the oligoribonucleotide complementary to a first region (B1) of the target gene, and wherein one strand (S2) or at least a portion of the strand (S2) of the double-stranded region of the further oligoribonucleotide (dsRNA II) the general partner to a second region (B2) of the target gene.
  42. 42. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 41, wobei das weitere Oligoribonukleotid eine doppelsträngige aus minde stens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweist. 42. Use according to any one of claims 36 to 41, wherein the further minde oligoribonucleotide having a double-stranded from least 49 successive nucleotide structure formed.
  43. 43. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 42, wobei das Oligoribonukleotid und/oder das weitere Oligoribonukleotid eine doppelsträngige aus weniger als 25 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren gebildete Struktur aufweist/en. 43. Use according to one of claims 36 to 42, wherein the oligoribonucleotide and / or the further oligoribonucleotide having a double-stranded formed from less than 25 successive nucleotide structure / s.
  44. 44. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 43, wobei der erste (B1) und der zweite Bereich (B2) abschnittsweise über lappen oder aneinandergrenzen. 44. Use according to any one of claims 36 to 43, wherein the first (B1) and the second region (B2) in sections adjacent to each other or overlap.
  45. 45. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 44, wobei der erste (B1) und der zweite Bereich (B2) voneinander beabstan det sind. 45. Use according to any one of claims 36 to 44, wherein the first (B1) and the second region (B2) are beabstan det each other.
  46. 46. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 45, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in micellare Strukturen, vorzugsweise in Liposomen, eingeschlossen wird/werden. 46. ​​Use according to one of claims 36 to 45, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is enclosed in micellar structures, preferably in liposomes, included / are.
  47. 47. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 46, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen wird/werden. 47. Use according to one of claims 36 to 46, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is enclosed in viral natural capsid or in prepared chemically or enzymatically produced artificial capsids or structures derived therefrom / are.
  48. 48. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 47, wobei das Zielgen eine der Sequenzen SQ001 bis SQ140 des Sequenzprotokolls aufweist. 48. Use according to one of claims 36 to 47, wherein the target gene comprises one of the sequences SQ001 to SQ140 of the Sequence Listing.
  49. 49. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 48, wobei das Zielgen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Onkogen, Cytokin-Gen, Id-Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen. 49. Use according to one of claims 36 to 48, wherein the target gene is selected from the following group: oncogene, cytokine gene, Id-protein gene, development gene, prion gene.
  50. 50. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 49, wobei das Zielgen in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmodien, exprimiert wird. 50. Use according to any one of claims 36 to 49, wherein the target gene is expressed in pathogenic organisms, preferably in plasmodia.
  51. 51. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 50, wobei das Zielgen Bestandteil eines Virus oder Viroids ist. 51. Use according to one of claims 36 to 50, wherein the target gene is part of a virus or viroid.
  52. 52. Verwendung nach Anspruch 51, wobei das Virus ein hu manpathogenes Virus oder Viroid ist. 52. Use according to claim 51, wherein the virus is a virus or viroid hu manpathogenes.
  53. 53. Verwendung nach Anspruch 52, wobei das Virus oder Viroid ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid ist. 53. Use according to claim 52, wherein the virus or viroid is a animal or plant pathogenic virus or viroid.
  54. 54. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 53, wobei un gepaarte Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substituiert sind. 54. Use according to one of claims 36 to 53, wherein un-paired nucleotides are substituted by nucleoside thiophosphates.
  55. 55. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 54, wobei die doppelsträngige Struktur durch eine chemische Verknüpfung der beiden Stränge stabilisiert wird. 55. Use according to one of claims 36 to 54, wherein the double-stranded structure is stabilized by chemical linkage of the two strands.
  56. 56. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 55, wobei die chemische Verknüpfung durch eine kovalente oder ionische Bin dung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwir kungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswechsel wirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet wird. 56. Use according to one of claims 36 to 55, wherein the chemical linkage by a covalent or ionic Bin dung, a hydrogen bond, hydrophobic interactions diseases, preferably van-der-Waals or Stapelungswechsel effects, or is formed by metal-ion coordination.
  57. 57. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 56, wobei die chemische Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe der beiden Enden (E1, E2) gebildet ist. 57. Use according to one of claims 36 to 56, wherein the chemical linkage near the one or near the two ends (E1, E2) is formed.
  58. 58. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 57, wobei die chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbin dungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vor zugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propandiol)- und/oder Polyethylenglycol-Ketten sind. 58. Use according to one of claims 36 to 57, wherein the chemical linkage is created by one or more groups dung Verbin, wherein the compound groups preferably before poly (oxyphosphinicooxy-1,3-propanediol) - and / or polyethylene glycol chains.
  59. 59. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 58, wobei die chemische Verknüpfung durch Purinanaloga gebildet ist. 59. Use according to one of claims 36 to 58, wherein the chemical linkage is formed by purine analogs.
  60. 60. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 59, wobei die chemische Verknüpfung durch Azabenzoleinheiten gebildet ist. 60. Use according to one of claims 36 to 59, wherein the chemical linkage is formed by azabenzene units.
  61. 61. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 60, wobei die chemische Verknüpfung durch anstelle von Nukleotiden benutzte verzweigte Nukleotidanaloga gebildet ist. 61. Use according to one of claims 36 to 60, wherein the chemical linkage is used instead of nucleotides by branched nucleotide is formed.
  62. 62. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 61, wobei zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylenblau; 62. Use according to one of claims 36 to 61, wherein for generating the chemical linkage at least one of the following groups is used: methylene blue; bifunktionelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; bifunctional groups, preferably bis- (2-chloroethyl) -amine; N-acetyl-N'- (p-glyoxyl-benzoyl)-cystamin; N-acetyl-N '(p-glyoxyl-benzoyl) -cystamine; 4-Thiouracil; 4-thiouracil; Psoralen. Psoralen.
  63. 63. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 62, wobei die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden des doppel strängigen Bereichs angebrachte Thiophosphoryl-Gruppen gebil det ist. 63. Use according to one of claims 36 to 62, wherein the chemical linkage is through mounted in the vicinity of the ends of the double-stranded region thiophosphoryl groups gebil det.
  64. 64. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 63, wobei die chemische Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1, E2) befindliche Tripelhelix-Bindungen gebildet ist. 64. Use according to one of claims 36 to 63, wherein the chemical linkage is formed by located in the vicinity of the ends (E1, E2) triple-helix bonds.
  65. 65. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 64, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) an minde stens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden, damit assoziiert oder davon umgeben ist. 65. Use according to any one of claims 36 to 64, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) derived from a virus, is derived or a synthetic viral envelope protein bound to minde least, associated with, or surrounded by, ,
  66. 66. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 65, wobei das Hüllprotein vom Polyomavirus abgeleitet ist. 66. Use according to one of claims 36 to 65, wherein the coat protein is derived from polyomavirus.
  67. 67. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 66, wobei das Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus- Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthält. 67. Use according to one of claims 36 to 66, wherein the coat protein contains the virus protein 1 (VP1) and / or the virus protein 2 (VP2) of the polyomavirus.
  68. 68. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 67, wobei bei Bildung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem Hüllprotein die eine Seite zum Inneren des Kapsids oder kap sidartigen Gebildes gewandt ist. 68. Use according to one of claims 36 to 67, wherein upon formation of a capsid or capsid-like structure from the coat protein, which faces a side toward the interior of the capsid or kap sidartigen structure.
  69. 69. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 68, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist. 69. Use according to one of claims 36 to 68, wherein said / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, II dsRNA) complementary to the primary or processed RNA transcript of the target gene.
  70. 70. Verwendung nach einem der Ansprüche 36 bis 67, wobei die Zelle eine Vertebratenzelle oder eine menschliche Zelle ist. 70. Use according to one of claims 36 to 67, wherein the cell is a vertebrate cell or a human cell.
  71. 71. Kit umfassend mindestens ein Oligoribonukleotid (dsRNA I) mit einer doppelsträngigen aus höchstens 49 aufeinander folgenden Nukleotidpaaren gebildeten Struktur, wobei ein Strang (S1) oder zumindest ein Abschnitt des Strangs (S1) der doppelsträngigen Struktur komplementär zu einem Zielgen ist, und Interferon. 71. Kit comprising at least one oligoribonucleotide (dsRNA I) structure formed to a double of a maximum of 49 successive nucleotide pairs, where one strand (S1) or at least a portion of the strand (S1) of the double-stranded structure is complementary to a target gene, and interferon.
  72. 72. Kit nach Anspruch 71, wobei zumindest ein Ende (E1) des Oligoribonukleotids (dsRNA I) zumindest ein nicht nach Watson & Crick gepaartes Nukleotid aufweist, 72. The kit of claim 71, wherein at least one end (E1) of the oligoribonucleotide (dsRNA I) has at least one unpaired by Watson & Crick nucleotide
  73. 73. Kit nach Anspruch 71 oder 72, wobei das Ende (E1) des Oligoribonukleotids einen aus 1 bis 4 Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Abschnitt aufweist. 73. The kit of claim 71 or 72, wherein the end (E1) of the oligoribonucleotide has a formed from 1 to 4 nucleotides single-stranded portion.
  74. 74. Kit nach einem der Ansprüche 71 und 73, wobei das Ende (E1) des Oligoribonukleotids ungepaarte Nukleotide aufweist. 71 and 73, wherein the end (E1) comprises 74. A kit according to one of the claims of the oligoribonucleotide unpaired nucleotides.
  75. 75. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 74, wobei das Ende (E1) das 3'-Ende eines Strangs oder beider Stränge der dop pelsträngigen Struktur ist. 75. Kit according to any one of claims 71 to 74, wherein the end (E1) the 3 'end of a strand or both strands of the dop-stranded structure.
  76. 76. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 75, wobei das Ziel gen aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Onkogen, Cyto kin-Gen, Id-Protein-Gen, Entwicklungsgen, Priongen. 76. Kit according to any one of claims 71 to 75, wherein the target gene is selected from the following group: oncogene, Cyto kin gene, Id-protein gene, development gene, prion gene.
  77. 77. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 76, wobei das Ziel gen in pathogenen Organismen, vorzugsweise in Plasmodien, ex primiert wird. 77. Kit according to any one of claims 71 to 76, wherein the target gene in pathogenic organisms, preferably, ex primed in plasmodia.
  78. 78. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 77, wobei das Ziel gen Bestandteil eines Virus oder Viroids ist. 78. Kit according to any one of claims 71 to 77, wherein the target gene is part of a virus or viroid.
  79. 79. Kit nach Anspruch 78, wobei das Virus ein humanpathoge nes Virus oder Viroid ist. 79. The kit of claim 78, wherein the virus is a virus or viroid humanpathoge nes.
  80. 80. Kit nach Anspruch 78, wobei das Virus oder Viroid ein tier- oder pflanzenpathogenes Virus oder Viroid ist. 80. The kit of claim 78, wherein the virus or viroid is a animal or plant pathogenic virus or viroid.
  81. 81. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 80, wobei ungepaarte Nukleotide durch Nukleosidthiophosphate substituiert sind. 81. Kit according to any one of claims 71 to 80, wherein unpaired nucleotides are substituted by nucleoside thiophosphates.
  82. 82. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 81, wobei die dop pelsträngige Struktur (E1) des Oligoribonukleotids durch eine chemische Verknüpfung der beiden Stränge stabilisiert ist. 82. Kit according to any one of claims 71-81, wherein the dop-stranded structure (E1) of the oligoribonucleotide stabilized by chemical linkage of the two strands.
  83. 83. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 82, wobei die chemi sche Verknüpfung durch eine kovalente oder ionische Bindung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen, vorzugsweise van-der-Waals- oder Stapelungswechselwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet ist. 83. Kit according to any one of claims 71-82, wherein the chemi cal linkage by a covalent or ionic bond, a hydrogen bond, hydrophobic interactions, preferably van-der-Waals or stacking interactions, or by metal-ion coordination is formed.
  84. 84. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 83, wobei die chemi sche Verknüpfung in der Nähe des einen oder in der Nähe der beiden Enden gebildet ist. 84. Kit according to any one of claims 71 to 83, wherein the chemi cal link in the vicinity of one or formed in the vicinity of the two ends.
  85. 85. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 84, wobei die chemi sche Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbindungsgrup pen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vorzugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propandiol)- und/oder Polyethy lenglycol-Ketten sind. 85. Kit according to any one of claims 71-84, wherein the chemi cal link via one or more Verbindungsgrup pen is formed, wherein the compound groups preferably being poly (oxyphosphinicooxy-1,3-propanediol) - and / or polyethylene glycol chains.
  86. 86. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 85, wobei die chemi sche Verknüpfung durch Purinanaloga gebildet ist. 86. Kit according to any one of claims 71-85, wherein the chemi cal linkage is formed by purine analogs.
  87. 87. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 86, wobei die chemi sche Verknüpfung durch Azabenzoleinheiten gebildet ist. 87. Kit according to any one of claims 71-86, wherein the chemi cal linkage is formed by azabenzene units.
  88. 88. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 87, wobei die chemi sche Verknüpfung durch anstelle von Nukleotiden benutzte ver zweigte Nukleotidanaloga gebildet ist. 88. Kit according to any one of claims 71-87, wherein the chemi cal link used by instead of nucleotides ver branched nucleotide analogs is formed.
  89. 89. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 88, wobei zur Her stellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der fol genden Gruppen benutzt wird: Methylenblau; 89. Kit according to any one of claims 71-88, wherein for Her position the chemical linkage at least one of the fol lowing groups is used: methylene blue; bifunktionelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; bifunctional groups, preferably bis- (2-chloroethyl) -amine; N-acetyl-N'- (p-glyoxyl-benzoyl)-cystamin; N-acetyl-N '(p-glyoxyl-benzoyl) -cystamine; 4-Thiouracil; 4-thiouracil; Psoralen. Psoralen.
  90. 90. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 89, wobei die chemi sche Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1, E2) des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thiophosphoryl-Gruppen gebildet ist. 90. Kit according to any one of claims 71-89, wherein the chemi cal link through in the vicinity of the ends (E1, E2) of the double-stranded region Inappropriate thiophosphoryl groups is formed.
  91. 91. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 90, wobei die chemi sche Verknüpfung durch in der Nähe der Enden (E1, E2) befind liche Tripelhelix-Bindungen gebildet ist. 91. Kit according to any one of claims 71-90, wherein the chemi cal link through in the vicinity of the ends (E1, E2) is formed befind Liche triple-helix bonds.
  92. 92. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 91, wobei das Oligo ribonukleotid (dsRNA I, dsRNA II) an mindestens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden, damit assoziiert oder davon umgeben ist. 92. Kit according to any one of claims 71 to 91, wherein the oligo ribonucleotide (dsRNA I, dsRNA II) linked to at least one derived from a virus, is derived or a synthetic viral coat protein, associated with, or surrounded by it.
  93. 93. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 92, wobei das Hüll protein vom Polyomavirus abgeleitet ist. 93. Kit according to any one of claims 71-92, wherein the envelope protein is derived from polyomavirus.
  94. 94. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 93, wobei das Hüll protein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus-Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthält. 94. Kit according to any one of claims 71-93, wherein the envelope protein of the virus protein 1 (VP1) and / or the virus protein 2 contains (VP2) of the polyomavirus.
  95. 95. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 94, wobei bei Bil dung eines Kapsids oder kapsidartigen Gebildes aus dem Hüll protein die eine Seite zum Inneren des Kapsids oder kapsidar tigen Gebildes gewandt ist. 95. Kit according to any one of claims 71-94, wherein protein in Bil dung of a capsid or capsid-like structure from the envelope which faces a side toward the interior of the capsid or kapsidar term structure.
  96. 96. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 95, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist/sind. 96. Kit according to any one of claims 71-95, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is complementary to the primary or processed RNA transcript of the target gene / are.
  97. 97. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 96, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dSRNA I, dsRNA II) in micellare Struk turen, vorzugsweise in Liposomen, eingeschlossen ist/sind. 97. Kit according to any one of claims 71-96, wherein the / the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) is in micellar structural structures, preferably in liposomes, included / shown.
  98. 98. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 97, wobei das/die Oligoribonukleotid/e (dsRNA I, dsRNA II) in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem Weg herge stellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen ist/sind. 98. Kit according to any one of claims / 71 to 97, wherein the / put the oligoribonucleotide / e (dsRNA I, dsRNA II) in natural viral capsids or to chemically or enzymatically produced artificial capsids Herge or structures derived therefrom is also included.
  99. 99. Kit nach einem der Ansprüche 71 bis 98, wobei die Se quenz des Zielgens eine der Sequenzen SQ001 bis SQ140 des Sequenzprotokolls auf weist. 99. Kit according to any one of claims 71-98, wherein the sequence of the target gene Se one of the sequences SQ001 to SQ140 of the Sequence Listing has on.
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