DE10051564A1 - Parallel sequencing of nucleic acids in a mixture, useful e.g. for detecting mutations, comprises a series of single-base extension reactions using protected, labeled nucleotides - Google Patents

Parallel sequencing of nucleic acids in a mixture, useful e.g. for detecting mutations, comprises a series of single-base extension reactions using protected, labeled nucleotides

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DE10051564A1
DE10051564A1 DE2000151564 DE10051564A DE10051564A1 DE 10051564 A1 DE10051564 A1 DE 10051564A1 DE 2000151564 DE2000151564 DE 2000151564 DE 10051564 A DE10051564 A DE 10051564A DE 10051564 A1 DE10051564 A1 DE 10051564A1
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    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869Methods for sequencing
    • C12Q1/6874Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Abstract

Parallel sequencing of at least two different nucleic acids (I) and (II) in a mixture. Parallel sequencing of at least two different nucleic acids (I) and (II) in a mixture, involves a surface being prepared with islands of nucleic acids (designated tertiary nucleic acid, tNA) of the same sort, then the opposite strands (tNA') are produced, and these are extended by one nucleotide (nt) that is protected at the 2'- or 3'-position, to prevent further extension, and carries an identifiable label. The incorporated nt is identified, then the protecting group removed and the label either removed or altered. The extension step, and all subsequent steps, are repeated as many times as needed to provide the required sequence information.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasen-gestützten parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nuklein säuren. The invention relates to a process for the solid-phase-supported parallel sequencing of at least two different nucleic acid contained in a mixture of nucleic acids.

Ein wichtiges Verfahren der biologischen Analytik ist die Sequenzanalyse von Nukleinsäu ren. Hier wird die genaue Basenfolge der interessierenden DNA- oder RNA-Moleküle be stimmt. An important method of biological analysis is ren sequence analysis of nucleic. Here, the accurate base sequence of the DNA of interest or RNA molecules will be true. Die Kenntnis dieser Basenfolge erlaubt beispielsweise die Identifikation bestimm ter Gene oder Transkripte, also der zu diesen Genen gehörigen Boten-RNA-Moleküle, die Aufdeckung von Mutationen bzw. Polymorphismen, oder auch die Identifikation von Or ganismen oder Viren, die sich anhand bestimmter Nukleinsäuremoleküle eindeutig erken nen lassen. Knowing these base sequence allows for example the identification limited hours ter genes or transcripts, so the linked to these genes messenger RNA molecules, the detection of mutations or polymorphisms, or even the identification of Or-organisms or viruses that are clearly based on specific nucleic acid molecules reveal. Üblicherweise wird die Sequenzierung von Nukleinsäuren nach dem Kettenab bruchverfahren durchgeführt (Sanger et al, (1977) PNAS 74, 5463-5467). Conventionally, the sequencing of nucleic acids according to the Kettenab will break process (Sanger et al, (1977) PNAS 74, 5463-5467). Hierzu wird eine enzymatische Ergänzung eines Einzelstrangs zum Doppelstrang vorgenommen, indem ein an besagten Einzelstrang hybridisierter "Primer", in der Regel ein synthetisches Oligonu kleotid, mittels Zugabe von DNA-Polymerase und Nukleotidbausteinen verlängert wird. For this purpose, an enzymatic addition of a single strand is made to the double strand by a hybridized to said single strand "primer" is usually a synthetic Oligonu kleotid, is extended by the addition of DNA polymerase and nucleotide. Ein geringer Zusatz von Abbruch-Nukleotidbausteinen, welche nach ihrer Inkorporation in den wachsenden Strang keine weitere Verlängerung mehr zulassen, führt zur Akkumulati on von Teilsträngen mit bekanntem, durch das jeweilige Abbruchnukleotid festgelegtem Ende. A small addition of demolition nucleotide building blocks, which do not permit further extension after their incorporation into the growing strand, leading to Akkumulati on of sub-tows having a known, fixed by the respective Abbruchnukleotid end. Das so erhaltene Gemisch unterschiedlich langer Stränge wird mittels Gel ektrophorese der Größe nach aufgetrennt. The resulting mixture of different length strands by gel according to size ektrophorese separated. Aus den entstehenden Bandenmustern läßt sich die Nukleotidfolge des unbekannten Strangs ableiten. From the resulting band patterns, the nucleotide sequence of the unknown strand can be deduced. Ein großer Nachteil des genannten Verfahrens besteht im erforderlichen instrumentellen Aufwand, der den erreichbaren Durchsatz an Reaktionen begrenzt. A great disadvantage of said method consists in the required instruments required, which limits the achievable throughput of reactions. Für jede Sequenzierungsreaktion ist, den Einsatz von mit vier unterschiedlichen Fluorophoren markierten Abbruchnukleotiden vorausgesetzt, mindestens eine Spur auf einem Flachgel oder, beim Einsatz von Kapillarelektrophorese, mindestens eine Kapillare erforderlich. At least one track on a slab gel or in the use of capillary electrophoresis, at least one capillary is provided the use of labeled with four different fluorophores Abbruchnukleotiden required for each sequencing reaction. Der hierdurch entstehende Aufwand begrenzt auf den derzeit modernsten kommerziell erhältlichen Sequenzierautomaten die Zahl an parallel prozessierbaren Sequenzierungen auf maximal 96. Ein weiterer Nachteil besteht in der Begrenzung der Leselänge", also der Zahl der richtig identifizierbaren Basen pro Sequenzierung, durch die Auflösung des Gelsystems. Ein alternatives Verfahren zur Sequenzie rung, die Sequenzbestimmung über Massenspektrometrie, ist schneller und erlaubt daher die Prozessierung von mehr Proben in der gleichen Zeit, ist andererseits aber auf verhält nismäßig kleine DNA-Moleküle (beispielsweise 40-50 Basen) beschränkt. Bei noch einer anderen Sequenzierungstechnik, Sequenzierung durch Hybridisierung (SBH, Sequencing By Hybridization; vgl. Drmanac et al., Science 260 (1993), 1649-1652), werden Basenfol gen durch die spezifische Hybridisierung unbekannter Proben mit bekannten Oligonukleo tiden identifiziert. Besagte bekannte Oligonukleotide werden hierzu in einer kom The thus resulting expense limited to the most advanced commercially available automated sequencer, the number of parallel processable sequencing to a maximum of 96. A further disadvantage is the limitation of read length ", ie the number of correctly identifiable bases per sequencing, by the resolution of the gel system. A alternative method for Sequenzie tion, the sequence determination via mass spectrometry, is faster and therefore allows the processing of more samples at the same time, on the other hand, on behaves ately small DNA molecules (e.g., 40-50 bases) limited. in yet another sequencing technique , sequencing by hybridization (SBH, sequencing by hybridization;.. see Drmanac et al, Science 260 (1993), 1649-1652)., Basenfol be gen by the specific hybridization of unknown samples with known Oligonukleo tiden identified Said oligonucleotides are known for this purpose in a com plexen Anordnung auf einem Träger fixiert, eine Hybridisierung mit der markierten, zu sequenzie renden Nukleinsäure wird vorgenommen, und die hybridisierenden Oligonukleotide wer den ermittelt. complexes arrangement on a support fixed, hybridization with labeled to sequenzie leaders nucleic acid is made and the hybridizing oligonucleotides who the determined. Aus der Information darüber, welche Oligonukleotide mit der unbekannten Nukleinsäure hybridisiert haben, und aus ihrer Sequenz läßt sich dann die Sequenz der unbekannten Nukleinsäure ermitteln. From the information on which oligonucleotides have hybridized with the unknown nucleic acid, and from their sequence, the sequence of the unknown nucleic acid can then be determined. Ein Nachteil des SBH-Verfahrens ist die Tatsache, daß sich die optimalen Hybridisierungsbedingungen für Oligonukleotide nicht exakt vor hersagen lassen und sich dementsprechend kein großer Satz an Oligonukleotiden entwerfen läßt, die einerseits alle bei ihrer gegebenen Länge möglichen Sequenzvariationen enthalten und andererseits exakt die gleichen Hybridisierungsbedingungen benötigen. A disadvantage of the SBH method is the fact that the optimum hybridization conditions for oligonucleotides can not be recite exactly in front and can therefore not design a large set of oligonucleotides, on the one hand contain all possible at their given length sequence variations and on the other hand exactly require the same hybridization conditions , Somit kommt es durch unspezifische Hybridisierung zu Fehlern in der Sequenz-Bestimmung. Thus, it comes through non-specific hybridization to errors in the sequence determination. Außerdem kann das SBH-Verfahren nicht für repetitive Regionen zu sequenzierender Nukleinsäuren eingesetzt werden. In addition, the SBH method can not be used for repetitive regions to be sequenced nucleic acids.

Neben der Analyse der Expressionsstärke bekannter Gene, wie sie durch Dot Blot- Hybridisierung, Northern-Hybridisierung und quantitative PCR möglich ist, sind auch Ver fahren bekannt, welche die de novo-Identifikation unbekannter zwischen verschiedenen biologischen Proben differentiell exprimierter Gene ermöglichen. In addition to analyzing the level of expression of known genes such as, Northern hybridization, and quantitative PCR is possible by dot blot hybridization, and Ver are known drive that enable the de novo identification of unknown between different biological samples of differentially expressed genes.

Eine solche Strategie zur Expressionsanalyse besteht in der Quantifizierung diskreter Se quenzeinheiten. Such a strategy for expression analysis is quenzeinheiten in the quantification of discrete Se. Diese Sequenzeinheiten können in sog. ESTs (Expressed Sequence Tags) bestehen. This sequence units (expressed sequence tags) are made in so-called. ESTs. Werden hinreichende Zahlen von Klonen aus cDNA-Banken, die von miteinan der zu vergleichenden Proben stammen, sequenziert, können jeweils identische Sequenzen erkannt und gezählt werden und die erhaltenen relativen Häufigkeiten dieser Sequenzen in den verschiedenen Proben miteinander verglichen werden (vgl. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 8303-8307). Are sufficient numbers of clones from cDNA libraries derived from miteinan the samples to be compared, sequenced identical sequences can each be detected and counted and the resulting relative frequencies of these sequences in the different samples to be compared with each other (see. Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 8303 to 8307). Unterschiedliche relative Häufigkeiten einer bestimmten Sequenz zeigen differentielle Expression des entsprechenden Transkripts an. Different relative abundances of a particular sequence indicate differential expression of the corresponding transcript. Allerdings ist das beschriebene Verfahren sehr aufwendig, da bereits für die Quantifizie rung der häufigeren Transkripte die Sequenzierung vieler tausend Klone erforderlich ist. However, the described method is very expensive since been tion for the quantification of the more common transcripts sequencing many thousands of clones is required. Andererseits ist für die eindeutige Identifikation eines Transkripts in der Regel lediglich ein kurzer Sequenzabschnitt von ca. 13-20 Basenpaaren Länge erforderlich. On the other hand, only a short sequence section of about 13 to 20 base pairs in length is required for unique identification of a transcript in general. Diese Tatsa che wird vom Verfahren des "Serial Analysis of Gene Expression" (SAGE) ausgenutzt (Velculescu et al, Science 270 (1995), 484-487). This Tatsa che is the process of "Serial Analysis of Gene Expression" (SAGE) exploited (Velculescu et al, Science 270 (1995), 484-487). Hier werden kurze Sequenzabschnitte ("Tags") konkateniert, kloniert, und die resultierenden Klone werden sequenziert. Here short sequence segments ( "tags") are concatenated, cloned and the resulting clones are sequenced. Mit ei ner einzelnen Sequenzreaktion lassen sich auf diese Weise etwa 20 Tags bestimmen. With egg ner single sequence reaction can be determined about 20 tags in this way. Den noch ist diese Technik noch nicht sehr leistungsfähig, da bereits für die Quantifizierung der häufigeren Transkripte sehr viele konventionelle Sequenzreaktionen durchgeführt und analysiert werden müssen. The still, this technique is not very efficient, as have already done a lot of conventional sequencing reactions for quantification of the more common transcripts and analyzed. Aufgrund des hohen Aufwands ist eine verläßliche Quantifizie rung seltener Transkripte mittels SAGE nur sehr schwer möglich. Due to the high cost is a reliable quantification tion rare transcripts by SAGE very difficult.

Ein weiteres Verfahren zur Sequenzierung von Tags nach der US-A 5 695 934 besteht darin, kleine Kugeln mit zu sequenzierender Nukleinsäure auf eine solche Weise zu be schichten, daß jede Kugel zahlreiche Moleküle lediglich einer Nukleinsäurespezies erhält. A further method for sequencing of tags according to the US-A 5,695,934 is, layers with little balls nucleic acid to be sequenced in such a way to be that each ball only receives numerous molecules of a nucleic acid species. Zur Sequenzierung wird dann das Verfahren des "stepwise ligation and cleavage" einge setzt, bei dem von einem artifiziellen Linker aus die zu sequenzierende Nukleinsäure durch Einsatz eines Typ IIS-Restriktionsenzyms basenweise abgebaut und dabei ihre Sequenz bestimmt wird. For sequencing, the method of the 'stepwise ligation and cleavage "is then set, as base degraded in which by an artificial linker of the nucleic acid to be sequenced by using a type IIS restriction enzyme and its sequence is determined. Damit eine Beobachtung und Aufzeichnung des Sequenziervorgangs mög lich ist, werden die verwendeten Kugeln in eine flachen Küvette eingebracht, die nur we nig höher ist als dem Kugeldurchmesser entspricht, um die Bildung einer einzelnen Lage zu erlauben. Thus, an observation and recording of the sequencing process is possible, please include, the balls used are introduced into a flat cuvette, which is only we nig higher than corresponding to the ball diameter to allow the formation of a single layer. Weiterhin müssen die Kugeln in dichtester Packung in der Küvette vorliegen, damit es während des Sequenziervorgangs weder durch den erforderlichen Austausch der Reaktionslösungen noch durch Erschütterungen des Geräts zu einer Veränderung der Ku gelanordnung kommt. Furthermore, the balls must be in closest packing in the cell, so that there is gelanordnung during the sequencing process either by the necessary exchange of the reaction solution or by vibrations of the instrument to a change in Ku. Obschon sich auf diese Weise viele Sequenzierreaktionen auf klei nem Raum durchführen lassen, hat die Anordnung in einer sehr engen Küvette (wenige Mikrometer Höhe) erhebliche Nachteile, da eine gleichmäßige Befüllung der Küvette schwer zu erreichen ist. Although to be carried out many sequencing on klei nem space in this way, the arrangement in a very narrow cell (a few microns high) has considerable disadvantages, since a uniform filling of the cuvette is difficult to achieve. Ein weiterer Nachteil besteht im hohen apparativen Aufwand des Verfahrens. Another disadvantage is the high equipment expense of the process. So muß beispielsweise mit hohen Drücken gearbeitet werden, damit trotz der kleinen Küvettengröße ein effizienter Austausch der notwendigen Reaktionslösungen möglich ist. So necessary to work with high pressures, for example, so that despite the small cuvette an efficient exchange of the necessary reaction solutions is possible. Noch ein weiterer Nachteil besteht im leichten Verstopfen der Küvette, wel ches ebenfalls durch die notwendigerweise geringen Maße der Küvette begünstigt wird. Yet another drawback is the easy plugging of the cuvette wel ches is also favored by the necessarily small dimensions of the cuvette.

Die bekannten Verfahren zur Nukleinsäureseanalytik weisen einen oder mehrere der fol genden Nachteile auf: The known methods for Nukleinsäureseanalytik have one or more of the fol lowing disadvantages:

  • - Sie ermöglichen nur in stark eingeschränkten Umfang die parallelisierte Durchführung von einzelnen Sequenzierungsreaktionen. - They allow only very limited scope of the parallelized execution of individual sequencing reactions.
  • - Sie benötigen relativ große Mengen der Nukleinsäure, deren Sequenz bestimmt werden soll. - you need relatively large amounts of nucleic acid whose sequence is to be determined.
  • - Sie sind nur zur Sequenzbestimmung kurzen Sequenzabschnitten geeignet und appara tiv aufwendig. - They are only suitable for sequencing short sequence segments and Appara tive consuming.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet. It is an object of the invention to provide a method which overcomes the disadvantages of the prior art.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nuklein säuren gelöst, wobei The inventive object is achieved by a method for parallel sequencing of at least two different nucleic acid contained in a mixture of nucleic acids, wherein

  • a) eine Oberfläche bereitgestellt wird, aufweisend Inseln von Nukleinsäuren jeweils gleicher Sorte, tertiäre Nukleinsäuren; a) is a surface provided, comprising islands of nucleic acids each variety, tertiary nucleic acids;
  • b) Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden; b) opposite strands of the tertiary nucleic acids, GTN provided;
  • c) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei c) the GTN be extended by one nucleotide, wherein
    • - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutz gruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert, - carrying the nucleotide at the 2'-OH position or at the 3'-OH position a protective group which prevents further extension
    • - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht; - the nucleotide carries a molecular group which enables the identification of the nucleotide;
  • d) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird; d) identifying the incorporated nucleotide;
  • e) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation verwendete Molekül gruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird, und e) the protecting group is removed and the molecule-group used for the identification of the incorporated nucleotide is removed or changed, and
  • f) Schritt (c) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die ge wünschte Sequenzinformation erhalten worden ist. f) Step (c) and subsequent steps are repeated until the desired ge sequence information has been obtained.

Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt das nachfolgen de dar, bei dem im Schritt (a) A special embodiment of the inventive method provides the de follow illustrate, wherein in step (a)

  • 1. eine Oberfläche bereitgestellt wird, an welche mindestens Primermoleküle eines ersten Primers und eines zweiten Primers und gegebenenfalls ein Nu kleinsäuregemisch umfassend die Nukleinsäuremoleküle, mit welchen beide Primer hybridisieren können, irreversibel immobilisiert worden sind, wobei beide Primer ein Primerpaar bilden; 1, a surface is provided, to which at least primer molecules of a first primer and a second primer, and optionally a Nu, are small mixed acid comprising the nucleic acid molecules with which both primers are capable of hybridizing been irreversibly immobilized, wherein both primers form a primer pair;
  • 2. Nukleinsäuremoleküle des Nukleinsäuregemischs mit einem oder mit bei den Primern desselben Primerpaares hybridisiert werden; 2. Nucleic acid molecules of the nucleic acid mixture are hybridized with one or the same with the primers primer pair;
  • 3. die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden; 3. irreversibly immobilized primer molecules are extended to the complementary Ge gens Trang to form secondary nucleic acids;
  • 4. die Oberfläche in einer von Nukleinäuremolekülen, die nicht durch irrever sible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen sind, befreiten Form bereitgestellt wird; 4. The surface in one of Nukleinäuremolekülen that are not bound by irrever sible immobilization to the surface, freed form is provided;
  • 5. die sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden. 5, the secondary nucleic acids are amplified to form tertiary nucleic acids.

Tertiäre Nukleinsäuren nach Maßgabe des Schritts (a) können bereitgestellt werden, indem man von einer Oberfläche ausgeht, an welche mindestens ein erster Primer und ein zweiter Primer und gegebenenfalls ein Nukleinsäuregemisch umfassend die Nukleinsäuremolekü le, mit welchen beide Primer hybridisieren können, irreversibel immobilisiert worden sind. Tertiary nucleic acids in accordance with step (a) can be provided, by starting from a surface to which at least a first primer and a second primer, and optionally a nucleic acid mixture, the Nukleinsäuremolekü le with which both primers are capable of hybridizing, have been irreversibly immobilized comprising , Beide Primer bilden ein Primerpaar, können also an Strang bzw. Gegenstrang der Nuklein säuremoleküle binden. Both primers form a primer pair can therefore acid molecules bind to strand or strand of nucleic. Wenn die Nukleinsäuremoleküle des Nukleinsäuregemischs an der Oberfläche bereits gebunden sind, dann kann die Hybridisierung in Schritt (a2) durch blo ßes Erhitzen und Abkühlen bewirkt werden. If the nucleic acid molecules of the nucleic acid mixture are already bound to the surface, then the hybridization in step (a2) by blo SLI heating and cooling can be effected. Andernfalls müssen die Nukleinsäuremole küle des Nukleinsäuregemischs in Schritt (a2) mit der Oberfläche in Kontakt gebracht werden. Otherwise, the Nukleinsäuremole must be brought into contact with nucleic acid molecules of the mixture in step (a2) with the surface. In diesem Zusammenhang wird auch auf die WO 00/18957 verwiesen. In this connection, reference is also made to WO 00/18957. Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt das nachfolgen de dar, bei dem im Schritt (a1) eine Oberfläche, an welche mindestens ein Primerpaar bildende Primermo leküle irreversibel immobilisiert wurden, bereitgestellt wird. A special embodiment of the inventive method provides the de follow illustrate, wherein in step (a1) a surface to which at least one primer pair forming Primermo leküle were irreversibly immobilized, is provided.

Die einzelnen durchzuführenden Arbeitsschritte lassen sich bei dieser Ausführungsform auch wie folgt wiedergeben: The individual steps to be carried out can also play as follows in this embodiment:

  • - Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, werden an eine Oberfläche ir reversibel immobilisiert; - primer molecules which form at least a pair of primers are immobilized to a surface ir reversible;
  • - Nukleinsäuremoleküle werden mit einem oder mit beiden Primern desselben Primer paares hybridisiert, indem man das Nukleinsäuregemisch mit der Oberfläche in Kon takt bringt; - nucleic acid molecules are hybridized with one or two primers of the same primer pair, by bringing the nucleic acid mixture with the surface in con tact;
  • - die irreversibel immobilisierten Primermoleküle werden komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert; - the irreversibly immobilized primer molecules are extended to the complementary Ge gens Trang to form secondary nucleic acids;
  • - die nicht durch irreversible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen Nukleinäu remoleküle werden von der Oberfläche entfernt; - the non-bound by irreversible immobilization on the surface Nukleinäu be removed from the surface acid molecules;
  • - die sekundären Nukleinsäuren werden unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren am plifiziert; - the secondary nucleic acids are plifiziert to form tertiary nucleic acids on;
  • - Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, werden bereitgestellt; - opposite strands of the tertiary nucleic acids, GTN, are provided;
  • - die GTN werden um ein Nukleotid verlängert, wobei - GTN be extended by one nucleotide, wherein
  • - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutzgruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert, - the nucleotide carrying a protective group at the 2'-OH position or at the 3'-OH position, which prevents further extension
  • - das Nukleotid trägt eine Molekülgruppe, die die Identifikation des Nukleotids ermög licht; - the nucleotide carries a molecular group which made the identification of the nucleotide light;
  • - das eingebaute Nukleotid wird identifiziert; - the incorporated nucleotide is identified;
  • - die Schutzgruppe wird entfernt und die zur Identifikation verwendete Molekülgruppe des eingebauten Nukleotids wird entfernt oder verändert, und - the protecting group is removed and the molecular group of the incorporated nucleotide used for identification is removed or altered, and
  • - der 7. Schritt und die nachfolgende Schritte werden solange wiederholt, bis die ge wünschte Sequenzinformation erhalten worden ist. - the seventh step and the subsequent steps are repeated until the ge wished sequence information has been obtained.

Bei dem Nukleinsäuregemisch des Schritts (a2) kann es sich zum Beispiel um eine Bi bliothek handeln, also um Nukleinsäuremoleküle, die über weite Strecken eine identische Sequenz aufweisen, sich aber in einem Teilbereich inmitten der identischen Bereiche stark unterscheiden. The nucleic acid mixture of step (a2) may be for example a Bi bliothek, so to nucleic acid molecules having an identical sequence over long distances, but differ greatly in a section in the middle of the identical portions. Häufig bestehen die Bibliotheken aus gegebenenfalls linearisierten Plasmi den, in welche verschiedene Nukleinsäurefragmente einkloniert wurden, die später sequen ziert werden sollen. Often the libraries consist of optionally linearized Plasmi the one in which different nucleic acid fragments were cloned, which will later be sequenced sheet. Ferner kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um Restriktions fragmente handeln, an deren Schnittenden Linkermoleküle gleicher Sequenz ligiert wur den. Further, it may be the nucleic acid mixture to restriction fragments act the same at the cut ends linker molecules sequence WUR ligated to. Hierbei unterscheiden sich in der Regel die Linker, die an das 5'-Ende der Fragmente gebunden werden von den Linkern, die an das 3'-Ende der Fragmente gebunden werden. Here, the linkers that are attached to the 5'-end of the fragments of the linkers that are bound to the 3'-end of the fragments differ in the rule. Jedenfalls ist in der Regel der interessierende Sequenzabschnitt in den Nukleinsäuremole külen des Nukleinsäuregemischs von zwei flankierenden im wesentlichen bei allen Nu kleinsäuremolekülen jeweils identischen Sequenzabschnitten umgeben, von denen minde stens einer der beiden Sequenzabschnitte bevorzugt eine selbstkomplementäre Sequenz aufweist. In any case, in general, the sequence of interest portion in the Nukleinsäuremole cules of the nucleic acid mixture of two flanking substantially small acid molecules in all Nu each identical sequence sections surrounded, of which minde least one of the two sequence segments is preferably a self-complementary sequence comprises. Der betreffende Sequenzabschnitt besitzt in einzelsträngiger Form eine ausge prägte Neigung zur Ausbildung einer sogenannten Hairpinstruktur. in single-stranded form of the sequence section in question has been coined tendency to form a so-called hairpin structure.

Die Primer oder die Primermoleküle in Schritt (a1 bis a3) sind einzelsträngige Nukleinsäu remoleküle einer Länge von etwa 12 bis etwa 60 Nukleotidbausteinen und mehr, die sich im weitesten Sinne für die Verwendung im Rahmen der PCR eignen. The primer or the primer molecules in step (a1 to a3) are single-stranded nucleic acid molecules of a length of about 12 to about 60 nucleotide units and more suitable in the broadest sense for use in the PCR. Es handelt sich um RNA-Moleküle, DNA-Moleküle oder deren Analoga, die zur Hybridisierung mit einer zumindest über einen Teilbereich komplementären Nukleinsäure bestimmt sind und als Hybrid mit der Nukleinsäure ein Substrat für eine Dopplestrang-spezifische Polymerase darstellen. These are RNA molecules, DNA molecules or analogs thereof, which are intended for hybridization with a complementary over at least a portion of nucleic acid and represented as a hybrid of the nucleic acid with a substrate for a double strand-specific polymerase. Bei der Polymerase handelt es sich vorzugsweise um DNA Polymerase I, T7- DNA-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, um Polymerasen, die bei der PCR Anwendung finden, oder auch um eine Reverse Transkriptase. In the polymerase it is preferably DNA polymerase I, T7 DNA polymerase, Klenow fragment of DNA polymerase I to polymerases, which are in the PCR application, or also a reverse transcriptase.

Das Primerpaar in Schritt (a2) stellt einen Satz von zwei Primern dar, die an Bereiche einer Nukleinsäure binden, die die zu amplifizierende Zielsequenz der Nukleinsäure flankieren. The primer pair in step (a2) represents a set of two primers that bind to regions of a nucleic acid which flank the target sequence to be amplified the nucleic acid. Bei diesen Bereichen handelt es sich bevorzugt um Sequenzabschnitte, die bei den Nukleinsäuremolekülen des Nukleinsäuregemisches identisch sind. These areas are preferably sequence sections that are identical with the nucleic acid molecules of the nucleic acid mixture. Zum Beispiel kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um eine Plasmid-Bibliothek handeln. For example, it may be the nucleic acid mixture to a plasmid library. Die Primer würden dann bevorzugt in dem Bereich der sogenannten Multiple Cloning Site (MCS) binden, und zwar einmal oberhalb und einmal unterhalb der Klonierungsstelle. The primer would then preferably in the range of so-called multiple cloning site (MCS) bind, once above and once below the cloning site. Ferner könnten die Pri mer an die Sequenzabschnitte binden, die den Linkem entsprechen, die, wie oben be schrieben, an Restriktionsfragmente beidseitig ligiert wurden. Furthermore, the Pri mer could bind to the sequence sections corresponding to the linkers, which, as above, be attributed, were ligated at both ends of restriction fragments. Das erfindungsgemäße Ver fahren wird bevorzugt mit nur einem Primerpaar durchgeführt, etwa wie das in der US-A 5 641 658 (WO 96/04404) beschriebene Verfahren, in dem auch nur ein Primerpaar einge setzt wird. The drive Ver inventive method about as described in US-A 5641658 (WO 96/04404) described, in which only one primer pair is introduced is preferably carried out with only one primer pair will. Erfindungsgemäß bevorzugt binden die Primer des Primerpaars oder oder der Primerpaare an Sequenzbereiche, die bei allen oder bei fast allen Nukleinsäuren des Nu kleinsäuregemischs im wesentlichen identisch sind (sogenannte konservierte Bereiche). According to the invention, the primers of the primer pair, or or the primer pairs of sequence regions that are identical in all or almost all nucleic acids of the nucleic acid mixture substantially bind (so-called conserved regions). Die Primer eines Primerpaars können im übrigen auch dieselbe Sequenz aufweisen. The primers of a primer pair can have, moreover, the same sequence. Dies kann dann von Vorteil sein, wenn die konservierten Bereiche, die die zu amplifizierende Sequenz flankieren, Sequenzen aufweisen, die zu einander komplementär sind. This may be advantageous if the conserved regions that flank the sequence to be amplified, having sequences that are complementary to each other.

Einer der Primer eines Primerpaars kann eine Sequenz, die die Ausbildung einer intramo lekularen Nukleinsäuredoppelhelix (einer sogenannten Hairpinstruktur) ermöglicht, auf weisen, wobei allerdings ein aus mindestens 13 Nukleotidbausteinen bestehender Bereich des 3'-Terminus ungepaart bleibt. One of the primers of a primer pair may have a sequence that enables the formation of a intramo-molecular nucleic acid double helix (a so-called hairpin structure), wherein, however, an existing of at least 13 nucleotide region of the 3 'terminus remains unpaired.

Bei der Oberfläche in Schritt (a, a1 und a2, a4) handelt es sich um die zugängliche Fläche eines Körpers aus Kunststoff, Metall, Glas, Silicium oder ähnlich geeigneten Werkstoffen. In the surface in step (a, a1 and a2, a4) is the accessible surface of a body made of plastic, metal, glass, silicon, or similar suitable materials. Vorzugsweise ist diese flach, insbesondere plan ausgestaltet. Preferably, this is flat, in particular plane-configured. Die Oberfläche kann eine quellbare Schicht aufweisen, zum Beispiel aus Polysacchariden, Polyzuckeralkoholen oder quellbaren Silikaten. The surface may be a swellable layer, for example, polysaccharides, polysugar alcohols or swellable silicates.

Irreversible Immobilisierung meint das Ausbilden von Wechselwirkungen mit der oben beschriebenen Oberfläche, die bei 95°C und der üblichen Ionenstärke bei den PCR- Amplifikationen des Schritts (a5) im Stundenmaßstab stabil sind. Irreversible immobilization means the formation of interaction with the above-described surface, which are stable at 95 ° C and the usual ionic strength with the PCR amplifications of the step (a5) in the hour scale. Bevorzugterweise han delt es sich dabei um kovalente Bindungen, die auch spaltbar sein können. Preferably, it han color changes are covalent bonds that can be cleaved. Bevorzugt wer den die Primermoleküle in Schritt (a) über die 5'-Termini irreversibel an der Oberfläche immobilisiert. Preferably whoever the primer molecules in step (a) immobilized via the 5 'termini irreversibly to the surface. Alternativ kann eine Immobilisierung auch über ein oder mehrere Nukleo tidbausteine, die zwischen den Termini des betreffenden Primermoleküls liegen, immobili siert werden, wobei allerdings ein Sequenzabschnitt von mindestens 13 Nukleotidbaustei nen gerechnet von dem 3'-Terminus ungebunden bleiben muß. Alternatively, immobilization may be via one or more nucleo tidbausteine, which lie between the respective termini of the primer molecule immobili Siert, but which must remain unbound from the 3 'terminus a sequence segment of at least 13 Nukleotidbaustei NEN expected. Bevorzugt erfolgt die Im mobilisierung durch Ausbildung kovalenter Bindungen. In the covalent bonds is preferably carried out by forming mobilization. Hierbei ist natürlich auf eine ent sprechende Belegungsdichte zu achten, die die Kontaktaufnahme der an der Polymerasekettenreaktion beteiligten Primer und Nukleinsäuren ermöglicht. Here, of course, is to pay attention to take out a suitable occupation density, which enables contact the primer and nucleic acids involved in the polymerase chain reaction. Werden zwei Primer immobilisiert, so sollten die Primer einen mittleren Abstand auf der Oberfläche haben, der zumindest größenordnungsmäßig mit der maximalen Länge bei vollständiger Streckung der zu amplifizierenden Nukleinsäuremoleküle übereinstimmt oder aber kleiner ist. Two primers immobilized, the primers should have an average distance to the surface that matches at least in order of magnitude with the maximum length at full extension of the amplified nucleic acid molecules or to but smaller. Hierbei ist im wesentlichen zu verfahren, wie in US-A 5 641 658 oder WO 96/04404 beschrieben. Here, as in US-A 5,641,658 or WO 96/04404 is to proceed substantially as described.

Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, chemisch geeignet derivatisierte Oli gonukleotide an Glasoberflächen zu binden. Methods are known from the prior art, chemically suitable derivatized Oli gonukleotide to bind to glass surfaces. Besonders geeignet sind hierzu beispielsweise endständige, über einen mehratomigen Spacer an das 5'-Ende des Oligonukleotids gebun dene primäre Aminogruppen ("Aminolink"), welche leicht im Zuge der Oligonukleo tidsynthese inkorporiert werden können und gut mit Isothiocyanat-modifizierten Oberflä chen reagieren können. Particularly suitable for this purpose, for example, terminal, via a polyatomic spacer to the 5'-end of the oligonucleotide TIALLY dene primary amino groups ( "Aminolink") which in the course of Oligonukleo tidsynthese can be incorporated easily and can react well with isothiocyanate modified Oberflä chen. Beispielsweise beschreiben Guo et al, (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5456-5465) ein Verfahren, Glasoberflächen mit Aminosilan und Phenylendii sothiocyanat zu aktivieren und anschließend 5'-aminomodifizierte Oligonukleotide hieran zu binden. For example, Guo et al, (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5456-5465) to enable a process, glass surfaces with aminosilane and Phenylendii isothiocyanate and then to bind the 5'-amino-modified oligonucleotides thereto. Besonders geeignet ist die Carbodiimid-vermittelte Bindung 5'-phosphorylierter Oligonukleotide an aktivierte Polystyrolträger (Rasmussen et al., Anal. Biochem 198 (1991), 138-142). Particularly suitable are the carbodiimide-mediated binding of 5'-phosphorylated oligonucleotides is to activated polystyrene support (Rasmussen et al., Anal. Biochem 198 (1991), 138-142). Ein anderes bekanntes Verfahren nutzt die hohe Affinität von Gold für Thiolgruppen zur Bindung von Thiol-modifizierten Oligonukleotiden an Goldoberflächen aus (Hegner et al, FEBS Lett 336 (1993), 452-456). Another known method utilizes the high affinity of gold for thiol groups to bind thiol-modified oligonucleotides to gold surfaces (Hegner et al, FEBS Lett 336 (1993), 452-456).

Der Begriff sekundäre Nukleinsäure in Schritt (a3) bezeichnet diejenigen Nukleinsäure moleküle, die durch komplementäre Verlängerung von Primermolekülen entstehen, wobei die Verlängerung komplementär zu den Nukleinsäuremolekülen des Schritts (a2) erfolgt, die mit den Primern hybridisiert wurden. The term secondary nucleic acid in step (a3) ​​designates those nucleic acid molecules which arise by complementary extension of primer molecules, wherein the extension is complementary to the nucleic acid molecules of step (a2), which were hybridized with the primers.

Die Oberfläche wird in einer von Nukleinsäuremolekülen, die nicht durch irreversible Im mobilisierung an die Oberfläche gebundenen sind, befreiten Form bereitgestellt (a4). The surface is provided in a nucleic acid molecules that are not by irreversible In mobilization bound to the surface, freed form (a4). So fern die Nukleinsäuremoleküle aus Schritt (a1) in Schritt (a1) an die Oberfläche bereits irreversibel immobilisiert worden sind, werden in Schritt (a2) in der Regel keine Nuklein säuremoleküle mit der Oberfläche in Kontakt gebracht. So far, the nucleic acid molecules of step (a1) in step (a1) to the surface have already been irreversibly immobilized, are used in step (a2) is usually no nucleic acid molecules with the surface brought into contact. Folglich müssen sie in den nach folgenden Schritten auch nicht entfernt werden. Consequently, they must also not be removed in the following steps. Wenn in Schritt (a2) Nukleinsäuremole küle zwecks Hybridisierung mit den Primern mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wer den, etwa weil die Nukleinsäuremoleküle nicht schon in Schritt (a1) an die Oberfläche ir reversibel immobilisiert worden sind, dann können diese in Schritt (a4) durch Waschen entfernt werden. In step (a2) Nukleinsäuremole molecules for the purpose of hybridization with the primers with the surface contacted who to, such as the nucleic acid molecules are not already in step (a1) are reversibly immobilized on the surface ir, then can use this in step (a4) are removed by washing. Es ist möglich, jedoch nicht bevorzugt, die Entfernung der vorgenannten Nukleinsäuremoleküle erst nach Durchlaufen eines oder mehrerer Amplifikationszyklen des Schritts (a5) vorzunehmen. It is possible, but not preferred to make the removal of the aforementioned nucleic acid molecules only after passing through one or more cycles of amplification of the step (a5).

Der Begriff tertiäre Nukleinsäuren bezeichnet sekundäre Nukleinsäuren sowie diejenigen Nukleinsäuremoleküle, die aus den sekundären Nukleinsäuren nach dem Verfahren der Polymerasekettenreaktion im Schritt (a5) gebildet werden. The term tertiary nucleic acids referred to secondary nucleic acids as well as those nucleic acid molecules from the secondary nucleic acids by the method of polymerase chain reaction in the step (a5) are formed. Hierbei ist es wichtig, daß Oberfläche und der die Oberfläche umgebende flüssige Reaktionsraum frei von zu amplifi zierenden Nukleinsäuren ist, die nicht irreversibel an die Oberfläche immobilisiert sind. It is important that the surface and the surface surrounding liquid reaction space is free of amplifi to ornamental nucleic acids that are not irreversibly immobilized on the surface. Durch die Amplifikation entstehen in der Regel regelrechte Inseln, das heißt diskrete Be reiche auf der Oberfläche, die tertiäre Nukleinsäuren der gleichen Sorte, das heißt identi sche oder hierzu komplementäre Nukleinsäuremoleküle, tragen. By amplification veritable islands usually arise, that is discrete Be rich on the surface, the tertiary nucleic acids of the same kind, that is identi cal or to their complementary nucleic acid molecules bearing.

In Schritt (b) werden Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren (GTN) bereitgestellt. In step (b) counter-strands of the tertiary nucleic acids (GTN) may be provided. Dies kann zum Beispiel durch eine von drei Maßnahmen geschehen, die im folgenden aufge führt werden: This can happen, for example, by one of three measures that will lead in following up:

  • - Zum einen können in Schritt (a1) Primermoleküle oder gegebenenfalls in Schritt (a1 oder a2) Nukleinsäuremoleküle (des Nukleinsäuregemischs) mit flankierenden Sequenzabschnitten verwendet werden, die selbstkomplementäre Bereiche aufwei sen und somit zur intramolekularen Basenpaarung in der Lage sind, was sich in ei ner sogenannten Hairpinstruktur äußert (siehe auch Fig. 3: Ligation von "maskier ten Hairpins" in Form doppelsträngiger Linkermoleküle). - On the one in step (a1) primer molecules or, where appropriate in step (a1 or a2) nucleic acid molecules (of the nucleic acid mixture) can be used with flanking sequence portions sen the self-complementary regions aufwei and thus the intramolecular base-pairing in a position which is ner in egg so-called hairpin structure expressed (see also Fig. 3: ligation of "masking th hairpins" in the form of double-stranded linker molecules). Die in Schritt (a5) gebil deten tertiären Nukleinsäuren weisen dann im einzelsträngigen Zustand, der durch Entfernung eines der beiden Stränge unter denaturierenden Bedingungen herbeige führt wird, in der Nähe ihres 3'-Terminus eine Rückfaltung in Form eines Hairpins auf. In step (a5) gebil Deten tertiary nucleic acids then have the single-stranded state that is by removal of one of the two strands under denaturing conditions herbeige leads, near its 3 'terminus to a refolding in the form of a hairpin. Bevorzugterweise reicht der doppelsträngige Anteil des Hairpins bis ein schließlich zur letzten Base des 3'-Endes, so daß besagter Hairpin unmittelbar als Substrat für eine zur Sequenzierung eingesetzte Polymerase dienen kann. Preferably, the double-stranded portion of the hairpin extends to a last, so that said hairpin may serve as a substrate for a polymerase used for sequencing to the last base of the 3 'end immediately. Dies ist durch geeignete Wahl der Sequenz der Primermoleküle bzw. der die Nukleinsäu remoleküle flankierenden Sequenzabschnitte zu gewährleisten. This must be ensured by appropriate selection of the sequence of primer molecules or nucleic acid molecules, the flanking sequence segments.
  • - Zweitens können GTN in Form von Hairpins durch Ligation von Oligonukleotiden bereitgestellt werden, die zur Hairpinbildung befähigt sind und gegebenenfalls be reits in Gestalt von Hairpins zur Ligation eingesetzt werden (siehe auch Fig. 2). - secondly GTN may be in the form of hairpins by ligation of oligonucleotides are provided that are capable of Hairpinbildung and optionally already be in the shape of hairpins are used for ligation (see also Fig. 2). Dies kann so geschehen, daß die tertiären Nukleinsäuren im doppelsträngigem (das heißt nicht denaturiertem) Zustand geschnitten und auf diese Weise einseitig von der Oberfläche abgetrennt werden. This can be done so that the tertiary nucleic acids in double-stranded (i.e., undenatured) state cut and separated in this way on one side of the surface. Bevorzugterweise geschieht dies durch Inkuba tion mit einer Restriktionsendonuklease, welche in genau einer der aus einem der beiden Primer stammenden Sequenzen (Primersequenzen) oder in einer an diese Primersequenzen angrenzenden Sequenzen eine Erkennungsstelle aufweist. Preferably, this is done by Inkuba tion with a restriction endonuclease which has a recognition site in exactly one of originating from one of the two primer sequences (primer sequences) or in a position adjacent to these primer sequences sequences. Nach erfolgtem Restriktionsschnitt ragt dann ein freies Ende der tertiären Nukleinsäuren in den Lösungsraum, welches je nach verwendeter Restriktionsendonuklease ein überhängendes Ende voraussagbarer Sequenz besitzt und an welches das Oligonu kleotid hybridisiert und ligiert werden kann. After the restriction a free end of the tertiary nucleic acids in the solution space, which depending on the restriction endonuclease has a protruding end predictable sequence and to which the Oligonu can be annealed and ligated kleotid then projects. Besonders geeignet wäre hierfür ein Oligonukleotid, welches bereits eine Hairpinstruktur ausgebildet hat, demnach also partiell doppelsträngig vorliegt, und einen zum freien Ende der tertiären Nuklein säuren komplementären Überhang besitzt. this would be particularly suitable is an oligonucleotide which has already formed a hairpin structure, so therefore partially double is present and has a acids to the free end of the tertiary nucleic complementary overhang. Um zu gewährleisten, daß eine Ligation ausschließlich an den irreversibel immobilisierten Strang des Doppelstrangs der tertiären Nukleinsäuren stattfindet, sollte das 5'-Ende des Oligonukleotids eine Phosphatgruppe tragen, während sich das 3'-Ende des irreversibel immobilisierten Strangs sowie das 5'-Ende des mit diesem hybridisierten Gegenstrangs eine OH- Gruppe aufweisen (siehe Fig. 2, Schritte 1 und 2). In order to ensure that ligation takes place exclusively at the irreversibly immobilized strand of the double strand of the tertiary nucleic acids, the 5 'end of the oligonucleotide should carry a phosphate group, while the 3'-end of the irreversibly immobilized strand, and the 5'-end of the hybridized with this opposite strand having an OH group (see Fig. 2, steps 1 and 2). Nach erfolgter Ligation wird der nicht irreversibel immobilisierte Strang der tertiären Nukleinsäuren unter denaturie renden Bedingungen entfernt. After ligation of not irreversible immobilized strand of the tertiary nucleic acids is removed under denaturing conditions in power. Alternativ hierzu könnte auch, wie in der US-A 5 798 210 vorgeschlagen (siehe dort insbesondere Fig. 7), eine Ligation eines zum Hair pin rückgefalteten Oligonukleotids an den einzelsträngig vorliegenden immobili sierten Strang der tertiären Nukleinsäuren vorgenommen werden. Alternatively, as proposed in US-A 5,798,210, a ligation of a refolded to Hair pin overbased oligonucleotide to the single stranded nucleic acids present immobili strand of the tertiary could also (cf. in particular Fig 7.) Are made. Problematisch ist bei dieser zweiten Maßnahme, daß eine oft beobachtete unzureichende Effizienz des Ligationsschritts vor der Sequenzierung nicht mehr wie bei der ersten Maß nahme durch Amplifikationsschritte kompensiert werden kann. The problem with this second measure is that one often observed inadequate efficiency of the ligation step prior to sequencing no more acceptance as the first level can be compensated by amplification. Dies kann dann eine zu geringe Signalstärke bei der nachfolgenden Sequenzierung zur Folge haben. This may have a low signal strength in the subsequent sequencing result.
  • - Drittens ist es auch möglich, Oligonukleotide, die nicht zur Ausbildung einer Hair pinstruktur in der Lage sind, mit den tertiären Nukleinsäuren unter Ausbildung von GTN zu hybridisieren (vgl. US-A 5 798 210, Fig. 8). - Thirdly, it is also possible to oligonucleotides that are not to form a hair pin structure capable of hybridizing with the tertiary nucleic acids with the formation of GTN (see US-A 5,798,210, Fig. 8.). Diese Alternative käme jeden falls nur dann in Frage, wenn in Schritt (a5) Bedingungen gewählt werden, die nicht zur Denaturierung, das heißt nicht zur Aufschmelzung der Doppelstränge, be stehend aus ggf. verlängerten Oligonukleotiden und tertiären Nukleinsäuren, füh ren. Wird in Schritt (a5) unter denaturierenden Bedingungen gearbeitet (z. B. durch Einsatz stärkerer Basen), wird man vorzugsweise auf die anderen Maßnahmen zu rückgreifen. This alternative would in any case only be considered if conditions are selected in step (a5) not to denature, that is not the melting of duplexes be standing out possibly extended oligonucleotides and tertiary nucleic acids füh, reindeer. If in step (a5) worked under denaturing conditions (eg., by use of stronger bases), it is preferably to resort to other measures.

Im Rahmen der beschriebenen Maßnahmen spielt die Länge der Oligonukleotide eine un tergeordnete Rolle. As part of the measures described, the length of the oligonucleotides plays an un subordinate role. In der Regel werden die Oligonukleotide eine Länge von kleiner 100 oder von kleiner 50 Nukleotidbausteinen aufweisen, so daß man auch allgemein von Nu kleinsäuren (hier: polymere Nukleotide, die mehr als drei Nukleotidbausteine umfassen) sprechen kann. In general, the oligonucleotides have a length of less than 100 or less than 50 nucleotide building blocks, so that it is also generally small acids Nu: can speak (here polymeric nucleotides comprising more than three nucleotide). Einzelsträngige Oligonukleotide einer Länge von größer 45 Nukleotidbausteinen sind infolge unspezifischer Wechselwirkungen nur schwer handhabbar, wenn sie keine Sequenz aufweisen, die Hairpins ermöglicht. Single-stranded oligonucleotides of length greater than 45 nucleotide building blocks are difficult to handle due to nonspecific interactions if they have no sequence, allows the hairpins. Durch die Fähigkeit, Hairpins auszu bilden, werden unspezifische Wechselwirkungen durch Kompetition vermindert. form, for For by the ability hairpins, non-specific interactions can be reduced by competition. Werden doppelsträngige Oligonukleotide eingesetzt, dann spielt folglich die Länge der Oligonu kleotide kaum eine Rolle (siehe auch Fig. 3). Be double-stranded oligonucleotides used, then the length of Oligonu therefore plays kleotide hardly any role (see also Fig. 3).

Alle vier Maßnahmen haben zur Folge, daß die tertiären Nukleinsäuren einen doppelsträn gigen Teilbereich aufweisen, der eine Strangverlängerung an den Gegensträngen der tertiä ren Nukleinsäuren (GTN) durch eine DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase er möglicht. All four measures have the effect that the tertiary nucleic acids have a doppelsträn Gigen portion, the strand extension in the complementary strands of the nucleic acids tertiae ren (GTN) by a DNA polymerase or reverse transcriptase, it made possible.

Bei dem Nukleotid, das in Schritt (c) komplementär zum Gegenstrang eingebaut wird, handelt es sich um ein entschützbares Abbruchnukleotid. The nucleotide used in step (c) is incorporated is complementary to the opposite strand, it is a entschützbares Abbruchnukleotid. Geeignete Abbruchnukleotide sind zum Beispiel aus US-A 5 798 210 bekannt. Suitable Abbruchnukleotide are known for example from US-A 5,798,210. Canard und Sarfati (Gene 148 (1994) 1-6) beschreiben 3'-veresterte Nukleotide, welche ein zusammen mit der Schutzgruppe abspalt bares Fluorophor enthalten. Canard and Sarfati (Gene 148 (1994) 1-6) describe 3'-esterified nucleotides containing a together with the protecting group abspalt bares fluorophore. Diese Nukleotidbausteine können mit allerdings niedriger Ef fizienz von verschiedenen Polymerasen in einen wachsenden Strang inkorporiert werden und wirken dann als Abbruchnukleotide, lassen also keine weitere Strangverlängerung zu. These nucleotide can be incorporated ciency of different polymerases in a growing strand and then act as Abbruchnukleotide, so let no further strand extension to, albeit with lower Ef. Die beschriebenen Ester lassen sich alkalisch oder enzymatisch abspalten, so daß freie, weitere Nukleotidinkorporation erlaubende 3'-OH-Gruppen entstehen. The esters described can be split off enzymatically or alkaline, so that free, more Nukleotidinkorporation permitting 3'-OH groups are formed. Die Esterspaltung erfolgt allerdings sehr langsam (innerhalb von 2 Stunden), so daß die beschriebenen Ver bindungen für eine Sequenzierung längerer DNA-Abschnitte (z. B. mehr als 20 Basen) un geeignet sind. However, the Esterspaltung is very slow (within 2 hours), so that the compounds described Ver for sequencing longer DNA segments (e.g., as more than 20 bases) un are suitable. Solange die Schutzgruppe in 3'-OH oder gegebenenfalls 2'-OH-Position (siehe unten) gebunden ist, stellt die um dieses Nukleotid verlängerte quartäre Nukleinsäu re kein Substrat mehr für eine Nukleinsäurepolymerase dar. Erst die Entfernung der Schutzgruppe in Schritt (e) macht eine weitere Verlängerung der quartären Nukleinsäure möglich. As long as the protecting group at the 3'-OH or optionally 2'-OH position (see below) is attached, the quaternary nucleic extended by this nucleotide re no longer a substrate for a nucleic acid polymerase. It is only the removal of the protecting group in step (e) makes a further extension of the quaternary nucleic possible. Die Schutzgruppe trägt außerdem in der Regel eine Molekülgruppe, die die Iden tifikation des eingebauten Nukleotids und so die Sequenzierung des wachsenden Nuklein säurestranges ermöglicht und das Nukleotid mit der Abspaltung der Schutzgruppe verläßt. The Working Party also usually wears a molecular group which enables the Ides fication of the incorporated nucleotide and so the sequencing of the growing nucleic acid strand and leaves the nucleotide with the removal of the protective group. Allerdings kann die identifizierende Molekülgruppe auch an einer anderen Stelle des Nu kleotids, zum Beipiel an der Base, gebunden sein. However, the identifying group of molecules can kleotids also at another point of the Nu, be bound to the Example of the base. In diesem Fall ist es notwendig, nach Schritt (d) in Schritt (e) das Signal der identifizierenden Molekülgruppe zu löschen. In this case, it is necessary to erase after step (d) in step (e) is the signal of the identifying group of molecules. Dies kann in der Regel auf zwei Arten erfolgen. This can be done generally in two ways. Zum Beispiel im Falle eines Fluorophors kann die Molekülgruppe durch Ausbleichen verändern werden. For example, in the case of a fluorophore molecule the group can be changed by fading. Daneben kann die identifizie rende Molekülgruppe auch entfernt werden, zum Beispiel durch photochemische Spaltung einer photolabilen Bindung. In addition, the identifica Rende molecular group may also be removed, for example by photochemical cleavage of a photolabile bond.

Ist die identifizierende Molekülgruppe nicht mit der Schutzgruppe verbunden und wird die identifizierende Molekülgruppe zur Signallöschung abgespalten, so ist die Bindung von Schutzgruppe an das Nukleotid und die Bindung von der identifizierenden Molekülgrup pe an das Nukleotid vorzugsweise so zu wählen, daß beide Gruppen in einem Reaktions schritt abgespalten werden können. Is the identifying group of molecules not connected with the protective group and the identifying molecule group is cleaved for signal cancellation, so the binding of protective group on the nucleotide and the binding of the identifying Molekülgrup pe at the nucleotide is preferably chosen so that both groups in one step reaction can be eliminated.

Bevorzugt trägt jeder der für den Einbau in Frage kommenden vier Nukleotidbausteine (G, A, T, C) eine andere identifizierende Molekülgruppe. Preferably, each bears the candidate for the installation of four nucleotide (G, A, T, C) other identifying molecular group. In diesem Fall können die vier Sor ten Nukleotide in Schritt (c) gleichzeitig angeboten werden. In this case, the four Sor th nucleotides can be offered simultaneously in step (c). Tragen verschiedene oder so gar alle Nukleotide dieselbe identifizierende Molekülgruppe, so ist Schritt (c) in in der Re gel vier Teilschritte zu zerlegen, in welchen die Nukleotide einer Sorte (G, A, T, C) ge trennt angeboten werden. Wear different or something even all nucleotides same identifying molecular group, step (c) in the re gel to break down four steps, are offered in which the nucleotides of one type (G, A, T, C) adjusted separately.

Bei der Molekülgruppe handelt es sich zum Beispiel um einen Fluorophor oder um einen Chromophor. In the group of molecules are, for example, a fluorophore or a chromophore. Letzterer könnte sein Absorptionsmaximum im sichtbaren oder im infraroten Frequenzbereich haben. The latter could have an absorption maximum in the visible or infrared frequency range. Die in Schritt (d) erfolgende Detektion erfolgt sowohl orts- als auch zeitaufgelöst, so daß die auf der Oberfläche befindlichen Inseln quartärer Nukleinsäu ren parallel sequenziert werden können. In step (d) taking place detection takes place both spatially and temporally resolved, so that the islands located on the surface of quaternary nucleic ren can be sequenced in parallel.

Als Schutzgruppe des Nukleotids in Schritt (c) ist ein chemischer Substituent zu verstehen, welcher die weitere Strangverlängerung nach Einbau des Nukleotids an dessen 3'-Position verhindert. As the protecting group of the nucleotide in step (c) is meant a chemical substituent which prevents the further strand extension after incorporation of the nucleotide at the 3'-position. Dabei kann die Schutzgruppe die zu schützende 3'-Position besetzen, also mit dem C-3 der Ribose verbunden sein oder die zu schützende 3'-Position abschirmen und so die Srangverlängerung sterisch behindern. The protecting group can occupy the protected 3'-position, thus be connected to the C-3 of the ribose or the shield to be protected 3'-position, thus hindering the Srangverlängerung sterically. Im letzteren Fall würde die Schutzgruppe in benachbarter Position, insbesondere am C-2 der Ribose mit dem Nukleotid verbunden werden. In the latter case the protecting group would be joined at the adjacent position, particularly at the C-2 of the ribose with the nucleotide.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (a1) Primer oder Nukleinsäuremoleküle mit flankierenden Sequenzabschnitten verwendet, die selbstkomplementäre Bereiche aufweisen. In a further embodiment of the method in step (a1) are used primer or nucleic acid molecules with flanking sequence portions having self-complementary regions.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) die tertiären Nukleinsäuren durch eine Restriktionsendonuklase restringiert, bevor an die auf diese Weise generierten Enden Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpin struktur fähig sind, ligiert werden. In a further embodiment of the method in step (b), the tertiary nucleic acids restricted by a restriction endonuclease prior to be ligated to the ends of oligonucleotides generated in this way, which are structurally capable of forming a hairpin. Es wird auf die Erläuterungen zu Schritt (b), Maßnah me 2 auf Seite 13 verwiesen, insbesondere auf die Erklärung des Begriffs Oligonukleotid. It is to the explanations of step (b), measures me 2 on page 13 referred to, in particular the explanation of the term oligonucleotide.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die zur Aus bildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide einzelsträngig. In a further embodiment of the inventive method are the formation of a hairpin structure from single-stranded oligonucleotides capable. Einzelsträngig meint hier nicht durchgängig doppelsträngig. Single stranded here means not consistently double-stranded. Die Oligonukleotide liegen also nicht als Heterodimer vor. The oligonucleotides are not so before as a heterodimer. Dies ist zum Beispiel bei Fig. 2 der Fall. This is the case for example in FIG. 2.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die zur Aus bildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide doppelsträngig. In a further embodiment of the inventive method are the formation of a hairpin structure capable oligonucleotides from double-stranded. Die Oligonu kleotide liegen also als Heterodimer vor. The Oligonu kleotide are therefore present as a heterodimer. Dies ist zum Beispiel bei Fig. 3 der Fall. This is for example the case 3 in Fig..

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) einzelsträngige Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, an tertiäre Nukleinsäuren hybridisiert, bevor tertiäre Nukleinsäuren und vorgenannte ein zelstängige Oligonukleotide ligiert werden. In a further embodiment of the inventive method, in step (b) single-stranded oligonucleotides which are capable of forming a hairpin structure hybridizes to tertiary nucleic acids, nucleic acids and before tertiary aforesaid a zelstängige oligonucleotides are ligated. Dies ist zum Beispiel bei Fig. 2 der Fall. This is the case for example in FIG. 2.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (a, a1) die Primermoleküle durch Ausbildung einer kovalenten Bindung an eine Oberfläche irreversibel immobilisiert. In a further embodiment of the inventive process in step (a, a1) the primer molecules irreversibly immobilized by forming a covalent bond to a surface.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt in Schritt (c) die Base die Molekülgruppe, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht. In a further embodiment of the method according to the invention, the base bears in step (c) the molecular group that enables the identification of the nucleotide.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt in Schritt (c) das Nukleotid an der 3'-OH-Position die Schutzgruppe. In a further embodiment of the inventive method, the protecting group transmits in step (c) the nucleotide at the 3'-OH position.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Schutz gruppe eine spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Peroxid-Gruppe auf. In a further embodiment of the inventive method, the protecting group to a cleavable ester, ether, anhydride or peroxide group.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Schutzgrup pe über eine Sauerstoff-Metall-Bindung mit dem Nukleotid verbunden. In a further embodiment of the inventive method Schutzgrup pe is connected via an oxygen-metal bond with the nucleotide.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt (e) die Entfernung der Schutzgruppe durch ein komplexbildendes Ion, vorzugsweise durch Cyanid, Thiocyant oder Fluorid oder Ethylendiamintetraacetat. In a further embodiment of the inventive method (s) in step is the removal of the protecting group by a complex-forming ion, preferably by cyanide, Thiocyant or fluoride or ethylene diamine tetraacetate.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Schutz gruppe in Schritt (c) einen Fluorophor auf und in Schritt (c) wird das Nukleotid fluorome trisch identifiziert. In a further embodiment of the method according to the invention, the protective group in step (c) a fluorophore, and in step (c) the nucleotide is symmetrical identified fluorome.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (e) die Schutzgruppe photochemisch abgespalten. In a further embodiment of the inventive method (s) is deprotected in step photochemically.

Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher beschrieben, wobei die Zeichenblätter mit fortlaufenden Ziffern versehen sind (1/10 bis 10/10). The invention is further described by the drawing, the drawing sheets are provided with consecutive numbers (10/01 to 10/10).

Es zeigt It shows

Fig. 1 die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen- gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäu remolekülen; Figure 1 acid molecules the amplification of individual nucleic acid molecules using surface bound primers to islands from each amplified nucleic identical.

Fig. 2 die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationsprodukte [ Fig. 2 um faßt zwei Zeichenblätter (2/10, 3/10), die Fig. 2 ergeben, indem man sie mit ihrer längeren Seite aneinander legt. Fig. 2 shows the sequencing of surface-bound amplification [Fig. 2 summarizes two to mark sheets (2/10, 3/10), the Fig. 2 shown by placing it together with its longer side. Dabei liegt das Blatt mit der niedrigeren fortlau fenden Ziffer (2/10) oben]; In this case, the sheet] is located at the lower fortlau fenden point (2/10) above;

Fig. 3 die Bereitstellung eines GTN durch Ausbildung einer Hairpinstruktur in Sequenz abschnitten, die Linker entstammen [ Fig. 3 umfaßt zwei Zeichenblätter (4/10, 5/10), die Fig. 3 ergeben, indem man sie mit ihrer längeren Seite aneinander legt. Fig. 3 to provide a GTN sections by forming a hairpin structure in sequence, the linker are taken [Fig. 3 comprises two sheets of drawing paper (4/10, 5/10), Fig. 3 shown by placing it with its longer side against each other , Dabei liegt das Blatt mit der niedrigeren fortlaufenden Ziffer (4/10) oben]; In this case, the sheet] is located at the lower continuous digit (4/10) above;

Fig. 4 die Parallele Sequenzierung an einer Oberfläche; Figure 4 illustrates the parallel sequencing on a surface.

Fig. 5 die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zusammen hängenden Sequenzen; Figure 5 shows the assembly of the detection and identification results to contiguous sequences.

Fig. 6 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expressions analyse; Fig. 6 is the provision of primary nucleic acids for use in the expression analysis;

Fig. 7 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Sequenzierung genomischer Klone, Fig. 7, the provision of primary nucleic acids for sequencing genomic clones

Fig. 8 das Ergebnis der Amplikation einzelner Nukleinsäuremoleküle gemäß Fig. 1 Fig. 8 shows the result of Amplikation of individual nucleic acid molecules according to Fig. 1

Fig. 1 zeigt die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen- gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäuremolekü len, wobei im einzelnen Fig. 1 shows the amplification of individual nucleic acid molecules using surface bound primers len to islands from each identical amplified Nukleinsäuremolekü, wherein in each

  • 1. die irreversible Immobilisierung von ein Primerpaar bildenden Oligonukleoti den, 1. the irreversible immobilization of a primer pair forming the Oligonukleoti,
  • 2. die Hybridisierung der primären Nukleinsäuren mit den Oberflächen- gebundenen Primern, 2. hybridization of the nucleic acids bonded with the primary surface primers
  • 3. die Bildung sekundärer Nukleinsäuren durch Strangverlängerung der Primer, 3. the formation of secondary nucleic acids by continuous extension of the primers,
  • 4. die Entfernung der nicht irreversibel gebundenen primären Nukleinsäuremo leküle und Amplifikation der sekundären Nukleinsäuren, 4. leküle the removal of the non irreversibly bound primary Nukleinsäuremo and amplification of the secondary nucleic acids,
  • 5. Inseln mit jeweils identischen tertiäreren Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. 5. Islands denoted by the identical tertiäreren nucleic acid molecules.

Fig. 2 veranschaulicht die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationspro dukte, wobei Fig. 2 illustrates the sequencing of surface-bound Amplifikationspro-products, wherein

  • 1. das Lösen der Amplifikationsprodukte durch Restriktionsdau der Amplifikati onsprodukte (Unterstrichen: die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonu klease SphI) (SEQ ID NO: 4); 1. dissolving the amplification modulation products by restriction digestion of Amplifikati (underlined: the recognition site for the Restriktionsendonu klease SphI) (SEQ ID NO: 4);
  • 2. die Dephosphorylierung; 2. dephosphorylation;
  • 3. die Ligation eines Hairpin-Oligonukleotids (fett) 3. ligating a hairpin oligonucleotide (bold)
  • 4. die Entfernung des nicht irreversibel immobilisierten Nukleinsäurestrangs (SEQ ID NO: 6); 4. The removal of the irreversibly immobilized nucleic acid strand (SEQ ID NO: 6);
  • 5. den Einbau und Identifikation eines ersten geschützten Nukleotids; 5. installation and identification of a first protected nucleotide;
  • 6. die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe unter Wiederher stellung einer freien 3'-OH-Gruppe; 6. The removal of protecting group and labeling group under restore position a free 3'-OH group;
  • 7. den Einbau und Identifikation eines zweiten geschützten Nukleotids; 7. installation and identification of a second protected nucleotide;
  • 8. die Wiederholung der Schritte 5 und 6 zeigt. 8. Repeat steps 5 and 6.

Fig. 3 zeigt die Bereitstellung eines GTN durch Ausbildung einer Hairpinstruktur in Se quenzabschnitten die Linker entstammen. Fig. 3 shows the provision of a GTN by forming a hairpin structure in the linker Se quenzabschnitten originate. Die zu sequenzierende Nukleinsäure (Restrikti onsfragment mit zwei unterschiedlichen Enden, eines hiervon durch die Restriktionsendo nuklease NlaIII erzeugt) ist grau hinterlegt. The nucleic acid to be sequenced (Restrikti onsfragment with two different ends, one by the restriction nuclease thereof Sendo NlaIII generated) is grayed out. CATG, durch Restriktionsendonuklease NlaIII generierter Überhang; CATG, generated by restriction endonuclease NlaIII overhang; GCATGC, Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease SphI (enthält die Erkennungsstelle für NlaIII, CATG); GCATGC, recognition site for restriction endonuclease Sph I (contains the recognition site for Nla III, CATG); NNNNNNNNNN und MMMMMMMMMM, "inverted repeats" (zueinander komplementäre Sequenzen, die in tramolekulare Rückfaltung eines Einzelstrangs erlauben); Nnnnnnnnnn and MMMMMMMMMM, "inverted repeats" (mutually complementary sequences that allow intramolecular refolding in a single strand); XXXXX und YYYYY, Spacer region zur Oberfläche. XXXXX and YYYYY, spacer region to the surface. Im einzelnen beschreibt describes in detail

  • 1. die Ligation eines Linkers mit "inverted repeat" und SphI-Schnittstelle an zu sequenzierendes Fragment; 1. ligating a linker with "inverted repeat" and SphI site to be sequenced fragment;
  • 2. die Denaturierung und Hybridisierung mit an einer Oberfläche immobilisier tem Primer; 2. denaturation and hybridization with immobilisier system to a surface primer;
  • 3. die Amplifikation mit zwei an Oberfläche immobilisierten Primern (Gegen primer nicht gezeigt); 3. amplification with two primers immobilized on the surface (not shown counter primer);
  • 4. das "halbseitige Lösen" der Amplifikationsprodukte von der Oberfläche durch Restriktionsendonuklease SphI (Pfeile); 4. the "unilateral loosening" of the amplification products from the surface by restriction endonuclease SphI (arrows);
  • 5. die Denaturierung und Entfernung des nicht an der Oberfläche immobilisier ten Strangs; 5. denaturation and removal of the immobilisier th at the surface strand;
  • 6. die Renaturierung unter Ausbildung eines Hairpins, Beginn der Sequenzierung durch Inkorporation entschützbarer Abbruchnukleotide. 6. the restoration to form a hairpin, the beginning of the sequencing by incorporation entschützbarer Abbruchnukleotide.

Fig. 3 zeigt eine bevorzugte Vorgehensweise zur Bereitstellung von als Sequenzierprimer dienenden Gegensträngen der tertiären Nukleinsäuren, GTN, indem die durch Behandlung mit einer ersten Restriktionsendonuklease (in Fig. 3 etwa die Erkennungssequenz CATG aufweisend) mit überhängenden Enden ausgestatteten Nukleinsäuremoleküle zunächst über eine Ligation mit flankierenden Sequenzabschnitten in Form doppelsträngiger Linkermo leküle versehen werden, welche erstens selbstkomplementäre Bereiche umfassen und zweitens distal an diese angrenzend eine Erkennungssequenz bzw. Schnittstelle für eine zweite Restriktionsendonuklease aufweisen. Fig. 3 shows a preferred procedure for the mobilization of serving as a sequencing primer complementary strands of the tertiary nucleic acids, GTN, by the treatment with a first restriction endonuclease equipped (in Fig. 3 about the recognition sequence CATG comprising) with overhanging ends of nucleic acid molecules, initially in a ligation with flanking sequence sections in the form of double-Linkermo leküle are provided which comprise first and second self-complementary regions have distally adjacent to this interface or a recognition sequence for a second restriction endonuclease. Bevorzugterweise handelt es sich hierbei wie in Fig. 3 gezeigt um eine Schnittstelle, deren innere Basen auf dem selben Strang identisch mit den Basen des besagten Überhangs sind (in Fig. 3 die Basenfolge CATG), mindestens eine der äußeren Basen jedoch sich von der entsprechenden, besagte Überhangsequenz vor oder nach Ligation flankierenden Base unterscheidet. Preferably, these are as in Fig. 3 by an interface whose inner bases identical to the bases of said overhang on the same line (in Fig. 3, the base sequence CATG), at least one of the outer bases, however, as appropriate for the , said overhang sequence before or after ligation of flanking base differs. Beispielsweise ist in Fig. 3 gezeigt, daß der zur Ligation verwandte Überhang "CATG" nach der Ligation an seinem 3'-Ende von der Base "T" flankiert wird. For example, shown in Fig. 3, that the related for ligation overhang "CATG" is flanked by ligation at its 3'-end of the base "T". Wird nun nach erfolgter Amplifikation der Nukleinsäu remoleküle in Schritt (a5) mittels eines Primerpaars, von dem ein Primer mit einem Strang besagter Linkermoleküle hybridisieren kann, mit einer zweiten Restriktionsendonuklease geschnitten, welche beispielsweise die Erkennungssequenz " G CAGT C " besitzt, und wurde diese Erkennungssequenz in besagten flankierenden Sequenzabschnitten (also als Teilse quenz der angefügten Linker) bereitgestellt, so erfolgt ein Schnitt innerhalb der bereitge stellten Sequenzabschnitte. Now, after the amplification of the nucleic acid molecules in step (a5) using a pair of primers having one primer can hybridize with one strand of said linker molecules, cut by a second restriction endonuclease which has, for example, the recognition sequence "G CAGT C", and was this recognition sequence in said flanking sequence portions (ie the appended linker sequence as Teilse) provided, a cut is made within the bereitge presented sequence segments. Nach erfolgter Entfernung des dann nicht mehr irreversibel an die Oberfläche gebundenen Strangs kann der 3'-Terminus des immobilisiert bleibenden Strangs intramolekular zu einem Hairpin rückfalten. After the removal of the then no longer irreversibly bound to the surface of the strand 3 'terminus of the immobilized strand can lasting intramolecularly refold into a hairpin. Dabei ist bevorzugt, daß, wie in Fig. 3 gezeigt, die Erkennungssequenz besagter ersten und zweiten Restriktionsendonuklease unmittelbar an die eingeführten selbstkomplementären Bereiche grenzen, so daß diese Be reiche durch besagte Ligation um die beiden besagten Erkennungsstellen gemeinsamen Basen verlängert werden. It is preferred that, as shown in Fig. 3, limits the recognition sequence of said first and second restriction endonuclease directly to the introduced self-complementary regions, so that these Be rich be extended through said ligation by said two recognition sites common bases. Hierbei weisen die verlängerten selbstkomplementären Bereiche dort eine Fehlpaarung auf, wo sich nach der Ligation die die Überhang-Sequenz flankie rende Base (bzw. Basen) von der Erkennungssequenz der zweiten Restriktionsendonu klease unterscheidet bzw. unterscheiden (in Fig. 3 eine G/T-Fehlpaarung). Here, the extended self-complementary regions where 3 have a mismatch on where the overhang sequence flankie Rende base after ligation (or bases) of the recognition sequence of the second Restriktionsendonu klease differs or differ (in Fig., A G / T mismatch). Gleichzeitig gewährleistet die hier beschriebene Vorgehensweise, in der die Erkennungsstelle der ersten Restriktionsendonuklease Bestandteil der längeren Erkennungsstelle der zweiten Restrikti onsendonuklease ist, daß die tertiären Nukleinsäuremoleküle bei der Inkubation mit der zweiten Restriktionsendonuklease keine internen Erkennungsstellen für die zweite Re striktionsendonuklease haben können, sondern lediglich exakt einmal im Bereich der flan kierenden Sequenzen geschnitten werden. At the same time ensures the procedure described here, in which the recognition site of the first restriction endonuclease is a part of the longer recognition site of the second Restrikti onsendonuklease that the tertiary nucleic acid molecules during the incubation with the second restriction endonuclease can striktionsendonuklease have no internal recognition sites for the second Re, but only exactly once be cut in the area of ​​flan kierenden sequences.

Fig. 4 beschreibt die parallele Sequenzierung an einer Oberfläche. FIG. 4 describes the parallel sequencing on a surface. "Inseln" identischer Nukleinsäuremoleküle sind in dieser Figur vereinfacht durch einen einzigen Strang sym bolisiert. "Islands" of identical nucleic acid molecules are in this Figure simplified by a single strand sym izes. Im einzelnen zeigt In detail shows

  • 1. die Befestigung eines Sequenzierprimers, Einbau des ersten Abbruchnukleo tids und parallele Detektion und Identifikation des jeweils ersten Nukleotid bausteins, 1. attaching a sequencing primer, installation of the first Abbruchnukleo TIDS and parallel detection and identification of the respective first nucleotide building block,
  • 2. die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe des ersten Nukleo tids, Einbau des zweiten Abbruchnukleotids und parallele Detektion und Identifikation des jeweils zweiten Nukleotidbausteins; 2. the removal of protective group and labeling group of the first nucleo TIDS, installation of the second Abbruchnukleotids and parallel detection and identification of the respective second nucleotide building;
  • 3. das Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base; 3. The detection and identification result of the first base;
  • 4. das Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base. 4. the detection and identification result of the second base.

Fig. 5 beschreibt die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zu sammenhängenden Sequenzen, wobei FIG. 5 describes the assembly of the detection and identification results to sammenhängenden sequences,

  • 1. die Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base, 1. the detection and identification result of the first base,
  • 2. die Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base, 2. the detection and identification result of the second base,
  • 3. die Detektions- und Identifikationsergebnis der n-ten Base, 3. the detection and identification result of the nth base,
  • 4. die assemblierten Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle in einzelnen Inseln bezeichnet. 4. The assembled sequences of nucleic acid molecules referred to in each of the islands.

Fig. 6 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expressionsanalyse, wobei im einzelnen Fig. 6 shows the provision of primary nucleic acids for use in the expression analysis, in which the individual

  • 1. die cDNA-Synthese mit biotinyliertem Primer, Bindung der doppelsträngigen cDNA an Streptavidin-beschichtete Oberfläche; 1. cDNA synthesis with biotinylated primer binding the double stranded cDNA to streptavidin-coated surface;
  • 2. den Restriktionsschnitt mit dem ersten Enzym (RE1), Fortwaschen der freige setzten Fragmente, und den zweiter Restriktionsschnitt mit dem zweiten En zym (RE2); 2. the restriction with the first enzyme (RE1), washing away the freige translated fragments, and the second restriction cleavage with the second En zym (RE2);
  • 3. die Ligation zweier verschiedener Linker; 3. ligation of two different linker;
  • 4. mRNA; 4. mRNA;
  • 5. doppelsträngige an Festphase immobilisierte cDNA; 5. double-immobilized on solid phase cDNA;
  • 6. ein cDNA-Fragment, das von zwei verschiedenen "überhängenden" Enden flankiert wird, which is flanked by two different "overhanging" ends 6, a cDNA fragment,
  • 7. ein von zwei verschiedenen Linkem (L1, L2) flankiertes cDNA-Fragment zeigt. 7. one of two different linkers (L1, L2) is flanked cDNA fragment.

Fig. 7 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Sequenzierung genomischer Klone, wobei im einzelnen Fig. 7 shows the provision of primary nucleic acids for sequencing genomic clones, wherein in each

  • 1. einen Restriktionsschnitt eines genomischen Klons parallel mit jeweils zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen (RE1-4), Ligation verschiedener Linker (L1-4); 1. a restriction of a genomic clone in parallel, each with two different restriction endonucleases (RE1-4), ligation of different linkers (L1-4);
  • 2. einen genomischen Klon; 2. a genomic clone;
  • 3. zwei überlappende Sätze mit Linkem ligierter Fragmente bezeichnet. 3. two overlapping sets of linkers designated ligated fragments.

Symmetrisch von identischen Linkem flankierte Fragmente (durchgestrichen) lassen sich nicht sequenzieren. Symmetrically flanked by identical linkers fragments (crossed) can not be sequenced.

Fig. 8 zeigt das Ergebnis der Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Ober flächengebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäure molekülen, visualisiert durch Anfärbung mit SYBR Green I. Fig. 8 shows the result of amplification of individual nucleic acid molecules by means of upper surface bound primer molecules to islands from each identical amplified nucleic acid, visualized by staining with SYBR Green I.

Die Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele näher erläutert. The invention will be explained in the following by examples.

Beispiel 1 example 1 Vorbereitung von Nukleinsäuremolekülen Preparation of nucleic acid molecules

4 µg Gesamt-RNA aus Rattenleber wurde mit Ethanol gefällt und in 15,5 µl Wasser gelöst. 4 ug of total RNA from rat liver was precipitated with ethanol and dissolved in 15.5 .mu.l of water. Es wurden 0,5 µl 10 cDNA-Primer CP28V (5'- ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3', SEQ ID NO: 1) hinzugegeben, 5 Minuten bei 65°C denaturiert und auf Eis gestellt. There was added 0.5 ul of 10 cDNA primers CP28V (, 5'ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 'SEQ ID NO: 1) was added, denatured for 5 minutes at 65 ° C and placed on ice. Die Mischung wurde mit 3 µl 100 mM Dithiothreitol (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 6 µl 5 × Superscript-Puffer (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 1,5 µl 10 mM dNTPs, 0,6 µl RNase Inhibitor (40 U/µl; Roche Molecular Biochemicals) und 1 µl Superscript II (200 U/µl, Life Technologies) ver setzt und zur cDNA-Erststrangsynthese 1 Stunde bei 42°C inkubiert. The mixture was diluted with 3 ul 100 mM dithiothreitol (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany), 6 ul 5X Superscript buffer (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany), 1.5 ul of 10 mM dNTPs, 0.6 ul RNase inhibitor (40 U / ul; Roche Molecular Biochemicals) and 1 .mu.l of Superscript II (200 U / ul, Life Technologies) ver sets and for cDNA first strand synthesis for 1 hour at 42 ° C. Zur Zweitstrangsyn these wurden 48 µl Zweitstrang-Puffer (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons), 3,6 µl 10 mM dNTPs, 148,8 µl H 2 O, 1,2 µl RNaseH (1,5 U/µl, Promega) und 6 µl DNA Polymerase I (New England Biolabs GmbH Schwal bach, 10 U/µl) hinzugefügt und die Reaktionen 2 Stunden bei 22°C inkubiert. For Zweitstrangsyn synthesis 48 ul second strand buffer (see FIG. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons), 3.6 ul of 10 mM dNTPs, 148.8 ul H 2 O, 1, (1.5 U / ul, Promega) 2 ul RNase H and 6 .mu.l DNA polymerase I (New England Biolabs GmbH Schwal bach, 10 U / ul) was added and the reactions for 2 hours at 22 ° C. Es wurde mit 100 µl Phenol, dann mit 100 µl Chloroform extrahiert und mit 0,1 Vol. Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Vol. Ethanol gefällt. It was extracted with 100 ul phenol, then with 100 ul chloroform and precipitated with 0.1 vol. Of sodium acetate pH 5.2 and 2.5 vol. Ethanol. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 15.000 g und Waschen mit 70% Ethanol wurde das Pellet in einem Restriktionsansatz aus 15 µl 10 × Universal buffer, 1 µl MboI und 84 µl H 2 O gelöst und die Reaktion 1 Stunde bei 37°C in kubiert. After centrifugation for 20 minutes at 15,000 g and washed with 70% ethanol, the pellet was resuspended in a restriction mixture of 15 ul of 10 × Universal buffer, dissolved 1 ul MboI and 84 .mu.l H2 O and cubed the reaction for 1 hour at 37 ° C in. Es wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. It was extracted with phenol, then extracted with chloroform and precipitated with ethanol. Das Pellet wurde in einem Ligationsansatz aus 0,6 µl 10 × Ligationspuffer (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl 10 mM ATP (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl Linker ML2025 (hergestellt durch Hybridisierung von Oligonukleotiden ML20 (5'- TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3', SEQ ID NO: 5) und LM25 (5'- GATCTCGCGAGACTTAGCATGTGAC-3', SEQ ID NO: 7), ARK), 6,9 µl H 2 O und 0,5 µl T4 DNA Ligase (Roche Molecular Biochemicals) gelöst und die Ligation über Nacht bei 16°C durchgeführt. The pellet was resuspended in a ligation mixture consisting of 0.6 ul of 10 x ligation buffer (Roche Molecular Biochemicals), 1 ul 10 mM ATP (Roche Molecular Biochemicals), 1 ul linker ML2025 (manufactured by hybridization of oligonucleotides ML20 (5'TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3 ' , SEQ ID NO: 7 dissolved), ARK), 6.9 ul H 2 O and 0.5 ul T4 DNA ligase (Roche Molecular Biochemicals) and: 5) and LM25 (5'GATCTCGCGAGACTTAGCATGTGAC-3 ', SEQ ID NO ligation overnight at 16 ° C. Die Ligationsreaktion wurde mit Wasser auf 50 µl aufgefüllt, mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und nach Zugabe von 1 µl Glycogen (20 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals) mit 50 µl 28% Polyethylenglycol 8000 (Promega)/10 mM MgCl 2 gefällt. The ligation reaction was made up with water to 50 .mu.l, with phenol, then extracted with chloroform and, after addition of 1 .mu.l glycogen (20 mg / ml, Roche Molecular Biochemicals) with 50 ul 28% polyethylene glycol 8000 (Promega) / 10 mM MgCl 2 like , Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 100 µl Wasser aufge nommen. The pellet was washed with 70% ethanol and resuspended in 100 ul of water taken up.

Beispiel 2 example 2 Beschichtung mit Oligonukleotiden Coating with oligonucleotides

Lyophilisierte, an ihrem 5'-Ende Aminolink-Gruppen tragende Oligonukleotide Amino- M13rev (5'-Amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3', SEQ ID NO: 8) und Amino-T7 (5'- Amino-TAATACGACTCACTATAGG-3', SEQ ID NO: 10) (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) wurden zu einer Endkonzentration von 1 mM in 100 mM Natriumcarbonatpuf fer pH 9 aufgenommen. Lyophilized, carrying at its 5 'end Aminolink groups oligonucleotides amino M13rev (5'-amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3', SEQ ID NO: 8) and amino-T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-amino-3 ', SEQ ID NO: 10) (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) were added to a final concentration of 1 mM in 100 mM Natriumcarbonatpuf fer pH. 9 Mikroskopie-Objektträger aus Glas ("Slides"; neoLab Migge La borbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg) wurden 1 Stunde in Chromschwefelsäure gerei nigt und danach 4 × mit destilliertem Wasser gewaschen. Microscopy glass slides ( "slides"; neoLab Migge La boron requirement-Vertriebs GmbH, Heidelberg) were nigt 1 hour gerei in chromic acid and then washed 4 times with distilled water. Nach Lufttrocknung wurden die Slides 5 Minuten in einer 1%igen Lösung von 3-Aminopropyltrimethoxysilan ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) in 95% Aceton/5% Wasser behandelt. After air drying, the slides were 5 minutes in a 1% solution of 3-aminopropyltrimethoxysilane ( "Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) treated in 95% acetone / 5% water. Danach wurde zehnmal für je 5 Minuten in Aceton gewaschen und 1 Stunde auf 110°C erhitzt. The mixture was then washed ten times, each for 5 minutes in acetone and heated to 110 ° C for 1 hour. Dann wurden die Slides für 2 Stunden in 0,2% 1,4-Phenylendiisothiocyanat ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) in einer Lösung aus 10% Pyridin in trockenem Di methylformamid (Merck KGaA, Darmstadt) eingelegt. Then the slides for 2 hours in 0.2% 1,4-phenylene were ( "Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) methylformamide in a solution of 10% pyridine in dry di (Merck KGaA, Darmstadt) inserted. Nach 5 Waschschritten in Methanol und 3 Waschschritten in Aceton wurden die Slides luftgetrocknet und direkt zur Be schichtung weiterverarbeitet. After 5 washes in methanol and 3 washes in acetone, the slides were air-dried and further processed directly to Be coating. Selbstklebende "Frame Seal"-Rähmchen für 65 µl- Reaktionskammern (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) wurden aufgebracht, 65 µl Oligonukleotid-Lösung wurden in die so gebildeten Reaktionskammern pipettiert, und die Kammern wurden durch Aufkleben eines Polyester-Deckblatts (MJ Research Inc.) unter Ausschluß von Luftblasen versiegelt. Self-adhesive "Frame Seal" -Rähmchen for 65 μl- reaction chambers (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) were applied 65 ul oligonucleotide solution were pipetted into the thus formed reaction chambers, and the chambers were adhering a polyester cover sheet (MJ Research Inc.) sealed in the absence of air bubbles. Die genaue Position der Reaktionskammer wurde mit einem wasserfesten Filzschreiber auf der Unterseite der Slides gekennzeichnet. The exact position of the reaction chamber was marked with a waterproof pen on the bottom of the slides. Die Bindung der Oligonukleotide via Aminolink an die Oberfläche der aktivierten Slides fand über 4 Stunden bei 37°C statt. The binding of the oligonucleotides via Aminolink to the surface of the activated slides was held for 4 hours at 37 ° C. Anschließend wurden die Kleberahmen entfernt und die Slides mit deionisiertem Wasser abgespült. The adhesive frames were removed and rinsed off the slides with deionized water. Um verbliebene reaktive Gruppen zu inak tivieren, wurden die Slides für 15 Minuten in auf 50°C temperierter Blockierungslösung (50 mM Ethanolamin ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1 M Tris pH 9 ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1% SDS ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) behandelt. Zur Entfernung nicht kovalent gebundener Oligonu kleotide wurden die Slides 5 Minuten in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) gekocht. Die Slides wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. To tivieren residual reactive groups INAK, the slides (for 15 minutes in temperature-controlled at 50 ° C blocking solution of 50 mM ethanolamine ( "Fluka" were: Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0.1 M Tris pH 9 ( "Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0.1% SDS ( "Fluka". treated Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) to remove non-covalently bound Oligonu kleotide the slides were 5 minutes in 800 ml 0.1 x SSC / 0, 1% SDS (see FIG. Ausubel et al., Current Protocols (in Molecular Biology 1999), John Wiley & Sons) cooked. The slides were washed with deionized water and air dried.

Beispiel 3 example 3 Beschichtung mit Oligonukleotiden Coating with oligonucleotides

Lyophilisierte, an ihrem 5'-Ende Aminolink-Gruppen tragende Oligonukleotide Amino- M13rev (5'-Amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3', Abfolge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 8) und Amino-T7 (5'-Amino-TAATACGACTCACTATAGG-3', Abfolge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 10) (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) wurden zu einer Endkonzentration von 100 µmol/µl in deionisiertem Wasser aufgenommen. Lyophilized, carrying at its 5 'end Aminolink groups oligonucleotides amino M13rev (5'-amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3' sequence of nucleotides as shown in SEQ ID NO: 8) and amino-T7 (5'-amino-3-TAATACGACTCACTATAGG 'sequence of nucleotides as shown in SEQ ID NO: 10) (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) were added to deionized water to a final concentration of 100 .mu.mol / ul. Je 1,4 µl dieser Primerlösungen wurden mit 32,2 µl Wasser und 35 µl 2 × Bindepuffer (300 mM Natriump hosphat pH 8,5) vermischt. Depending 1.4 .mu.l of this primer solutions were treated with 32.2 .mu.l of water and 35 ul 2 x binding buffer (300 mM sodium p calcium phosphate Product pH 8.5) were mixed. Selbstklebende "Frame Seal"-Rähmchen für 65 µl- Reaktionskammern (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) wurden auf "3D- Link activated slides" (zur Bindung Amino-modifizierter Nukleinsäuren aktivierte Objekt träger aus Glas; (Surmodics, Eden, Prairie, Minnesota, USA) aufgebracht. 65 µl Oligonu kleotid-Lösung wurden in die so gebildeten Reaktionskammern pipettiert, und die Kam mern wurden durch Aufkleben eines Polyester-Deckblatts (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) unter Ausschluß von Luftblasen versiegelt. Die genaue Position der Re aktionskammer wurde mit einem wasserfesten Filzschreiber auf der Unterseite der Slides gekennzeichnet. Die Bindung der Oligonukleotide via Aminolink an die Oberfläche der aktivierten Slides fand über Nacht bei Raumtemperatur statt. Anschließend wurden die Kleberahmen entfernt und die Slides mit deionisiertem Wasser abgespült. Um verbliebene reaktive Gruppen zu inaktivieren, wurden die Slides für 15 Minuten in auf 50°C tempe r Self-adhesive "Frame Seal" -Rähmchen for 65 μl- reaction chambers (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) (for "3D-Link activated slides" activated for binding amino-modified nucleic acids glass slide (Surmodics, Eden applied Prairie, Minnesota, USA). 65 .mu.l Oligonu kleotid solution were pipetted into the thus formed reaction chambers, and the Kam numbers were (MJ Research Inc. by sticking a polyester cover sheet, Watertown, Minnesota, USA) with the exclusion of air bubbles sealed. the exact position of Re was marked with a permanent felt tip pen on the bottom of the slides action chamber. the binding of the oligonucleotides via Aminolink took place overnight at room temperature instead of to the surface of the activated slides. Subsequently, the adhesive frame were removed and the slides with deionized water rinsed off. in order to inactivate any remaining reactive groups, the slides for 15 minutes were at 50 ° C tempe r ierter Blockierungslösung (50 mM Ethanolamin ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1 M Tris pH 9 ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1% SDS ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) behandelt. FOURTH blocking solution (50 mM ethanolamine ( "Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0.1 M Tris pH 9 ( "Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0.1% SDS ( "Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) treated. Zur Entfernung nicht kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Slides 5 Minuten in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) gekocht. To remove non-covalently bound oligonucleotides, the slides for 5 minutes in 800 ml 0.1 x SSC / 0.1% SDS (see Ausubel et al., Current Protocols (1999), John Wiley & Sons. In Molecular Biology) were boiled. Die Slides wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. The slides were washed with deionized water and air dried.

Beispiel 4 example 4

Plasmide pRNODCAB (enthält Basen 982 bis 1491 des Transkripts von Ornithindecar boxylase aus Ratte, AC-Nummer J04791, kloniert in Vektor pCR II (Invitrogen BV, Groningen, Niederlande) und pRNHPRT (enthält Basen 238 bis 720 des Transkripts Hypoxanthinphosphoribosyltransferase aus Ratte, AC-Nummer M63983, kloniert in Vektor pCR II (Invitrogen)) wurden linearisiert, indem je 1 µg Plasmid in einem Volumen von 20 µl 1 × Restriktionspuffer H ("Roche Molecular Biochemicals": Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) mit je 5 U der Restriktionsenzyme BglII und ScaI (Roche Molecular Bioche micals) für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Anschließend wurde eine Amplifikation der Vektor-Inserts vorgenommen, indem je 1 µl der Restriktionsansätze in einem Volumen von 100 µl PCR-Puffer II (Perkin-Elmer, Foster City, California, USA)mit 4 µl 10 mM Primer T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3', SEQ ID NO: 10), 4 µl 10 mM Primer M13 (5'-CAGGAAACAGCGATGAC-3', SEQ ID NO: 8) (ARK), 4 µl 50 mM MgCl 2 ("Fluk Plasmids pRNODCAB (containing bases 982-1491 of the transcript of Ornithindecar decarboxylase from rat AC number J04791 cloned into vector pCR II (Invitrogen BV, Groningen, Netherlands) and pRNHPRT (contains bases 238-720 of the transcript hypoxanthine phosphoribosyltransferase rat, AC- number M63983, cloned into vector pCR II (Invitrogen)) were linearized by each 1 ug plasmid (in a volume of 20 ul 1 x restriction buffer H "Roche Molecular Biochemicals": Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) with 5 U of the restriction enzymes BglII and Scal (Roche Molecular Bioche micals) was incubated for 1.5 hours at 37 ° C. then, an amplification of the vector-insert was performed by adding 1 ul of each restriction mixtures in a volume of 100 ul PCR buffer II (Perkin-Elmer , Foster City, California, USA) with 4 .mu.l 10 mM primer T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3 ', SEQ ID NO: 10), 4 ul 10 mM primer M13 (5'-CAGGAAACAGCGATGAC-3', SEQ ID NO: 8) (ARK), 4 ul 50 mM MgCl 2 ( "Fluk a": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 5 µl Dimethylsulfoxid ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 1 µl 10 mM dNTPs (Roche Molecular Biochemicals), und 1 µl AmpliTaq DNA Polymerase (5 u/µl; a ": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 5 .mu.l of dimethyl sulfoxide (" Fluka ": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 1 ul 10 mM dNTPs (Roche Molecular Biochemicals), and 1 ul of AmpliTaq DNA polymerase (5 u / ul; Perkin-Elmer) versetzt wurde. Perkin-Elmer) was added. Anschließend wurden die Reaktionen in einem Gene Amp 9700 Thermocycler (Perkin-Elmer) einem Temperaturprogramm bestehend aus 20 Zyklen Denaturierung für 20 Sekunden bei 95°C, Primerannealing für 20 Sekunden bei 55°C und Primerextension für 2 Minuten bei 72°C unterworfen. Subsequently, the reactions were (Perkin-Elmer) subjected in a Gene Amp 9700 thermal cycler a temperature program consisting of 20 cycles of denaturation for 20 seconds at 95 ° C, primer annealing for 20 seconds at 55 ° C and primer extension for 2 minutes at 72 ° C. Die Amplifikationsprodukte wurden elektrophoretisch auf einem 1,5% Aga rosegel auf ihre richtige Größe hin untersucht. The amplification products were analyzed by electrophoresis on a 1.5% Aga rosegel to their right size out. Zur Entfernung uninkorporierter Primer wurden die Reaktionen mittels QiaQuick-Säulen (Qiagen AG, Hilden) gemäß den Anga ben des Herstellers gereinigt und in 50 µl deionisierten Wassers eluiert. To remove uninkorporierter primer reactions using QiaQuick columns (Qiagen AG, Hilden) were of the indications of the manufacturer ben cleaned and eluted in 50 ul of deionized water.

Beispiel 5 example 5 Amplifikation amplification

Zur Befestigung von in Beispiel 2 vorbereiteten Nukleinsäuren an Glasträgern wurden An nealing-Mischungen aus je 1 µl unverdünnter oder in parallelen Ansätzen 1 : 10, 1 : 100 bzw. 1 : 1000 mit Wasser verdünnter Amplifikationsprodukt-Lösungen, je 4 µl 50 mM MgCl 2 - Lösung, je 1 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals), je 5 µl Dimethylsulfoxid, je 1 µl 10 mM dNTPs und je 1 µl AmpliTaq in einem Gesamtvolumen von je 100 µl 1 × PCR-Puffer II hergestellt. For the attachment of the prepared in Example 2 nucleic acids to glass slides were At nealing mixtures of 1 per .mu.l neat or in parallel batches, 1: 10, 1: 100 or 1: 1000 diluted with water amplification solutions, additional 4 ul 50 mM MgCl 2 - solution, each 1 ul bovine serum albumin (20 mg / ml; Roche Molecular Biochemicals) per 5 .mu.l of dimethyl sulfoxide, each 1 ul 10 mM dNTPs and 1 ul AmpliTaq prepared in a total volume of 100 .mu.l 1 × PCR buffer II. Unter Beachtung der Filzschreiber- Markierungen auf der Slide-Unterseite wurden Frame-Seal-Kammern in den zur Oligonu kleotid-Beschichtung verwendeten Positionen auf die in Beispiel 1 vorbereiteten Slides aufgebracht. Observing the Filzschreiber- marks on the Slide Base Frame-Seal chambers were applied in the conditions used for Oligonu kleotid coating positions on the prepared in Example 1 slides. Dann wurden je 65 µl der Annealing-Mischungen in die Reaktionskammern pipettiert und die Kammern wie oben versiegelt. Then each 65 ul of the annealing mixture were pipetted into the reaction chambers and the chambers sealed as above. Die Slides wurden auf den Heizblock ei nes UNO II-in situ-Thermocyclers (Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) gelegt, mit einem Polster aus Papiertüchern abgedeckt und mittels des höhenverstellbaren Heizdeckels an den Heizblock gepreßt. The slides were placed on the heating block ei nes UNO II in situ thermal cycler (Biometra biomedical Analytik GmbH, Göttingen, Germany), covered with a pad of paper towels and pressed against the heating block by means of the height-adjustable heated lid. Zum Annealing und der nachfolgenden Primerex tension kam folgendes Temperaturprogramm zur Anwendung: Denaturierung 30 Sekunden bei 94°C, Annealing 10 Minuten bei 55°C, Primerextension 1 Minute bei 72°C. For annealing and the subsequent Primerex tension following temperature program was used: denaturation 30 seconds at 94 ° C, annealing for 10 minutes at 55 ° C, primer extension for 1 minute at 72 ° C. Nach erfolgter Reaktion wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides wurden mit deioni siertem Wasser abgespült. After the reaction, the reaction chambers were removed and the slides were rinsed with deioni siertem water. Zur Entfernung der nicht kovalent gebundenen Stränge wurde 1 Minute in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS gekocht, die Slides mit Wasser abgespült und luft getrocknet. To remove the non-covalently bound strands 1 minute cooked 0.1 × SSC / 0.1% SDS in 800 ml, rinsed with water and the slides air-dried. Um eine kompartimentierte Amplifikation der an den Träger gebundenen Nu kleinsäuremoleküle vorzunehmen, wurden erneut an den zuvor gewählten Positionen Re aktionskammern aufgebracht und 65 µl einer Amplifikationsmischung aufgetragen, zu sammengesetzt wie folgt: 4 µl 50 mM MgCl 2 , 1 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml), 5 µl Dimethylsulfoxid, 1 µl AmpliTaq (5 U/µl), 1 µl 10 mM dNTPs, in 100 µl 1 × PCR-Puffer II. Nach Versiegelung der Kammern wurde auf dem in situ-Thermocycler folgendes Tem peraturprogramm angewendet: Denaturierung 20 Sekunden bei 93°C, Primerannealing 20 Sekunden bei 55°C, Extension 1 Minute bei 72°C, für 50 Zyklen. A compartmented amplification of the support-bound nucleic acid molecules make, were re-action chambers at the preselected positions Re applied and applied 65 ul of a amplification mixture to sammengesetzt as follows: 4 ul 50 mM MgCl 2, 1 ul bovine serum albumin (20 mg / ml .), 5 .mu.l of dimethyl sulfoxide, 1 ul AmpliTaq (5 U / ul), 1 ul 10 mM dNTPs, in 100 ul 1 × PCR buffer II After sealing of the chambers has been applied peraturprogramm on the following in situ thermocycler Tem: denaturation 20 seconds at 93 ° C, primer annealing 20 seconds at 55 ° C, extension for 1 minute at 72 ° C, for 50 cycles. Nach beendeter Am plifikation wurden die Kammern entfernt und die Slides mit Wasser abgespült und luftge trocknet. After completion On plifikation the chambers were removed and rinsed with water and the slides luftge dries. Zur Detektion der durch kompartimentierte Amplifikation entstandenen klonalen Inseln wurden 40 µl SYBR Green I-Lösung (Molecular Probes; Lösung 1 : 10.000 in Was ser) auf die Slides pipettiert und mit Deckgläsern #2 (MJ) abgedeckt. pipetted onto the slides and covered with cover slips # 2 (MJ): (in what ser 10,000 Solution 1 Molecular Probes) for detecting the resulting compartmentalized by clonal amplification islands 40 ul SYBR Green I solution. Die Detektion er folgte auf einem konfokalen Mikroskop DMRBE (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 530 nm. Es konnten klonale Inseln kompartimentiert amplifizierter Nukleinsäuremole küle detektiert werden, die sich in einer Zufallsanordnung über die Slideoberfläche im Be reich der Reaktionskammern verteilten (vergl. Fig. 8). The detection he followed on a confocal microscope DMRBE (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg) at an excitation wavelength of 488 nm and a detection wavelength of 530 nm. It could clonal islands compartmentalized amplified Nukleinsäuremole molecules are detected that are in a random array on the slide surface Be rich distributed to the reaction chambers (see Fig. Fig. 8). Im Bereich von Reaktionskammern, in denen als Negativkontrolle entweder keine Oligonukleotide an den Träger gebunden worden waren oder in denen die Amplifikationsreaktion ohne vorherige Hybridisierung von Template-Molekülen vorgenommen worden war, wurden hingegen keine von klonalen Inseln stammende Signale detektiert. In the range of reaction chambers in which had been bound as a negative control either no oligonucleotides on the support or in which the amplification was carried out without prior hybridization of template molecules, while not originating from clonal islands signals were detected. Weiterhin zeigte der Vergleich der Slide-Oberflächen im Bereich von Reaktionskammern, in denen unterschiedliche Konzentrationen von Tem plate eingesetzt worden war, eine klare Abhängigkeit der Anzahl gebildeter klonaler Inseln von der Menge an eingesetzten Molekülen. Continued to show the comparison of the slide surfaces in the area of ​​reaction chambers had been used in which different concentrations of Tem plate, a clear dependence on the number of clonal islands formed on the amount of inserted molecules.

Beispiel 6 example 6

Zur Identifikation der Nukleinsäuremoleküle in den detektierten klonalen Inseln wurden die Slides nach der Detektion der mittels SYBR Green angefärbten doppelsträngigen DNA 10 Minuten in Wasser entfärbt. To identify the nucleic acid molecules in the detected clonal islands, the slides were decolorized after the detection of the stained using SYBR Green double stranded DNA for 10 minutes in water. Dann wurden erneut Reaktionskammern an den gleichen Positionen wie zuvor aufgeklebt und eine Restriktionsmischung, bestehend aus 12 µl 10 × Universal buffer (Stratagene GmbH, Heidelberg), 1 µl Rinderserumalbumin, 3 µl Restrik tionsendonuklease MboI (1 U/µl; Stratagene) und 64 µl Wasser, hinzupipettiert. Then reaction chambers again were as glued at the same positions before, and a restriction mixture consisting of 12 ul of 10 × Universal buffer (Stratagene GmbH, Heidelberg), 1 ul bovine serum albumin, 3 .mu.l restrictive endonuclease MboI (1 U / ul; Stratagene) and 64 .mu.l water, added with a pipette. Zur Re striktion der Nukleinsäuremoleküle mittels der internen MboI-Schnittstelle wurde 1,5 h bei 37°C inkubiert, dann wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides mit Wasser gewaschen. To re striction of the nucleic acid molecules by means of the internal interface MboI was 1.5 h at 37 ° C, then the reaction chambers were removed and the slides washed with water. Die nicht kovalent an den Glasträger gebundenen Strangfragmente wurden duch Denaturierung für 2 Minuten in 800 ml kochendem 0,1 × SSC/0,1% SDS entfernt. The non-covalently bound to the carrier strand glass fragments were duch denaturation for 2 minutes in 800 ml of boiling 0.1 x SSC / 0.1% SDS removed. Nach erneutem Waschen in Wasser und Lufttrocknung wurden neue Reaktionskammern aufgebracht. After washing in water and air drying new reaction chambers were applied. Pro Hybridisierungsexperiment wurde eine Hybridisierungslösung aus 8 µl 10 × PCR-Puffer II, 3,2 µl 50 mM MgCl 2 , 2 µl 100 µmol/µl Oligonukleotidsonde Cy5- HPRT (5'-Cy5-TCTACAGTCATAGGAATGGACCTATCACTA-3', SEQ ID NO: 3; ARK), 2 µl 100 µmol/µl Oligonukleotidsonde Cy3-ODC (5'-Cy3- ACATGTTGGTCCCCAGATGCTGGATGAGTA-3', SEQ ID NO: 2) und 65 µl Wasser hergestellt. A hybridization solution of 8 ul per hybridization experiment was 10 × PCR buffer II, 3.2 .mu.l 50 mM MgCl2, 2 ul 100 .mu.mol / ul oligonucleotide probe Cy5-HPRT (5'-Cy5-TCTACAGTCATAGGAATGGACCTATCACTA-3 ', SEQ ID NO: 3 ; ARK), 2 ul (5'-Cy3 ACATGTTGGTCCCCAGATGCTGGATGAGTA-3 ', SEQ ID NO 100 .mu.mol / ul oligonucleotide Cy3-ODC: 2) and 65 .mu.l of water. Für jedes Hybridisierungsexperiment wurden 65 µl hiervon in die jeweilige Reaktionskammer gegeben und 3 Stunden bei 50°C hybridisiert. 65 ul thereof was added in the respective reaction chamber for each hybridization experiment and hybridized at 50 ° C for 3 hours. Nach Beendigung der Hybridisierung wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides 5 Minuten bei Raumtemperatur in 30 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. After completion of the hybridization, the reaction chambers were removed and the slides washed for 5 minutes at room temperature in 30 ml of 0.1 × SSC / 0.1% SDS. Die Slides wurden kurz mit destilliertem Wasser abgespült, luftgetrocknet und zur Detektion eingesetzt. The slides were briefly rinsed with distilled water, air dried and used for detection. Die Detektion erfolgte wie oben mit Hilfe eines konfokalen Lasermikroskops. Detection was performed as above using a confocal laser microscope. Als Anregungswellenlän gen wurden 568 nm und 647 nm verwendet, nachgewiesen wurden Signale bei 600 nm und bei 665 nm. Es konnte gezeigt werden, daß die zuvor mit SYBR Green detektierten klona len Inseln zum Teil durch die Sonde Cy3-ODC und zum Teil durch die Sonde Cy5-HPRT detektiert wurden. As Anregungswellenlän gen 568 nm and 647 nm were used were detected signals at 600 nm and at 665 nm. It has been shown that the previously with SYBR Green detected KLONA len islands in part by the probe Cy3-ODC and in part by the probe Cy5-HPRT were detected.

Beispiel 7 example 7 Expressionsanalyse durch hochparallele Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen Expression analysis by massively parallel sequencing of nucleic acid molecules

Die in Beispiel 1 erhaltenen Ligationsprodukte wurden 1 : 1000 mit Wasser verdünnt und 1 µl dieser Verdünnung wie in Beispiel 5 beschrieben für 50 Zyklen kompartimentiert ampli fiziert. The ligation products obtained in Example 1 were diluted 1: 1000 with water and 1 ul of this dilution as described in Example 5 for 50 cycles compartmentalized ampli fied. Hierfür wurden wie beschrieben mit den Amplifikationsprimern Amino-CP28V (5'- Amino-ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTV-3', Abfolge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 1) und Amino-ML20 (5'-Amino-TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3', Ab folge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 5) beschichtete Glasslides verwendet. For this purpose were as described with the amplification primers amino-CP28V (5'-amino-ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTV-3 'sequence of nucleotides as shown in SEQ ID NO: 1) and amino ML20 (5'-amino-TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3', from sequence of nucleotides uses 5) coated glass slides: as shown in SEQ ID NO. Zur ein seitigen Ablösung der Amplifikationsprodukte vom Träger wurde die Amplifikationsmi schung durch eine Restriktionsmischung ersetzt, bestehend aus 12 µl 10 × Universal buffer (Stratagene), 1 µl Rinderserumalbumin, 4 µl Restriktionsendonuklease MboI, in einem Endvolumen von 65 µl. To a-side separation of the amplification products from the support, the Amplifikationsmi research was replaced by a restriction mixture consisting of 12 ul of 10 × Universal buffer (Stratagene), 1 ul bovine serum albumin, 4 .mu.l restriction endonuclease MboI, in a final volume of 65 ul. Nach Inkubation bei 37°C für 2 h wurde die Restriktionsmischung ersetzt durch eine Dephosphorylierungsmischung aus 1 U alkalischer Phosphatase aus ark tischen Krabben (Amersham) in 65 µl des mitgelieferten Reaktionspuffers. After incubation at 37 ° C for 2 h, the restriction mixture was replaced by a dephosphorylation of 1 U alkaline phosphatase ark tables crabs (Amersham) in 65 ul of the reaction buffer supplied. Nach Inkubati on für 1 Stunde bei 37°C und Inaktivierung für 15 Minuten bei 65°C wurden Reaktions kammern und die Dephosphorylierungsmischung entfernt, die Slides gründlich mit destil liertem Wasser gewaschen, erneut Reaktionskammern aufgebracht und mit 65 µl einer Li gationsmischung gefüllt, bestehend aus 3 U T4 DNA-Ligase (Roche Diagnostics) und 500 ng am 5'-Ende phosphoryliertem Hairpin-Sequenzierprimer SLP33 (5'- TCTTCGAATGCACTGAGCGCATTCGAAGAGATC-3', SEQ ID NO: 9) in 65 µl des mitgelieferten Ligationspuffers. After Inkubati on for 1 hour at 37 ° C and inactivation for 15 minutes at 65 ° C reaction chambers were and the dephosphorylation removed, washed the slides thoroughly with Destil of water required, applied reaction chambers again with 65 ul of a Li gationsmischung filled consisting of 3 U T4 DNA ligase (Roche Diagnostics) and 500 ng 5 'end-phosphorylated hairpin sequencing SLP33 (5'TCTTCGAATGCACTGAGCGCATTCGAAGAGATC-3', SEQ ID NO: 9) in 65 ul of ligation buffer supplied. Es wurde 14 Stunden bei 16°C ligiert, dann wurden Liga tionsmischung und Reaktionskammern entfernt. It was ligated at 16 ° C for 14 hours, then ligation mixture and reaction chambers were removed. Zur Entfernung der nicht kovalent an den Glasträger gebundenen Strangfragmente wurde für 2 Minuten in 800 ml kochendem 0,1 × SSC/0,1% SDS behandelt und mit destilliertem Wasser nachgewaschen. To remove the non-covalently bound to the carrier strand glass fragments boiling 0.1X SSC / 0.1% SDS was treated for 2 minutes in 800 ml and washed with distilled water. Zur Herstellung geeigneter entschützbarer Abbruchnukleotide wurden dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Ro che Molecular Biochemicals) an ihrer 3'-OH-Gruppe mit 4-Aminobuttersäure verestert. To prepare suitable entschützbarer Abbruchnukleotide dATP, dCTP, dGTP and dTTP were (Ro che Molecular Biochemicals) esterified at its 3'-OH group of 4-aminobutyric acid. Diese Derivate wurden mit den Fluoreszenzgruppen FAM (dATP, dCTP) und ROX (dGTP, dTTP) markiert (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). These derivatives were incubated with the fluorescent FAM groups (dATP, dCTP) and ROX (dGTP, dTTP) marked (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Zur parallelen Bestimmung der ersten Base wurden erneut Reaktionskammern auf die Slides aufgebracht und eine Primerextensionsmischung aus 1 mM FAM-dATP, 1 mM ROX-dGTP und 2 U Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA) in 65 µl Reakti onspuffer (40 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM MgCl 2 , und 25 mM NaCl) eingefüllt. For determining in parallel the first base reaction chambers were applied to the slides again and a primer extension mixture of 1 mM FAM-dATP, 1 mM ROX-dGTP and 2 U Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA) in 65 ul Reakti onspuffer (40 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM MgCl 2, and 25 mM NaCl) were charged. Nach Inkubation bei 37°C für 5 Minuten wurde mit Reaktionspuffer gewaschen und auf dem Laserscanningmikroskop detektiert. After incubation at 37 ° C for 5 minutes was washed with reaction buffer and detected in the laser scanning microscope. Anregungswellenlängen waren 488 nm und 568 nm, detektiert wurde bei 530 nm und bei 600 nm. Nach der Detektion wurde erneut Primerex tensionsmischung zugegeben, welche nun die übrigen beiden markierten Nukleotide, FAM-dCTP und ROX-dTTP, enthielt. Excitation wavelengths were 488 nm and 568 nm, detected at 530 nm and at 600 nm. After the detection Primerex tensionsmischung was added again, now containing the remaining two labeled nucleotides, FAM-ROX and dCTP-dTTP. Nach erfolgter Inkorporation wurde erneut gewa schen und detektiert, und die Schutzgruppen wurden durch enzymatische Spaltung ent fernt. After the incorporation was again gewa rule and detected, and the protecting groups were removed by enzymatic cleavage ent. Hierzu wurde mit 5 mg/ml Chirazyme L Lipase (Roche Diagnostics) in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 9 für 1 h bei 35°C behandelt. For this purpose, 5 mg / ml lipase Chirazyme L (Roche Diagnostics) in 100 mM potassium phosphate buffer pH 9 was treated for 1 h at 35 ° C. Anschließend wurde die Sequen zierung wie oben beschrieben für 15 weitere Zyklen durchgeführt. Then the Sequen was cation as described above was carried out for 15 additional cycles.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (17)

  1. 1. Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nukleinsäuren, wobei 1. A method for parallel sequencing of at least two different nucleic acids contained within a nucleic acid mixture, wherein
    • a) eine Oberfläche bereitgestellt wird, aufweisend Inseln von Nukleinsäuren jeweils gleicher Sorte, tertiäre Nukleinsäuren; a) is a surface provided, comprising islands of nucleic acids each variety, tertiary nucleic acids;
    • b) Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden; b) opposite strands of the tertiary nucleic acids, GTN provided;
    • c) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei c) the GTN be extended by one nucleotide, wherein
      • - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutz gruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert, - carrying the nucleotide at the 2'-OH position or at the 3'-OH position a protective group which prevents further extension
      • - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht; - the nucleotide carries a molecular group which enables the identification of the nucleotide;
    • d) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird; d) identifying the incorporated nucleotide;
    • e) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation verwendete Molekül gruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird, und e) the protecting group is removed and the molecule-group used for the identification of the incorporated nucleotide is removed or changed, and
    • f) Schritt (c) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die ge wünschte Sequenzinformation erhalten worden ist. f) Step (c) and subsequent steps are repeated until the desired ge sequence information has been obtained.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt (a) 2. The method of claim 1, wherein in step (a)
    • 1. eine Oberfläche bereitgestellt wird, an welche mindestens Primermoleküle eines ersten Primers und eines zweiten Primers und gegebenenfalls ein Nu kleinsäuregemisch umfassend die Nukleinsäuremoleküle, mit welchen beide Primer hybridisieren können, irreversibel immobilisiert worden sind, wobei beide Primer ein Primerpaar bilden; 1, a surface is provided, to which at least primer molecules of a first primer and a second primer, and optionally a Nu, are small mixed acid comprising the nucleic acid molecules with which both primers are capable of hybridizing been irreversibly immobilized, wherein both primers form a primer pair;
    • 2. Nukleinsäuremoleküle des Nukleinsäuregemischs mit einem oder mit bei den Primern desselben Primerpaares hybridisiert werden; 2. Nucleic acid molecules of the nucleic acid mixture are hybridized with one or the same with the primers primer pair;
    • 3. die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden; 3. irreversibly immobilized primer molecules are extended to the complementary Ge gens Trang to form secondary nucleic acids;
    • 4. die Oberfläche in einer von Nukleinäuremolekülen, die nicht durch irrever sible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen sind, befreiten Form bereitgestellt wird; 4. The surface in one of Nukleinäuremolekülen that are not bound by irrever sible immobilization to the surface, freed form is provided;
    • 5. die sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden; 5, the secondary nucleic acids are amplified to form tertiary nucleic acids;
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei im Schritt (a1) eine Oberfläche, an welche mindestens ein Primerpaar bildende Primermo leküle irreversibel immobilisiert wurden, bereitgestellt wird. 3. The method of claim 2, wherein in step (a1) a surface to which at least one primer pair forming Primermo leküle were irreversibly immobilized, is provided.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a1) Primer oder Nukleinsäuremoleküle mit flankierenden Sequenzabschnitten ver wendet werden, die selbstkomplementäre Bereiche aufweisen. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that in step (a1) primer or nucleic acid molecules with flanking sequence sections are applies ver having self-complementary regions.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die tertiären Nukleinsäuren durch eine Restriktionsendonuklase restringiert werden bevor an die auf diese Weise generierten Enden Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, ligiert werden. 5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that in step (b) can be restricted by a restriction endonuclease prior to be ligated to the ends generated in this way oligonucleotides which are capable of forming a hairpin structure, the tertiary nucleic acids.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide einzelsträngig sind. 6. A method according to claim 5, characterized in that the capable of forming a hairpin oligonucleotides are single stranded.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide doppelsträngig sind. 7. A method according to claim 5, characterized in that the capable of forming a hairpin oligonucleotides are double-stranded.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) einzelsträngige Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, an tertiäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, bevor tertiäre Nukleinsäuren und vorgenannte einzelstängige Oligonukleotide ligiert werden. 8. A method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that in step (b) single-stranded oligonucleotides which are capable of forming a hairpin structure, are hybridized to nucleic acids tertiary before tertiary nucleic acids and the aforementioned single-stranded oligonucleotides are ligated.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a1) die Primermoleküle durch Ausbildung einer kovalenten Bindung an eine Oberflä che irreversibel immobilisiert werden. 9. A method according to any one of claims 2 to 8 characterized in that in step (a1) the primer molecules che by forming a covalent bond to a Oberflä are irreversibly immobilized.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Base die Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht. 10. A method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that in step (c) the base carries the molecule group, which enables the identification of the nucleotide.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe die Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht. 11. A method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that in step (c), the protecting group transmits the molecule group, which enables the identification of the nucleotide.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) das Nukleotid an der 3'-OH-Position die Schutzgruppe trägt. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that in step (c), the protecting group carries the nucleotide at the 3'-OH position.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe eine spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Peroxid-Gruppe aufweist. 13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that in step (c), the protecting group has a cleavable ester, ether, anhydride or peroxide group.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe über eine Sauerstoff-Metall-Bindung mit dem Nukleotid verbun den ist. 14. A method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that in step (c) verbun the protecting group via an oxygen-metal bond with the nucleotide is the.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (e) die Entfer nung der Schutzgruppe durch ein komplexbildendes Ion, vorzugsweise durch Cyanid, Thiocyant oder Fluorid oder Ethylendiamintetraacetat erfolgt. 15. The method according to claim 14, characterized in that in step (e) the voltage Entfer the protecting group by a complex-forming ion, preferably by cyanide, Thiocyant or fluoride or ethylene diamine tetraacetate.
  16. 16. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (e) die Schutzgruppe photochemisch abgespalten wird. 16. The method any one of claims 1 to 12, characterized in that in step (e), the protective group is cleaved photochemically.
  17. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe einen Fluorophor aufweist und in Schritt (d) das Nukleotid fluo rometrisch identifiziert wird. 17. The method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that in step (c), the protecting group comprises a fluorophore and, in step (d) the nucleotide fluo rometrisch is identified.
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