DE10063048A1 - Single-chain antibody with improved stability - Google Patents

Single-chain antibody with improved stability

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DE10063048A1 DE2000163048 DE10063048A DE10063048A1 DE 10063048 A1 DE10063048 A1 DE 10063048A1 DE 2000163048 DE2000163048 DE 2000163048 DE 10063048 A DE10063048 A DE 10063048A DE 10063048 A1 DE10063048 A1 DE 10063048A1
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Abstract

Beschrieben wird ein Einzelketten-Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der C-Terminus der V¶H¶-Domäne ohne Linker direkt mit dem N-Terminals der V¶L¶-Domäne verknüpft ist, wobei die V¶H¶-Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure und/oder die V¶L¶-Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem N-Terminus vorkommenden Aminosäure aufweist, vorzugsweise lediglich die V¶H¶-Domäne des Einzelketten-Antikörpers eine Deletion der natürlicherweise den C-Terminus darstellenden Aminosäure aufweist. Disclosed is a single-chain antibody, which is characterized in that the C-terminus of the V¶H¶ domain is linked directly to the N-terminal of the V¶L¶ domain without a linker, wherein the domain V¶H¶ a deletion of at least one naturally occurring amino acid at its C-terminus and / or the V¶L¶ domain having a deletion of at least one naturally occurring at its N-terminus amino acid, preferably only the domain of the single chain V¶H¶- having a deletion of the antibody naturally the C-terminus representing the amino acid. Dadurch kann eine deutlich verbesserte Stabilität des Antikörpers bei Lagerung und auch eine verbesserte Halbwertszeit im Plasma erreicht werden. This can achieve a significantly improved stability of the antibody during storage and an improved half-life in plasma.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Einzelketten-Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der C-Terminus der V H -Domäne ohne Linker direkt mit dem N-Terminus der V L -Domäne verknüpft ist, wobei die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure und/oder die V L -Domane eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem N-Terminus vorkommenden Aminosäure aufweist, vorzugsweise lediglich die V H -Domäne des Einzelketten-Antikörpers eine Deletion der natürlicherweise den C-Terminus darstellenden Aminosäure aufweist. The present invention relates to a single-chain antibody, which is characterized in that the C-terminus of the V H domain is linked directly to the N-terminus of the V L domain with no linker, wherein the V H domain, a deletion of at least having a naturally occurring, at its C-terminus amino acid and / or the V L -Domane a deletion of at least one naturally occurring at its N-terminus amino acid, preferably only the V H domain of the single chain antibody, a deletion of the naturally the C terminus representing the amino acid. Dadurch kann eine deutlich verbesserte Stabilität des Antikörpers bei Lagerung und auch eine verbesserte Halbwertszeit im Plasma erreicht werden. This can achieve a significantly improved stability of the antibody during storage and an improved half-life in plasma. Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch diese Einzelketten-Antikörper kodierende DNA- Sequenzen und die erfindungsgemäßen Verbindungen enthaltende Arzneimittel. The present invention finally also relates to these single-chain antibody encoding DNA sequences and compounds of the invention pharmaceutical compositions containing them.

Rekombinante Antikörper, vorzugsweise Einzelketten-Antikörper (scFv) spielen inzwischen in der Medizin sowohl im Bereich der Diagnostik als auch bei der Therapie, z. Recombinant antibodies, preferably single-chain antibody (scFv) have come to play in medicine both in the field of diagnostics and in therapy, for example. B. bei der Tumortherapie, eine wichtige Rolle. As in tumor therapy, an important role. Diese Einzelketten- Antikörper werden üblicherweise rekombinant hergestellt und zeichnen sich in der Regel dadurch aus, daß der C-Terminus der V H -Domäne über einen Aminosäure- Linker mit dem N-Terminus der V L -Domäne verknüpft ist. These single chain antibodies are typically produced recombinantly and are characterized in general by the fact that the C-terminus of the V H domain amino acid via a linker to the N-terminus of the V L domain is linked. Ein Nachteil der bisher im Stand der Technik verwendeten Antikörper ist allerdings deren relative Instabilität. A disadvantage of the antibodies previously used in the prior art is their relative instability. Dies bezieht sich sowohl auf die Lagerung als auch die Halbwertszeit im Plasma nach der Verabreichung an den Patienten. This refers to both the storage and the half-life in plasma following administration to the patient.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Einzelketten-Antikörper bereitzustellen, die eine höhere Stabilität aufweisen. Thus, the present invention is the technical problem of providing single-chain antibody, which have a higher stability.

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. The solution to this technical problem is solved by providing the embodiments characterized in the claims.

In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß eine wesentlich erhöhte Stabilität dadurch erreicht werden kann, daß bei den Einzelketten-Antikörpern der C-Terminus der V H -Domäne ohne Linker direkt mit dem N-Terminus der V L -Domäne verknüpft ist, wobei die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure und/oder die V L -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem N- Terminus vorkommenden Aminosäure aufweist. In the present invention it could be shown that a significantly increased stability can be achieved in that, in the single chain antibodies of the C-terminus of the V H domain is linked directly to the N-terminus of the V L domain with no linker, wherein the V H domain having a deletion of at least one naturally occurring amino acid at its C-terminus and / or the V L domain, a deletion of at least one naturally occurring amino acid at its N-terminus. Überraschenderweise wird dadurch die Funktion des Antikörpers, z. Surprisingly, thereby the function of the antibody, eg. B. hinsichtlich Spezifität und Affinität, nicht wesentlich beeinträchtigt. B. specificity and affinity is not significantly impaired. Durch dieses Vorgehen können sehr stabile dimere bivalente Antikörpermoleküle erzeugt werden, wobei die Spezifität der Antikörper nicht negativ beeinflußt wird. This procedure very stable dimeric bivalent antibody molecules can be generated, the specificity of the antibody is not adversely affected. Die erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörper weisen eine bessere Lagerungsstabiltät auf und es kann davon ausgegangen werden, daß ihre Halbwertszeit in vivo ebenfalls höher ist. The single-chain antibodies of the invention have better storage stability of and it can be assumed that its half-life is also higher in vivo. Die erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörper sind außerdem stabiler gegenüber chemischen Modifikationen, wie z. The single-chain antibodies of the invention are also stable to chemical modifications such. B. Iodination oder das Anknüpfen von Chelatkomplexen. B. Iodination or the attachment of chelate. Darüber hinaus kann davon ausgegangen werden, daß die erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörper auf Grund ihrer geringeren Größe im Vergleich zu den bisher verwendeten Antikörpern eine verbesserte Gewebedurchdringung aufweisen, was (ua in Verbindung mit der erhöhten Halbwertszeit in vivo) beispielsweise dazu führen kann, daß auch bereits bei geringeren Dosierungen die erwünschten Wirkungen auftreten bzw. diese Wirkungen in stärkerem Maß auftreten. In addition, it can be assumed that single-chain antibodies of the invention due to their smaller size as compared to the previously used antibodies have an improved tissue penetration, which (among other things in conjunction with the increased half-life in vivo) may mean, for example that already the desired effects occur at lower doses and these effects occur to a greater extent.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Einzelketten-Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, daß der C-Terminus der V H -Domäne ohne Linker direkt mit dem N-Terminus der V L -Domäne verknüpft ist, wobei die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure und/oder die V L -Domäne eine Deletion von mindestens einer an ihrem N-Terminus natürlicherweise vorkommenden Aminosäure aufweist. Thus, the present invention relates to a single-chain antibody, which is characterized in that the C-terminus of the V H domain is linked directly to the N-terminus of the V L domain with no linker, wherein the V H domain, a deletion of having at least one amino acid naturally occurring at its C-terminus and / or the V L domain, a deletion of at least one naturally occurring amino acid at its N-terminus.

Die erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörper weisen im Vergleich zu den im Stand der Technik verwendeten Antikörpern (Verknüpfung der V H -Domäne mit der V L -Domäne über einen Linker, keine Verkürzung der V H bzw. V L -Domäne) keine wesentlich verringerte Spezifität und/oder Affinität auf. The single chain antibody according to the invention have, in comparison to those used in the prior art antibodies (linking of the V H domain with the VL domain by a linker, any shortening of the V H or V L domain) does not substantially reduced specificity and / or affinity.

Der hier verwendete Ausdruck "Einzelketten-Antikörper" betrifft alle künstlichen Antikörper, bei denen die V H -Domäne mit der V L -Domäne verknüpft ist, also z. The term "single chain antibodies" refers to all artificial antibody in which the VH domain is linked to the V L domain, that is z. B. scFv-Antikörper. B. scFv antibody.

Der hier verwendete Ausdruck "verknüpft" bezieht sich auf eine Peptidbindung. The term "linked" refers to a peptide bond.

Der hier verwendete Ausdruck "wobei die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure und/oder die V L -Domäne eine Deletion von mindestens einer an ihrem N-Terminus natürlicherweise vorkommenden Aminosäure aufweist" betrifft alle Deletions- Konstrukte, die im Vergleich zu den im Stand der Technik verwendeten Antikörpern (Verknüpfung der V H -Domäne mit der V L -Domäne über einen Linker, keine Verkürzung der V H - bzw. V L -Domäne) keine wesentlich verringerte Spezifität und/oder Affinität aufweisen, jedoch eine erhöhte Stabilität. As used herein, "wherein the V H domain having a deletion of at least one naturally occurring at its C-terminus amino acid and / or the V L domain, a deletion of at least one naturally occurring at its N-terminus amino acid" refers to all Deletions - constructs in comparison to those used in the prior art antibodies (linking of the V H domain with the VL domain by a linker, any shortening of the V H - or V L domain) does not substantially reduced specificity and / or have affinity but increased stability. Der Fachmann kann mittels üblicher Methoden DNA-Sequenzen herstellen, die die vorstehenden Deletions-Konstrukte kodieren und die biologischen Eigenschaften der dadurch kodierten Einzelketten-Antikörper über übliche Assays, z. The skilled artisan can produce DNA sequences that encode the above deletion constructs and the biological properties of the encoded thereby, single chain antibodies by conventional assays, for example by means of conventional methods. B. auch mit den in den nachstehenden Beispielen 3 und 4 beschriebenen Assays bestimmen. determine example with those described in the following Examples 3 and 4 assays. Vorzugsweise betreffen die Deletionen (pro Domäne) nicht mehr als 10 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als 5 Aminosäuren, am meisten bevorzugt nicht mehr als 1 oder 2 Aminosäuren. Preferably, the deletions affect (per domain) not more than 10 amino acids, preferably no more than 5 amino acids, most preferably not more than 1 or 2 amino acids.

Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörpers mit den vorstehenden Eigenschaften bzw. der einen solchen Antikörper kodierenden DNA-Sequenzen, deren Expression in geeigneten Wirten und deren Gewinnung und Reinigung sind dem Fachmann bekannt und z. A process for the preparation of an inventive single-chain antibody with the above properties or such an antibody coding DNA sequences whose expression in suitable hosts and its recovery and purification are known in the art and such. B. auch beschrieben in WO 89/09622, WO 89/01783, EP-A1 0 239 400, WO 90/07861 und Colcher et al., Cancer Research 49 (1989), 1732-1745. As also described in WO 89/09622, WO 89/01783, EP-A1 0239400, WO 90/07861 and Colcher et al., Cancer Research 49 (1989), 1732-1745. Der Fachmann ist auch in der Lage die entsprechenden Immunglobulin-Domänen weiter zu modifizieren, z. The specialist is to further modify also capable of the corresponding immunoglobulin domains such. B. mittels Aminosäure-Deletionen, -Insertionen, -Substitutionen und/oder Rekombinationen. Example by means of amino acid deletions, insertions, substitutions and / or recombinations. Verfahren zur Einführung solcher Modifikationen in die die immunglobulinkette kodierende DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt; Methods for introducing such modifications in the immunoglobulin chain encoding DNA sequence are known in the art; siehe z. see, for example. B. Sambrook, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), NY Zum Erhalt der den variablen Teil des Antikörpers darstellenden Domänen kodierenden DNA-Sequenzen kann der Fachmann von bereits publizierten Sequenzen ausgehen. , Sambrook, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY For obtaining the variable portion of the antibody representing domains encoding DNA sequences the skilled person may start from already published sequences. Dem Fachmann ist auch bekannt, was er bei der Verknüpfung der diese Domänen kodierenden DNAs beachten muß, und welche zusätzlichen Elemente die den Einzelketten-Antikörper kodierende DNA enthalten muß, beispielsweise das "Schwanzstück" (µtp), die "leader" Sequenz der VH- Domäne und Gelenkregion etc. The expert is also known what he must observe coding DNAs in linking these domains and what additional elements must include the single-chain antibody encoding DNA, for example, the "tail" (μtp), the "leader" sequence of the VH domain and hinge region etc.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Einzelketten- Antikörpers weist lediglich die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure auf, vorzugsweise weist die V H -Domäne eine Deletion der natürlicherweise den C- Terminus darstellenden Aminosäure auf. In a preferred embodiment of the single chain antibody of the invention only the V H domain comprises a deletion of at least one naturally occurring at its C-terminus amino acid, preferably, the V H domain, a deletion of the naturally the C-terminus representing the amino acid on. Dies führt üblicherweise dazu, daß dann die C-terminale Aminosäure der V H -Domäne Val ist und die N-terminale Aminosäure der V L -Domäne Asp. This typically results that then the C-terminal amino acid of the V H domain is Val and the N-terminal amino acid of the V L domain Asp.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform liegt der erfindungsgemäße Einzelketten-Antikörper in polymerer Form vor, beispielsweise als Dimer, Tetramer, Pentamer, Hexamer oder einem Gemisch daraus. In a more preferred embodiment, the single chain antibody of the invention is in polymeric form, for example as a dimer, tetramer, pentamer, hexamer, or a mixture thereof. Diese Formen zeichnen sich gegenüber den monomeren Formen durch eine höhere Avidität aus. These forms are distinguished from the monomeric form by a higher avidity. Die Gewinnung der polymeren Formen des Antikörpers kann durch allgemein bekannte Verfahren erfolgen, z. The recovery of the polymeric forms of the antibody may be accomplished by well-known methods, such. B. mittels der in den nachstehenden Beispielen 1 und 3 beschriebenen Fraktionierung des Kulturüberstands über Gelfiltration, beispielsweise mit Superdex- 200 TM . B. using the method described in the following Examples 1 and 3 fractionating the culture supernatant by gel filtration, for example with Superdex- 200 TM.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft den erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörper kodierende DNA-Sequenzen. A further preferred embodiment of the present invention relates to the novel single-chain antibody encoding DNA sequences. Bezüglich der Herstellung dieser DNA-Sequenzen wird auf die vorstehenden in Zusammenhang mit dem Einzelketten-Antikörper selbst offenbarten Ausführungen verwiesen. With regard to the manufacture of these DNA sequences to the above in connection with the single-chain antibody itself disclosed embodiments is referenced.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor insertiert werden. The DNA sequences of the invention may also be inserted into a vector or expression vector. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Thus, the present invention also includes vectors containing these DNA sequences or expression vectors. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. The term "vector" refers to a plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript, etc.), a virus or another suitable vehicle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in einem Expressionsvektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. In a preferred embodiment, the DNA sequence of the invention operably linked in an expression vector to regulatory elements allowing the expression in prokaryotic or eukaryotic host cells. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Such vectors contain besides the regulatory elements, for example a promoter, typically a replication origin and specific genes which allow the phenotypic selection of a transformed host cell. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryoten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryoten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. The regulatory elements for expression in procaryotes, for example E. coli include the lac, trp-promoter or T7 promoter, and for the expression in eukaryotes the AOX1 or GAL1 promoter in yeast and the CMV-, SV40- , RVS-40 promoter, CMV- or SV40 enhancer for expression in animal cells. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Further examples of suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E. coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate und pGEX-2T. Suitable expression vectors for E. coli include, for example pGEMEX, pUC derivatives and pGEX-2T. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4. Suitable for expression in yeast vectors include pY100 and Ycpad1, for expression in mammalian cells pMSXND, pKCR, PEFBOS, cDM8 and pCEV4.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. General known in the art can be used to construct expression vectors containing DNA sequences of the invention and suitable control sequences. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. These methods include, for example, in vitro recombination techniques, synthetic methods and in vivo recombination methods as they are described for example in Sambrook et al., Supra. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden, so daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können. The DNA sequences of the invention may also be inserted in conjunction with a gene encoding a different protein or peptide DNA, so that DNA sequences of the invention can be expressed, for example, in the form of a fusion protein.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. The present invention also relates to the above-described host cells containing vectors. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9-Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. These host cells include bacteria (e.g., E. coli strains HB101, DH1, X1776, JM101, JM109, BL21 and SG13009), yeast, preferably S. cerevisiae, insect cells, preferably Sf9 cells, and animal cells, preferably mammalian cells. Bevorzugte Säugerzellen sind Myelomzellen, vorzugsweise Maus-Myelomzellen. Preferred mammalian cells are myeloma cells, preferably mouse myeloma cells. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Methods of transforming these host cells, of phenotypically selecting transformants and of expressing the DNA sequences of the invention using the above described vectors are known in the art.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur rekombinanten Herstellung des erfindungsgemäßen Einzelketten-Antikörpers unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. The present invention further relates to methods for recombinant production of the single chain antibody of the invention using the expression vectors of the invention. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. The inventive method comprises culturing the host cells described above under conditions that permit expression of the protein (or fusion protein) (preferably stable expression), and recovering the protein from the culture or from the host cells. Dem Fachmann sind Bedingungen bekannt, transformierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivieren. The skilled worker conditions known transformed or transfected host cells to cultivate. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Bio chem. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993),187; Wong, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 538; und Davies, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffini tätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt. Suitable methods for the recombinant production of proteins are well known (see for example Holmgren, Annu Rev. Bio Chem 54 (1985), 237;.. LaVallie et al, Bio / Technology 11 (1993), 187;. Wong, Curr. Opin. . (1995) Biotech 6, 517; Romanos, Curr Opin Biotech 6 (1995), 527;... Williams et al, Curr Opin Biotech 6 (1995), 538;.... and Davies, Curr Opin Biotech., . 6 (1995), 543. also suitable purification procedures, for example, preparative chromatography, affinity chromatography, for example Immunoaffini tätschromatographie, HPLC etc.) are well known.

Wie bereits vorstehend ausgeführt weisen die erfindungsgemäßen Einzelketten- Antikörper ausgezeichnete Eigenschaften hinsichtlich der Stabilität bei Lagerung und der Halbwertszeit in vivo auf, sind somit für eine Reihe von therapeutischen (oder diagnostischen) Maßnahmen sehr gut geeignet. As stated above, single chain antibodies of the invention have excellent properties in terms of stability during storage and the half-life in vivo, are thus for a number of therapeutic (or diagnostic) measures very suitable. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das die erfindungsgemäßen Einzelketten- Antikörper, DNA-Sequenzen oder Expressionsvektoren enthält. Thus, the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the single chain antibody of the invention, DNA sequences or expression vectors. Dieses Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. This pharmaceutical composition further optionally comprises a pharmaceutically acceptable carrier. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Suitable carriers and the formulation of such drugs are known in the art. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Suitable carriers include, for example phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions such as oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions etc. The administration of the drugs can be administered orally or parenterally. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. To the processes for parenteral administration include topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, z. The appropriate dosage is determined by the attending physician and depends on various factors such. B. von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc. As of the age, sex and weight of the patient, the type of disease, the route of administration, etc.

Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, und in die Zellen eingeschleust. Preferably, the DNA sequences described above are inserted into a suitable gene therapy vector, for example under control of a tissue-specific promoter, and introduced into the cells. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adenovirus. In a preferred embodiment of the vector, the above-described DNA sequences containing a virus such as an adenovirus, vaccinia virus or adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Particularly preferred are retroviruses. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. For the purpose of gene therapy according to the invention DNA sequences in the form of colloidal dispersions that can be transported to the target cells. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). These include, for example, liposomes or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Die Figuren zeigen: The figures show:

Fig. 1 Schematische Darstellung der Erzeugung des erfindungsgemäßen anti- CD19 scFv-1 Konstruktes und des Vergleichskonstruktes anti-CD19 scFv 10 (Diabody CD19) Fig. 1 Schematic representation of the generation of the anti-CD19 scFv-1 construct according to the invention and the comparative construct anti-CD19 scFv 10 (diabody CD19)
c-terminale Sequenzen der V H - und N-terminale Sequenzen der V L -Domänen sind unterstrichen. c-terminal sequences of the V H - and N-terminal sequences of the V L domains are underlined. Der Linker des Diabody CD19 ist in Fettschrift angegeben. The linker of diabody CD19 is indicated in bold. Die Abkürzungen (rbs) bedeuten Ribosomenbindungsstelle, (pelB) pelB "Leader", (c- myc) c-myc Epitop, (His 6 ) Hexahistidin-tag und (stop) Stopcodon. The abbreviations (rbs) mean ribosome binding site (pelB) pelB "Leader" (c- myc) c-myc epitope (His 6) tag and hexahistidine (stop) codon.

Fig. 2: Ergebnisse der Gelfiltration des erfindungsgemäßen anti-CD19 scFv-1 (a) und des Diabody CD19 (b) FIG. 2 shows results of gel filtration of the inventive anti-CD19 scFv-1 (a) and the diabody CD19 (b)
In vitro Stabilität von anti-CD19 scFv-1 (a) und des Diabody CD19 (b) wurden bestimmt durch eine Größenausschluß FPLC. In vitro stability of anti-CD19 scFv-1 (a) and the diabody CD19 (b) were determined by size exclusion FPLC. Die Proben wurden bei 37°C in Puffer gelagert und einer Zentifugation unterworfen, bevor sie auf die Säule gegeben wurden. The samples were stored at 37 ° C in buffer and subjected to Zentifugation before they were loaded onto the column. Die Positionen des monomeren (M) und dimeren (D) anti-CD19 scFv-1 bzw. Diabody CD19 sind angegeben. The positions of the monomer (M) and dimers (D) anti-CD19 scFv-1 and diabody CD19 are given.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung. The following examples illustrate the invention.

Beispiel 1 example 1 Allgemeine Verfahren General procedures A) Vektor-Konstrukte A) Vector constructs

Die Plasmide pHOG-scFv 0 αCD19 und pHOG-scFv 0 αCEA, die ein scFv-Molekül mit einem "Null"-Aminosäurelinker (scFv 0) kodieren, das spezifisch für humanes CD19 bzw. humanes CEA ist (Kipriyanov et al., J. Immunol. Methods 196 (1996), 51-62; Chester et al., Lancet 343 (1994), 455-456), wurden als Material für die Herstellung der CD19- und CEA-Konstrukte verwendet. The plasmids pHOG scFv 0 αCD19 and pHOG scFv encoding 0 αCEA that an scFv molecule with a "zero" -Aminosäurelinker (scFv 0), which is specific for human CD19 and human CEA (Kipriyanov et al., J. . Immunol Methods 196 (1996), 51-62;. Chester et al, Lancet 343 (1994), 455-456), were used as material for the production of the CD19 and CEA constructs. Für die Konstruktion von scFv-1 kodierenden Genen wurden die PCR-Fragmente der V H -Domäne von anti- CD19 unter Verwendung folgender Primer erzeugt: For the construction of scFv-1 encoding genes, the PCR fragments of the V H domain of anti-CD19 were generated using the following primers:
DP1: 5'-TCA CAC AGA ATT CTT AGA TCT ATT AAA GAG GAG AAA TTA ACC-3' DP1: 5'-CAC TCA AGA ATT CTT AGA TCT ATT AAA GAG GAG AAA TTA ACC-3 '
V H/CD19 : 5'-GAG CAA GAT ATC GAC GGT GAC TGA GGT TCC-3' V H / CD19: 5'-GAG CAA GAT ATC GAC GGT GAC TGA GGT TCC-3 '

Für die V H -Domäne für anti-CEA wurde der vorstehende Primer DP1 verwendet sowie der Primer V H/CD19 : For the V H domain of anti-CEA of the above primers DP1 was used and the primer V H / CD19:
5'-GAG CAC GAT ATC GAC GGT GAC CGT GGT TCC-3' 5'-GAG CAC GAT ATC GAC GGT GAC CGT GGT TCC-3 '

Die entstandenen PCR-Fragmente wurden mit den Restriktionsenzymen Ncol und EcoRV geschnitten und mit dem mit Ncol/EcoRV linearisierten Plasmid pHOG-scFv 0 αCD19 und pHOG-scFv 0 αCEA ligiert. The resulting PCR fragments were cut with the restriction enzymes NcoI and EcoRV and ligated to the linearized with NcoI / EcoRV plasmid pHOG scFv 0 αCD19 and pHOG scFv 0 αCEA. Alle scFv-Fragmente kodierenden Sequenzen wurden hinsichtlich Korrektheit mittels des Didesoxynucleotidverfahrens überprüft. All scFv fragments coding sequences were checked for correctness by the Didesoxynucleotidverfahrens.

(B) Proteinexpression und Aufreinigung (B) Protein expression and purification

Zur Expression der scFv-Fragmente wurden die Plasmide in den E. coli-Stamm K12 XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA) transformiert. To express the scFv fragments, the plasmids were transformed XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA) in the E. coli K12 strain. Die Plasmide wurden bei 37°C in Schüttelflaschen in 2 × YT-Medium mit 0,1 g/l Ampicillin gezüchtet. The plasmids were grown at 37 ° C in shake flasks in 2 x YT-medium containing 0.1 g / l ampicillin. Die IPTG-Induktion und die Isolierung von periplasmatischen Extrakten wurden wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Kipriyanov et al., supra). The IPTG induction and isolation of periplasmic extracts were performed as previously described (Kipriyanov et al., Supra). Zur Isolierung der scFv- Fragmente wurden der Kulturüberstand und der lösliche periplasmatische Extrakt vereinigt und unter Verwendung einer Amicon YM10®-Membran (Amicon, Witten, Deutschland) mit einer Auschlussgrenze von 10 kDa konzentriert. For the isolation of scFv fragments of the culture supernatant and the soluble periplasmic extract were combined and concentrated using an Amicon YM10® membrane (Amicon, Witten, Germany) concentrated with an exclusion limit of 10 kDa. Danach erfolgte eine gründliche Dialyse gegen 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH-Wert 7,0. This was followed by thorough dialysis against 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7.0. Die Reinigung wurde durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC)) unter Verwendung von Cu 2+ -beladener "Chelating Sepharose" (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wie in Kipriyanov et al., Protein Eng. Purification was achieved by immobilized metal affinity chromatography (IMAC)) using Cu 2+ -beladener "Chelating Sepharose" (Pharmacia, Freiburg, Germany) as shown in Kipriyanov et al., Protein Eng. 10 (1997), 445-453 beschrieben erreicht. reaches 10 (1997), 445-453 described. Der letzte Reinigungsschritt bestand aus einer Ionenaustauschchromatographie an einer "MonoQ HR5/5"-Säule (Pharmacia) in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, mit einem linearen 0-1 M NaCl-Gradienten. The final purification step consisted of an ion exchange chromatography on a "Mono Q HR5 / 5" column (Pharmacia) in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, with a linear 0-1 M NaCl gradient. Alle Reinigungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. All purification steps were performed at 4 ° C.

(C) SDS-PAGE und Größenausschlußchromatographie (C) SDS-PAGE and Size Exclusion Chromatography

SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli, Nature 259 (1970), 680-685 unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. SDS-PAGE was performed according to Laemmli, Nature 259 (1970), 680-685 conducted under reducing conditions. Analytische Gelfiltration der scFv- Präparationen wurde an einer kalibrierten Superdex 200 TM HR10/30-Säule (Pharmacia) in PBSI (15 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 50 mM Imidazol, pH- Wert 7,0) durchgeführt. Analytical gel filtration of the scFv preparations was performed on a calibrated Superdex 200 TM HR10 / 30 column (Pharmacia) in PBSI (15 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 50 mM imidazole, pH 7.0). Das Probenvolumen und die Fließgeschwindigkeit waren 50 µl bzw. 0,5 ml/min. The sample volume and the flow rate was 50 .mu.l and 0.5 ml / min.

(D) Durchflußzytometrie und Affinitätsbestimmung für humanes CD19 (D) Flow cytometry and affinity determination for human CD19

Die humane CD 19+ B-Zellinie JOK-1 wurde wie kürzlich beschrieben (Kipriyanov et al., J. Immunol. Methods 196 (1996), 51-62) für die Durchflußzytometrie verwendet. The human CD 19+ B cell line JOK-1 were as previously described (Kipriyanov et al., J. Immunol. Methods 196 (1996), 51-62) was used for flow cytometry. Die abgeschätzten Affinitäten der rekombinanten Antikörpermoleküle wurden mittels Assays hinsichtlich der kompetitiven Hemmung bestimmt (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772). The estimated affinities of recombinant antibody molecules were determined by assays for the competitive inhibition determined (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772). Dabei wurden ansteigende Konzentrationen an gereinigten Antikörperfragmenten zu unter der Sättigungsgrenze liegenden Konzentration von FITC-markiertem MAK HD37 (anti-CD19) gegeben und mit JOK- 1-Zellen inkubiert. In this case, increasing concentrations of purified antibody fragments lying below the saturation limit concentration of FITC-labeled MAb HD37 were added (anti-CD19) and incubated with JOK- 1 cells. Die Fluoreszenzintensitäten der gefärbten Zellen wurden mittels eines "FACSan"-Durchflußzytometers (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) gemessen. The fluorescence intensities of the stained cells were measured using a "FACScan" -Durchflußzytometers (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Die Bindungsaffinitäten wurden gemäß folgender Gleichung berechnet: K D(I) = IC 50 /(1 + [FITC-MAK]/K D(MAK) , wobei I der unmarkierte Inihibitor ("Diabody", Triabody" oder "Tetrabody") ist, [FITC-MAK] die Konzentration des FITC-markierten MAK HD37, K D(MAK) die Bindungsaffinität des MAK und IC 50 die Konzentration des Inhibitors, die zu 50% Bindungshemmung führt. Dem MAK HD37 konnte ein Wert von 0.4 nM für die Affinitätskonstante (K o ) zugeordnet werden (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772). The binding affinities were calculated according to the following equation: K D (I) = IC 50 / (1 + [FITC-MAK] / K D (MAK), where I is the unmarked Inihibitor ( "diabody" triabody "or" tetra Body ") is [FITC-MAK] is the concentration of FITC-labeled MAb HD37, K D (MAK) the binding affinity of MAK and IC 50 is the concentration of inhibitor resulting in 50% inhibition of binding. mAb HD37 has a value of 0.4 nM for the affinity constant (K o) are assigned (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772).

(E) Zelloberflächenretentions-Assay (E) cell surface retention assay

Zelloberflächenretentions-Assays wurden bei 37°C in vitro im wesentlichen wie von Adams et al., Br. J. Cancer 77 (1998), 1405-1412 beschrieben durchgeführt, außer daß der Nachweis der zurückgehaltenen Antikörperfragmente unter Verwendung des antic-myc-MAK 9E10 (IC Chemikalien, Ismaning, Deutschland) und im Anschluß daran mittels FITC-markiertem anti-Maus-IgG durchgeführt wurde. Cell surface retention assays were performed at 37 ° C in vitro essentially as described by Adams et al., Br. J. Cancer 77 (1998) 1405-1412, except that the detection of the retained antibody fragments using the antic-myc-MAK 9E10 (IC chemicals, Ismaning, Germany) and it carried out following by FITC-labeled anti-mouse IgG. Die kinetischen Dissoziationskonstanten (K off ) wurden mittels einer Gleichung der ersten Ordnung (F t = F 0 × eb -kt ) berechnet, wobei Ft die Fluoreszenz zur Zeit t 0 ist, F 0 die Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 und k ist k off . The kinetic dissociation constant (K off) were determined by an equation of the first order (F t = F 0 × eb -kt), where Ft is the fluorescence at time t is 0, F 0 is the fluorescence at time 0 and k is k off. Die Halbwertszeit (t 1/2 ) für die Dissoziation des Antikörperfragments wurde mittels der Gleichung t 1/2 = In2/k off berechnet. The half-life (t 1/2) for dissociation of the antibody fragment was determined by the equation t 1/2 = In2 / k off is calculated.

(F) Analyse der Antikörperstabilität in vitro (F) Analysis of antibody stability in vitro

Die Antikörperfragmente wurden in PBS-Imidazol, pH-Wert 7,0, bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml verdünnt und durch Filtration über ein Membrex 4CA TM - Filter mit einem Leervolumen von 50 µl und einer Porengröße von 0,2 µm (MembranePure, Lorzweiler, Deutschland) sterilisiert. The antibody fragments were diluted in PBS-imidazole, pH 7.0, to a concentration of 1 mg / diluted ml and by filtration through a Membrex 4CA TM - (filter having a void volume of 50 ul and a pore size of 0.2 .mu.m MembranePure, Lörzweiler, Germany) sterilized. Aliquots (100 µl) wurden auf einmal unter sterilen Bedingungen präpariert und bei 37°C aufbewahrt. Aliquots (100 ul) were prepared at once under sterile conditions and stored at 37 ° C. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Größe der Moleküle an einer kalibirierten Superdex 200 TM HR10/30-Säule wie vorstehend beschrieben bestimmt. At the indicated time points, the size of the molecules to a Superdex 200 TM kalibirierten HR10 / 30 column was determined as described above. Die Aliquots wurden bei -80°C eingefroren. The aliquots were frozen at -80 ° C. Die Aktivitäten der Proben wurden mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung von CD19 + JOK-1 Zellen und CEA + LOVO Zellen bestimmt. The activities of the samples were determined by flow cytometry using CD19 + JOK-1 cells and CEA + LOVO cells. Die Proteinpräzipitation und Proteindegradierung in den jeweiligen Proben wurden über SDS-12% PAGE und Western-Blot-Analysen mittels des anti- c-myc-MAK 9E10 wie beschrieben (Kipriyanov et al., Molec. Immunol. 31 (1994), 1047-1058) bestimmt. The protein precipitation and protein degradation in the samples were analyzed by SDS-12% PAGE and Western blot analyzes using the anti-c-myc MAb 9E10 as described (Kipriyanov et al., Molec. Immunol. 31 (1994), 1047- 1058) determined.

Beispiel 2 example 2 Konstruktion der erfindungsgemäßen scFv-Moleküle, Expression und Reinigung Construction of scFv molecules, expression and purification according to the invention

Die anti-CD19 scFv 0- und anti-CEA scFv 0-Genkonstrukte (Le Galt et al., FEBS Letters 453 (1999), 164-168), bei denen die VH- und VL-Domänen mit dem "Null"- Rest, also ohne Linker, (scFv 0) verknüpft worden waren, wurden als Matrize zur Erzeugung erfindungsgemäßer scFv-1 Konstrukte verwendet ( Fig. 1). The anti-CD19 scFv 0 and anti-CEA scFv 0 gene constructs (Le Galt et al, FEBS Letters 453 (1999), 164-168.) In which the VH and VL domains with the "zero" - Rest , without linker (scFv 0) were linked, were used as a template for generating the invention scFv-1 constructs (Fig. 1). ScFv-1 wurde durch Ligation des Codons für das C-terminale V H -Val III mit dem N-terminalen V L -Asp I (Numerierung gemäß Kabat el al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242 (1991)) konstruiert. ScFv-1 was constructed by ligation of the codon for the C-terminal V H -Val III (with the N-terminal V L I -Asp numbering according to Kabat el al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242 (1991)) was constructed. Alle scFv- Fragmente wurden in E. coli durch Sezernierung in das bakterielle Periplasma produziert. All scFv fragments were produced in E. coli by secretion into the bacterial periplasm. Die löslichen Antikörperfragmente wurden aus periplasmatischen Extrakten und dem Kulturmedium durch zwei Chromatographie-Schritte isoliert, wobei die typischen Ausbeuten bei 0,9 mg (für anti-CD19 scFv-1) und 3 mg (für anti-CEA scFv-1) pro 1 Liter Schüttelflaschenkultur betrugen. The soluble antibody fragments were isolated from periplasmic extracts and the culture medium by two chromatography steps, with typical yields 0.9 mg (for anti-CD19 scFv-1) and 3 mg (for anti-CEA scFv-1) per 1 liter shake flask, respectively.

Beispiel 3 example 3 Proteinanalysen protein analysis

Die Gelfiltration auf einer kalibrierten Superdex 200 TM -Säule zeigte, daß das anti- CD19 scFv-1 Protein einen einzelnen symetrischen Peak mit einer relativen molekularen Masse von 60 kDa (als Dimer) für anti-CD19 ( Fig. 2a) lieferte bzw. einen asymetrischen, einem Dimer entsprechenden Peak im Fall des Vergleichskonstruktes (Diabody CD19) ( Fig. 2b). The gel filtration on a calibrated Superdex 200 column showed that the anti-CD19 scFv-1 protein a single symmetrical peak with a relative molecular mass of 60 kDa delivered (as a dimer) for anti-CD19 (Fig. 2a) and a asymmetric, corresponding to a dimer peak in the case of Comparative construct (diabody CD19) (Fig. 2b).

Die relativen Affinitäten des anti-CD19 scFv-1 und des Diabody CD19 wurden durch kompetitive Bindung an humane JOK-1 Zellen in Gegenwart des FITC-markierten anti-CD19 MAK HD37 analysiert. The relative affinities of the anti-CD19 scFv-1 and CD19 diabody were analyzed by competitive binding to human JOK-1 cells in the presence of FITC-labeled anti-CD19 MAb HD37. Die relativen Affinitäten wurden von den entsprechenden IC 50 -Werten berechnet. The relative affinities were calculated 50 values of the corresponding IC. Die Ergebnisse der Hemmungsexperimente zeigten, daß der anti-CD19 scFv-1 mit einer Affinität band, die mit der des Diabody CD19 identisch war (Tabelle 1). The results of the inhibition experiments showed that the band-anti-CD19 scFv-1 with an affinity that was identical to that of CD19 diabody (Table 1).

Zur Bestätigung der biologischen Relevanz der Affinitätswerte wurden diese auch über in vitro Retentionsexperimente auf der Oberfläche von CD19-positiven Zellen, die bei 37°C inkubiert worden waren, mittels Durchflußzytometrie bestimmt. To confirm the biological relevance of these affinity values ​​were determined via in vitro experiments retention on the surface of CD19-positive cells, which had been incubated at 37 ° C by flow cytometry. Der verkürzte anti-CD19 scFv-1 wies eine ähnliche Retentionshalbwertszeit (t 1/2 ) auf wie der Diabody CD19 (Tabelle 1). The condensed anti-CD19 scFv-1 had a similar retention half-life (t 1/2) on how the diabody CD19 (Table 1).

Tabelle 1 Table 1

Affinitäten und Bindungskinetiken von Antikörpern gegen humanes CD19 (mit JOK-1 Zellen (CD3 - /CD19 + ) Affinities and binding kinetics of antibodies against human CD19 (with JOK-1 cells (CD3 - / CD19 +)

Beispiel 4 example 4 Analysen zur Stabilität in vitro Analyzes for stability in vitro

Eines der wichtigsten Anwendungsgebiete für dimere rekombinante Antikörper stellt die Krebstherapie dar, wobei Faktoren wie z. One of the most important applications for dimeric recombinant antibody is cancer therapy, taking into account factors such. B. Halbwertszeit im Plasma und Eindringung in den Tumor eine wichtige Rolle spielen. play as half-life in plasma and penetration into the tumor an important role. Daher wurde die Antigenbindungsaktivität der dimeren, in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Einzelketten-Antikörper bei Lagerung bei 37°C nach verschiedenen längeren Zeitintervallen bestimmt. Therefore, the antigen binding activity of the dimeric described in Example 1 and 2, single-chain antibody when stored at 37 ° C was determined according to different longer time intervals. Die Restaktivität wurde mittels Durchflußzytometrie mit CD19 + JOK Zellen und CEA + LOVO Zellen bestimmt. The residual activity was determined cells by flow cytometry with CD19 + JOK cells and CEA + LOVO. Es zeigte sich, daß anti-CD19 scFv-1 selbst nach Inkubation in PBSI, pH-Wert 7,0, über einen Zeitraum von 196 Stunden über 60% der Antigenbindungsaktivität beibehalten hatte, während jedoch der Diabody CD19 nach 196 Stunden seine Fähigkeit zur Bindung praktisch vollständig verlor (Tabelle 2). It was found that anti-CD19 had scFv-1 retained even after incubation in PBSI, pH 7.0, over a period of 196 hours over 60% of the antigen-binding activity, while, however, the diabody CD19 after 196 hours its ability to bind almost completely lost (Table 2).

Analysen der Molekülgröße über Größenausschlußchromatographie zeigten, daß nach 96 Stunden anti-CD19 scFv-1 in dimerer Form vorhanden war, während für den Diabody CD19 bereits nach 24 Stunden keine Moleküle mehr nachweisbar waren. Analysis of molecular size by size exclusion chromatography showed that after 96 hours of anti-CD19 scFv-1 was present in dimeric form, whereas no longer molecules could be detected for the diabody CD19 after 24 hours. Die Spezifität der Moleküle wurde nach einer Lagerung bei 37°C für 196 Stunden mittels Durchflußzytometrie bestimmt. The specificity of the molecules was determined after storage at 37 ° C for 196 hours by flow cytometry. Anti-CD19 scFv-1-Moleküle zeigten Spezifität für humanes CD19 Antigen, im Fall des Diabody CD19 konnte keine Bindung bestimmt werden. Anti-CD19 scFv-1 molecules showed specificity for human CD19 antigen, in the case of CD19 diabody no binding could be determined.

Der scFv-1 mit CEA-Spezifität zeigte ebenfalls nach 264 Stunden bei 37°C eine bessere Stabilität als der Diabody CEA (Tabelle 3). The scFv-1 with CEA specificity also showed better stability than the diabody CEA (Table 3) after 264 hours at 37 ° C. Die Gegenwart dimerer Formen von scFv-1 anti-CEA konnte auch nach 264 Stunden mittels Größenausschlußchromatographie nachgewiesen werden. The presence of dimeric forms of scFv-1 anti-CEA could be detected even after 264 hours by means of size exclusion chromatography. Die Spezifität dieser dimeren Formen konnte über FACS-Analysen an CEA + Zellen ebenfalls bestätigt werden. The specificity of these dimeric forms was also confirmed by FACS analysis of CEA + cells.

Claims (11)

1. Einzelketten-Antikörper, dadurch gekennzeichnet , daß der C-Terminus der V H - Domäne ohne Linker direkt mit dem N-Terminus der V L -Domäne verknüpft ist, wobei die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure und/oder die V L -Domäne eine Deletion von mindestens einer an ihrem N-Terminus natürlicherweise vorkommenden Aminosäure aufweist. 1. Single-chain antibody, characterized in that the C-terminus of the V H - linker domain is linked without directly to the N-terminus of the V L domain, wherein the V H domain, a deletion of at least one naturally at its C terminus comprises occurring amino acid and / or the V L domain, a deletion of at least one naturally occurring amino acid at its N-terminus.
2. Einzelketten-Antikörper nach Anspruch 1, wobei die V H -Domäne eine Deletion von mindestens einer natürlicherweise an ihrem C-Terminus vorkommenden Aminosäure aufweist. 2. Single-chain antibody according to claim 1, wherein the V H domain having a deletion of at least one naturally occurring amino acid at its C-terminus.
3. Einzelketten-Antikörper nach Anspruch 2, wobei die V H -Domäne eine Deletion der natürlicherweise den C-Terminus darstellenden Aminosäure aufweist. 3. Single-chain antibody of claim 2, wherein the V H domain comprises a deletion of the naturally the C-terminus representing the amino acid.
4. Einzelketten-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der spezifisch an αCD19 oder CEA bindet. 4. Single-chain antibody of any of claims 1 to 3, which specifically binds to αCD19 or CEA.
5. Einzelketten-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der in polymerer Form vorliegt. 5. single-chain antibody of any of claims 1 to 4, which is in polymeric form.
6. DNA-Sequenz, kodierend den Einzelketten-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5. 6. DNA sequence encoding the single chain antibody of any of claims 1 to. 5
7. Expressionsvektor, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 6. 7. Expression vector containing the DNA sequence of claim. 6
8. Zellinie, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 7. 8. cell line containing the DNA sequence of claim 6 or the expression vector according to claim. 7
9. Arzneimittel, enthaltend den Einzelketten-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die DNA-Sequenz nach Anspruch 6 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 7. 9. A medicament containing the single chain antibody of any of claims 1 to 5, the DNA sequence of claim 6 or the expression vector according to claim. 7
10. Verfahren zur Herstellung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 10. A method for producing the antibody of any one of claims 1 to 5, characterized in that
  • a) eine Zellinie nach Anspruch 8 mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 7 transfiziert und unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, und a) transfecting a cell line according to claim 8 with the expression vector according to claim 7, and cultured under suitable conditions, and
  • b) das exprimierte Protein aus der Zellinie oder der Kultur gewonnen und gereinigt wird. b) recovering the expressed protein from the cell line or culture and purified.
11. Verwendung des Einzelketten-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-5 für diagnostische und/oder therapeutische Zwecke. 11. The use of the single chain antibody of any of claims 1-5 for diagnostic and / or therapeutic purposes.
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