DE10024788A1 - Substance for increasing an immune response during vaccinations or for increasing the production of antibodies, comprises solid lipid particles of a specific size and charge - Google Patents

Substance for increasing an immune response during vaccinations or for increasing the production of antibodies, comprises solid lipid particles of a specific size and charge

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DE10024788A1
DE10024788A1 DE2000124788 DE10024788A DE10024788A1 DE 10024788 A1 DE10024788 A1 DE 10024788A1 DE 2000124788 DE2000124788 DE 2000124788 DE 10024788 A DE10024788 A DE 10024788A DE 10024788 A1 DE10024788 A1 DE 10024788A1
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    • A61K2039/55511Organic adjuvants

Abstract

A substance (I) that increases the immune response to an immunization of human or animals, or that increases the amount of antibodies produced and which comprises solid lipid particles at room temperature, is new. A new substance (I) that increases the immune response to an immunization of human or animals, or that increases the amount of antibodies produced comprises solid lipid particles at room temperature. The particles comprise an optimal dose, size, charge and surface activity (stabilizing tenside layer) according to the need of the individual subject. (I) is simply mixed with the antigen solution.

Description

1. Hintergrund der Erfindung 1. Background of the Invention

Antigene werden Tieren und Menschen appliziert, um Antikörper zu er zeugen. Antigens are administered animals and humans to witness antibodies to it. Ziele sind dabei zum Beispiel die Immunisierung von Menschen oder Tieren zum Schutz vor Erkrankungen oder die Erzeugung von Anti körpern, die nachher isoliert und zu Produkten verarbeitet werden. Objectives are, for example, immunization of humans or animals to protect against disease or the generation of anti bodies that are subsequently isolated and processed into products. Der häufigste Applikationsweg für Antigene ist die parenterale Verabreichung; The most common route of administration for antigens is parenteral administration; alternative Wege sind z. alternative routes are for. B. die orale, nasale und topische Applikation. As oral, nasal, and topical application.

Ein häufiges Problem ist, daß oft die Stärke der Immunantwort auf das verabreichte Antigen für den beabsichtigten Zweck nicht ausreicht. A common problem is that often the strength of the immune response to the antigen administered for the intended purpose is not sufficient. Manchmal kann das Problem dadurch gelöst werden, daß die verabreichte Dosis des Antigens stark erhöht wird. Sometimes the problem can be solved in that the administered dose of the antigen is greatly increased. Ein ernsthaftes Problem ist jedoch, daß Antigene oft sehr teuer sind und die Dosiserhöhung zu einer entspre chenden Verteuerung des Impfstoffes führt. A serious problem, however, is that antigens are often very expensive and performs the dose increase to a entspre sponding increase in the cost of the vaccine. Diese Kosten führen zu einer starken Belastung des Gesundheitssystems, für viele Bevölkerungs schichten - insbesondere in der Dritten Welt - wird der Impfstoff zu teuer und wünschenswerte Massenimpfungen können nicht durchgeführt wer den. These costs result in a heavy burden on the health system, layers for many population - especially in the Third World - the vaccine is too expensive and desirable mass vaccination can not be performed to who.

Ein alternativer Lösungsansatz ist die Verabreichung von Antigenen zu sammen mit einem Adjuvans, das die Antigenwirkung verstärkt und so zu einem höheren Antikörpertiter führt. An alternative approach is the administration of antigens to together with an adjuvant which enhances the antigenicity and thus leads to a higher antibody titer. Das Adjuvans-Prinzip wurde erstma lig 1948 von Jules Freund beschrieben [Freund, JJ Immunology 1948, 60, 383-398] und durch zwei Emulsionen auf der Basis von Mineralöl rea lisiert. The adjuvant-principle was erstma lig 1948 described by Jules friend [friend, JJ Immunology 1948, 60, 383-398] and lisiert by two emulsions based on mineral oil rea. Freunds unvollständiges Adjuvans (Freund's Incomplete Adjuvant - FIA) ist eine Mischung von Mineralöl mit Mannide Monooleat (Montanide, Arlacel). Freund's incomplete adjuvant (Freund's Incomplete Adjuvant - FIA) is a mixture of mineral oil with mannides monooleate (Montanide, Arlacel). Zur Anwendung mischt man es mit der Antigenlösung und inji ziert die gebildete Emulsion. For the application it is mixed with the antigen solution and inji graces the emulsion formed. Die dadurch hervorgerufene Verstärkung der Immunantwort ist so groß, daß FIA immer noch als "Goldstandard" her angezogen wird, wenn neue Adjuvantien entwickelt und getestet werden. Caused thereby enhancing the immune response is so great that FIA is still dressed as the "gold standard" her when new adjuvants are developed and tested. Man bewertet ihre Effizienz und Qualität durch Vergleich mit FIA, wobei jedoch viele neu entwickelte Adjuvantien deutlich unterhalb der Effizienz von FIA bleiben (z. B. bei 0,2, FIA = 1,0). One rated efficiency and quality by comparison with FIA, but many newly developed adjuvants well below the efficiency of FIA (z. B. 0.2, FIA = 1.0) remain.

Der Zusatz von abgetöteten Mycobakterien zu FIA (z. BM tuberculosis) erhöhte weiterhin die Immunantwort. The addition of killed mycobacteria to FIA (eg. BM tuberculosis) further increased the immune response. Diese Mischung wird als Freunds komplettes Adjuvans bezeichnet (Freund's Complete Adjuvant - FCA). This mixture is as Freund's complete adjuvant called (Freund's Complete Adjuvant - FCA). Die Ölemulsion nach Freund erzeugt jedoch entzündliche und ulzerierende Geschwülste (Granulome) an der Injektionsstelle, teilweise brechen sie auf und gehen in sich ausbreitende Abszesse über. However, the oil emulsion according Friend generates inflammatory and ulcerating tumors (granulomas) at the injection site, sometimes they break up and go into spreading abscesses. Nach heutigem Standard steht daher die Anwendung der Ölemulsion nach Freund am Menschen außerhalb jeglicher Frage. Therefore, by today's standards, the application of the oil emulsion is to friend human beyond any question. Teilweise erfolgt die Anwendung bei Tieren. In part, the application takes place in animals. Oft ist das Allgemeinbefinden der Tiere so stark beeinträchtigt, daß es zu un wirtschaftlichen Ausfällen kommt. Often the general condition of the animals is so severely impaired that there is un economic failures. Die von Freund zur Komplettierung des Adjuvans vorgeschlagenen Mycobakterien M. tuberculosis oder M. buty ricum sind ebenfalls schlecht verträglich. The measures proposed by friend to complete the adjuvant mycobacteria M. tuberculosis or M. butyl ricum are also poorly tolerated. Auch sie rufen Granulome und Fieber sowie Abszesse an der Einstichstelle hervor [Brown, EA Rev Aller gy 1969 23(5): 389-400]. They also call granulomas and fever and abscesses at the injection site out [Brown, EA Rev Aller gy 1969 23 (5): 389-400].

Es besteht daher die Aufgabe, ein verträglicheres Adjuvans zu finden, ins besondere unter den Gesichtspunkten kostengünstige Impfstoffe herzu stellen, wünschenswerten weltweiten Impfungen gegen bestimmte Er krankungen, die nur mit einem kostengünstigen Impfstoff finanziell reali sierbar sind und der zunehmenden Bedeutung immunologischer Produk tionstechniken und Produkte. There is therefore the task of finding a more compatible adjuvant, provide near, in particular from the point of affordable vaccines desirable global vaccines against certain he diseases that are financially reali sierbar only with an inexpensive vaccine and tion techniques to the increasing importance of immunological production and products. Auch unter zunehmendem Bewußtsein für die Schutzbedürftigkeit von Tieren und entsprechendem Druck der Ge setzgebung muß ein verträglicheres, (dh biokompatibles) gleich effizien tes, aber gleichzeitig kostengünstiges Adjuvans gefunden werden. Also under increasing awareness of equal efficien tes, but at the same cost-effective adjuvant must setzgebung for the need for protection of animals and the corresponding pressure of Ge a more compatible (ie biocompatible) are found. Zusätz lich muß es physikalisch stabil sein, damit eine Zumischung vor der In jektion entfallen kann und Schwankungen in der Effizienz - z. Zusätz After all, it must be physically stable so that an admixture before can be omitted in jection and variations in efficiency - eg. B. durch unterschiedliche Dispergierung - eliminiert werden. For example, by varying dispersion - are eliminated.

Das heutzutage am häufigsten eingesetzte Adjuvans mit Zulassung zur Anwendung am Menschen ist eine feine Suspension von Aluminium hydroxid, dessen Wurzeln noch archaischer sind als die der Emulsion von Freund [Glenny, AT et al. The adjuvant used nowadays most frequently with approval for use in humans hydroxide is a fine suspension of aluminum, whose roots are still more archaic than that of the emulsion of friend [Glenny, AT et al. J. Pathol. J. Pathol. 1926, 29 31-40]. 1926 29 31-40]. Es basiert auf der Annahme, daß Antigene vom Immunsystem besser erkannt werden, wenn sie auf der Oberfläche der Aluminiumhydroxid-Partikel adsorbiert sind. It is based on the assumption that antigens are better recognized by the immune system when they are adsorbed on the surface of the aluminum particles. Nachteilig ist jedoch, daß Aluminiumhydroxid weniger effizient ist als Freunds Adjuvans und es ebenfalls Granulome bewirken kann. However, a disadvantage is that aluminum is less efficient than Freund's adjuvant and it can also cause granulomas.

Ausgehend von Freunds Emulsion wurden neuerdings Emulsionen be schrieben, welche aus verträglicheren Materialien bestehen wie z. Starting from Freund emulsion emulsions be were written more recently, which consist of more compliant materials such. B. Squalan und Sqalen, [Sanchez-Pestador, L. et al. B. squalane and Sqalen, [Sanchez-Pestador, L. et al. J. Immunol. J. Immunol. 1988 141, 1720-1727, Masihi KN, Lunge, W., Bremer W., Ribi, E. Int. 1988 141, 1720-1727, Masihi CN, lung, W., W. Bremer, Ribi, E. Int. J. Immuno pharmacol. J. Pharmacol Immuno. 1986 8(3), 339-45, Hunter RL, Bennett, B. Scand J Immunol. 1986 8 (3), 339-45, Hunter RL, Bennett, B. Scand J Immunol. 1986 23(3), 287-300, Allison AC, et al. 1986 23 (3), 287-300, Allison AC, et al. Semin Immunol. Semin Immunol. 1990 2(5), 369-74]. 1990 2 (5), 369-74]. Eines dieser Systeme ist MF59 (European Patent Application 0399843A2). One of these systems is MF59 (European Patent Application 0399843A2).

Basierend auf den Suspensionen nach Glenny wurden Partikel aus unter schiedlichen Polymeren bis hin zu diversen anorganischen und organi schen Partikeln (z. B. Kohlenstoff) eingesetzt [O'Hagan, DT, Jeffrey, H., Roberts MJ, McGee, JP, Davies, SS Vaccine. Based on the suspensions according to Glenny particles (carbon z. B.) were used from [O'Hagan, DT, Jeffrey, H., Roberts MJ, McGee, JP, Davies difference union polymers up to various inorganic and organic particles rule, SS Vaccine. 1991 9(10), 68-71, Glenny, AT et al. 1991 9 (10), 68-71, Glenny, AT et al. J. Pathol. J. Pathol. 1926, 29 31-40]. 1926 29 31-40]. Nachteile dieser Systeme sind die Zytotoxizität einiger Polymere (z. B. Formaldehydbildung bei Po lyalkylcyanoacrylaten), fehlende oder zu langsame Abbaugeschwindigkeit im Organismus (z. B. Polystyrol oder Polymethacrylatderivate), unzurei chende Biokompatibilität (z. B. Kapselbildung bei PLA-Partikeln, pH- Verschiebung bis zu pH2) sowie mangelnde Zulassungsfähigkeit durch die Registrierungsbehörden (z. B. Rußpartikel). Disadvantages of these systems are the cytotoxicity of some polymers (eg., Formaldehyde formation at Po lyalkylcyanoacrylaten), missing, or too slow a rate of degradation in the organism (eg. As polystyrene or Polymethacrylatderivate) unzurei sponding biocompatibility (eg. B. capsule formation in PLA particles, pH shift to pH 2) and lack of authorization capability (by the registration authorities z. B. soot particles).

Ein alternativer Weg zur Verwendung von partikulären Adjuvantien wie Öltropfen oder Feststoffpartikeln ist der Einsatz von makromolekularen Adjuvantien. An alternative way to use of particulate adjuvants such as oil droplets or solid particles is the use of macromolecular adjuvants. Es wurde gezeigt, daß die von Freund beschriebenen My cobakterien durch Bausteine aus deren Kapselsubstanz ersetzt werden können, welche größere Körperverträglichkeit aufweisen. It has been shown that the My cobakterien described by Freund can be replaced by modules from the capsule substance which have greater biocompatibility. Besonders be schrieben und synthetisiert wurden MDP (N-acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutamin) [Adam, A., Lederer, E. Med. Res. Rev. 1984 4, 111-152] Thr- MDP (threonyl Analog des MDP) [Byars NE, et al. Especially be written down and were synthesized MDP (N-acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutamine) [Adam, A. Lederer, E. Med. Res. Rev. 1984 4, 111-152] Thr-MDP (threonyl analog of MDP) [Byars NE, et al. Vaccine. Vaccine. 1987 5(3), 223-8] und das aus dem Joghurtbazillus stammende GMDP (N- acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) [Grubhofer, N. Immunolo gy Letters 1995 44, 19-24]. 1987 5 (3), 223-8] and derived from the Joghurtbazillus GMDP (N- acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) [Grubhofer, N. Immunology Letters 1995 gy 44, 19-24]. GMDP ist ein Homolog des MDP, für GMDP wurde inzwischen eine gesteigerte immunstimulierende Wirkung nachge wiesen (Patentschrift DE 196 11 235 C1). GMDP is a homolog of the MDP, GMDP for an increased immunostimulating effect has now been nachge reported (Patent Document DE 196 11 235 C1).

Weitere Ansätze bei der Entwicklung eines Adjuvans waren die Verwen dung von molekularen Adjuvantien in hoher Konzentration, so daß die Löslichkeit überschritten wurde und man eine Suspension erhielt (z. B. DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid) [Grubhofer, N. Immunology Letters 1995 44, 19-24] und zur Erhöhung der humoralen Antwort die Mi schung von makromolekularen Adjuvantien wie Glykopeptiden mit Fest stoffpartikeln (z. B. GMDP mit kolloidalen Partikeln) [Grubhofer, N. Im munology Letters 1995 44, 19-24]. Other approaches to the development of an adjuvant were USAGE dung of molecular adjuvants in high concentration, so that the solubility has been exceeded and a suspension obtained (z. B. DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide) [Grubhofer, N. Immunology Letters 1995 44, 19- 24] and to increase the humoral response research the Mi of macromolecular adjuvants such as glycopeptides with solid particles (e.g., B. GMDP colloidal particle) [Grubhofer, N. In munology Letters 1995, 44, 19-24].

Bis jetzt ist jedoch noch keine Lösung gefunden worden, welche eine glei che Wirkungseffizienz wie Freunds Adjuvans aufweist und gleichzeitig den übrigen Anforderungen entspricht: Die neuen Emulsionen werden keines wegs immer reaktionsfrei vertragen, die synthetischen Makromoleküle wie Glykopeptide haben sich bislang den Mycobakterien nicht überlegen ge zeigt, zusätzlich sind sie viel zu teuer. So far, however, no solution has been found which has a moving surface effect efficiency as Freund's adjuvant, and at the same time meets the other requirements: the new emulsions are of no way always tolerated reactive free, synthetic macromolecules such as glycopeptides have so far not superior ge mycobacteria shows in addition, they are much too expensive. Feststoffpartikel haben Zulas sungsprobleme. Solid particles have sungsprobleme Zulas. Viele Adjuvantien zeigen zu hohe Toxizität und somit zu geringe Biokompatibilität. Many adjuvants show excessive toxicity and thus insufficient biocompatibility. Hinzu kommen Probleme mit der physikali schen Stabilität (Vermeidung von Aggregation bzw. Koaleszenz). There are also problems with the physi rule stability (avoiding aggregation and coalescence). So muß die FIA-Emulsion frisch hergestellt und injiziert werden, langfristige Lage rung ist nicht möglich. Thus, the FIA ​​emulsion must be freshly prepared and injected, long-term situation tion is not possible. Ausreichend physikalische Lagerstabilität ist je doch die essentielle Voraussetzung für ein vermarktbares Produkt - insbe sondere für Arzneimittel. Sufficient physical storage stability is ever but the essential prerequisite for a marketable product - in particular sondere for drugs.

Ziele sind somit die Herstellung eines neuen Adjuvans mit: Goals are thus the production of a new adjuvant with:

  • 1. ausreichend physikalischer Stabilität, 1. sufficient physical stability,
  • 2. geringer Zytotoxizität und ausreichender Biokompatibilität, 2. low cytotoxicity and sufficient biocompatibility,
  • 3. vergleichbarer Wirkungseffizienz zu FIA, 3. comparable effect efficiency FIA,
  • 4. kostengünstiger Herstellung. 4. cost-effective production.
1. Beschreibung der Erfindung 1. Description of the invention

Bisher mußte zur Erhöhung der immunstimulierenden Wirkung GMDP in Mischung mit kolloiddispersen festen Lipidpartikeln in einer Partikelgröße < 200 nm eingesetzt werden (USA Patent Gerbu, Bearbeitungsnummer des US Patentamtes ist 08/816,787). So far <200 nm had for increasing the immunostimulatory effect of GMDP in mixture with colloidal solid lipid particles in a particle size are used (United States Patent Gerbu, batch number of the US Patent Office 08 / 816.787). Der Aufbau der Partikel wurde in Unter suchungen für diese Erfindung systematisch modifiziert (z. B. eingesetzte Tenside, Stabilisatoren) um Lipidpartikel zu finden, die die immunstimu lierende Wirkung von GMDP weiter erhöhen könnten. The structure of the particles was in investigations for this invention systematically modified (eg. As used surfactants, stabilizers) to lipid particles to find that may further increase the immunstimu-regulating effect of GMDP. Überraschender Weise wurde hierbei gefunden, daß Lipidpartikel alleine genau so effizient sind wie die Kombination aus Lipidpartikeln und GMDP (Beispiel 9). Surprisingly, it has here found that lipid particles alone are just as effective as the combination of lipid particles and GMDP (Example 9). Somit kann in der Erfindung auf das teure GMDP verzichtet werden und eine vergleichbar hohe humorale Immunstimulierung durch ein kostengünsti ges Lipidpartikel alleine erzielt werden. Thus it can be dispensed with in the invention on the expensive GMDP and a comparably high humoral immune stimulation are achieved by a kostengünsti saturated lipid particles alone.

Die Stärke der immunstimulierenden Wirkung hängt hierbei von den Oberflächeneigenschaften der Partikel (verwendete Tenside, Partikella dung) und von der Partikelgröße ab. The strength of the immune-stimulating action here depends on the surface properties of the particles (surfactants used, Partikella formation) and on the particle size. Bei negativer Ladung des Lipidparti kels beträgt die Wirkungseffizienz ca. 1/3 von FIA, bei Erzeugung eines positiv geladenen Lipidpartikels durch Zusatz von EQ1 ist die Wirkungsef fizienz vergleichbar FIA (kein signifikanter Unterschied, t-Test) (Beispiel 9). When negative charge of the lipid Parti kels the impact efficiency is approximately 1/3 of FIA, upon generation of a positively charged lipid particle by adding EQ1 the Wirkungsef ficiency is comparable FIA ​​(no significant difference, t-test) (Example 9). Über die Zusammensetzung der verwendeten Lipidpartikel kann somit die gewünschte Wirkungsstärke gezielt eingestellt werden. thus the desired effect intensity can be adjusted specifically on the composition of lipid particles used. Dies vermeidet Überreaktionen des Organismus. This avoids overreactions of the organism.

Aus der bisherigen Adjuvans-Forschung an anorganischen und Polymer- Suspensionen ist bekannt, daß es für jedes Antigen eine Partikelgröße mit maximaler Wirkungseffizenz gibt, ebenso ist eine Speziesabhängigkeit be kannt. From the recent research adjuvant of inorganic and polymer suspensions is known that there is a particle size at maximum Wirkungseffizenz for each antigen, as well as a species depending be known. So wird die am besten geeignete Partikelgröße von Aluminium hydroxid-Suspensionen für einen Impfstoff empirisch ermittelt, Polymer partikel als Adjuvans zur Immunisierung hatten einen unterschiedlichen Effekt als Funktion ihrer Größe [Kreuter J, et al. Thus, the most suitable particle size of aluminum hydroxide suspensions is determined empirically for a vaccine that polymer particles as an adjuvant for immunization had a different effect as a function of their size [Kreuter J, et al. Vaccine. Vaccine. 1986, 4, 125-9]. , 1986, 4, 125-9]. Das gleiche wurde trotz des sehr unterschiedlichen Matrixmaterials überraschenderweise für die Lipidpartikel gefunden, so daß die Wirkungs stärke über Veränderung der Partikelgröße antigenspezifisch und spezies spezifisch moduliert werden kann. The same was found, surprisingly, for the lipid particles, despite the very different matrix material, so that the effect on strength change in the particle size of antigen-specific and can be specifically modulated species.

Die Lipidpartikel-Dispersionen des stabilen biokompatiblen Adjuvans (SBA) bestehen aus in Wasser oder wäßrigen Flüssigkeiten oder nichtwäß rigen, z. The lipid particle dispersions of stable biocompatible adjuvant (SBA) are made in water or aqueous liquids or nichtwäß membered, z. B. öligen Flüssigkeiten dispergierten Lipidpartikeln, wobei diese durch Tenside oder Polymere stabilisiert werden können, aber nicht müs sen. B. oily liquids dispersed lipid particles, which can be stabilized by surfactants or polymers, but not Müs sen. Bei ausreichend hoher Viskosität der äußeren Phase oder Feinheit der Partikel wird eine physikalisch stabile Dispersion erhalten. At a sufficiently high viscosity of the external phase, or fineness of the particles have a physically stable dispersion is obtained. Gleiches gilt auch bei niedrig viskosen äußeren Phasen, wenn die Partikel eine aus reichend hohe gleichsinnige Ladung tragen und somit gebildete Sedimente leicht redispergiert werden können. The same applies to the case of low viscous outer phases when the particles carry a high from reaching the same direction and charge thus formed sediments can be easily redispersed.

Die Herstellung der SBA erfolgt durch Dispergierung oder Präzipitation, wobei in Lehrbüchern der Pharmazie und Verfahrenstechnik beschriebene allgemein bekannte Methoden eingesetzt werden. The preparation of the SBA by dispersion or precipitation, using commonly known methods described in textbooks of pharmaceutical technology and methods are used. Bei der Dispergierung zerteilt man grobdisperse Lipide durch mechanische Verfahren. When dispersing one cut coarsely dispersed lipids by mechanical methods. Die Lipide können sich hierbei im festen Aggregatzustand (z. B. Mörsermühle) oder im flüssigen Aggregatzustand befinden (z. B. Emulgierung geschmolzener Lipide durch Rührer). The lipids in the solid state (z. B. mortar mill) or in the liquid state can in this case are (z. B. emulsifying molten lipids by stirrer). Zur Herstellung der SBA-Dispersion können die Li pide zuerst zerkleinert und anschließend in der äußeren (z. B. wäßrigen) Phase dispergiert werden oder alternativ direkt in der äußeren Phase zer kleinert werden. To prepare the dispersion, the SBA-Li can pide first crushed and subsequently in the external phase (z. B. aqueous) is dispersed, or alternatively, directly kleinert zer in the outer phase. Zur Herstellung von SBA-Dispersionen durch Dispergie rung können z. For the preparation of SBA dispersions by Dispersin tion z can. B. ua eingesetzt werden: Kolben-Spalt-Homogenisatoren (z. B. APV-Homogenisatoren, French Press), Jet-Stream-Homogenisatoren (z. B. Microfluidizer), Rotor-Stator-Rührer (z. B. Ultraturax, Silverson-Homo genisatoren), statische Mischer im Mikromaßstab und Makromaßstab (z. B. Mischer der Firma Sulzer), Gasstrahlmühle, Rotor-Stator-Kolloidmühle und Mörsermühle (Beispiel 15). B. be used include:. Piston-gap homogenizers (. For example APV homogenizer, French Press), jet stream homogenizer (. Eg Microfluidizer), rotor-stator stirrer (for example Ultraturax, Silverson homo genisatoren), static mixers microscale and macroscale (z. B. mixers from Sulzer), gas-jet mill, rotor-stator colloid mill, mortar mill (example 15).

SBA-Dispersionen zeigen eine ausreichende physikalische Langzeitstabi lität. SBA dispersions exhibit sufficient long-term physical stability formality. Bestimmung der Partikelgröße mit Photonenkorrelationsspektrosko pie (PCS) und Laserdiffraktometrie (LD) zeigten kein oder vernachlässigba res Partikelwachstum über Zeiträume von 1-3 Jahren (Beispiel 3). Determination of particle size with Photonenkorrelationsspektrosko pie (PCS) and laser diffractometry (LD) showed no particle growth or vernachlässigba res for periods of 1-3 years (Example 3). Die Stabilität von SBA-Dispersionen ist der von Freunds unvollständigem Adjuvant (FIA) weit überlegen (Beispiel 1); The stability of SBA dispersions is that of Freund's incomplete adjuvant (FIA) far superior (Example 1); auch gegenüber neueren Adju vans-Emulsionen zeigt sich eine höhere Stabilität (Beispiel 2). also against newer Adju vans emulsions, a higher stability (Example 2).

Stabilität stability

SBA-Dispersionen stellen ein einfaches System dar. Im Gegen satz zu Glykopeptiden sind die eingesetzten Hilfsstoffe chemisch einfach strukturiert und robust. SBA dispersions represent a simple system. In contrast to glycopeptides set the auxiliaries used are chemically simple structure and robust. Anwendung von Hitze bei Sterilisationsprozessen führt zu keiner chemischen Zersetzung, die Dispersion bleibt physikalisch stabil und Partikelaggregation tritt nicht ein. Application of heat in sterilization processes does not lead to chemical degradation, dispersion remains physically stable and particle aggregation does not occur. Ein Beispiel für die Sterilisa tion von SBA-Dispersionen durch Autoklavieren (121°C, 15 Minuten, 2 bar) zeigt Beispiel 4. FIA zeigt unter gleichen Bedingungen Phasensepara tion. An example of the Sterilisa tion of SBA dispersions by autoclaving (121 ° C, 15 minutes, 2 bar) shows Example 4. FIA shows under the same conditions Phasensepara tion.

Viele Impfstoffe werden bei niedriger Temperatur gelagert (4-6°C). Many vaccines are stored at low temperature (4-6 ° C). Bei optimierten SBA-Dispersionen ist auch Lagerung bei Raumtemperatur und auch noch höheren Temperaturen möglich, ohne daß physikalische Destabilisierung auftritt (Beispiel 11). Under optimized SBA dispersions also stored at room temperature and higher temperatures is possible without physical destabilization occurs (Example 11). Dies vereinfacht die Handhabung der Produkte auf der Basis von SBA, insbesondere für heißere Klimazonen (z. B. Einsatz als Adjuvans bei Massenimpfungen in Ländern der Dritten Welt). This simplifies the handling of the products on the basis of SBA, especially for hotter climates (eg. As used as an adjuvant in mass immunization campaigns in countries of the Third World).

Biokompatibilität biocompatibility

Essentiell für ein breit einsetzbares Adjuvans ist geringe Toxizität und gute Biokompatibilität. Essential for a widely usable adjuvant is low toxicity and good biocompatibility. In einer Schaf-Studie wurden nach Applikation von SBA-Dispersion keine Auffälligkeiten am Applikationsort beobachtet (Beispiel 6). In a sheep study no abnormalities were observed at the application site (Example 6) after application of SBA dispersion. Die gute Verträglichkeit wird erklärt mit der in vi tro in Zellkulturen beobachteten extrem geringen Toxizität von Lipiden. The good compatibility is explained by the tro observed in vi in ​​cell cultures extremely low toxicity of lipids. Im Vergleich zu von den deutschen Zulassungsbehörden und von der FDA zur parenteralen Applikation zugelassenen Polymeren zeigen sie eine um mindestens ca. Faktor 20 höhere Viabilität bei hohen Partikelkonzentra tionen (Beispiel 5). Compared to approved by the German regulatory authorities and by the FDA for parenteral administration polymers, they exhibit higher by at least a factor of about 20 viability at high Partikelkonzentra functions (Example 5). Die gute Biokompatibilität wird darauf zurückgeführt, daß allgemein Körperproteine nur zu einem geringen Ausmaß auf die Par tikeloberfläche adsorbieren - im Gegensatz zu anderen Partikeln (Beispiel 7). The good biocompatibility is attributed to the fact that generally the body tikeloberfläche proteins adsorb only to a small extent on the par - in contrast to other particles (Example 7). Hinzu kommt, daß auf der Oberfläche keine Proteine nachgewiesen wurden, die Unverträglichkeitsreaktionen fördern. In addition, no proteins were detected on the surface that promote intolerance reactions.

Für einen breiten Einsatz eines Adjuvans bietet es sich aus Kostengrün den an, ein Adjuvans-Präparat herzustellen, das vor der Anwendung der Antigenlösung zugemischt wird. For widespread use of an adjuvant, it lends itself to cost Green to produce an adjuvant preparation which is mixed before application of the antigen solution. Idealerweise sollte dabei das Adjuvans in seinen Eigenschaften so hergestellt sein, daß es bei einer Reihe unter schiedlicher Antigene zugemischt werden kann. Ideally, the adjuvant should in this case be produced in its properties so that it can be mixed in a number under schiedlicher antigens. Zur Verringerung des In jektionsschmerzes sollte die Mischung in physiologischer Kochsalzlösung oder anderweitig isotonisierter Lösung appliziert werden. In order to reduce the jektionsschmerzes the mixture in a physiological saline solution, or otherwise isotonisierter solution should be applied. Physiologische Kochsalzlösung führt aufgrund der Reduktion des Zetapotentials zu einer Destabilisierung in bispersionen und nachfolgender Aggregation [Lucks, JS et al., Int. Physiological saline solution leads due to the reduction of the zeta potential to a destabilization in bispersionen and subsequent aggregation [Luck, JS et al., Int. J. Pharm 1990 58, 229-235]. J. Pharm 1990 58, 229-235]. Das SBA-Adjuvans sollte nach Zumischung zum Antigen in isotonischer Lösung ausreichend lange physikalisch stabil sein. The SBA adjuvant should be physically stable in isotonic solution sufficiently long after admixing the antigen. Beispiel 8 zeigt, daß die Lipidpartikel nach Zumi schung zu physiologischer Kochsalzlösung sogar über 6 Stunden stabil sind; Example 8 shows that the lipid particles according to Zumi research of physiological saline are stable even over 6 hours; meßbare Aggregation tritt nicht auf. measurable aggregation does not occur.

Neben der Partikelgröße können auch Oberflächeneigenschaften wie La dung gezielt eingestellt und so das SBA-Adjuvans in Wirkungsstärke spe ziesspezifisch hergestellt werden. In addition to particle size and surface properties such as La dung can selectively set and so the SBA adjuvant produced in potency spe ziesspezifisch. Positive und negative Ladungen können durch Zumischung entsprechend geladener Tenside oder Stabilisatoren erzeugt werden. Positive and negative charges can be generated by admixing according charged surfactants or stabilizers. Über die Konzentration des Zusatzes kann die Stärke der Ladung eingestellt werden. the strength of the charge can be adjusted by the concentration of the additive. Idealer Zusatz sind dabei geladene Substan zen, die wie Cetylpyridiniumchlorid als Konservierungsmittel für die pa renterale Appliktion zugelassen sind (Beispiel 12). Ideally additive are charged zen Substan approved as cetylpyridinium chloride as a preservative for the pa renterale use application (Example 12).

Eine Vielzahl unterschiedlicher Lipide kann zur Herstellung von SBA- Dispersionen eingesetzt werden. A wide variety of lipids may be employed for the production of SBA dispersions. Dies sind sowohl chemisch einheitliche Lipide als auch ihre Mischungen. These are both chemically defined lipids as well as their mixtures. Charakterisiert sind die Lipide dadurch, daß sie im Endprodukt SBA-Dispersion im kristallinen Zustand (z. B. β-, βi-Modifikation) oder im flüssig-kristallinen Zustand (α-Modifikation) vor liegen bzw. in deren Mischung. the lipids are characterized in that they contain (β- z. B., βi-modification) in the final product SBA dispersion in the crystalline state or the liquid crystalline state (α-modification) or in front are in a mixture thereof. Bei eingesetzten Lipidmischungen können auch flüssige Lipide (z. B. Öle, lipophile Kohlenwasserstoffe, lipophile orga nische Flüssigkeiten wie Oleylalkohol) den festen Lipiden (z. B. Glyceride, lipophile Kohlenwasserstoffe wie Hartparaffin) zugemischt werden (sog. "lipid blends"). When employed lipid mixtures and liquid lipids (eg. As oils, lipophilic hydrocarbons, lipophilic orgasmic African liquids such as oleyl alcohol), the solid lipids (z. B. glycerides, lipophilic hydrocarbons such as hard paraffin) ( "lipid blends" called.) Can be added.

Einsatz finden z. are used for. B. folgende Lipide als dispergierte Phase und können als individuelle Komponente oder als Mischung angewendet werden: Natürli che oder synthetische Triglyceride bzw. Mischungen derselben, Monogly ceride und Diglyceride, alleine oder Mischungen derselben oder mit z. Example, the following lipids as the dispersed phase and can be used as an individual component or as a mixture: Natürli che or synthetic triglycerides or mixtures thereof, Monogly glycerides and diglycerides, alone or mixtures thereof or with z. B. Triglyceriden, selbst-emulgierende modifizierte Lipide, natürliche und synthetische Wachse, Fettalkohole, einschliesslich ihrer Ester und Ether sowie in Form von Lipidpeptiden, oder irgendwelche Mischungen dersel ben. B. triglycerides, self-emulsifying modified lipids, natural and synthetic waxes, fatty alcohols, including their esters and ethers and in the form of lipid peptides, or any mixtures dersel ben. Besonders geeignet sind synthetische Monoglyceride, Diglyceride und Triglyceride als individuelle Substanzen oder als Mischung (z. B. Hartfett), Imwitor 900, Triglyceride (z. B. Glyceroltrilaurat, Glycerolmyristat, Gly cerolpalmitat, Glycerolstearat und Glycerolbehenat) und Wachse wie z. Especially suitable are synthetic monoglycerides, diglycerides and triglycerides as individual substances or as a mixture (z. B. hard fat), Imwitor 900, triglycerides (eg. B. Glyceroltrilaurat, Glycerolmyristat, Gly cerolpalmitat, glycerol stearate and glycerol behenate) and waxes such. B. Cetylpalmitat und weisses Wachs (DAB). B. cetyl palmitate and white wax (DAB). Außerdem Kohlenwasserstoffe, wie z. In addition, hydrocarbons such. B. Hartparaffin. As hard paraffin.

Der Anteil der inneren oder Lipidphase bezogen auf die Gesamtformulie rung ist 0,1% bis 80% (m/m) und liegt vorzugsweise im Bereich von 1% bis 40% (m/m). The proportion of the inner or lipid phase in relation to the Gesamtformulie tion is 0.1% to 80% (m / m) and is preferably in the range of 1% to 40% (m / m). Sollte der Zusatz von dispersionsstabilisierenden Additi ven notwendig oder gewünscht sein, z. If the addition of dispersion stabilizing Additi ven be necessary or desired for. B. Emulgatoren, um stabile Disper sion zu produzieren zu können, so können diese in Form von reinen Sub stanzen oder in Form von Mischungen eingearbeitet sein, um die Partikel zu stabilisieren. As emulsifiers, to produce stable Disper sion, they can punch in the form of pure sub or be incorporated in the form of mixtures, in order to stabilize the particles.

Die Menge an solchen Additiven, die im Verhältnis zu der gesamten Ein waage der wäßrigen Dispersion zugesetzt werden können, liegt im Bereich von 0,01% bis 30% und vorzugsweise im Bereich von 0,5% bis 20%. The amount of such additives that may be added in proportion to the total A level of the aqueous dispersion is in the range of 0.01% to 30%, and preferably in the range of 0.5% to 20%. Zur Stabilisierung der SBA-Dispersionen oder zu ihrer gezielten Oberflä chenmodifikation können die Tenside, Stabilisatoren und Polymere einge setzt werden, die allgemein aus der Herstellung von Dispersionen bekannt sind. can chenmodifikation to stabilize the SBA dispersions or their targeted Oberflä the surfactants, stabilizers and polymers is well known from the production of dispersions sets are. Beispiele dafür sind: Examples include:

  • 1. sterisch stabilisierende Substanzen wie Poloxamere und Poloxamine. 1. sterically stabilizing substances such as poloxamers and poloxamines. (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Block-Copolymere), ethoxylierte Sorbi tanfettsäure-Ester, besonders Polysorbate (z. B. Polysorbat 80 bzw. Tween 80®), ethoxylierte Mono- und Diglyceride, ethoxylierte Lipide, ethoxylierte Fettalkohole oder Fettsäuren, und Ester und Ether von Zuckern oder von Zuckeralkoholen mit Fettsäuren oder Fettalkoholen (z. B. Sucrose Mono stearat, Sucrose Distearat, Sucrose Cocoat, Sucrose Stearat, Sucrose Di palmitat, Sucrose Palmitat, Sucrose Laurat, Sucrose Octanoat, Sucrose Oleat). (Polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymers), ethoxylated Sorbi tanfettsäure esters, especially polysorbates (eg., Polysorbate 80 or Tween 80®), ethoxylated mono- and diglycerides, ethoxylated lipids, ethoxylated fatty alcohols or fatty acids, and esters and ethers of sugars or of sugar alcohols with fatty acids or fatty alcohols (eg., sucrose mono stearate, sucrose distearate, sucrose cocoate, sucrose stearate, sucrose palmitate Di, sucrose palmitate, sucrose laurate, sucrose octanoate, sucrose oleate).
  • 2. geladene ionische Stabilisatoren so wie Diacetylphosphate, Phosphati dylglycerin, Lecithine unterschiedlicher Herkunft (z. B. Eilecithin oder So jalecithin), chemisch modifizierte Lecithine (z. B. hydrierte Lecithine), ge nauso wie Phospholipide und Sphingolipide, Mischung von Lecithinen mit Phospholipiden, Sterolen (z. B. Cholesterol und Cholesterol-Derivate, ge nauso wie Stigmasterin) und ebenfalls gesättigte und ungesättigte Fett säuren, Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat, Natri umdeoxycholat oder ihrer Mischungen, Aminosäuren oder Anti- Flokkulantien, wie z. 2. charged ionic stabilizers such as diacetyl, Phosphati dylglycerin, lecithins of different origin (e.g., egg lecithin or B. So jalecithin), chemically modified lecithins (eg. For example, hydrogenated lecithins), so forgiving such as phospholipids and sphingolipids, mixture of lecithins with phospholipids , sterols (for. example, cholesterol and cholesterol derivatives, so forgiving as stigmasterol) and also saturated and unsaturated acids fat, sodium cholate, sodium glycocholate, sodium taurocholate, Natri umdeoxycholat or mixtures thereof, amino acids or anti-flocculants such. B. Natriumcitrat, Natriumpyrophosphat, Natriumsor bat [Lucks, JS et al. Sodium citrate, sodium pyrophosphate, Natriumsor bat [Lucks, JS et al. Int. Int. J. Pharm., 1990, 58, 229-235]. J. Pharm., 1990, 58, 229-235]. Zwitterionische Tenside wie z. Zwitterionic surfactants such. B. (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propanesulfonate) [CHAPSO], (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]- 1-propanesulfonate) [CHAPS] und N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio- 1-propansulfonat. B. (3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate) [CHAPSO], (3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] - 1-propanesulfonate) [CHAPS], and N- dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate. Kationische Tenside, insbesondere als Konservierungs mittel eingesetzte Verbindungen, wie z. Cationic surfactants, in particular medium used as preservatives compounds such. B. Benzyldimethylhexadecylammo niumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Benzalkonium-chlorid, Cetylpy ridiniumchlorid. B. Benzyldimethylhexadecylammo niumchlorid, methylbenzethonium benzalkonium chloride, Cetylpy ridiniumchlorid.
  • 3. Viskositätserhöhende Substanzen wie z. 3. Viscosity substances such. B. Cellulose-Ether und Cellulo se-Ester (z. B. Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcel lulose, Natriumcarboxymethyl-cellulose), Polyvinylderivate sowie Po lyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylacetat, Alginate, Polyacrylate (z. B. Carbopol), Xanthane und Pektine. For example, cellulose ethers and Cellulo se-esters (e.g., methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, cellulose moistened Hydroxypropylcel, sodium carboxymethyl cellulose), polyvinyl derivatives and Po lyvinylalkohol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl acetate, alginates, polyacrylates (eg. Carbopol), xanthans and pectins ,

Die geladenen Stabilisatoren sind, wenn notwendig oder gewünscht, vor zugsweise mit 0,01% bis 20% (m/m) und insbesondere in einer Menge von 0,05% bis zu 10% in der SBA-Dispersion enthalten. The charged stabilizers are, if necessary or desired, before preferably 0.01% to 20% (m / m) and especially in an amount of from 0.05% up to 10% in the SBA dispersion contained. Viskositätserhöhende Substanzen sind, wenn notwendig oder erwünscht, im ähnlichen Verhält nis in der Formulierung eingearbeitet, vorzugsweise in einer Menge von 0,01-20% und insbesondere in einer Menge von 0,1% bis 10% (m/m) und vorzugsweise im Bereich zwischen 0,5% und 5%. Viscosity-increasing substances are, if necessary or desired, nis in similar behaves in the formulation incorporated preferably in an amount of 0.01-20%, and particularly in an amount of 0.1% to 10% (m / m) and preferably in the range between 0.5% and 5%.

Als äußere Phase (Dispersionsmedium, kontinuierliche Phase) können Wasser, wässrige Lösungen oder Flüssigkeiten mischbar mit Wasser, so wie Glycerin oder Polyethylenglykol und ölige Flüssigkeiten wie Miglyole (medium chain triglycerides - MCT) und andere Öle (Rizinus-, Erdnuß-, Soja-, Baumwollsamen-, Raps-, Leinsamen-, Oliven-, Sonnenblumen-, Di stelöl eingesetzt werden. As the outer phase (dispersion medium, continuous phase) water, aqueous solutions or liquids may be mixed with water so as glycerin or polyethylene glycol and oily liquids such as Miglyols (medium chain triglycerides - MCT), and other oils (castor, peanut, soybean, cottonseed, rapeseed, linseed, olive, sunflower, Tue be used stel oil.

Tensidfreie SBA werden hergestellt durch Dispergierung der Lipidphase in einer wäßrigen Lösung, die eine oder mehrere viskositätserhöhende Sub stanzen enthält, entweder allein oder in Kombination mit anderen Sub stanzen, sowie Zucker, Zuckeralkohole, besonders Glukose, Mannose, Trehalose, Mannitol, Sorbitol sowie andere. Surfactant SBA be prepared by dispersing the lipid phase in an aqueous solution containing punching one or more viscosity-Sub, either alone or in combination punch with other Sub, as well as sugars, sugar alcohols, especially glucose, mannose, trehalose, mannitol, sorbitol and others. Desweiteren ist es möglich, eine Kombination der viskositätserhöhenden Stoffe oder die Kombination dieser mit Zuckern oder Zuckeralkoholen, oder in einer weiteren Kombi nation mit Ladungsstabilisatoren oder Anti-Flokkulantien zu gebrauchen. Furthermore, it is possible to use a combination of the viscosity-increasing substances or the combination of these nation with sugars or sugar alcohols, or in a further combination to use with charge stabilizers or anti-flocculants.

SBA-Dispersionen können als Adjuvans zu vielen unterschiedlichen Anti genen zur Impfung gegen unterschiedliche Erkrankungen eingesetzt wer den. SBA dispersions can be used as adjuvant to many different antigens for vaccination against various diseases used to who. Beispiele dafür sind: Examples include:
Glykoproteine wie z. Glycoproteins such. B. Gonococcal Protein I, Brucella abortus Antigen, Tetanus toxoid, Diphteria toxoid, Listeria monocytogenes, B. Gonococcal Protein I, Brucella abortus antigen, tetanus toxoid, diphtheria toxoid, Listeria monocytogenes,
Virusantigene wie ZB Semliki Forest Virus, Enceohalomyocarditis Virus, Porcine rarovirus, Pseudorabiesvirus, Newcastle desease Virus, Bovine vi ral diarrhea, HIV, Influenza, Cytomegalievirus, Herpes Simplex, Hepatitis- C, Masern, Virus cell antigens such as Semliki Forest Virus, Enceohalomyocarditis virus, Porcine rarovirus, pseudorabies virus, Newcastle desease virus, Bovine diarrhea vi ral, HIV, influenza, cytomegalovirus, herpes simplex, hepatitis C, measles,
Parasiten, wie z. Parasites such. B. Malaria, Eimeria Spp. As malaria, Eimeria spp.

Zusammenfassend ist zu sagen, daß mit den SBA-Dispersionen ein Adju vans zur Verfügung steht, das: In summary, to say that a Adju consistent with the SBA dispersions vans available that:

  • 1. eine ausreichende physikalische Stabilität besitzt, um als Produkt und speziell als Arzneimittel hergestellt zu werden, 1. a sufficient physical stability has to be made as a product, especially as a medicament,
  • 2. eine niedrige Toxizität und gute Biokompatibilität besitzt, insbesondere wenn biologisch abbaubare Lipide wie Glyceride eingesetzt werden, 2. low toxicity and good biocompatibility has, in particular when biodegradable lipids such as glycerides are used,
  • 3. eine vergleichbare Wirkung wie Freunds unvollständiges Adjuvans (FIA) besitzt und 3 has a similar effect such as Freund's incomplete adjuvant (FIA) and
  • 4. kostengünstig aus niedrigpreisigen Hilfsstoffen mit kostengünstigen Herstellungsverfahren produziert werden kann. 4. can be inexpensively produced from low-priced auxiliaries with low-cost manufacturing process.

SBA-Dispersionen können breite Anwendung finden, um mit toxikologisch akzeptablen Hilfsstoffen die Antigendosis und damit die Kosten zu redu zieren, da durch Zusatz von SBA bei niedriger Antigendosis die gleiche immunstimulierende Wirkung erzielt wird. SBA dispersions are widely used to decorate to redu with toxicologically acceptable excipients, the dose of antigen and thus the costs, since the addition of SBA low antigen dose, the same immune stimulating effect.

Antigene mit bisher unzureichender Antigenität für einen Impfstoff kön nen durch Zusatz von Immunantwort stimulierendem SBA in einen effizi enten Impfstoff überführt werden. Antigens having been insufficient for a vaccine antigenicity Kgs NEN be transferred to a effi ducks vaccine by the addition of immune response stimulating SBA.

Aufgrund der kostengünstigen Herstellung bei vorhandener vergleichbarer Effizienz zu FIA eignen sich SBA-Dispersionen als Adjuvans für Impfungen im Veterinärbereich, wo aus Rentabilitätsgründen nur sehr niedrigpreisige Impfstoffe eingesetzt werden können. Due to the cost-effective production at existing comparable efficiency to FIA to SBA dispersions suitable as an adjuvant for vaccines in the veterinary field where very low-priced vaccines may be used for reasons of profitability.

Bisher eingesetzte Adjuvantien haben sich fokussiert auf die Steigerung der humoralen Immunantwort. Adjuvants used to date have focused on increasing the humoral immune response. Angesichts der Wirkungseffizienz von SBA- Dispersionen ist es nicht mehr notwendig, ein weiteres Adjuvans den SBA- Lipidpartikeln zuzusetzen bzw. Zusatz von Adjuvantien wie GMDP bringen keine weitere Steigerung der humoralen Immunantwort. Given the effect efficiency of SBA dispersions, it is no longer necessary, another adjuvant add the SBA lipid particles or the addition of adjuvants such GMDP bring any further increase in the humoral immune response. Offensichtlich ist das Immunsystem an seiner maximalen Kapazität der Antwort, zusätzli ches Adjuvans kann keinen zusätzlichen Effekt mehr bringen. Obviously, the immune system to its maximum capacity of response, zusätzli ches adjuvant can bring no additional effect more. Somit brin gen Zusätze zu SBA für die humorale Antwort keinen Vorteil, Zusätze wie in dem Patent der Firma Gerbu (Patentschrift DE 196 11 235 C1) beschrie ben, werden durch die überraschend gefundene Wirkstärke der in der Er findung beschriebenen SBA überflüssig. ben therefore brin gen additions to SBA for the humoral response no advantage additives as in the patent by Gerbu (Patent DE 196 11 235 C1) beschrie be obsolete by the surprisingly found potency of the SBA described in He-making.

Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß es nach Applikation von GMDP in Kombination mit SBA-Dispersionen bei einer erneuten spä teren Impfung zu einer deutlich gesteigerten zellulären Immunantwort kam als wenn vorher nur SBA-Dispersion alleine als Adjuvans eingesetzt wurde. It has surprisingly been found, however, that occurred after administration of GMDP in combination with SBA dispersions with a renewed latest, direct inoculation to a significant increase in cellular immune response than when previously only SBA dispersion was used alone as an adjuvant. Somit wurde neu gefunden, daß eine Kombination von SBA- Dispersion spezifisch zur Steigerung der zellulären Immunantwort bei er neuter Impfung geeignet ist. Thus, it was newly found that a combination of SBA dispersion is specifically suitable for increasing the cellular immune response in he neuter vaccination. Es kommt zu einer erhöhten Immunantwort bei späterer Zweitimpfung, wenn vorher ein zusätzliches Adjuvans wie GMDP in Mischung mit SBA-Dispersion verwendet wurde (Beispiel 13). There is an increased immune response in a later second vaccination, if previously an additional adjuvant such as GMDP was used in a mixture with SBA dispersion (Example 13).

Zur Herstellung eines Adjuvans mit Ziel einer Erhöhung der zellulären Immunantwort ist es somit vorteilhaft, die SBA-Dispersion mit einem weiteren Adjuvans zu kombinieren. For the preparation of an adjuvant with aim of increasing the cellular immune response, it is thus advantageous to combine the SBA dispersion with another adjuvant. Mögliche Adjuvantien für eine Kombi nation sind: N-Acetylglucosaminyl-(β1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutamin [GMDP], Dimethyldioctadecylammoniumbromid [DDA], N- acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [MDP], N,N Di-(β-Stearoylethyl)- N,N-dimethylammoniumchlorid [EQ1], Glykopeptide, Bestandteile der Zellwand von Mycobakterien, Saponine, quaternäre Amine, wie z. Possible adjuvants for a combi nation are: N-Acetylglucosaminyl- (β1-4) -N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine [GMDP], dimethyldioctadecylammonium bromide [DDA], N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine [ MDP], N, N di (β-Stearoylethyl) - N, N-dimethyl ammonium chloride [EQ1], glycopeptides, components of the cell wall of mycobacteria, saponins, quaternary amines, such as. B. Cetyl pyridiniumchlorid und Benzalkoniumchlorid, zwitterionische Amine wie CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), Dextransulfat, Dextran, 3-Odesacyl-4'-monophosphoryl lipid A [MPL®], N- Acetyl-L-Alanyl-Disoglutaminyl-L-Alanin-82)-1,2 dipalmitoyl-sn-glycero--3-(hydroxy-phosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz [MTP-PE], Gra nulocyten-Makrophagen-Kolonien stimulierender Faktor [GM-CSF], Block copolymere, z. B. cetyl pyridinium chloride and benzalkonium chloride, zwitterionic amines such as CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate), dextran sulfate, dextran, 3-4'-monophosphoryl lipid Odesacyl-A [MPL®], N- acetyl -L-alanyl-L-alanine Disoglutaminyl 82) -1,2 dipalmitoyl-sn-glycero - 3- (hydroxy-phosphoryloxy)) ethylamide, monosodium salt [MTP-PE], Gra nulocyten-macrophage colony stimulating factor [ GM-CSF], block copolymers, for example. B. P1205, Poloxamer 401 (Pluronic L121), Dimyristoyl phosphatidylcholin [DMPC], Dehydroepiandrosterone-3β-01-17-on [DHEA], Dimyristoylphosphatidylglycerol [DMPG], Deoxycholsäure-Natriumsalz, Cytokine, Imiquimod, DTP-GDP, Saponine, 7-Allyl-8-Oxoguanosin, Mon tanide ISA 51, Montanide ISA 720, MPL, Murametid, Murapalmitin, D- Murapalmitin, 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol, Dicetylphosphat, Polyme thylmethacrylat [PMMA], PEG-Sorbitanfettsäureester wie Polysorbat 80 (TWEEN® 80), Quil A Saponin, Sorbitanfettsäureester wie Sorbitantrioleat (SPAN®85, Arlacel85), DTP-DPP, Stearyl-Tyrosin, N,N dioctadecyl-N',N'- bis(2-hydroxyethyl) Propandiamin, Calcitriol. B. P1205, Poloxamer 401 (Pluronic L121), dimyristoyl phosphatidyl choline [DMPC], Dehydroepiandrosterone-3β-01-17-on [DHEA], dimyristoyl phosphatidyl glycerol [DMPG], deoxycholic acid sodium salt, cytokines, imiquimod, DTP-GDP, saponins, 7 allyl-8-oxoguanosine, Mon tanide ISA 51, Montanide ISA 720, MPL, murametide, Murapalmitin, D- Murapalmitin, 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol, dicetyl phosphate, polyme methacrylate [PMMA], PEG-sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 80 (TWEEN ® 80), Quil A saponin, sorbitan fatty acid esters such as sorbitan trioleate (SPAN®85, Arlacel85), DTP-DPP, stearyl-tyrosin, N, N dioctadecyl-N ', N'-bis (2-hydroxyethyl) propanediamine, calcitriol.

Neben der Steigerung der humoralen Immunantwort durch SBA- Dispersionen eröffnet sich durch die Erfindung die Möglichkeit zur Steige rung der zellulären Immunantwort bei Zweitimpfung durch Kombination von SBA-Dispersionen mit anderen Adjuvantien. In addition to increasing the humoral immune response by SBA dispersions the possibility of platforms opened up by the invention tion of the cellular immune response in second vaccination by a combination of SBA dispersions with other adjuvants.

Anstelle einer Zumischung von Adjuvantien zur Erhöhung der zellulären Immunantwort können die Adjuvantien auch in die Lipidpartikel inkorpo riert werden. Instead of an admixture of adjuvants to increase the cellular immune response to adjuvants may also be in the lipid particles inkorpo riert. Inkorporation ist möglich durch Einlagerung in die feste Partikelmatrix, Anreicherung in der Grenzfläche im Falle von amphiphilen Adjuvantien oder durch einfache Adsorption auf die Partikeloberfläche. Incorporation is possible by incorporation into the solid matrix particles, accumulate in the interface in the case of amphiphilic adjuvants or by simple adsorption onto the particle surface. Die Inkorporation von Adjuvantien kann während der Partikelherstellung oder nachträglich erfolgen (z. B. im Falle der Inkorporation, Beispiel 16). The incorporation of adjuvants can be during particle preparation or afterwards (for. Example, in the case of incorporation, Example 16). Zur Inkorporation während der Herstellung werden Adjuvantien in der ge schmolzenen Lipidphase gelöst, solubilisiert oder dispergiert und die Ad juvans beinhaltende Lipidphase dann weiterverarbeitet. For incorporation during the preparation of adjuvants are dissolved, solubilized or dispersed in the molten lipid phase GE and then further processes the Ad juvans-containing lipid phase. Im Falle von am phiphilen Adjuvantien können diese auch in der äußeren Phase der SBA- Dispersion gelöst werden und reichern sich dann in der Partikelgrenzflä che oder durch Adsorption auf der Oberfläche an. In the case of the adjuvants phiphilen these may also be in the outer phase of the SBA dispersion are dissolved and then accumulate in the Partikelgrenzflä surface or by adsorption on the surface of. Durch Inkorporation von Adjuvantien kommt es zu einer verlängerten Freisetzung durch die Diffusion oder im Zuge des Partikelabbaus durch Enzyme. By incorporation of adjuvants, there is a prolonged release by diffusion or during the particle degradation by enzymes. Eine verzögerte Freisetzung über einen längeren Zeitraum erhöht die Immunantwort. A sustained release over a longer period increases the immune response.

Ein weiteres attraktives Anwendungsgebiet ist die Antikörperproduktion im Tier. Another attractive application is the production of antibodies in the animal. Durch Zusatz des Adjuvans kann die Antikörperausbeute deutlich erhöht werden. The addition of the adjuvant, the antibody yield can be significantly increased.

Beispiele Examples Beispiel 1 example 1 Bestimmung der physikalischen Stabilität von SBA-versus- Freunds-Incomplete-Adjuvant (FIA) Determination of the physical stability of SBA-versus Freund's Incomplete adjuvant (FIA)

Eine wäßrige SBA-Dispersion wurde durch Hochdruckhomogenisation bei 95°C aus 20% Bienenwachs, 2% Tween 80 hergestellt (PCS-Durchmesser 289 nm Polydispersitätsindex 0,101). An aqueous SBA dispersion was prepared by high pressure homogenization at 95 ° C of 20% beeswax, 2% Tween 80 (PCS diameter 289 nm polydispersity index 0.101). FIA wurde nach der von Freund beschriebenen Methode herge stellt [Freund, JJ Immunology 1948, 60, 383-398]. FIA was in the manner described by Freund method Herge provides [friend, JJ Immunology 1948, 60, 383-398]. SBA und FIA wurden bei den Temperaturen der Klimazonen gelagert, die bei der Stabili tätsprüfung von Arzneimitteln eingesetzt werden [EMEA-Richtlinie CPMP/QWP/159/96, Januar 1998)]. SBA and FIA were stored at temperatures of climates that are used in the Stabili tätsprüfung of drugs [EMEA guideline CPMP / QWP / 159/96 January 1998)]. Die Lagertemperaturen waren: 5°C, 25°C, 40°C. The storage temperatures were 5 ° C, 25 ° C, 40 ° C. Bestimmung der physikalischen Stabilität erfolgte über Mes sung der Partikelgröße mit Laserdiffraktometrie, Charakterisierungspara meter waren der Durchmesser 50% und der Durchmesser 95% (50% bzw. 95% der Partikel sind unter der angegebenen Größe, sensitiver Pa rameter für Partikelaggregation). Determination of the physical stability was about Mes solution of the particle size by laser diffractometry, characterization para meters were the diameter of 50% and the 95% diameter (50% and 95% of the particles are of the specified size, Pa sensitive parameters for particle aggregation). FIA zeigte bereits nach wenigen Minuten Lagerung - sogar bei Raumtemperatur - ein deutliches Partikelwachstum, FIA ist somit kein lagerstabiles Adjuvans. FIA showed after only a few minutes Storage - even at room temperature - a clear particle growth, FIA is therefore not stable in storage adjuvant. Demgegenüber bleiben die Par tikelgrößen von SBA unter den 3 Lagerbedingungen über einen Zeitraum von 1 Jahr unverändert (Tabelle 1). In contrast, the Par remain tikelgrößen SBA among the three storage conditions over a period of 1 year unchanged (Table 1).

Tabelle 1 Table 1

Untersuchung der Stabilität von SBA (20% Bienenwachs, 2% Tween 80) im Vergleich mit Freunds unvollständigem Adjuvans (FIA) Study of the stability of SBA (20% beeswax, 2% Tween 80) as compared with Freund's incomplete adjuvant (FIA)

Beispiel 2 example 2 Bestimmung der physikalischen Stabilität von SBA-versus- Squalen-Adjuvans Determination of the physical stability of SBA-versus-squalene adjuvant

SBA wurde hergestellt wie unter 1 beschrieben; SBA was prepared as described under 1; es enthielt 10% Cetylpalmitat und 1,2% Miranol (PCS-Durchmesser 210 nm, PCS-Polydispersitätsindex 0,189). it contained 10% cetyl palmitate and 1.2% Miranol (PCS diameter 210 nm, PCS polydispersity index 0.189). Squalen-Adjuvans wurde hergestellt nach der Beschreibung in der europäischen Patentanmeldung 0 399 843 mit Anmeldedatum 25. Mai 1990 (Adjuvans MF59). Squalene adjuvant was prepared as described in European Patent Application 0,399,843 25 with Joined May 1990 (MF59 adjuvant). Partikelgrößenmes sung erfolgte mit Laserdiffraktometrie; Partikelgrößenmes solution was performed with laser diffraction; Lagerung wurde wie in Beispiel 1 bei 3 Temperaturen durchgeführt (Tabelle 2). Storage was as in Example 1 was carried out at 3 temperatures (Table 2). Zusätzlich wurde ein be schleunigter Stabilitätstest durchgeführt, SBA- und MF59-Dispersionen wurden bei 40° mit einer Frequenz von 50 Hz geschüttelt (Tabelle 3). In addition, a stability test was schleunigter be performed, and MF59 SBA dispersions were shaken at 40 ° at a frequency of 50 Hz (Table 3). So wohl bei normaler Lagerung, als auch im Streßtest zeigt SBA eine erhöhte Stabilität. So well under normal storage conditions, and in the stress test SBA shows increased stability.

Tabelle 2 table 2

Untersuchung der Stabilität von SBA (10% Cetylpalmitat, 1,2% Miranol) im Vergleich mit MF59 Study of the stability of SBA (10% cetyl palmitate, 1.2% Miranol) compared with MF59

Tabelle 3 table 3

Stabilität von MF 59 gegen SBA bei 40°C und einer Schüttelfre quenz von 50 Hz Stability of MF 59 against SBA at 40 ° C and a frequency of 50 Hz Schüttelfre

Beispiel 3 example 3 Langzeitstabilität von SBA Long-term stability of SBA

SBA-Dispersion, bestehend aus 20% Bienenwachs, 2% Tween 80 wurde bei 4-6°C ein Jahr gelagert. SBA dispersion consisting of 20% beeswax, 2% Tween 80 was stored for one year at 4-6 ° C. Die PCS- Daten und Laserdiffraktometer-Durchmesser zeigten wenig oder keine Veränderung (Tabelle 4). The PCS data and laser diffractometer diameter showed little or no change (Table 4).

Tabelle 4 table 4

Langzeitstabilität von SBA: SBA-Dispersion bestehend aus 20% Bienenwachs, 2% Tween 80 wurde bei 4-6°C ein Jahr gelagert Long-term stability of SBA: SBA dispersion consisting of 20% beeswax, 2% Tween 80 was stored for one year at 4-6 ° C

Beispiel 4 example 4 Hitzestabilität von SBA bei Autoklavierung (Hitze, Druck) ver sus FIA und MF59 Heat stability of SBA during autoclaving (heat, pressure) ver sus FIA and MF59

Die SBA-Dispersion war zusammengesetzt aus 18% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser. The SBA dispersion was composed of 18% hard paraffin, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3) and water. Sterilisation von jeweils 20 mL erfolgte in Injektionsfläschchen nach den Standardbedin gungen des europäischen Arzneibuches (121°C, 2 bar, 15 Minuten). Sterilization of 20 mL was in vials according to the Standardbedin conditions of the European Pharmacopoeia (121 ° C, 2 bar, 15 minutes). Parti kelgrößenbestimmung erfolgte mit PCS und Laserdiffraktometrie (LD 95%) (PI: Polydispersitätsindex, Maß für die Breite der Partikelverteilung, MW: Mittelwert aus 3 Messungen, Stabw.: Standardabweichung, PI Polydis persitätsindex) (Tabelle 5). Parti kelgrößenbestimmung was carried out by PCS and laser diffractometry (LD 95%) (PI: polydispersity index, measure of the width of the particle distribution, MW: mean of 3 measurements Stabw .: standard deviation, PI Polydis persitätsindex) (Table 5). Die FIA-Emulsion zeigte nach Autoklavieren Phasentrennung, MF59 ein deutliches Partikelwachstum. The FIA ​​emulsion showed phase separation after autoclaving, MF59 a significant particle growth. SBA ist physi kalisch stabil und kann durch Autoklavieren sterilisiert werden. SBA is physi lisch stable and can be sterilized by autoclaving.

Tabelle 5 table 5 Hitzestabilität von SBA bei Autoklavierung (Hitze, Druck) versus FIA und MF59 Heat stability of SBA during autoclaving (heat, pressure) versus FIA and MF59

Die SBA-Dispersion war zusammengesetzt aus 18% Hart paraffin, 4% Tween 89/Span 85, 7/3 und Wasser. The SBA dispersion was composed of 18% hard paraffin, 4% Tween 89 / Span 85, 7.3 and water. Sterilisation von je weils 20 mL in Injektionsfläschchen bei 121°C, 2 bar, 15 Minuten. Sterilization of each weils in 20 mL vials at 121 ° C, 2 bar, 15 minutes. Parti kelgrößenbestimmung erfolgte mit PCS und Laserdiffraktometrie. Parti kelgrößenbestimmung carried out by PCS and laser diffractometry.

Beispiel 5 example 5 Physiologische Verträglichkeit physiological compatibility

Zur Abschätzung der Verträg lichkeit wurde die Zytotoxizität von SBA in Zellkulturen bestimmt (humane Granulozyten, HL60-Zellen). friendliness for estimating the treaty the cytotoxicity of SBA in cell cultures determined (human granulocytes, HL-60 cells) was. Zur Quantifizierung der Toxizität wurde die Viabilität der Zellen mit dem MTT-Test [Mosmann, T., J. Immu nol. To quantify the toxicity of the viability of the cells with the MTT assay [Mosmann, T., J. Immu nol was. Meth. 1993, 65, 55-63] bestimmt. Meth., 1993, 65, 55-63] determined. Die SBA-Dispersion war zusam mengesetzt aus 10% Cetylpalmitat, 0,5% Poloxamer 188 und Wasser. The SBA dispersion was quantitative together is 10% cetyl palmitate, 0.5% poloxamer 188 and water. Die Zellzahl pro well betrug 200.000 bei Humangranulozyten und 200.000 bei HL60-Zellen. The number of cells per well was 200,000 at human granulocyte and 200,000 in HL60 cells. Inkubation erfolgte für 12 Stunden. Incubation was for 12 hours. Bei SBA betrug die Via bilität 80% bei den Granulozyten und 85% bei den HL60-Zellen. In the SBA Via stability was 80% for granulocytes and 85% in the HL60 cells. Bei Nanopartikeln aus PLA betrug die Viabilität lediglich 5%, bei Nanoparti keln aus PLA/GA sank sie auf 0%. When nanoparticles of PLA viability was only 5%, at Nano Parti angles of PLA / GA it dropped to 0%. Die Verträglichkeit von SBA ist in den Zellkulturen um mindestens Faktor ca. 20 besser als die der FDA zugelas senen Polymere zur parenteralen Applikation. The compatibility of SBA is in the cell cultures at least a factor 20 better than the FDA zugelas Senen polymers for parenteral administration.

Beispiel 6 example 6 Verträglichkeit nach parenteraler Applikation Compatibility for parenteral administration

Eingesetzt wurde wäßrige SBA-Dispersion mit der Zusammensetzung 5% Hartparaffin, 5% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser. SBA was used aqueous dispersion having a composition of 5% paraffin wax, 5% Tween 80 / Span 85 (7/3) and water. Es erfolgte parenterale Injektion in Schafe (n = 30), Injektionsort war die seitliche Brustwand, das Injektions volumen betrug 5 mL verteilt auf 4 Injektionsorte. There was parenteral injection into sheep (n = 30), the injection site was the lateral chest wall, the injection volume was 5 mL over 4 injection sites. Die Schafe zeigten keine Auffälligkeiten, weder am Injektionsort, noch in ihrem Verhalten. The sheep showed no abnormalities, neither at the injection site, nor in their behavior.

Beispiel 7 example 7 Biokompatibilität - Interaktion mit Körperproteinen Biocompatibility - interaction with body proteins

Die SBA- Dispersion war zusammengesetzt aus 10 Compritol, 2,5% Poloxamer 407 und Wasser. The SBA dispersion was composed of 10 Compritol, 2.5% poloxamer 407 and water. Herstellung erfolgte mit Hochdruckhomogenisation. Was produced using high-pressure homogenization. Die Par tikel wurden 5 Minuten inkubiert mit humanem Plasma, anschließend vom Plasma abgetrennt und die auf der Partikeloberfläche adsorbierten Körperproteine mit zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese [Blunk, T et al. The Par Tikel five minutes were incubated with human plasma, then separated from the plasma and adsorbed on the particle surface body proteins with two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis [Blunk, T et al. Electrophoresis 14, 1382-1387 (1993)] bestimmt. determined Electrophoresis 14, 1382-1387 (1993)]. Bei ver gleichbaren Partikeloberflächen adsorbierte auf SBA mit 96,41 cpm (counts per minute) im Vergleich zu Emulsionen eine sehr geringe Pro teinmenge (Vergleichswerte: 472 cpm auf Emulsion, 390 cpm auf Polysty rolpartikeln [Harnisch, S. et al. Elektrophoresis 1998, 19, 349-354, Blunk, T., Electrophoresis 1993, 14, 1382-1387]. Komplementfaktoren, die eine Unverträglichkeit fördern, wurden auf der SBA-Oberfläche nicht detek tiert. In ver parable particle surfaces adsorbed on SBA with 96.41 cpm (counts per minute) compared to emulsions a very low per teinmenge (comparative figures. 472 cpm on emulsion 390 cpm on polySTY rolpartikeln [Harnisch, S. et al Electrophoresis 1998 19, 349-354, Blunk, T., Electrophoresis, 1993, 14, 1382-1387]. complement that promote incompatibility were not Detek advantage on the SBA-surface.

Beispiel 8 example 8 Stabilität in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlö sung (PBS) Stability in phosphate-buffered physiological saline in (PBS)

SBA zusammengesetzt aus 20% Hartparaffin, 5% Tween 80/Span85 (7/3) und Wasser wurden mit PBS gemischt (2 mL SBA + 2 mL Salzlösung). SBA composed of 20% hard paraffin, 5% Tween 80 / Span85 (7/3) and water were mixed with PBS (2 mL SBA + 2 mL salt solution). Die physikalische Stabilität in der physiologischen Kochsalz lösung wurde mit Laserdiffraktometrie als Funktion der Zeit bestimmt. The physical stability in the physiological saline solution was determined by laser diffraction as a function of time. Über 6 Stunden kam es zu keinem Anstieg der Partikelgröße (Durchmesser 90% und 95%, Tabelle 6) (Stabw.: Standardabweichung). Over 6 hours, there was no increase in particle size (diameter 90% and 95%, Table 6) (Stabw .: standard deviation).

Tabelle 6 table 6

Stabilität in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlö sung (PBS) SBA (20% Hartparaffin, 5% Tween 80/Span85 (7/3)) wurden mit PBS gemischt (2 mL SBA + 2 mL Salzlösung). Stability in phosphate-buffered physiological saline in (PBS) SBA (20% paraffin wax, 5% Tween 80 / Span85 (7/3)) was mixed with PBS (2 mL SBA + 2 mL salt solution). Bestimmung der physi kalischen Stabilität in der physiologischen Kochsalzlösung mit Laserdif fraktometrie als Funktion der Zeit. Determination of physi-earth stability in physiological saline with Laserdif fraktometrie as a function of time.

Beispiel 9 example 9 Adjuvans-Effekt im Vergleich zu molekularem Adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) und FIA Adjuvant effect in comparison with molecular adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) and FIA

Schafe wur den geimpft mit dem Stamm Mycoplasma Bovis PG 45 R9. Sheep inoculated with the strain WUR the Mycoplasma bovis PG 45 R9. Die Kultivie rung des Impfantigens erfolgte in Standkultur über 72 Stunden unter mi kroaerophilen Bedingungen in Hayflick-Medium. The Kultivie tion of vaccine antigen was performed in standing culture for 72 hours under mi kroaerophilen conditions in Hayflick medium. Inaktivierung erfolgte durch Zugabe von 0,1% β-Propiolacton. Inactivation was performed by adding 0.1% β-propiolactone. Die Zellen wurden separiert, mit Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen und auf einen Gehalt von 1 × 10 10 CFU/mL eingestellt. The cells were separated, washed with phosphate buffer pH 7.4 adjusted to a content of 1 x 10 10 CFU / mL. Die Sterilität der Präparation wurde gemäß Deut schem Arzneibuch, Ausgabe 10, geprüft. The sterility of the preparation was tested in accordance with schem Deut Pharmacopoeia, Edition 10th Die Trockenmassebestimmung er gab einen Gehalt 1 mg/mL Mycoplasma-Bovis-Antigen. The dry mass determination gave a content of 1 mg / mL Mycoplasma bovis antigen. Das Adjuvans SBA, GMDP und FIA wurde zu gleichen Teilen mit dem Antigen in Puffer gemischt. The adjuvant SBA, GMDP and FIA was mixed in equal parts with the antigen in buffer. Injektionsvolumen war 5 mL, verteilt auf 4 Injektionsorte. Injection volume was 5 mL, divided into 4 injections sites.

Zusammensetzung von SBA war 4% Hartparaffin, 1% EQ1 (N,N Di-(β- Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). Composition of SBA was 4% hard paraffin, 1% EQ1 (N, N di- (β- Stearoylethyl) -N, N-dimethyl ammonium chloride) and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3). Zusammensetzung des GMDP-Adjuvans war 5% Lipid und 0,5% Tensid. The composition of the GMDP adjuvant was 5% lipid and 0.5% surfactant. FIA wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. FIA was prepared as in Example. 1

Blutentnahme erfolgte am Tag 0 vor Impfung, am Tag 35 und am Tag 63. Bestimmung der Antikörper erfolgte mit ELISA. Blood samples were taken on day 0 prior vaccination on day 35 and day 63. Determination of the antibodies was performed by ELISA. Für den ELISA-Test wurde ein handelsüblicher markierter Anti-IgG-Sheep der Firma Sigma einge setzt. For the ELISA test, a commercially available labeled anti-IgG Sheep Sigma has been set.

SBA zeigte dabei eine vergleichbare Wirkintensität wie die Kombination von Lipidpartikeln mit GMDP. SBA demonstrated a comparable intensity as the effective combination of lipid particles with GMDP. Weiterhin war SBA von vergleichbarer Ef fektivität wie FIA ( Abb. 1). Furthermore, SBA was tiveness of comparable Ef as FIA (Fig. 1). Es bestand kein signifikanter Unterschied in der Wirkintensität zwischen den drei Adjuvantien. There was no significant difference in the intensity of action between the three adjuvants.

Abb. 1 Fig. 1 Adjuvans-Effekt im Vergleich zu molekularem Adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) und FIA Adjuvant effect in comparison with molecular adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) and FIA

Zu sammensetzung von SBA war 4% Hartparaffin, 1% EQ1 (N,N Di-(β- Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). For composition of SBA was 4% hard paraffin, 1% EQ1 (N, N di- (β- Stearoylethyl) -N, N-dimethyl ammonium chloride) and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3). Zusammensetzung des GMDP-Adjuvans war 5% EQ1 und 0,5% Montanide 888. FIA lt. Beispiel 1. The composition of the GMDP adjuvant was 5% lt EQ1 and 0.5% Montanide 888. FIA. Example 1.

Beispiel 10 example 10 Effekt von SBA-Zusammensetzung auf Immuntiter Effect of SBA composition on Immuntiter

SBA- Dispersionen wurden mit identischem Lipid, aber unterschiedlichen Ten siden auf der Oberfläche hergestellt, dh sie unterscheiden sich in ihren Oberflächeneigenschaften. SBA dispersions were identical with lipid but different Ten Šiden formed on the surface, that is, they differ in their surface properties. Die Formulierung SBA-1 besteht aus 4% Hart paraffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser, die Formulierung SBA- 2 enthält 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/ Span 85 (7/3) und Wasser. The formulation SBA-1 consists of 4% hard paraffin, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3) and water, the formulation SBA 2 contains 4% hard paraffin, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7 / 3) and water. Die Effizienz zur Steigerung des Immuntiters wurde analog Bei spiel 9 getestet; The efficiency to increase Immuntiters was tested similarly In game 9; als Vergleich diente FIA. The comparison used was FIA. In Abhängigkeit von den Oberflä cheneigenschaften ergeben sich unterschiedlich hohe Immunantworten für die beiden SBA-Dispersionen ( Abb. 2). Cheneigenschaften depending on the result of different heights Oberflä immune responses for the two SBA dispersions (Fig. 2). Die Stärke der ge wünschten Immunantwort kann somit durch Variation der Oberflächenei genschaften (Tenside, Stabilisatoren, Ladung etc.) eingestellt werden. The strength of the ge desired immune response can thus be adjusted by varying the characteristics Oberflächenei (surfactants, stabilizers, charge etc.).

Abb. 2 Fig. 2 Effekt der SBA-Zusammensetzung auf Immuntiter Effect of SBA composition on Immuntiter

Formu lierung SBA-1 besteht aus 4% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser, Formulierung SBA-2 enthält 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser. Formu-regulation SBA-1 consists of 4% hard paraffin, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3) and water, the formulation SBA-2 contains 4% hard paraffin, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3 ) and water.

Beispiel 11 example 11 Lagerstabilität von SBA-2 Storage stability of SBA-2

Die SBA-Dispersion SBA-2 aus Beispiel 11 wurde bei verschiedenen Temperaturen gelagert und die phy sikalische Stabilität über Messung der Partikelgröße mit PCS bestimmt. The SBA dispersion SBA-2 from Example 11 was stored at different temperatures and determines the phy sikalische stability by measuring the particle size with PCS. Ein Partikelwachstum trat nicht auf ( Abb. 3). Particle growth did not occur (Fig. 3).

Abb. 3 Fig. 3 Lagerstabilität von SBA-2 Storage stability of SBA-2

Die SBA-Dispersion SBA-2 aus Beispiel 11 wurde bei verschiedenen Temperaturen gelagert und die phy sikalische Stabilität über Messung der Partikelgröße mit PCS bestimmt. The SBA dispersion SBA-2 from Example 11 was stored at different temperatures and determines the phy sikalische stability by measuring the particle size with PCS.

Beispiel 12 example 12 Oberflächenmodifikation von SBA-Dispersionen Surface modification of SBA dispersions

Zur Modifi kation der Oberflächenladung wurden SBA-Dispersionen mit grenzflä chenaktiven positiv geladenen Stabilisatoren (EQ1 - Distearoylethyldia moniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid) und negativ geladenen Stabilisa toren (Natriumlaurylsulfat, (SDS)) hergestellt. To modifi cation of the surface charge were incubated with grenzflä-active positively charged stabilizers SBA dispersions (EQ1 - Distearoylethyldia ammonium chloride, cetylpyridinium chloride) and negatively charged stabilizing factors (sodium lauryl sulfate (SDS)) was prepared. Die Zusammensetzung der SBA-Dispersionen war: SBA-EQ1 (20% Cetylpalmitat, 4% Tween 80/Span 85 (7/3), 1% EQ1), SBA-CPC (18% Lipid, 10% Tensid, 0,1% Cetylpyridi niumchlorid) und SBA-SDS (20% Cetylpalmitat, 1% SDS 80. Als Maß für die Ladung wurde das Zetapotential in Millivolt (mV) gemessen (Elektrophorese-Messung), Zetasizer4 (Malvern Instruments, UK). Um wandlung der elektrophoretischen Mobilität in das Zetapotential erfolgte mit der Helmholtz-Smoluchowski-Gleichung. Die Zetapotentiale betrugen +40 mV, +28 mV und -35 mV für die 3 SBA-Dispersionen. The composition of the SBA dispersions was: SBA-EQ1 (20% cetyl palmitate, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), 1% EQ1), SBA-CPC (18% lipid, 10% of surfactant, 0.1% Cetylpyridi niumchlorid) and SBA-SDS (20% cetyl palmitate, 1% SDS 80. As a measure of the charge was the zeta potential in millivolts (mV) measured (electrophoresis measurement), Zetasizer4 (Malvern Instruments, UK). to change the electrophoretic mobility was carried out in the zeta potential using the Helmholtz-Smoluchowski equation. the zeta potentials were +40 mV, +28 mV and -35 mV for 3 SBA dispersions.

Beispiel 13 example 13 Erhöhte zelluläre Immunantwort bei Hühnern bei Auffri schungsimpfung, die bei der Erstimmunisierung mit GMDP enthaltendem Adjuvans (SBA) behandelt worden waren Increased cellular immune response in chickens at Auffri research vaccination, which had been treated in the primary immunization with GMDP-containing adjuvant (SBA)

SBA (5% EQ1, 0,5% Montanide 888 wurde 1 : 1 mit dem Antigen (IgG vom Kaninchen) gemischt und subcutan injiziert. SBA enthielt 5 µg GMDP, und das Immunisierungs schema war wie folgt: Erstimmunisierung und zwei Auffrischungsimpfun gen an Tag 14 und Tag 28. Die Antikörperbestimmung fand am Tag 42 statt, und gemessen wurde der IgY-Titer im Eigelb. Zur Untersuchung auf eine verstärkte zelluläre Immunantwort fand an Tag 100 ein erneuter An tigenkontakt statt (erneute Auffrischungsimpfung) und am Tag 120 die Antikörperbestimmung. Die Ergebnisse zeigen, daß im Falle der Erstim munisierung (Tag 14 und 28) mit GMDP enthaltendem SBA bei erneutem Antigenkontakt eine deutlich verstärkte Antikörperproduktion stattfindet. Säulen 2, 3 und 4, Abb. 4. SBA (5% EQ1, 0.5% Montanide 888 was mixed 1: 1 with the antigen (rabbit IgG) and injected subcutaneously SBA contained 5 ug GMDP, and the immunization was schematically as follows:. First immunization and two Auffrischungsimpfun gene on day 14 and day 28. the antibody determination was on day 42 instead, and measured the IgY titers were in the egg yolk. to test for an enhanced cellular immune response was on day 100, a renewed an term contact place (re-booster vaccination) and day 120, the antibody determination. the results show that in the case of Erstim munisierung (day 14 and 28) with GMDP-containing SBA upon renewed antigen contact a significantly enhanced antibody production takes place. columns 2, 3 and 4, Fig. 4.

Abb. 4 Fig. 4 Antikörperproduktion in Hühnern nach erfolgter Grundim munisierung und erneutem Antigenkontakt am Tag 100 munisierung antibody production in chickens after Grundim and renewed antigen challenge on day 100

Die letzte Anti körperbestimmung der Grundimmunisierung fand am Tag 42 statt, die der Auffrischungsimpfung (Tag 100) am Tag 120. Die Zusammensetzung der Impfstoffe der Beispiele 1-5 ist wie folgt: The last anti body specifications of the primary vaccination took place on day 42, the booster vaccination (day 100) on day 120. The composition of the vaccines of Examples 1-5 is as follows:

  • 1. Tag 42: Antigen in PBS, Tag 100: Antigen in PBS (k. A.: kein Adjuvant, Antigen in PBS). 1st day 42: antigen in PBS, Day 100: antigen in PBS (k A .: no adjuvant, antigen in PBS.).
  • 2. Tag 42: Antigen in SBA mit GMDP, Tag 100: Antigen in SBA. 2nd day 42: antigen in SBA with GMDP, Day 100: antigen in SBA.
  • 3. Tag 42: Antigen in SBA mit GMDP, Tag 100: Antigen in FCA (FCA = Freunds komplettes Adjuvans). 3. Day 42: antigen in SBA with GMDP, Day 100: antigen in FCA (FCA = Freund's complete adjuvant).
  • 4. Tag 42: Antigen in SBA mit GMDP, Tag 100: Antigen in PBS. 4th day 42: antigen in SBA with GMDP, Day 100: antigen in PBS.
  • 5. Tag 42: Antigen in FCA, Tag 100: Antigen in PBS. 5th day 42: antigen in FCA, Day 100: antigen in PBS.
Beispiel 14 example 14

Die Adsorption von GMDP auf SBA-Partikel wurde mittels PCS untersucht. The adsorption of GMDP on SBA-particles was investigated by PCS. GMDP wurde mit SBA gemischt (4% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, um eine Adsorption des GMDP an die Partikel zu ermöglichen. Die End konzentration betrug 1,435 mg/ml. Der Größenzuwachs beträgt 3,9 nm. (PCS-Durchmesser ohne GMDP: 99,4 nm, Standardabweichung: 0,764, Durchmesser mit GMDP: 103,3 nm, Standardabweichung: 0,755). GMDP was mixed with SBA (4% hard paraffin, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), and 30 minutes at room temperature, allowed to stand to allow adsorption of GMDP to the particles. The final concentration was 1.435 mg / ml. the increase in size is 3.9 nm (PCS diameter without GMDP: 99.4 nm, standard deviation: 0.764, diameter with GMDP: 103.3 nm, standard deviation: 0.755)..

Beispiel 15 example 15 Modifikation der Partikelgröße Modification of the particle size

Die SBA-Dispersion mit EQ1 aus Beispiel 12 (SBA-EQ1) wurde mit verschiedenen Herstellungsverfah ren produziert, um die Partikelgröße zu variieren. The SBA dispersion with EQ1 from Example 12 (SBA-EQ1) was produced with different ren Herstellungsverfah to vary the particle size. Die Messung der Parti kelgröße erfolgte mit Laserdiffraktometrie (Laserdiffraktometer LS 230, Firma Coulter Electronics,Germany, Meßbereich: 40 nm-2000 µm). The measurement of the Parti kelgröße carried out by laser diffractometry (laser diffractometer LS 230, Coulter Electronics, Germany, measuring range: 40 nm-2000 microns). Als Charakterisierungsparameter ist der Durchmesser 50% der Partikel ange geben. As a characterization parameter is the diameter give 50% of the particles being. Folgende Herstellungsmethoden wurden eingesetzt: The following manufacturing methods were used:

  • a) Hochdruckhomogenisation: a) high-pressure homogenization:
    Das Lipid wurde geschmolzen, in die wäßrige Tensidlösung gegeben, mit einem Rührer dispergiert und die erhaltene Rohemulsion bei 80°C mit einem Hochdruckhomoge nisator homogenisiert (Micron LAB 40, APV Gaulin Homogeniser GmbH, Germany). The lipid was melted, added to the aqueous surfactant solution, dispersed with a stirrer and the coarse emulsion obtained at 80 ° C with a Hochdruckhomoge nisator homogenized (Micron LAB 40, APV Gaulin Homogeniser GmbH, Germany). Homogenisationsparameter waren 500 bar Druck, 3 Homogenisationszyklen. Homogenization were 500 bar pressure, three homogenization cycles. Der Partikeldurchmesser 50% betrug 0,15 µm. The particle diameter of 50% was 0.15 microns.
  • b) Die Rohemulsion wurde wie unter a) beschrieben hergestellt und mit einem Microfluidizer homogenisiert (Gerättyp 110-Y, Microflui dix Inc., USA). b) The crude emulsion was prepared as described under a) and homogenized (with a Microfluidizer device type 110-Y, Microflui dix Inc., USA).
    Homogenisationsparameter waren 700 bar, 10 Minuten Zirkulati onszeit. Homogenization were bar 700, onszeit 10 minutes DHW circulation. Der mittlere Partikeldurchmesser betrug 0,452 µm. The average particle diameter was 0.452 microns.
  • c) Rotor-Stator-Dispergierung: c) the rotor-stator dispersion:
    Die Rohemulsion wurde wie unter a) beschrieben hergestellt und anschließend mit einem Ultraturrax (Typ T25, Firma Jahnke und Kunkel, Staufen, Germany) bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 10000 Umdrehungen pro Minute für 1 Minute und 10 Minuten dispergiert, Dispergiertemperatur 80° C. Die Partikeldurchmesser betrugen 7,5 und 1,2 µm The crude emulsion was prepared as described under a) and then with an Ultraturrax (Type T25, Jahnke and Kunkel, Staufen, Germany) was dispersed at a revolution rate of 10,000 rpm for 1 minute and 10 minutes, dispersion temperature 80 ° C. The particle diameter were 7.5 and 1.2 micrometers
  • d) Statischer Mischer: d) Static mixer:
    Lipid und wäßrige Tensidlösung aus a) wurden auf 80°C erhitzt und in einem statischen Mischer (Firma Sulzer, Germany) gemischt. Lipid and aqueous surfactant solution from a) was heated to 80 ° C and in a static mixer (Sulzer, Germany) were mixed. Die Partikelgröße betrug 15,8 µm. The particle size was 15.8 microns.
  • e) Gasstrahlmühle: e) gas jet mill:
    Behensäure Triglycerid wurde luftstrahlgemahlen (Jetmill, Mosokawa Alpine AG) und anschließend unter Rühren in der wäßrigen Tensidlösung bei Raumtemperatur dispergiert. Behenic acid triglyceride was air jet milled (Jetmill, Mosokawa Alpine AG) and then dispersed with stirring in the aqueous surfactant solution at room temperature. Der Partikeldurchmesser 50% betrug 37,03 µm. The particle diameter of 50% was 37.03 microns.
  • f) Mörsermühle: f) mortar mill:
    Das grob gepulverte Lipid wurde in einer Mörser mühle unter Zusatz von flüssigem Stickstoff für 3 Minuten und 15 Minuten gemahlen (Retsch Mörsermühle, Firma Reetsch, Germany). The coarsely powdered lipid was ground in a mortar mill with addition of liquid nitrogen for 3 minutes and 15 minutes (Retsch mortar mill, company Reetsch, Germany). Das Lipid wurde wie in e) in Wasser dispergiert. The lipid was dispersed as described in e) in water. Die mittlere Parti kelgröße betrug 40 µm. The mean Parti kelgröße was 40 microns.
Beispiel 16 example 16 Molekulares Adjuvans zur Erhöhung der zellulären Im munantwort, inkorporiert in SBA Molecular adjuvant to increase the cellular In munantwort incorporated into SBA

GMDP wurde in Span 85-(W/O)Emul gator gelöst und Cetylpalmitat dazugegeben. GMDP was dissolved in clamping 85- (W / O) Emul gator and added cetyl palmitate. Die Mischung wurde bei 70 °C geschmolzen und nach dem Wiederererkalten in der Mörsermühle un ter Zugabe von flüssigem Stickstoff gemahlen. The mixture was melted at 70 ° C and milled ter after Wiederererkalten in the mortar mill un addition of liquid nitrogen. Die gemahlene Lipid- GMDP-Mischung wurde in einer 2,5 prozentigen Tween-80-Lösung dis pergiert und mit dem Ultraturrax 1 Minute bei 8000 U/min vordispergiert. The ground lipid GMDP mixture was pergiert in a 2.5 percent Tween-80 solution and dis predispersed with an Ultraturrax for 1 minute at 8000 U / min. Diese Dispersion wurde bei 4°C mittels Hochdruckhomogenisation in 3 Zyklen bei 1000 bar homogenisiert. This dispersion was homogenized at 4 ° C by means of high pressure homogenization in 3 cycles at 1000 bar. Der PCS-Durchmesser beträgt 260 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,430. The PCS diameter is 260 nm with a polydispersity index of 0.430.

Beispiel 17 example 17 Molekulares Adjuvans zur Erhöhung der zellulären Im munantwort, inkorporiert in die Grenzfläche Molecular adjuvant to increase the cellular In munantwort incorporated into the interface

Saponine sind allgemein be kannt zur Erhöhung der zellulären Immunantwort. Saponins generally be known to increase cellular immune response. Die Herstellung der Partikel erfolgte mit einem Rotor-Stator analog zu Beispiel 15. Die Zu sammensetzung der SBA-Dispersion ist 5% Cetylpalmitat, 0,5% Saponin (Quil-A-Saponin) und Wasser. The preparation of the particles was carried out with a rotor-stator analogously to Example 15. The composition of the SBA dispersion to 5% cetyl palmitate, 0.5% saponin (Quil-A saponin) and water. Das Saponin wurde in der wäßrigen Phase gelöst, diese auf 80° erhitzt und das geschmolzene Lipid zugegeben. The saponin was dissolved in the aqueous phase, heated it to 80 ° and the molten lipid was added. Her stellung erfolgte mit einem Ultraturrax, Rühren mit 10000 RPM für 5 Mi nuten. Her position was carried out with an Ultraturrax, 10000 rpm stirring with grooves for 5 mi. Der mit dem Laserdiffraktometer bestimmte Durchmesser 50% betrug 2,28 µm. The determined using the laser diffractometer 50% diameter was 2.28 .mu.m.

Beispiel 18 example 18 Produktion von SBA in Gegenwart eines amphiphilen Adju vant Production of SBA vant in the presence of an amphiphilic Adju

Das amphiphile Tensid CHAPS ist in der Literatur beschrieben als Mittel zur Erhöhung der Immunantwort. The amphiphilic surfactant CHAPS is described in the literature as a means of increasing the immune response. Die Partikel bestehen aus 5% Cetylpalmitat und 0,5% CHAPS. The particles consist of 5% cetyl palmitate and 0.5% CHAPS. Die Herstellung der Partikel erfolgte ana log Beispiel 20. Der Durchmesser 50%, mittels Laserdiffraktometrie be stimmt, beträgt 1,897 µm. The preparation of the particles was ana log Example 20. The diameter of 50%, agrees be by laser diffractometry, is 1.897 microns.

Beispiel 19 example 19 Vergleich SBA-versus reines molekulares-Adjuvant Compare SBA versus pure molecular adjuvant

Die SBA- Dispersion Nr. 2 aus Beispiel 10 (SBA-2) wurde in Schafen getestet (Bedingungen wie in Beispiel 9) gegen molekulares Adjuvant, dh reines GMDP (N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptid). The SBA dispersion no. 2 of Example 10 (SBA-2) was tested in sheep (conditions as in Example 9) against molecular weight adjuvant, ie pure GMDP (N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide). Die Konzentra tion an GMDP (0,1 mg/ml) war analog zu Beispiel 9. Die in-vivo-Testung erfolgte wie in Beispiel 9 beschrieben. The concentra tion of GMDP (0.1 mg / ml) was analogous to Example 9. The in vivo testing was carried out as described in example. 9 SBA 2 zeigt eine höhere Wirkinten sität als reines GMDP ( Abb. 5). SBA 2 shows a higher intensity than Wirkinten pure GMDP (Fig. 5).

Zusammensetzung von SBA 2 Composition of SBA 2

4% Hartparaffin, 1% EQ1 (N,N Di-(β- Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). 4% hard paraffin, 1% EQ1 (N, N di- (β- Stearoylethyl) -N, N-dimethyl ammonium chloride) and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3).

Beispiel 20 example 20 Effekt der Ladung (Oberflächeneigenschaft) auf die Im munantwort (Schaf-Studie analog Beispiel 9) Effect of charge (surface property) In the munantwort (sheep study analogous to Example 9)

Zwischen den positiv gela denen Partikeln SBA 4 und SBA 2 ist kein Unterschied in der Wirkstärke feststellbar. Between the gela positive particles which SBA SBA 4 and 2, no difference in potency is observed. EQ1 aus SBA 2 kann ohne Wirkungsverlust durch das toxi kologisch untersuchte und als pharmazeutisches Konservierungsmittel zugelassene Cetylpyridiniumchlorid ersetzt werden (SBA 4). are EQ1 from SBA 2 may without loss of efficacy by the toxi ecologically examined and approved as a pharmaceutical preservative cetylpyridinium replaced (SBA 4). Gegenüber den negativ geladenen Partikeln der Formulierung SBA 5 beobachtet man eine stärkere Wirkung der positiv geladenen Partikelformulierungen ( Abb. 6). In contrast to the negatively charged particles of the formulation SBA 5 is observed a stronger effect of the positively charged particle formulations (Fig. 6).

Die SBA-Formulierungen haben die folgende Zusammensetzung: SBA 4: The SBA formulations have the following composition: SBA 4:
4% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3), 0,5% Cetylpyridiniumchlo rid. 4% hard paraffin, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), 0.5% Cetylpyridiniumchlo ​​chloride. SBA 5: 4% Hartparaffin, Natriumdeoxycholat 0,2%, Natriumcholat 0,2%, Natriumoleat 1%, Lipoid E80 2%. SBA 5: 4% hard paraffin, sodium deoxycholate 0.2%, sodium cholate 0.2%, 1% sodium oleate, Lipoid E80 2%. SBA 2: 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). SBA 2: 4% hard paraffin, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3). Die Oberflächenladungen (Zetapotential) wurde in Leitfähigkeitswasser mit einer Leitfähigkeit von 50 µS/cm bestimmt: SBA 4: +41,2 mV, SBA 2: +40,5 mV, SBA 5: -36,4 mV. The surface charges (zeta potential) was determined in conductivity water having a conductivity of 50 S / cm: SBA 4: +41.2 mV, SBA 2: +40.5 mV, SBA 5: -36.4 mV. Die Größen (PCS-Durchmesser und Polydispersitätsindex (PI)) wa ren: SBA 4: 103 nm (PI 0,110), SBA 5: 107 nm (PI 0,115), SBA 2: 101 nm (PI 0,101). The sizes (PCS diameter and polydispersity index (PI)) wa ren: SBA 4: 103 nm (PI 0.110), SBA 5: 107 nm (PI 0.115), SBA 2: 101 nm (0.101 PI).

Beispiel 21 example 21 Speziesunabhängigkeit des Effektes (Hühner) Species independence of the effect (chicken)

Das Antigen aus Beispiel 9 wurde mit SBA 1 und SBA 2 im Verhältnis 1 : 1 gemischt und 0,5 ml je Huhn injiziert. The antigen of Example 9 was mixed with SBA 1 and SBA 2 in the ratio 1: 1 and injected 0.5 ml per chicken. Die Antikörpertiter wurden aus den Hühner eiern bestimmt. Antibody titers were determined from the chicken eggs. Zur Quantifizierung diente ein ELISA-Test. For quantification, an ELISA assay was used. Im Gegensatz zur Beschreibung in Beispiel 9 wurde im ELISA-Test ein markierter Anti- IgG-chicken verwendet. In contrast to the description in Example 9, a labeled anti-IgG-chicken was used in the ELISA test. Die erste Immunisierung fand am Tag 0 stattt. The first immunization was stattt day 0th Eine Boosterung mit den gleichen Zubereitungen erfolgte an Tag 31. Ana log zu den Ergebnissen in Beispiel 10 zeigt sich eine stärkere Wirkung der Formulierung SBA 2 ( Abb. 7). A booster with the same preparations was determined on day 31 Ana lied to the results in Example 10, a stronger effect of the formulation SBA shows 2 (Fig. 7).

Zusammensetzung SBA 1: 4% Hartparaffin und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 107 nm (PI 0,112) und SBA 2: 4% Hartparaf fin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS Durchmesser: 101 nm (PI 0,101). Composition SBA 1: 4% hard paraffin and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), PCS diameter: 107 nm (0.112 PI) and SBA 2: 4% Hartparaf fin, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), PCS diameter: 101 nm (0.101 PI).

Beispiel 22 example 22 Einfluß der Lipidmatrix auf die Adjuvanswirkung Influence of the lipid matrix on the adjuvant effect

Bei der Formulierung SBA 2 wurde das nicht bioabbaubare Hartparaffin gegen das bioabbaubares Glyceroltribehenat ausgetauscht (SBA 3). In the formulation SBA 2, the non-biodegradable hard paraffin was changed to the biodegradable glycerol tribehenate (SBA 3). Die Intensi tät der Wirkung unterscheidet sich nicht; The Intensi ty of the effect is no different; Hartparaffin kann durch Gly ceroltribehenat ersetzt werden ( Abb. 8). Hard paraffin can be replaced by Gly ceroltribehenat (Fig. 8).

Zusammensetzung SBA 2: 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 101 nm (PI 0,101) SBA 3: 4% Gly ceroltribehenat, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durch messer: 105 nm (PI 0,112). Composition SBA 2: 4% hard paraffin, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), PCS diameter: 101 nm (0.101 PI) SBA 3: ceroltribehenat 4% Gly, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), PCS diameter: 105 nm (PI 0.112).

Beispiel 23 example 23

Die Formulierungen SBA 1 und SBA 2 wurden im Vergleich zu Aluminiumhydroxid getestet (Durchführung analog Beispiel 9). The formulations of SBA 1 and SBA 2 were tested in comparison with aluminum hydroxide (Procedure analogous to Example 9). Die Wirkung von SBA 1 und von SBA 2 ist gleich der Wirkung von Alumini umhydroxid (Kontrolle: Antigen in PBS). The effect of SBA 1 and SBA 2 is equal to the effect of Alumini hydroxide (control: antigen in PBS). Analog Beispiel 9 ist SBA 2 stär ker wirksam als SBA 1 ( Abb. 9). Analogously to Example 9 SBA 2 Staer ker effective as SBA 1 (Fig. 9).

Zusammensetzung SBA 2: 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 101 nm (PI 0,101) SBA 1: 4% Hart paraffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 107 nm (PI 0,112). Composition SBA 2: 4% hard paraffin, 1% EQ1 and 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), PCS diameter: 101 nm (0.101 PI) SBA 1: 4% hard paraffin, 4% Tween 80 / Span 85 (7/3), PCS diameter: 107 nm (0.112 PI).

Liste der Abbildungen List of Figures

Abb. 1: Adjuvans-Effekt im Vergleich zu molekularem Adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) und FIA. Fig. 1: Adjuvant effect in comparison with molecular adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) and FIA.

Abb. 2: Effekt der SBA-Zusammensetzung auf Immuntiter. Fig. 2: Effect of SBA composition on Immuntiter.

Abb. 3: Lagerstabilität von SBA 2. Fig. 3: Storage stability of SBA second

Abb. 4: Antikörperproduktion in Hühnern nach erfolgter Grundim munisierung und erneutem Antigenkontakt an Tag 100, die letzte Anti körperbestimmung der Grundimmunisierung fand am Tag 42 statt, die der Auffrischungsimpfung (Tag 100) an Tag 120. Fig. 4: munisierung antibody production in chickens after Grundim and renewed antigen contact on Day 100, the last antibody determination of the basic immunization took place on day 42, the booster vaccination (day 100) on day 120.

Abb. 5: Adjuvans-Effekt von SBA im Vergleich zu molekularem Adju vans GMDP (Beispiel 19). Fig. 5: adjuvant effect of SBA in comparison to molecular Adju vans GMDP (Example 19).

Abb. 6: Wirkung unterschiedlicher Partikelladung (Beispiel 20). Fig. 6: effect of different particle charge (Example 20).

Abb. 7: Adjuvanswirkung in Hühnern (Beispiel 21). Fig. 7: adjuvant in chickens (Example 21).

Abb. 8: Einfluß der Lipidmatrix auf die Adjuvanswirkung (Beispiel 22). Fig. 8: Influence of the lipid matrix on the adjuvant effect (Example 22).

Abb. 9: Vergleich der Wirkung von SBA 1 und SBA 2 mit Alumini umhydroxid (Beispiel 23). Fig. 9: Comparison of the effect of SBA 1 and SBA 2 Alumini hydroxide (Example 23).

Claims (22)

1. Mittel zur Steigerung der Immunantwort bei Impfungen von Men schen und Tieren sowie zur Steigerung der Ausbeute von Antikörpern in der Immunologie und Antikörperproduktion, dadurch gekenn zeichnet , daß es sich um bei Raumtemperatur (= 20°C) feste Li pidpartikel handelt, welche in einer für das jeweilige zu immunisie rende Subjekt charakteristischen Optimaldosis, sowie optimaler Par tikelgröße, Partikelladung sowie Oberflächeneigenschaften (stabilisierende Tensidschicht) appliziert werden, wobei sie der Lö sung des Antigens einfach zugemischt werden. Rule 1 means for increasing the immune response in vaccination of men and animals, and is characterized for increasing the yield of antibodies in immunology and antibody production, terized in that order at room temperature (= 20 ° C) solid Li pidpartikel is that in a characteristic of the respective subject to immunisie yield optimum dose and optimal par tikelgröße, particle charge and surface properties (stabilizing surfactant layer) are applied, where they are simply mixed into the Lö solution of the antigen.
2. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 10-1000 nm handelt. 2. Composition according to claim 1, wherein it is particles in the range of 10-1000 nm.
3. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 1-10 µm handelt. 3. Composition according to claim 1, wherein it is particles in the range of 1-10 microns.
4. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 10-200 µm, insbesondere um Partikel im Bereich von 10-100 µm handelt. 4. A composition according to claim 1, wherein it is particles in the range of 10-200 microns, in particular particles in the range of 10-100 microns.
5. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 200-1000 µm, insbesondere um Partikel im Bereich von 200-500 µm handelt. 5. A composition according to claim 1, wherein it is particles in the range of 200-1000 microns, in particular particles in the range of 200-500 microns.
6. Mittel nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung der Lipidpartikel eingesetzten Lipide bei Raumtempe ratur fest sind, beispielsweise Ethylstearat, Octadecan, DDA, Natürli che oder synthetische Triglyceride bzw. Mischungen derselben, Mo noglyceride und Diglyceride, alleine oder Mischungen derselben oder mit z. 6. A composition according to claims 1-5, characterized in that the lipids used for preparing the lipid particles are temperature solid at room Tempe, such as ethyl stearate, octadecane, DDA, Natürli che or synthetic triglycerides or mixtures thereof, Mo noglyceride and diglycerides, alone or mixtures thereof, or with z. B. Triglyceriden, selbst-emulgierende modifizierte Lipide, natür liche und synthetische Wachse, Fettalkohole, einschliesslich ihrer Ester und Ether sowie in Form von Lipidpeptiden, oder irgendwelche Mischungen derselben. B. triglycerides, self-emulsifying modified lipids, natuer Liche and synthetic waxes, fatty alcohols, including their esters and ethers and in the form of lipid peptides, or any mixtures thereof. Besonders geeignet sind synthetische Mono glyceride, Diglyceride und Triglyceride als individuelle Substanzen oder als Mischung (z. B. Hartfett), Imwitor 900, Triglyceride (z. B. Gly ceroltrilaurat, Glycerolmyristat, Glycerolpalmitat, Glycerolstearat und Glycerolbehenat) und Wachse wie z. Particularly suitable synthetic mono are glycerides, diglycerides and triglycerides as individual substances or as a mixture (z. B. hard fat), Imwitor 900, triglycerides (eg. B. Gly ceroltrilaurat, Glycerolmyristat, Glycerolpalmitat, glycerol stearate and glycerol behenate) and waxes such. B. Cetylpalmitat und weisses Wachs (DAB), wobei sie einzeln oder in Mischungen verwendet wer den können, außerdem Kohlenwasserstoffe, wie z. B. cetyl palmitate and white wax (DAB), which individually or also in mixtures who can, hydrocarbons such. B. Hartparaffin. As hard paraffin.
7. Mittel nach dem Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß den zur Herstellung der Lipidpartikel eingesetzten festen Lipiden flüssige Li pide wie flüssige Gyceride (Miglyole), Erdnußöl, Rizinusöl, Sojaöl, Baumwollsamenöl, Rapsöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, Distelöl zugemischt werden, wobei die daraus hergestellten Partikel bei Raumtemperatur (20°C) fest sind. 7. The composition according to claim 6, characterized in that the solid lipids used for preparing the lipid particle liquid Li pide as liquid Gyceride (miglyols), peanut oil, castor oil, soybean oil, cottonseed oil, rapeseed oil, linseed oil, olive oil, sunflower oil, safflower oil are mixed, wherein the particles produced therefrom at room temperature (20 ° C) are fixed.
8. Mittel nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie positiv geladen sind. 8. A composition according to claims 1-7, characterized in that they are positively charged.
9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung der positiven Ladung bei der Herstellung der Lipidpartikel die Sub stanzen Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Methylbenze thoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, N,N-Di-(β-Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid, Dimethyldiocta decylammoniumbromid einzeln oder in Mischung miteinander zuge setzt werden. 9. A composition according to claim 8, characterized in that for generating the positive charge in the production of the lipid particles the sub punch benzyldimethylhexadecylammonium chloride, methyl thoniumchlorid Benze, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, N, N-di- (β-Stearoylethyl) -N, N-dimethyl ammonium chloride are Dimethyldiocta decylammonium supplied individually or together in sets mixture.
10. Mittel nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie negativ geladen sind. 10. A composition according to claims 1-7, characterized in that they are negatively charged.
11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeu gung der negativen Ladung bei der Herstellung der Lipidpartikel die folgenden Verbindungen: Diacetylphosphate, Phosphatidylglycerin, Lecithine unterschiedlicher Herkunft (z. B. Eilecithin oder Sojalecit hin), chemisch modifizierte Lecithine (z. B. hydrierte Lecithine), ge nauso wie Phospholipide und Sphingolipide, Mischung von Lecithi nen mit Phospholipiden, Sterolen (z. B. Cholesterol und Cholesterol- Derivate, genauso wie Stigmasterin) und ebenfalls gesättigte und un gesättigte Fettsäuren, Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natrium taurocholat, Natriumdeoxycholat, einzeln oder in Mischung mitein ander zugesetzt werden. 11. A composition according to claim 10, characterized in that for the generation of the negative charge supply in the production of the lipid particles, the following compounds: diacetyl, phosphatidylglycerol, lecithins of various origin (e.g. egg lecithin or Sojalecit out.), Chemically modified lecithins (eg. for example, hydrogenated lecithins), so forgiving such as phospholipids and sphingolipids, mixture of Lecithi NEN with phospholipids, sterols (for. example, cholesterol and cholesterol derivatives, as well as stigmasterol) and also saturated and un saturated fatty acids, sodium cholate, sodium glycocholate, sodium taurocholate are other added sodium deoxycholate, individually or in mixture mitein.
12. Mittel nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ungeladen oder nur gering geladen sind. 12. Composition according to claims 1-7, characterized in that they are charged, uncharged, or only slightly.
13. Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur ihrer Er zeugung bei der Herstellung der Lipidpartikel ungeladene Substanzen wie Polyethylenglykol-Sorbitanfetsäureester (insbesondere die Tween Reihe wie Tween 80), Polyoxyethylenpolyoxypropylenkopolymere (insbesondere die Poloxamer-Reihe und die Poloxamine-Reihe), ethoxylierte Mono- und Diglyceride, ethoxylierte Lipide, ethoxylierte Fettalkohole oder Fettsäuren, und Ester und Ether von Zuckern oder von Zuckeralkoholen mit Fettsäuren oder Fettalkoholen (z. B. Saccha rose-Monostearat) einzeln oder in Mischung miteinander zugesetzt werden. 13. Composition according to claim 12, characterized in that for their He generation in the production of the lipid particles uncharged substances such as polyethylene glycol Sorbitanfetsäureester (particularly the Tween series, such as Tween 80), Polyoxyethylenpolyoxypropylenkopolymere (in particular the poloxamer series and the poloxamines series), ethoxylated mono- and diglycerides, ethoxylated lipids, ethoxylated fatty alcohols or fatty acids, and esters and ethers of sugars or of sugar alcohols with fatty acids or fatty alcohols (eg. B. Saccha rose monostearate) be added individually or in mixture with one another.
14. Mittel nach den Ansprüchen 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß ih nen ein oder mehrere Adjuvantien zugesetzt sind. 14. Medium according to claims 1-13, characterized in that ih are NEN added one or more adjuvants.
15. Mittel nach dem Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es mo lekulare Adjuvantien wie N-Acetylglucosaminyl-(β1-4)-N- acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [GMDP], Dimethyldioctadecy lammoniumbromid [DDA], N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [MDP], N,N Di-(β-Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid [EQ1], Glykopeptide, Bestandteile der Zellwand von Mycobakterien, Saponine, quaternäre Amine, wie z. 15. Composition according to claim 14, characterized in that it mo-molecular adjuvants such as N-Acetylglucosaminyl- (β1-4) -N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine [GMDP], Dimethyldioctadecy lammoniumbromid [DDA], N- acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine [MDP], N, N di (β-Stearoylethyl) -N, N-dimethyl ammonium chloride [EQ1], glycopeptides, components of the cell wall of mycobacteria, saponins, quaternary amines, such as. B. Cetylpyridiniumchlorid und Benzalkoniumchlorid, zwitterionische Amine wie CHAPS (3-[(3- cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), Dextran sulfat, Dextran, 3-Odesacyl-4'-monophosphoryl lipid A [MPL®], N- Acetyl-L-Alanyl-Disoglutaminyl-L-Alanin-82)-1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxy-phosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz [MTP-PE], Granulocyten-Makrophagen-Kolonien stimulierender Fak tor [GM-CSF], Blockcopolymere, z. As cetylpyridinium chloride and benzalkonium chloride, zwitterionic amines such as CHAPS (3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate), dextran sulfate, dextran, 3-4'-monophosphoryl lipid Odesacyl-A [MPL®], N- acetyl -L-alanyl-L-alanine Disoglutaminyl 82) -1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)) ethylamide (, monosodium salt [MTP-PE], granulocyte-macrophage colony stimulating Fak tor [GM -CSF], block copolymers, for example. B. P1205, Poloxamer 401 (Pluronic L121), Dimyristoylphosphatidylcholin [DMPC], Dehydroepiandro sterone-3β-01-17-on [DHEA], Dimyristoylphosphatidylglycerol [DMPG], Deoxycholsäure-Natriumsalz, Cytokine, Imiquimod, DTP- GDP, Saponine, 7-Allyl-8-Oxoguanosin, Montanide ISA 51, Montani de ISA 720, MPL, Murametid, Murapalmitin, D-Murapalmitin, 1- Monopalmitoyl-rac-glycerol, Dicetylphosphat, Polymethylmethacrylat [PMMA], PEG-Sorbitanfettsäureester wie Polysorbat 80 (TWEEN® 80), Quil A Saponin, Sorbitanfettsäureester wie Sorbitantrioleat (SPAN®85, Arlacel85), DTP-DPP, Stearyl-Tyrosin, N,N dioctadecyl- N',N'-bis(2hydroxyethyl) Propandiamin, Calcitriol, enthält. B. P1205, Poloxamer 401 (Pluronic L121), dimyristoyl phosphatidyl choline [DMPC], Dehydroepiandro sterone-3β-01-17-on [DHEA], dimyristoyl phosphatidyl glycerol [DMPG], deoxycholic acid sodium salt, cytokines, imiquimod, DTP GDP, saponins, 7 allyl-8-oxoguanosine, Montanide ISA 51, Montani de ISA 720, MPL, murametide, Murapalmitin, D-Murapalmitin, 1- Monopalmitoyl-rac-glycerol, dicetyl phosphate, polymethyl methacrylate [PMMA], PEG-sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 80 (TWEEN® 80), Quil A saponin, sorbitan fatty acid esters such as sorbitan trioleate (SPAN®85, Arlacel85), DTP-DPP, stearyl-tyrosin, N, N dioctadecyl-N ', N'-bis (2-hydroxyethyl) propanediamine, calcitriol contains.
16. Mittel nach dem Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es par tikuläre Adjuvantien wie z. 16. Composition according to claim 14, characterized in that it par tikuläre adjuvants such. B. Aluminiumhydroxid, Polymerpartikel, Liposomen, sind. As aluminum, polymeric particles, liposomes.
17. Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ihnen die Wirksamkeit von Adjuvantien steigernde Substanzen aus der Gruppe der zweiwertigen Übergangsmetallionen, quaternären Aminen, Dex tran, Dextransulfat, Vitamin-E-Derivate wie Vitamin-E-Phosphat und Vitamin-E-Hemisuccinat, und Isoprinosin zugestzt wurden. 17. Composition according to claim 14, characterized in that they the effectiveness of adjuvants enhancing substances from the group of divalent transition metal ions, quaternary amines, Dex tran, dextran sulfate, vitamin E derivatives such as Vitamin E phosphate, and vitamin E-hemisuccinate and isoprinosine were zugestzt.
18. Mittel nach den Ansprüchen 1-17 dadurch hergestellt, daß die Li pidpartikel durch Zerkleinerung von Lipiden im festen Aggregatzu stand hergestellt wurden, z. 18. Compositions as claimed in claims 1-17 prepared by prepared Li pidpartikel stand by comminution of lipids in the solid Aggregatzu, z. B. Mörsermühle, Gasstrahlmühle, Elek trosputtering, Hochdruckhomogenisation, Mikrofluidisation. B. mortar mill, jet mill, Elek trosputtering, high pressure homogenization, microfluidization.
19. Mittel nach den Ansprüchen 1-17 dadurch hergestellt, daß die Li pidpartikel durch Zerkleinerung von Lipiden im geschmolzenen Zu stand unter Dispergierung in einer äußeren Phase (z. B. hochtourige Rührer, statische Mischer im Mikromaßstab und Makromaßstab, Rotor-Stator-Mühlen, Kolloidmühlen, Hochdruckhomogenisation, Mi krofluidisation, Sprühverfahren wie Sprühtrocknung und Elektro sprayverfahren) hergestellt werden, wobei die äußere Phase flüssig (Wasser, organische Flüsigkeiten, Öle oder deren Mischungen) oder gasförmig (Luft, Stickstoff, Edelgas) sein kann. 19. Compositions as claimed in claims 1-17 prepared by the Li pidpartikel stand by comminution of lipids in the molten dispersion to be examined in an outer phase (eg. As high-speed stirrer, static mixer in a microscale and macroscale, rotor-stator mills , colloid mills, high pressure homogenization, Mi krofluidisation, spraying such as spray drying and electrospray method) are prepared, wherein the outer phase may be (water, organic Flüsigkeiten, oils or mixtures thereof) or gaseous (air, nitrogen, inert gas) fluid.
20. Mittel nach den Ansprüchen 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidpartikel und ggf. das zusätzliche Adjuvants in einer äußeren Phase dispergiert sind, z. 20. Composition according to Claims 1-19, characterized in that the lipid particles and possibly the additional adjuvant are dispersed in an external phase, z. B. wäßrige Flüssigkeiten wie Wasser, isoto nische Zuckerlösungen und isotonischer Natriumchloridlösung, nichtwäßrige Flüssigkeiten wie PEG 400 oder 600, organische Flüs sigkeiten wie Öle (Miglyole, Erdnußöl, Rizinusöl, Sojaöl, Baumwoll samenöl, Rapsöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, Distelöl und andere Öle oder deren Mischungen. Example, aqueous liquids such as water, isotopic African sugar solutions and isotonic sodium chloride solution, non-aqueous liquids such as PEG 400 or 600, organic flues fluids such as oil (miglyols, peanut oil, castor oil, soybean oil, cottonseed oil, rapeseed oil, linseed oil, olive oil, sunflower oil, safflower oil and other oils or mixtures thereof.
21. Mittel nach dem Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der äu ßeren Phase viskositätserhöhende Substanzen zugestezt wurden, z. 21. Medium according to claim 20, characterized in that the externa ßeren phase viscosity-increasing substances were zugestezt, z. B. B.
22. Mittel nach den Ansprüchen 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidpartikel und ggf. das zusätzliche Adjuvants in einer trockenen Form vorliegen, z. 22. Composition according to Claims 1-19, characterized in that the lipid particles and possibly the additional adjuvant is present in a dry form, eg. B. als Lyophilisat, sprühgetrocknetes Produkt, feste Dispersion, Pellet oder Tablette. B. as a lyophilisate, spray-dried product, solid dispersion, pellet or tablet.
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