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DE10042023C2 - Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln, und deren Verwendung bei Bioassays zum Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe - Google Patents

Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln, und deren Verwendung bei Bioassays zum Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe

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DE10042023C2
DE10042023C2 DE2000142023 DE10042023A DE10042023C2 DE 10042023 C2 DE10042023 C2 DE 10042023C2 DE 2000142023 DE2000142023 DE 2000142023 DE 10042023 A DE10042023 A DE 10042023A DE 10042023 C2 DE10042023 C2 DE 10042023C2
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SUPERNOVA DIAGNOSTICS, INC., US
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by the preceding groups
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587Nanoparticles

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kapseln, die feste Teil­ chen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle tragen, die Zielmole­ küle in einer Probe spezifisch erkennen und daran binden. Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung dieser Kapseln zur Signalerzeugung beim optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen. Es wird ein Nach­ weisverfahren und ein Kit bereitgestellt.

Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, nach denen jeder beliebige Verbindungstyp in Mikrokapseln eingeschlossen werden kann. In der Regel werden dabei die den Mikrokapseln einzuverleibenden Substanzen in einem Lösungsmittel gelöst. So wird z. B. in DE 31 36 606 C2 ein Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden Mikrokapseln beschrieben.

Es ist weiterhin bekannt, nanokristalline magnetische Partikel, die aus einem Eisenoxidkern und einer an diesen Kern chemisorbierten Hülle bestehen, zur in-vivo-Therapie und - Diagnostik (Radiotherapie, Hyperthermie, Chemotherapie, MR- Diagnostik, biomagnetische Sonde) zu verwenden (vgl. EP 0 516 252 A2).

Bioassays wie Festphasen-Enzym-Immungssays (ELISA), Radio­ immungssays (RIA), Fluoreszenz-Immungssays (FIA) oder Im­ munagglutinationsassays sind in der Fachwelt bekannt und spielen eine wichtige Rolle beim Nachweis von Analyten in der medizinischen Diagnose, bei Umweltanalysen und Lebens­ mittelanalysen. Bioassays beruhen auf der Wechselwirkung eines markierten Biomoleküls mit einem nachzuweisenden Ana­ lyten. Die Markierung fungiert als Hilfsmittel, um die Wechselwirkung sichtbar zu machen. Es sind verschiedene Ar­ ten von Markierungen bekannt: Enzyme bei ELISAs, Radioiso­ tope bei RIAs, Fluorophore bei FIAs, Liposomen, Latex-Teil­ chen bei Immunagglutinationsassays, sowie Farbstoffe, Ver­ mittler, Gold-Teilchen und DNA.

Die wichtigsten Anforderungen an Bioassays sind Spezifität und Empfindlichkeit. Die Spezifität wird durch das Bioer­ kennungsmolekül bestimmt, z. B. das Zusammenpassen der Bindungsstelle eines Antikörpers mit seinem Antigen (Analyt) oder die Hybridisierung zweier komplementärer Nucleinsäure- Stränge. Die Empfindlichkeit eines Bioassays wird ebenfalls durch das Bioerkennungsmolekül aufgrund der Affinitätskon­ stante seiner biologischen Wechselwirkung beeinflußt. Die Markierung fungiert als Marker für das Biomolekül und läßt sich mit verschiedenen Techniken messen: i) optisch durch Messung der Absorption eines Farbstoffs oder des durch Fluorophore angeregten Fluoreszenzlichts, oder turbidi­ metrisch durch die Lichtstreuung agglutinierter Latex-Teil­ chen, ii) auf radioaktivem Wege durch Messen von Radio­ isotopen, iii) elektrochemisch durch Messen von Vermittlern oder elektroaktiven Substanzen.

Die Empfindlichkeit von Bioassays wird in erheblichem Maße durch die Beschaffenheit der Markierung und die zur Messung der Konzentration der Markierung eingesetzte Nachweistech­ nik bestimmt. Die RIA-Technologie, bei der Radioisotope verwendet werden, ist nach wie vor die empfindlichste Me­ thode. Diese überaus leistungsfähige Technik wurde 1959 von Yalow und Berson eingeführt und wurde zu einem neuen Gebiet in der analytischen Chemie sowie in der Diagnostik und Me­ dizin. Allerdings besteht bei dieser Technik der Nachteil, daß sich das Risiko gefährlicher Kontaminationen von Menschen und Umwelt aufgrund der verwendeten radioaktiven Isotope nicht auf Null reduzieren läßt.

Daher wurden nicht-radioaktive Methoden mit dem Ziel ent­ wickelt und verbessert, eine vergleichbare Empfindlichkeit zu erreichen. Die Bedeutung der auf Fluoreszenz, Lumi­ neszenz und Absorptionsspektroskopie beruhenden optischen Verfahren nahm mit der Zeit zu und ist noch immer im Ansteigen begriffen.

Bei der ELISA-Technologie werden Enzyme als Marker zur Si­ gnalverstärkung verwendet. Nach Durchführung des Bioassays wird die biologische Wechselwirkung von Analyt und Sonde durch die Produktion einer großen Zahl von Farbstoffmolekü­ len durch ein einziges Enzym-Markermolekül verstärkt. Es werden Enzyme wie Glucoseoxidase (GOD, EG 1.1.3.4.), al­ kalische Phosphatase (AP, EG 3.1.3.1) oder Peroxidase (POD, EG 1.11.1.7) mit Umsatzzahlen von 2000 Substratmolekülen pro Sekunde (s-1), 5000 s-1 beziehungsweise 10000 s-1 verwen­ det. Verstärkungsraten von etwa 10000 bis eine Million sind mit Substratinkubationszeiten von 10 bis 60 Minuten möglich. Ein Nachteil der ELISA-Technik ist die große Zahl der Schritte bei diesem Verfahren und die zusätzliche Zeit, die für die Substratinkubation erforderlich ist.

Auch Fluoreszenzverfahren werden in der Bioanalytik seit Jahren eingesetzt und sind von hohem Interesse. Mit allen auf Fluoreszenz beruhenden Techniken sind eine gute Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen von 10-8 bis 10-18 M sichergestellt. Mit speziellen Techniken, z. B. "zeitaufgelöster Fluoreszenz", Chemi- und Biolumineszenz oder Techniken, die auf der Energieübertragung zwischen ei­ nem Farbstoff- und einem Fluorophor-Molekül beruhen, lassen sich Nachweisgrenzen von 10-15 bis 10-18 M erreichen.

Bei den im Stand der Technik bekannten Fluoreszenz-Immungs­ says werden niedermolekulare Fluoreszenz-Markierungen mit reaktiven funktionellen Linker-Gruppen (Southwick P. L. et al., Cytometry, 11, S. 418-430, 1990; Mujumdar R. B. et al., Bioconjugate Chemistry 4, S. 105-111; 1993, Mujumder R. B. et al., Cytometry 10, S. 11-19, 1989), fluoreszierende und mit Farbstoff gefärbte Teilchen (US 4 837 168; US 6 013 531; WO 95/08772) oder mit Fluorophoren durchsetzte Dendrimere (DE 197 03 718) verwendet.

DE 36 18 100 A1 beschreibt z. B. in Beispiel 1 ein Fluoreszenz- Immunoassayverfahren, bei dem Mikrokapseln, die mit Antikörpern auf der Oberfläche markiert sind und fluoreszierendes Eosin beinhalten, zum Nachweis dienen. Zum Aufbrechen der Membran der Mikrokapseln dient ein Metallionen freisetzendes Metallsalz.

Bekannt aus dem Stand der Technik ist auch die Verwendung Marker tragender Liposomen zur Signalverstärkung bei Immun­ gssays (US 5 756 362, 4 874 710, 4 703 017). Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist insofern begrenzt, als die Menge an Marker-Substanzen, die in die Liposomen in löslich gemachter Form eingebracht werden kann, begrenzt ist. Ein weiterer Nachteil bei der Verwendung von markierten Liposo­ men ist die begrenzte Stabilität der Liposomen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens für Zielmoleküle in einer Probe, das im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Ver­ fahren eine sehr gute Empfindlichkeit, niedrige Nachweisgrenzen und eine Verstärkung des Nachweissignals bezogen auf die Menge an Zielmolekül sicherstellt.

Vorzugsweise sollte das erfindungsgemäße Verfahren für op­ tische Nachweise, insbesondere bei Fluoreszenz-Immungssays geeignet sein.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung eines Kits für den optischen, elektrochemischen oder chemi­ schen Nachweis von Zielmolekülen.

Ebenfalls Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung mar­ kierter Biomoleküle, die sich leicht herstellen lassen und bei den erfindungsgemäßen Bioassays, vorzugsweise bei Fluo­ reszenz-Immungssays anwendbar sind.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem wird gelöst durch ein Verfahren zum optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in ei­ ner Probe unter Nutzung der auf Affinität beruhenden Wech­ selwirkungen zwischen dem Zielmolekül und einem Affinitäts­ molekül für die spezifische Erkennung des Zielmoleküls, um­ fassend die Schritte:

  • a) Inkubieren der Zielmoleküle mit Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äußeren Oberfläche die entsprechenden Affinitätsmoleküle tragen,
  • b) Abtrennen des resultierenden Komplexes aus Ziel- und Affinitätsmolekül von den Kapseln mit unumge­ setzten Affinitätsmolekülen auf deren Oberfläche,
  • c) Freisetzen und Lösen der eingekapselten festen Teilchen der signalerzeugenden Substanzen durch Be­ handeln des erhaltenen Ziel/Affinitäts-Komplexes mit physikalischen oder chemischen Mitteln,
  • d) Nachweisen oder Quantifizieren des Signals, das durch die freigesetzten und gelösten signalerzeu­ genden Substanzen erzeugt wird und in direkter oder indirekter Beziehung zur Menge an Zielmolekülen steht.

Durch die verwendeten Kapseln, die feste signalerzeugende Substanzen in hohen Mengen einkapseln, die während des Nachweisvorgangs freigesetzt und gelöst werden, wird eine Signalverstärkung erreicht.

Gegenstand der Erfindung sind auch die Kapseln nach den An­ sprüchen 1 bis 17.

Erfindungsgemäß tragen die verwendeten Kapseln auf ihrer äußeren Oberfläche Affinitätsmoleküle, die Zielmoleküle spezifisch erkennen und daran binden. Mit "Zielmolekül" ist der nachzuweisende Analyt gemeint bzw. ein Analyt, der mit einem Molekül verknüpft ist, das an die Affinitätsmoleküle an der Oberfläche der Kapsel binden kann.

Je nach den nachzuweisenden Zielmolekülen sind die Affini­ tätsmoleküle ausgewählt aus der Gruppe der Peptide oder Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, Liganden mit nied­ rigem Molekulargewicht und molekular aufgedruckten Polyme­ ren (MIPs) oder Mischungen derselben. Als Peptide oder Pro­ teine können Antikörper, Rezeptoren, Antigene, Lektine, Avidine, Oligopeptide, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptid­ hormone und Allergene oder Teile derselben verwendet wer­ den. Die Nucleinsäuren, die ebenfalls Affinitätsmoleküle auf der Kapseloberfläche sein können, sind ausgewählt aus der Gruppe der einzel- oder doppelsträngigen DNAs, RNAs, Oligonucleotide, Ribozyme, Aptamere und Teilen derselben. Auch Kohlenhydrate, ausgewählt aus der Gruppe der Mono-, Oligo- und Polysaccharide, Glycolipide, Proteopolysaccha­ ride und Teilen derselben können Affinitätsmoleküle sein. Erfindungsgemäß sind Liganden mit niedrigem Molekularge­ wicht Biotin oder ein Biotin-Derivat, ein Steroid oder Hor­ mon, ein Cofaktor oder Coenzym, ein Aktivator, Inhibitor, Pseudosubstrat oder eine prosthetische Gruppe eines Enzyms, ein Arzneimittel, ein Pestizid, ein Allergen oder Digoxin oder ein Hapten.

Die Affinitätsmoleküle sind z. B. durch Van-der-Waals- Kräfte, Wasserstoff-Bindungen oder elektrostatische Wech­ selwirkungen an die äußere Oberfläche der Kapseln konju­ giert, oder sie sind direkt oder über Linker-Moleküle cova­ lent an die äußere Oberfläche der Kapseln gebunden, wobei das Linker-Molekül normalerweise ein Biomolekül, vorzugs­ weise Avidin, Streptavidin, Neutravidin, Protein A, Protein G, Lektin oder ein niedermolekularer Vernetzer ist.

Die Kapseln, welche die festen signalerzeugenden Substanzen einkapseln, die beim erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendet werden, werden hergestellt durch Behandeln von wenig wasserlöslichen oder wasserunlöslichen ungeladenen festen signalerzeugenden Substanzen mit einer wäßrigen Lösung eines ionischen Detergens, wobei die amphiphile Sub­ stanz an der Oberfläche der festen signalerzeugenden Sub­ stanzen angeordnet wird und diese empfänglich gemacht werden für die anschließende Beschichtung mit einer Schicht eines geladenen Polyelektrolyten oder mit einer Mehrfachschicht, umfassend abwechselnde Schichten entgegengesetzt geladener Polyelektrolyten.

Die feste signalerzeugende Substanz wird vor Gebrauch zu feinen Teilchen vermahlen, oder Teilchen geeigneter Größe werden mit Hilfe anderer Methoden erzeugt, z. B. durch Sprühtrocknung.

Beim ersten Schritt des Verfahrens werden die ungeladenen festen signalerzeugenden Teilchen mit einer amphiphilen Substanz behandelt, die die Oberfläche der Teilchenmateria­ lien mit einer elektrischen Ladung versieht. Die Behandlung der festen signalerzeugenden Teilchen mit dem Tensid ist auch im Laufe eines Naßmahlverfahrens möglich.

Beim zweiten Schritt werden die mit amphiphiler Substanz beschichteten Teilchen mit einem Polyelektrolyt beschich­ tet, der eine zur Oberfläche der Teilchenmaterialien entge­ gengesetzte Ladung aufweist. Zur Bildung von Mehrfach­ schichten werden die signalerzeugenden Teilchen anschlie­ ßend mit entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten behan­ delt, d. h., abwechselnd mit kationischen und anionischen Polyelektrolyten. Die Polymerschichten fügen sich auf den vorher geladenen festen Matrizen durch elektrostatische schichtweise Abscheidung von selbst zusammen und bilden so eine mehrschichtige polymere Hülle um die festen Kerne.

In einem letzten Schritt wird die Oberfläche der erhaltenen Polyelektrolyt-Kapseln gemäß dem nachzuweisenden Zielmole­ kül mit Affinitätsmolekülen modifiziert (vgl. Fig. 1). Er­ findungsgemäß werden die Polyelektrolyt-Kapseln mit den Af­ finitätsmolekülen, z. B. mit Immunglobulinen, inkubiert. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Af­ finitätsmoleküle durch chemische Reaktion covalent an die Polyelektrolyt-Kapseln gebunden, z. B. nach EDC/NHS-Aktivierung der Teilchen mit einer äußersten Schicht des Polyelek­ trolyten Polyacrylsäure.

Es ist auch möglich, die Affinitätsmoleküle mit Linker-Mo­ lekülen umzusetzen, die zwei funktionelle Gruppen aufweisen und an die Polyelektrolyt-Kapsel und das Affinitätsmolekül binden können, z. B. durch Verwendung eines homo- oder he­ terobifunktionellen Vernetzers wie DSS, DTSSP oder SMCC bzw. MBS.

Das beschriebene Einkapselungsverfahren ermöglicht den Ein­ schluß einer breiten Auswahl und hoher Mengen an signaler­ zeugenden Substanzen (107 bis 109 Moleküle pro Teilchen, je nach Größe und Dichte des Teilchens und Molekulargewicht der Substanz). Je nach gewünschtem Nachweisverfahren können niedermolekulare Substanzen, ausgewählt aus Fluorophoren, Luminophoren, Chromophoren, Enzymsubstraten, prosthetischen Gruppen, oder redoxaktive Substanzen, ausgewählt aus Redox­ vermittlern, elektrodenaktiven Substanzen und Metallsalzen eingekapselt werden. Auch hochmolekulare Substanzen, ausge­ wählt aus der Gruppe der Enzyme und ihrer Vorläufer, biolu­ minogene und fluorogene Proteine, Nucleinsäuren, Ribozyme und Aptamere können die signalerzeugenden Substanzen sein, die eingekapselt werden.

Erfindungsgemäß sind die eingekapselten festen Teilchen aus signalerzeugenden Substanzen Kristalle, amorphe oder lyo­ philisierte Teilchen, sprühgetrocknete Teilchen, gemahlene Teilchen oder Mischungen derselben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben die eingekapselten fe­ sten Teilchen eine Teilchengröße von 10 nm bis 10 µm, vor­ zugsweise etwa 100 nm.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln kann als am­ phiphile Substanz jede Substanz verwendet werden, die ioni­ sche hydrophile und hydrophobe Gruppen aufweist. Vorzugsweise werden ionische Tenside, Phospholipide und/oder am­ phiphile Polyelektrolyte verwendet. Amphiphile Polyelek­ trolyte beispielsweise sind Polyelektrolyte, die eine gela­ dene Gruppe als hydrophile Gruppe und eine hydrophobe Gruppe, z. B. eine aromatische Gruppe umfassen. Bevorzugt ist die Verwendung eines kationischen oder/und anionischen Tensids. Beispiele für geeignete kationische Tenside sind quartäre Ammonium-Salze (R4N+X-, insbesondere Didodecyldi­ methylammoniumbromid (DDDAB), Alkyltrimethylammoniumbromid, insbesondere Dodecyltrimethylammoniumbromid oder Palmityl­ trimethylammoniumbromid oder N-Alkylpyridinium-Salze oder tertiäre Amine (R3NH+X-, insbesondere Cholesteryl-3β-N-(di­ methylaminoethyl)carbamat oder Mischungen derselben, wobei X- ein Gegenanion wie z. B. ein Halogenid bedeutet. Beispiele für geeignete anionische Tenside sind Alkylsulfonate (R-SO3M), insbesondere Dodecylsulfat, z. B. Natriumdodecyl­ sulfat (SDS), Laurylsulfat oder Olefinsulfonate (R-SO3M), insbesondere Natrium-n-dodecylbenzolsulfonat oder Alkylsul­ fate (R-OSO3M) oder Fettsäuren (R-COOM), insbesondere Dode­ cansäure-Natriumsalz, oder phosphorige Säure oder Cholsäu­ ren oder fluororganische Verbindungen, insbesondere Lithi­ um-3-[2-(perfluoralkyl)ethylthio]propionat oder Mischungen derselben. Besonders bevorzugt sind Tenside mit 6 bis 30 Kohlenstoffen in ihren Alkyl- oder Olefin-Gruppen.

Bevorzugt ist weiterhin, eine polymere Substanz als amphi­ phile Substanz zu verwenden, die geladene Gruppen und hy­ drophobe Stellen bereitstellt. In einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform wird Polystyrolsulfonat (PSS) verwendet.

Unter Polyelektrolyten sind im allgemeinen Polymere mit io­ nisch dissoziierbaren Gruppen zu verstehen, die eine Kompo­ nente oder ein Substituent der Polymerkette sein können. Normalerweise ist die Zahl dieser ionisch dissoziierbaren Gruppen in Polyelektrolyten so groß, daß die Polymere in dissoziierter Form (auch Polyionen genannt) wasserlöslich sind. Der Begriff Polyelektrolyte soll in diesem Zusammen­ hang auch Ionomere abdecken, bei denen die Konzentration an ionischen Gruppen zur Wasserlöslichkeit nicht ausreicht, die aber genügend Ladungen zum Selbstzusammenfügen aufwei­ sen. Vorzugsweise umfaßt die Hülle allerdings "echte" Po­ lyelektrolyte, d. h., wasserlösliche Polyelektrolyte. Je nach Art der dissoziierbaren Gruppe werden Polyelektrolyte in Polysäuren und Polybasen eingeteilt.

Dissoziierte Polysäuren bilden unter Abspaltung von Proto­ nen Polyanionen, die anorganische, organische und Biopoly­ mere sein können. Beispiele für Polysäuren sind Polyphos­ phorsäure, Polyvinylschwefelsäure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphonsäure und Polyacrylsäure. Beispiele für die entsprechenden Salze, die auch Polysalze genannt wer­ den, sind Polyphosphat, Polysulfat, Polysulfonat, Polyphos­ phonat und Polyacrylat.

Polybasen enthalten Gruppen, die z. B. durch Reaktion mit Säuren Protonen aufnehmen können, wobei ein Salz gebildet wird. Beispiele für Polybasen mit dissoziierbaren Gruppen in ihrem Gerüst und/oder ihren Seitengruppen sind Polyal­ lylamin, Polyethylimin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin. Durch die Aufnahme von Protonen bilden Polybasen Polykatio­ nen.

Geeignete erfindungsgemäße Polyelektrolyte sind auch Biopo­ lymere wie etwa Alginsäure, Gummi arabicum, Nucleinsäuren, Pektine, Proteine und andere, sowie chemisch modifizierte Biopolymere wie etwa Carboxymethylcellulose und Ligninsul­ fonate, sowie synthetische Polymere wie z. B. Polymethacryl­ säure, Polyvinylsulfonsäure, Polyvinylphosphonsäure und Po­ lyethylenimin.

Es können lineare oder verzweigte Polyelektrolyte verwendet werden. Die Verwendung von verzweigten Polyelektrolyten führt zu weniger kompakten Polyelektrolyt-Mehrfachschich­ ten, die höhere Wandporosität aufweisen. Zur Erhöhung der Kapselstabilität können Polyelektrolyt-Moleküle innerhalb oder/und zwischen den einzelnen Schichten vernetzt sein, z. B. durch Vernetzen von Amino-Gruppen mit Aldehyden.

Im Grunde bestehen keine Einschränkungen hinsichtlich der zu verwendenden Polyelektrolyte bzw. Ionomere so lange die eingesetzten Moleküle ausreichend hohe Ladung aufweisen oder/und an die Schicht darunter über eine andere Art Wech­ selwirkung binden können, z. B. durch Wasserstoff-Bindung und/oder hydrophobe Wechselwirkungen.

Geeignete Polyelektrolyte sind somit sowohl niedermolekula­ re Polyelektrolyte als auch Polyionen, die z. B. Molekular­ gewichte von einigen hundert Dalton aufweisen, bis hin zu makromolekularen Polyelektrolyten, z. B. Polyelektrolyten biologischen Ursprungs, die Molekulargewichte von mehreren tausend bis Millionen Dalton aufweisen.

Weitere Beispiele für ein organisches Polymer als Bioelek­ trolyt sind biologisch abbaubare Polymere wie etwa Polygly­ colsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyamide, Poly-2-hy­ droxybutyrat (PHB), Polycaprolacton (PCL), Polymilch-co­ glycolsäure (PLGA), fluoreszenzmarkierte Polymere, leitende Polymere, Flüssigkristall-Polymere, photoleitende Polymere, photochrome Polymere und deren Copolymere und/oder Mischun­ gen derselben. Beispiele für Biopolymere, die als Polyelek­ trolyt bevorzugt sind, sind Polyaminosäuren, insbesondere Peptide, S-Schichtproteine, Polykohlenhydrate wie etwa Dex­ trin, Pektin, Alginat, Glycogen, Amylose, Chitin, Chondro­ itin, Hyaluronsäure, Polynucleotide wie etwa DNA, RNA, Oli­ gonucleotide oder/und modifizierte Biopolymere wie etwa Carboxymethylcellulose, Carboxymethyldextran oder Lignin­ sulfonate. Bevorzugte Beispiele für anorganische Polymere als Polyelektrolyt sind Polysilane, Polysilanole, Polyphos­ phazene, Polysulfazene, Polysulfide und/oder Polyphosphate.

Möglich ist auch die Abscheidung geladener Nanoteilchen oder Biomoleküle als Kapselmaterial.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln wird vorzugs­ weise so durchgeführt, daß überschüssiges Material der bei den einzelnen Schritten verwendeten Ausgangssubstanzen nach jedem Behandlungsschritt abgetrennt wird. Zum Beispiel wird zunächst eine wäßrige Dispersion der Matrizenteilchen ge­ bildet, die mit einer wäßrigen Lösung der amphiphilen Sub­ stanz versetzt wird. Nach Abtrennung etwaiger überschüssi­ ger amphiphiler Moleküle wird eine erste Polyelektrolyt- Spezies zugesetzt, um die erste Polyelektrolyt-Hülle aufzu­ bauen. Nach Abtrennung etwaiger überschüssiger Polyelektro­ lyt-Moleküle wird die entgegengesetzt geladene Polyelektro­ lyt-Spezies, die zum Aufbau der nächsten Schicht verwendet wird, zugesetzt. Anschließend werden entgegengesetzt gela­ dene Schichten aus Polyelektrolyt-Molekülen nacheinander aufgebracht, wobei für jede Schicht gleicher Ladung identi­ sche oder unterschiedliche Polyelektrolyt-Spezies oder Mi­ schungen aus Polyelektrolyt-Spezies ausgewählt werden kön­ nen und zwischen jedem Inkubationsschritt ein Reinigungs­ schritt durchgeführt wird. Die Vorgehensweise beim Be­ schichten der Kapseln mit Affinitätsmolekülen ist in Bei­ spiel 4 beschrieben. Techniken, die auf direkter Adsorption oder covalenter Verknüpfung mit niedermolekularen Vernet­ zern beruhen, sind versierten Fachleuten wohlbekannt. Er­ findungsgemäß wird in bevorzugter Weise das Binden biotiny­ lierter Moleküle an Avidin-vorbeschichtete Kapseln ange­ wandt.

Erfindungsgemäß sind die wie vorstehend beschrieben herge­ stellten Kapseln bei Bioassays zum optischen, elektrochemi­ schen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen vorzüglich einsetzbar. In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden die Zielmoleküle mit den erfin­ dungsgemäßen Kapseln, die an ihrer äußeren Oberfläche Ziel­ moleküle spezifisch erkennende Affinitätsmoleküle tragen, über einen hinreichenden Zeitraum inkubiert, um einen Kom­ plex aus Ziel- und Affinitätsmolekül zu ergeben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Zielmo­ leküle direkt oder über ein anderes Affinitätsmolekül an eine feste Phase gebunden, z. B. an eine Mikrotiterplatte oder eine Nitrocellulose-Unterlage.

Beim zweiten Schritt des Nachweisverfahrens wird der resul­ tierende Ziel-/Affinitätsmolekül-Kapsel-Komplex von den un­ umgesetzten Affinitätsmolekülen, d. h., von den Kapseln mit unumgesetzten Affinitätsmolekülen auf ihrer Oberfläche abgetrennt.

Im nächsten Verfahrensschritt werden die eingekapselten fe­ sten Teilchen der signalerzeugenden Substanzen mit Hilfe physikalischer oder chemischer Mittel aus den Kapseln in ein Medium freigesetzt. Bei einer Ausführungsform der Er­ findung wird die Freisetzung durch Zugabe von Reagenzien erreicht, die zum Lösen der ungeladenen festen Kernsubstan­ zen geeignet sind, z. B. ein organisches Lösungsmittel, in dem das Material löslich ist, oder ein saures oder alkali­ sches Lösungsmittel, in dem das Material ein lösliches Salz bildet. Erfindungsgemäß kann das Auflösen der Matrizenteil­ chen in milder Weise im Laufe einer kurzen Inkubationszeit vorgenommen werden, z. B. 1 min bis 1 h bei Raumtemperatur. Die Matrizen zerfallen fast vollständig, da kein Rückstand an Teilchen mehr nachweisbar ist, selbst wenn man die ver­ bleibenden Hüllen mit einem Elektronenmikroskop untersucht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kapseln mit einem organischen Lösungsmittel oder mit einem Enzym oder Ribozym oder durch Ändern des pH-Werts oder des Werts für die Ionenstärke behandelt. Die bevorzugten einsetzbaren organischen Lösungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe der Alkohole, insbesondere Ethanol und Methanol, Ketone, insbe­ sondere Aceton, Ester, insbesondere Ethylester, Aromaten, insbesondere Toluol, Sulfoxide, insbesondere DMSO, sowie Ether, besonders Dimethylether oder aus Mischungen organi­ scher Lösungsmittel mit Wasser.

Das Zerfallen der eingekapselten festen signalerzeugenden Substanzen läßt sich auch durch physikalische Mittel errei­ chen, vorzugsweise durch Ultraschall-Zermahlung, elektri­ schen Impuls oder osmotischen Schock.

Der letzte Schritt des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens umfaßt den Nachweis oder die Messung des Signals, das durch die freigesetzten und gelösten signalerzeugenden Substanzen generiert wird und in direkter oder indirekter Beziehung zur Menge an Zielmolekülen steht.

In einer Ausführungsform der Erfindung läßt sich der Nach­ weis eines oder mehrerer Zielmoleküle in einer Probe in ei­ nem Fluoreszenz-Immungssay durchführen. In diesem Fall sind die eingekapselten signalerzeugenden Substanzen Fluoro­ phore, z. B. fluoreszierende Substanzen auf der Grundlage von Cyanin-, Carbocyanin-, Rhodamin-, Xanthen- und Diazo- Farbstoffen. Eine komprimierte Beschreibung von mehr als 500 Farbstoffen, darunter Fluorophoren, findet sich in: The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators; Floyd J. Green; Aldrich Chemical Company, Inc., 1991.

Der Fluoreszenz-Immungssay ist eine bevorzugte Ausführungs­ form der vorliegenden Erfindung. Da es möglich ist, große Mengen an festen Fluorophor-Teilchen einzukapseln, wird ein hohes Fluorophor/Affinitätsmolekül-Verhältnis erreicht. Aufgrund des Lösens in einem Lösungsmittelvolumen wird eine hohe Quantenausbeute erhalten. Löschungseffekte treten nicht auf. Wie z. B. aus Beispiel 3 und Fig. 5 der vorliegenden Beschreibung ersichtlich, ist nach Freisetzung und Lösen der Fluorophor-Teilchen aus den erfindungsgemäßen Kapseln eine bemerkenswerte Verstärkung des Fluoreszenzsi­ gnals nachweisbar.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in einer Probe auch mit einem sichtbaren Farbstoff durchgeführt werden, der in den erfindungsgemäßen Polyelektrolyt-Kapseln einge­ kapselt ist, vorzugsweise mit Cyanin-, Pyrazolon-, Anthra­ chinon-, Anthroloin-, Carbocyanin-, Rhodamin-, Xanthen-, Carotinoid-, Diazo- und Monoazo-, Oxazin-, indigoiden und Riboflavin-basierten Farbstoff-Substanzen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis ähnlich wie ein ELISA durchgeführt werden, wobei ein Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase oder Glucoseoxidase die eingekapselte signalerzeugende Substanz ist. Das ent­ sprechende Substrat kann im Aufbrechpuffer enthalten sein, der für die Zerstörung der Kapseln und zur Freisetzung des Enzyms verwendet wird.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Ra­ dioimmungssays durchgeführt werden. Die Kapseln tragen eine radioaktive Substanz, die nach Freisetzung aus den Kapseln in einem Szintillationszähler gemessen wird.

Erfindungsgemäß ist die Immunagglutination der Kapseln eine geeignete Möglichkeit, die an einen Analyten gebundenen Kapseln auszufällen und sie von unumgesetzten Kapseln abzu­ trennen, d. h., von Kapseln, die nicht an ein Zielmolekül oder einen Analyt gebunden sind.

Die vorliegende Erfindung macht auch ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines (oder mehrerer) Analy­ ten verfügbar, wobei eine elektroaktive Substanz, ein elektroinaktives Enzymsubstrat oder ein Enzym als signalerzeu­ gende Substanz elektrochemisch nachgewiesen wird.

Die elektrochemische Messung wird mit einem Sensorsystem durchgeführt, umfassend eine Arbeits-, Bezugs- und Gegen­ elektrode sowie eine Elektrolytlösung. Es können Mikro- oder Makrodickfilm-, Dünnfilm-Elektroden oder herkömmliche Stabelektroden sein. Beim amperometrischen Ansatz wird ein Potential angelegt, so daß die elektroaktive Substanz redu­ ziert oder oxidiert werden kann. Beim potentiometrischen Ansatz wird die vorstehend beschriebene elektrochemische Vorrichtung verwendet, mit der Ausnahme, daß diese eine In­ dikator- und Bezugselektrode kombiniert aufweist und die durch eine elektroaktive Substanz (z. B. Ionen) verursachte Potentialänderung mißt.

In der Amperometrie können bekannte Vermittler als elektro­ aktive Substanzen eingesetzt werden, die bei niedrigem Po­ tential oxidiert werden. Je nach Beschaffenheit des Analy­ ten trägt die Arbeitselektrode Antikörper oder Antigene, die mit Hilfe verschiedener Methoden auf der Elektro­ denoberfläche oder auf einer Membran immobilisiert sind, die die Oberfläche der Arbeitselektrode bedeckt.

Beim Nachweis eines hochmolekularen Antigens (zum Beispiel des Frühinfarkt-Markers fettsäurebindendes Protein, FABP) sind Fänger-Antikörper gegen das Antigen (FABP) auf der Ar­ beitselektrode immobilisiert. Eine Blut- oder Plasmaprobe (enthaltend das Antigen FABP) wird der Elektrode zusammen mit Kapseln zugesetzt, die eingekapselte feste elektroak­ tive Substanzen enthalten und Detektor-Antikörper gegen das Antigen (FABP) auf der Kapseloberfläche aufweisen. Die Sub­ stanzen bilden ein "Sandwich" auf der Arbeitselektrode: Fänger-Antikörper/Antigen(FABP)-Detektor-Antikörper/einge­ kapselte elektroaktive Substanz. Danach wird das Elektro­ densystem mit neutralem Puffer gewaschen, um nichtgebundene Substanzen und Probenbestandteile auszuwaschen, und es werden organische Lösungsmittel (z. B. DMSO oder Ethanol) zuge­ setzt, um die Freisetzung und Auflösung der elektroaktiven Substanz in der Nähe der Elektrodenoberfläche zu erleich­ tern. Es wird ein starker Oxidationsstrom erzeugt, der zur Menge der erzeugten elektroaktiven Substanz proportional ist. Das Sensorsystem läßt sich vor dem Einsatz mit Hilfe unterschiedlicher Mengen Antigen und gleichen Mengen eingekapselter elektroaktiver Substanzen kalibrieren.

Die Empfindlichkeit des Assays läßt sich noch weiter stei­ gern, wenn ein Enzym in festem Zustand (zum Beispiel alka­ lische Phosphatase, AP) zur Signalerzeugung eingekapselt ist und ein elektrodeninaktives Substrat (wie etwa p-Amino­ phenylphosphat, pAPP) in hoher Konzentration zusammen mit dem Aufbrechreagens zur Freisetzung des Enzyms zugegeben wird. Das Produkt (p-Aminophenol) wird enzymatisch gebildet und anschließend an der Arbeitselektrode oxidiert.

Für niedermolekulare Antigene (Haptene), die keine Bildung von Sandwich-Anordnungen gestatten, sind die beschriebenen Systeme anwendbar, sofern ein Konkurrenzprinzip Anwendung findet. In diesem Fall müssen entweder die Kapseln durch das Antigen (oder Antigen-Analogon) markiert werden und müssen um den Analyten konkurrieren, oder das gleiche Anti­ gen (oder Antigen-Analogon) wie der nachzuweisende Analyt muß an die Oberfläche der Arbeitselektrode gebunden sein. Die Antikörper-markierten Kapseln konkurrieren dann um den freien (nachzuweisenden) Analyten und das an die Oberfläche gebundene Antigen. In beiden Fällen ist das Elektrodensi­ gnal indirekt proportional zur Analyt-Konzentration (ähn­ lich wie bei ELISA und RIA).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung tragen die Kapseln eine chemische Substanz, die als Katalysator fun­ gieren kann (z. B. Dibenzoylperoxid zur Einleitung einer Po­ lymerisationsreaktion eines Monomers, z. B. Acrylsäure), oder ein Edukt für eine chemische Reaktion (z. B. ein Kupp­ lungsreagens für Diazonium-Salzbildung, das geeignet ist, in einer Diazonium-Reaktion unter Bildung eines Farbstoffs oder eines fluoreszierenden Produkts zu reagieren).

Weiterhin macht die Erfindung ein immunchromatographisches Verfahren (Seitenfließtest) zum Nachweisen oder Quantifi­ zieren eines Analyten verfügbar. Als Beispiel wird ein hochmolekulares Antigen wie FABP ausgewählt, das in einer Plasmaprobe nachzuweisen ist.

Die Probe wird an einem Ende eines absorbierenden Materials (zum Beispiel Nitrocellulose) der Testvorrichtung aufgetra­ gen. Die Flüssigkeit wandert aufgrund der Kapillarkräfte zum anderen Ende, die durch ein am anderen Ende befindli­ ches Saugkissen verstärkt werden. Die mit Kapseln (enthal­ tend die feste signalerzeugende Substanz) markierten Detek­ tor-Antikörper sind vorzugsweise in nicht diffusionsfähiger Form im Überschuß im Kontaktbereich gebunden. Die signaler­ zeugende Substanz kann ein fluoreszierender Farbstoff, ein sichtbarer Farbstoff, ein biolumineszierendes oder chemilu­ mineszierendes Material sein.

Das Antigen (FABP) aus der Probe tritt mit den Detektor-An­ tikörpern in Wechselwirkung und wandert zum anderen Ende der Vorrichtung, wobei es die Kapseln mit sich führt. Im Indikatorbereich (Punkt oder Streifen) in der Nähe des Saugkissens wird ein Sandwich mit Fänger-Antikörpern gebil­ det. Hier sind die Fänger-Antikörper mehr oder weniger fest an das absorbierende Material gebunden und können daher nicht wandern. Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist, desto mehr Sandwich-Strukturen werden gebildet und desto mehr Kapseln werden im Indikatorbereich gebunden. Die si­ gnalerzeugende Substanz kann durch Eintauchen der gesamten Vorrichtung in ein Lösungsmittel (z. B. Ethanol) oder durch Auftropfen eines Lösungsmitteltropfens auf den Indikatorbereich oder durch Einbringen eines die Kapsel lysierenden Lösungsmittels in die Vorrichtung freigesetzt werden. Das Signal kann sofort mit bloßem Auge oder zur Quantifizierung mit einem optischen Lesegerät erfaßt werden.

Hinter dem Indikatorbereich ist ein Kontrollbereich ange­ ordnet. Er zeigt an, ob der Eintauchstreifen richtig arbei­ tet und enthält Antikörper (Punkt oder Streifen), die fest an das absorbierende Material gebunden und gegen die Detek­ tor-Antikörper gerichtet sind. In jedem Fall ist ein Teil der Detektor-Antikörper (die mit Kapseln markiert sind) nicht im Indikatorbereich gebunden und wandert weiter. Das Kontrollsignal wird zur gleichen Zeit wie im Indikatorbe­ reich erzeugt. Anstelle der Anti-Detektor-Antikörper kann auch das fest gebundene Antigen (oder Antigen-Analogon) zur Schaffung der Kontrolle verwendet werden.

Unter Anwendung des Konkurrenzprinzips kann der Eintauch­ streifen für niedermolekulare Substanzen modifiziert wer­ den. Statt des seitlichen Fließens läßt sich auch eine Vor­ richtung mit senkrechtem Fluß konstruieren. Sollen mehrere Antigene gemessen werden, so sind die geeigneten Antikörper einzusetzen und dementsprechend müssen unterschiedliche si­ gnalerzeugende Substanzen für die verschiedenen Analyten verwendet werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Kit für den optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekü­ len in einer Probe, umfassend Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln und an ihrer äuße­ ren Oberfläche Affinitätsmoleküle zum spezifischen Erkennen und Binden an ein Zielmolekül tragen. Die Kapseln können auch in lyophilisierter Form enthalten sein, deren Wieder­ herstellung durch den Anwender mit Wasser problemlos mög­ lich ist. Gegebenenfalls kann das Kit auch einen wie vor­ stehend beschriebenen Eintauchstreifen enthalten.

In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das erfindungsge­ mäße Kit

  • a) Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substan­ zen einkapseln und Affinitätsmoleküle binden sollen;
  • b) Agenzien zur Modifizierung von Affinitätsmolekülen, so daß sie zur Bindung an die Oberfläche der Kapseln ge­ eignet sind;
  • c) Agenzien zur Durchführung der Bindungsreaktion zwischen den Kapseln und Affinitätsmolekülen.

In einer besonders bevorzugten Variante dieser Ausführungs­ form können die Kapseln a) einen Farbstoff enthalten und sind chemisch präaktiviert, indem sie z. B. N-Succinimid-ak­ tivierte Ester an ihrer Oberfläche zur covalenten Bindung an ein Affinitätsmolekül wie z. B. ein Immunglobulin tragen. Als Agenzien b) kann das Kit z. B. Biotinylierungsreagenzien (3-Sulfo-N-hydroxysuccinimidylbiotin) zur Biotinylierung eines Affinitätsmoleküls enthalten, so daß dieses zur Bin­ dung an Avidin-vorbeschichtete Kapseln geeignet ist. Als Agenzien c) kann das Kit zum Beispiel homo- oder bifunktio­ nelle Vernetzer enthalten. Das Kit kann auch einen wie vor­ stehend beschrieben Eintauchstreifen enthalten.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figu­ ren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch die Einkapselung der signalerzeu­ genden festen Teilchen in Polyelektrolyt-Schichten. In Schritt 1 werden die ungeladenen Teilchen durch das Selbst­ zusammenfügen geladener Tensidmoleküle beschichtet, so daß sie wasserdispergierbar werden und somit zugänglich für die nachfolgende Beschichtung mit Polyelektrolyt-Schichten sind (Schritt 2). Jede abgeschiedene Polyelektrolyt-Schicht hat eine zu der bereits adsorbierten entgegengesetzte Ladung. In Schritt 3 wird ein Affinitätsmolekül, das ein Zielmolekül spezifisch erkennt, an die äußere Oberfläche der Polye­ lektrolyt-Kapsel konjugiert bzw. gebunden.

Fig. 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Verwen­ dung der erfindungsgemäß hergestellten Kapseln bei einem Bioassay zum Nachweis eines Zielmoleküls (Analyt). In einem ersten Schritt wird der Analyt über einen Fänger-Antikörper auf einer festen Phase immobilisiert. Im zweiten Schritt wird der Analyt mit den erfindungsgemäß hergestellten Kap­ seln inkubiert. Der resultierende Komplex wird mit physika­ lischen oder chemischen Mitteln behandelt (Schritt 3), so daß die signalerzeugenden Teilchen in die Lösung freige­ setzt und gelöst und im letzten Schritt nachgewiesen wer­ den.

Fig. 3 zeigt die elektrophoretische Mobilitätsmessung von FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kapseln mit ζ-Potentialen als Funktion der Polyelektrolyt-Schichtzahl der FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kap­ seln. Die FDA-Teilchen wurden vor der ersten PSS-Abschei­ dung mit einer DPPC-Schicht vorbeschichtet. Die geraden Schichtzahlen entsprechen der PSS-Adsorption und die unge­ raden Schichtzahlen (außer der ersten) der PAH-Adsorption.

Fig. 4 zeigt das SEM-Bild der FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kapseln. Die Größe der gemahlenen und in DPPC-Lösung suspendierten FDA-Teilchen lag im Bereich von 1~3 µm. Nach Zusammenfügen mit 4 Doppelschichten PSS/PAH zeigen die Teilchen wenig Ag­ gregation.

Fig. 5 zeigt den Fluoreszenz-Immungssay für den Nachweis von Ziege-Antimaus-IgG unter Verwendung von Maus-IgG-konju­ gierten FDA/DPPC/(PSS/PAH)4-Kapseln als Markierung. Vor der Zugabe von DMSO/NaOH waren die Fluoreszenz-Signale vernach­ lässigbar. Nach der Zugabe von DMSO/NaOH waren die Fluores­ zenzsignale auf mehr als das 200fache verstärkt.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung von Polyelektrolyt-Kapseln, die feste FDA-Teil­ chen als signalerzeugende Substanz einkapseln

Fluoresceindiacetat-Teilchen (FDA; von Sigma) wurden wie folgt eingekapselt: 50 mg fein gemahlenes FDA wurden gründ­ lich mit 12 ml einer 0.4% Lösung von DL-α-Dipalmitoylphos­ phatidylcholin (DPPC, von Sigma) oder Natriumdodecylsulfat (SDS) gemischt. Die Suspension wurde 15 min lang stehenge­ lassen, um die großen Teilchen abzusetzen. Der trübe weiße Überstand wurde extrahiert, durch Zentrifugieren auf 2 ml eingeengt und einmal mit Wasser gewaschen. Die resultieren­ den FDA-Teilchen durchliefen dann den Prozeß des schicht­ weisen Zusammenfügens wechselweise mit den Polyelektrolyten PSS und PAH. Das Polykation, Poly(allylamin-hydrochlorid) (PAH), M.G. 15000, wie auch das Polyanion, Poly(natrium-4- styrolsulfonat) (PSS), M.G. 70000, wurden von Aldrich käuflich erworben. Das PSS wurde vor Gebrauch gegen Milli- Q-Wasser (M.G.-Schnitt 14000) dialysiert und lyophili­ siert. Das bei allen Experimenten verwendete Wasser wurde in einem Reinigungssystem Millipore Milli-Q Plus 185 vorbe­ reitet und hatte einen spezifischen Widerstand von mehr als 18,2 MΩ.cm. Alle verwendeten Reagenzien (außer PSS) wurden wie vom Hersteller erhalten eingesetzt.

Typischerweise wurde 1 ml PSS-Lösung (enthaltend 5 mg/ml PSS und 0,5 M NaCl) zu 0,5 ml einer DPPC-vorbehandelten FDA-Teilchensuspension gegeben. Die Suspension wurde in re­ gelmäßigen Abständen geschüttelt. Nach 15 min Belassen zur maximalen Adsorption wurde die Suspension 3 min lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Dann wurde der Überstand abge­ trennt und der Niederschlag mit Wasser gewaschen, um über­ schüssigen, nicht adsorbierten Polyelektrolyt zu entfernen. Dann wurde 1 ml PAH-Lösung (enthaltend 5 mg/ml PAH und 0,5 M NaCl) zugesetzt, um eine nachfolgende Schicht auf der Kapseloberfläche zu bilden. Die Zentrifugations-/Wasch­ schritte und die daraus folgende Adsorption entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte wurden wiederholt. Die erhaltenen Kapseln wurden dann als FDA/DPPC/(PSS/PAH)n bezeichnet, ins­ besondere mit n = 4.

Die elektrophoretische Mobilität beschichteter FDA-Kri­ stalle wurde mit einem Malvern Zetasizer 4 gemessen, wobei der Durchschnitt aus 5 Messungen im stationären Zustand ge­ nommen wurde. Die ζ-Potentiale wurden erhalten aus der Be­ ziehung ζ = uη/ε, worin η und ε die Viskosität bzw. die Di­ elektrizitätskonstante der Testlösung sind (vgl. Fig. 3).

Die Rasterelektronenmikroskopie(SEM)-Messungen wurden mit einem Instrument durchgeführt, das mit einer Beschleuni­ gungsspannung von 5 kV betrieben wurde. Die SEM-Proben (auf Deckglas-Objektträgern) wurden mit etwa 20 nm Au zerstäu­ bungsbeschichtet (vgl. Fig. 4).

Beispiel 2 Antikörper-Konjugation an die äußere Oberfläche der in Bei­ spiel 1 erhaltenen Kapseln

Die covalente Konjugation von Maus-IgG an die Kapseln von Beispiel 1 wurde wie folgt durchgeführt: 1 mg Maus-Immun­ globulin G (mIgG, von Sigma-Aldrich) wurde durch Reaktion mit 2-Iminothiolan (von Pierce) in 0,1 M PBS-Puffer (ent­ haltend 10 mM EDTA) aktiviert. Der Komplex wurde durch Gel­ filtration an einer Sephadex G 25-Säule gereinigt. Die FDA/DPPC/(PSS/PAH)n-Kapseln wurden durch Reaktion mit Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) von Pierce in 0,05 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5, aktiviert und durch Zentrifugation und wiederholtes Waschen aus dem überschüssigen SMCC ausgewaschen. Der 2-Iminothio­ lan-modifizierte Antikörper und die Maleinimid-aktivierten FDA-Kapseln wurden dann gemischt und 1 h lang bei 37°C inkubiert. Überschüssiger, nicht konjugierter Antikörper wurde durch Zentrifugation und Waschen mit PBS-Puffer in mehreren Durchgängen ausgewaschen.

Beispiel 3 Fluoreszenz-Immungssay zum Nachweis von Ziege-Antimaus-IgG mit den Antikörper-konjugierten Kapseln von Beispiel 2

Eine Polystyrol-Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Nung) wurde mit Ziege-Antimaus-IgG (gaMIgG, von Sigma-Aldrich)) in Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Konzentration an gaMIgG variierte von 12 ng/ml bis 5 µg/ml. Nach dem Waschen wurde die Platte mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) (Fraktion V, erhalten von Sigma-Aldrich) bei 37°C 1 h lang blockiert. Die Platte wurde dreimal gewaschen, und es wurde eine 1 : 300-Verdünnung der Suspension aus Antikörper-konjugierten Kapseln zugesetzt. Nach 1stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Platte dreimal gewaschen und mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroplattenle­ sers (Bio-Rad) untersucht. Es wurden keine signifikanten Fluoreszenzsignale gemessen.

Dann wurden einer jeden Vertiefung 50 µl DMSO und 50 µl 0,5 M NaOH zugesetzt, und die Platte wurde wieder mit Hilfe des Fluoreszenz-Mikroplattenlesers untersucht. Die Fluores­ zenzsignale wurden auf mehr als das 200fache verstärkt (vgl. Fig. 5).

Beispiel 4 Alternative Konjugationsstrategien zur Bindung biointerak­ tiver Moleküle, z. B. Immunglobulin G an die Kapseloberflä­ che 4.1 Direkte Adsorption von IgG

1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.) wurde mit 100 µl monoklonalen Anti-FABP-Antikörpern (2 mg/ml) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur und 12 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Der Überschuß an Antikörpern wurde durch wieder­ holte Zentrifugations- und Waschdurchgänge entfernt, und die Markierung wurde schließlich in PBS wieder suspendiert.

4.2 Beschichten von IgG über Neutravidin - ein Verfahren, das bei Verwendung der Kapseln in einem Kit anwendbar ist a) Biotinylierung des Antikörpers

0,2 mg Biotin-X-NHS (Pierce, USA) in 100 µl Beschich­ tungspuffer wurden einer Lösung von 1 mg monoklonalem Anti-hCG-beta-Antikörper (Clone ME 106, Dunn Labortech­ nik, Asbach) in 1 ml Beschichtungspuffer zugesetzt. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inku­ biert. Unumgesetztes Biotin wurde durch wiederholte Zentrifugationsschritte in einer Centricon-Trenneinheit (30 kd, Centricon, USA) vom Antikörper abgetrennt. Der Puffer wurde zu 1 ml PBS geändert, 1% BSA wurde zur La­ gerung zugesetzt.

b) Beschichten der Fluorophor-Teilchen mit Neutravidin

1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol., mit einer äußeren Schicht aus Polyacrylsäure, PAA) wurde in PBS-Puffer, enthaltend 10 mM N-Hydroxysuccin­ imid (NHS) und 20 mM 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]- carbodiimid-hydrochlorid (EDC), resuspendiert, und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inku­ biert. Unumgesetztes EDC/NHS wurde durch einen Zentri­ fugations- und Waschdurchgang entfernt. Es wurde 1 ml einer Lösung von 2 mg Neutravidin (Pierce, USA) in Carbonat-Puffer (pH 8,5) verwendet, um die Teilchen wieder zu suspendieren. Die Suspension wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht aufbeschich­ tetes Neutravidin wurde durch einen Zentrifugations- und Waschdurchgang entfernt, und die Teilchen wurden schließlich in 1 ml PBS mit 1% BSA resuspendiert.

c) Beschichten von Fluorophor-Teilchen mit biotinyliertem Antikörper

1 ml der Fluorophorteilchen-Suspension (5% Gew./Vol.) wurde mit 100 µl des biotinylierten Antikörpers Anti- hCG-b-Antikörper (1 mg/ml) 2 Stunden lang bei Raumtem­ peratur inkubiert. Der Überschuß an Antikörper wurde durch wiederholte Zentrifugations- und Waschdurchgänge entfernt, und die beschichteten Kapseln wurden schließ­ lich in PBS resuspendiert. Nach Zugabe von 1% BSA sind die Kapseln gebrauchs- bzw. lagerfähig.

Beispiel 5 Verwendung der mit Affinitätsmolekülen beschichteten Kap­ seln in Bioassays 1) Festphasen-Immungssay auf Humanchoriongonadotropin (hCG) a) Beschichten

100 µl einer Lösung von 25 µg/ml Anti-hCG- Antikörper (Clone ME 107, Dunn Labortechnik, Asbach) in Carbonat-Puffer (100 mM, pH 9,6) pro Vertiefung wurden in einer Multititerplatte mit 96 Vertiefungen (Costar Maxi Sorb Polystyrol-Platte) 3 Stunden lang inkubiert. Die Platte wurde mit Wasser gewaschen und mit 300 µl einer 1% BSA-Lösung in PBS pro Vertiefung 1 Stunde lang blockiert.

b) Probeninkubation

200 µl der hCG-Proben (Sigma) mit Verdünnungen von 0,1 µE bis 100 µE pro ml wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde zweimal mit Wasser gewaschen.

c) Markierungsinkubation

Die Fluorophorteilchen-Suspen­ sion (5% Gew./Vol.) mit dem über Neutravidin konjugier­ ten, biotinylierten Anti-hCG-b-Antikörper wurde mit ei­ nem 1% BSA enthaltenden PBS-Puffer auf 1 : 1000 verdünnt. 200 µl Verdünnung pro Vertiefung wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde zweimal mit Wasser gewaschen, 300 µl Ethanol (96%) wurden zuge­ setzt, und es wurde unter Schütteln 2 Minuten lang in­ kubiert.

d) Fluoreszenzmessung

Der Gehalt an freigesetztem Fluoro­ phor aus den Markierungskapseln wurde mit einem Fluo­ reszenz-ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Die Werte der Proben (B) wurden mit den ohne Probe gemessen Werten (B0) in Beziehung gesetzt.

2) Reagensglastest auf fettsäurebindendes Protein (FABP) a) Beschichten

400 µl einer Lösung von 1 mg/ml Anti-FABP- Antikörper in Carbonat-Puffer (100 mM, pH 9,6) wurden in einem Costar Maxi Sorb 5 ml-Polystyrol-Röhrchen 3 Stunden lang inkubiert (nur der erste Zentimeter des unteren Teils stand in Kontakt mit der Lösung). Das Reagensglas wurde mit Wasser gewaschen und mit 2 ml ei­ ner 1% BSA-Lösung in PBS 1 Stunde lang blockiert (die gesamte Innenwandung des Röhrchens wurde blockiert).

b) Probeninkubation

200 µl der FABP-Proben mit Verdünnun­ gen von 0,1 µg bis 50 µg pro ml wurden 2 Stunden lang im Reagensglas bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhr­ chen wurden zweimal mit Wasser gewaschen.

c) Markierungsinkubation

Die Fluorophorteilchen-Suspen­ sion (5% Gew./Vol.) mit dem direkt adsorbierten mono­ klonalen Anti-FABP-Antikörper wurde mit einem 1% BSA enthaltenden PBS-Puffer auf 1 : 1000 verdünnt. 300 µl Verdünnung wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Reagensglas inkubiert. Das Reagensglas wurde zweimal mit Wasser gewaschen, 500 µl Ethanol (96%) wurden zuge­ setzt, und es wurde unter Schütteln 2 Minuten lang in­ kubiert.

d) Fluoreszenzmessung

Der Gehalt an freigesetztem Fluoro­ phor aus den Markierungskapseln wurde mit einem Spek­ trofluorimeter gemessen. Die Werte der Proben (B) wur­ den mit den ohne Probe gemessen Werten (B0) in Beziehung gesetzt.

Claims (25)

1. Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substan­ zen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und an ihrer äußeren Oberfläche Affinitäts­ moleküle tragen, um Zielmoleküle spezifisch zu erkennen und daran zu binden.
2. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe der Peptide oder Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhy­ drate, Liganden mit niedrigem Molekulargewicht und mo­ lekular aufgedruckten Polymeren (MIPs) oder Mischungen derselben.
3. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide oder Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe der Antikörper, Rezeptoren, Antigene, Lektine, Avidine, Oligopeptide, Lipoproteine, Glycoproteine, Peptidhormone und Allergene oder Teilen derselben.
4. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe der einzel- oder doppelsträngigen DNAs, RNAs, Oligonucleo­ tide, Ribozyme, Aptamere und Teilen derselben.
5. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenhydrate ausgewählt sind aus der Gruppe der Mono-, Oligo- und Polysaccharide, Glycolipide, Proteo­ polysaccharide und Teilen derselben.
6. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mit niedrigem Molekulargewicht Biotin oder ein Biotin-Derivat, ein Steroid oder Hormon, ein Cofak­ tor oder Coenzym, ein Aktivator, Inhibitor, Pseudosub­ strat oder eine prosthetische Gruppe eines Enzyms, ein Arzneimittel, ein Pestizid, ein Allergen oder Digoxin oder ein Hapten ist.
7. Kapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle an die äußere Oberfläche der Kapseln konjugiert oder direkt oder über Linker-Mole­ küle daran gebunden sind.
8. Kapseln nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Linker-Molekül ein Biomolekül ist, vorzugsweise Avidin, Streptavidin, Neutravidin, Protein A, Protein G, Lektin oder ein niedermolekularer Vernetzer.
9. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen signalerzeugender Substanzen Kristalle, amorphe oder lyophilisierte Teil­ chen, sprühgetrocknete Teilchen, gemahlene Teilchen oder Mischungen derselben sind.
10. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen eine Teilchengröße von 10 nm bis 10 µm, vorzugsweise etwa 100 nm aufwei­ sen.
11. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen signalerzeugender Substanzen niedermolekulare Substanzen sind, ausgewählt aus der Gruppe der Fluorophore, Luminophore, Chromo­ phore, Enzymsubstrate, prosthetischen Gruppen, oder re­ doxaktive Substanzen, ausgewählt aus Redoxvermittlern, elektrodenaktiven Substanzen, Metallsalzen.
12. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingekapselten festen Teilchen signalerzeugender Substanzen hochmolekulare Substanzen sind, ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme und ihrer Vorläufer, bio­ luminogenen und fluorogenen Proteine, Nucleinsäuren, Ribozyme und Aptamere.
13. Kapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapselwandungen aus einer oder mehreren Polyelek­ trolyt-Schichten bestehen.
14. Kapseln nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyelektrolyte in einer Schicht und/oder zwischen den Schichten vernetzt sind.
15. Kapseln nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyelektrolyte aus organischen Polymeren, Biopoly­ meren und Mischungen derselben ausgewählt sind.
16. Kapseln nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Polymer ein aus Polyamin (PAH), Polysul­ fonsäure (PSS), Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyamiden, Poly-2-hydroxybutyrat (PHB), Polyca­ prolacton (PCL), fluoreszenzmarkierten Polymeren und ihren Copolymeren und/oder Mischungen derselben ausge­ wähltes Polymer ist.
17. Kapseln nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Biopolymer ausgewählt ist aus Polyaminosäuren, ins­ besondere Peptiden, Polylysin, aus Polykohlenhydraten, insbesondere Dextrin, Pektin, Alginat, Glycogen, Amylo­ se, Chitin, Chondroitin, Hyaluronsäure, aus Polynucleo­ tiden, insbesondere DNA, RNA, Oligonucleotide, sowie aus modifizierten Biopolymeren, insbesondere Carboxy­ methylcellulose, Carboxymethyldextran oder Ligninsul­ fonate.
18. Verfahren zum optischen, elektrochemischen oder chemi­ schen Nachweis eines oder mehrerer Zielmoleküle in ei­ ner Probe unter Nutzung der auf Affinität beruhenden Wechselwirkungen zwischen dem Zielmolekül und einem Af­ finitätsmolekül für die spezifische Erkennung des Ziel­ moleküls, umfassend die Schritte:
  • a) Inkubieren der Zielmoleküle mit Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und an ihrer, äußeren Oberfläche die entsprechenden Affinitätsmoleküle tragen,
  • b) Abtrennen des resultierenden Komplexes aus Ziel- und Affinitätsmolekül von den Kapseln mit unumgesetzten Affinitätsmolekülen auf deren Oberfläche,
  • c) Freisetzen und Lösen der eingekapselten festen Teilchen der signalerzeugenden Substanzen durch Behandeln des erhaltenen Ziel/Affinitäts-Kom­ plexes mit physikalischen Mitteln ausgewählt aus Ultraschall-Zermahlung oder elektrischem Impuls oder chemischen Mitteln ausgewählt aus Behandeln mit einem organischen Lösungsmittel oder mit einem Enzym, Ribozym oder Aptamer oder durch Ändern des pH-Werts
  • d) Nachweisen oder Quantifizieren des Signals, das durch die freigesetzten und gelösten signaler­ zeugenden Substanzen erzeugt wird und das in direkter oder indirekter Beziehung zur Menge der Zielmoleküle steht.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe der Alkohole, insbesondere Ethanol und Methanol, Ketone, insbesondere Aceton, Ester, insbesondere Ethyl­ ester, Aromaten, insbesondere Toluol, Sulfoxide, ins­ besondere DMSO, sowie Ether, besonders Dimethylether, oder aus Mischungen organischer Lösungsmittel mit Was­ ser.
20. Kit für den optischen, elektrochemischen oder chemi­ schen Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe, umfas­ send Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Sub­ stanzen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und an ihrer äußeren Oberfläche Affinitäts­ moleküle zum spezifischen Erkennen und Binden an ein Zielmolekül tragen.
21. Kit nach Anspruch 20, umfassend einen Eintauchstreifen.
22. Kit für den optischen, elektrochemischen oder chemi­ schen Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe, umfas­ send
  • a) Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Sub­ stanzen einkapseln, die freigesetzt und gelöst werden können, und Affinitätsmoleküle binden sollen;
  • b) Agenzien zur Modifizierung von Affinitätsmolekülen, so daß sie zur Bindung an die Oberfläche der Kap­ seln geeignet sind;
  • c) Agenzien zur Durchführung der Bindungsreaktion zwi­ schen den Kapseln und Affinitätsmolekülen.
23. Kit nach Anspruch 22, umfassend einen Eintauchstreifen.
24. Verwendung der Kapseln nach den Ansprüchen 1 bis 17 in Bioassays für den optischen, elektrochemischen oder chemischen Nachweis von Zielmolekülen.
25. Verwendung nach Anspruch 24 zusammen mit einem Ein­ tauchstreifen.
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