DE10008594B4 - Device and method for spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur ortsaufgelösten Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) mit einer Probe (P), mit
(a) einer bildgebenden Laser-Scanning-Mikroskopeinheit, LSM-Einheit, mit mindestens einem LSM-Detektor,
(b) einer Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopieeinheit, FCS-Einheit, zur Analyse molekularer Wechselwirkungen in kleinen Volumina mittels der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, dadurch gekennzeichnet, dass
(c) Messorte für die Analyse molekularer Wechselwirkungen mithilfe des bildgebenden Verfahrens mindestens zweidimensional bestimmt und ausgewählt werden,
(d) sowohl die bildgebende LSM-Einheit als auch die FCS-Einheit mit einer gemeinsamen Steuereinheit (CU) betrieben werden,
(e) die Analyseergebnisse dem Bild der bildgebenden LSM-Einheit zugeordnet werden und
(f) über die Steuereinheit (CU) und einen Computer (C) mindestens die Analyseergebnisse der FCS-Einheit bildhaft dargestellt werden,
(g) wobei die Probe (P) punktweise mindestens zweidimensional mit Beleuchtungslicht abgescannt wird,
(h) das von der Probe (P) kommende Licht über mindestens einen ersten Detektor detektiert wird und
(i) während des Scanvorganges und/oder nach dem Scanvorgang für mindestens einen Probenpunkt eine FCS-Auswertung erfolgt wobei die FCS-Einheit zwischen dem Scanner (S) der LSM-Einheit und der Probe (P) in den Beleuchtungsstrahlengang der LSM-Einheit eingekoppelt ist.

Figure DE000010008594B4_0000
Method for spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy (FCS) with a sample (P), with
(a) an imaging laser scanning microscope unit, LSM unit, with at least one LSM detector,
(b) a fluorescence correlation spectroscopy unit, FCS unit, for analyzing molecular interactions in small volumes by means of fluorescence correlation spectroscopy, characterized in that
(c) measuring sites for the analysis of molecular interactions are determined and selected using the imaging method at least two-dimensionally,
(d) both the LSM imaging unit and the FCS unit are operated with a common control unit (CU),
(e) the analysis results are assigned to the image of the LSM imaging unit and
(F) via the control unit (CU) and a computer (C) at least the analysis results of the FCS unit are displayed pictorially,
(g) whereby the sample (P) is scanned point by point at least two-dimensionally with illumination light,
(H) the light coming from the sample (P) is detected via at least one first detector and
(i) during the scanning process and / or after the scan for at least one sample point an FCS evaluation takes place whereby the FCS unit between the scanner (S) of the LSM unit and the sample (P) coupled into the illumination beam path of the LSM unit is.
Figure DE000010008594B4_0000

Description

Die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) mit ihrer Realisierung in einem Mikroskopaufbau (FCM) bewährt sich insbesondere dort zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen, wo die Untersuchungen in sehr geringen Konzentrationsbereichen kleiner 1 µMol und in Meßvolumina kleiner 10-14 I stattfinden1. Solange die zu untersuchenden Proben homogen sind, spielt der Meßort nur eine untergeordnete Rolle. Im Falle von strukturierten Proben wie zum Beispiel biologischen Zellen, ist die Kenntnis bzw. die Auswahl des Meßortes aber von entscheidender Bedeutung. Diese Kenntnis über den Meßort wurde bisher über klassische Durchlicht- bzw. Auflicht-Mikroskopie gewonnen. Dazu wurde z.B. zwischen der FCS-Detektionseinheit und einer klassischen Fluoreszenzmikroskopanordnung umgeschaltet. Die Anwendung der klassischen Mikroskopie hat mehrere Nachteile. Einerseits werden dabei die Proben einer hohen Strahlungsbelastung ausgesetzt, andererseits kann der optimale Meßort im dreidimensionalen Koordinatensystem nicht mit der erforderlichen Präzision von weniger 1 µm lokalisiert werden.Fluorescence correlation spectroscopy ( FCS ) with its realization in a microscope setup ( FCM ) has proved particularly useful for the investigation of biomolecular interactions, where the investigations take place in very small concentration ranges of less than 1 μmol and in measurement volumes of less than 10 -14 I 1 . As long as the samples to be examined are homogeneous, the measuring location plays only a minor role. In the case of structured samples such as biological cells, however, the knowledge or the choice of the measuring location is of crucial importance. This knowledge of the measuring location has hitherto been obtained by means of classical transmitted light or reflected light microscopy. For this example was between the FCS Detection unit and a classic fluorescence microscope arrangement switched. The application of classical microscopy has several disadvantages. On the one hand, the samples are exposed to a high radiation load, on the other hand, the optimal measuring location in the three-dimensional coordinate system can not be located with the required precision of less than 1 micron.

Zuber, D.: „Konfokale Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zur Messung von Diffusionskoeffizienten“, Diplomarbeit im Studiengang Physik, Fakultät für Physik und Astronomie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, 1996, beschreibt eine durch Umbau eines konfokalen Laser-Abtast-Mikroskops zur Verwendung für die FCS-Meßmethode geeignete Anordnung. Eine gleichzeitige Nutzung als Laser-Abtast-Mikroskop und zur FCS-Messung ist dabei nicht möglich.Zuber, D .: "Confocal Fluorescence Correlation Spectroscopy for Measuring Diffusion Coefficients", Diploma Thesis in Physics, Faculty of Physics and Astronomy, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, 1996, describes a modification of a confocal laser scanning microscope Use for the FCS -Meßmethode suitable arrangement. Simultaneous use as a laser scanning microscope and for FCS Measurement is not possible.

Die in den Patentansprüchen sowie anhand der bildlichen Darstellungen unten beschriebene Einrichtungen und Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Erweiterung der FCS Methode zu einem bildgebenden Verfahren (S-FCM). Damit können Aussagen zur räumlichen Verteilung der zu untersuchenden molekularen Wechselwirkungen gewonnen werden.The facilities and methods described in the claims and with reference to the pictorial representations advantageously allow the extension of the FCS Method to an imaging procedure (S FCM ). This allows conclusions to be drawn about the spatial distribution of the molecular interactions to be investigated.

Je nach Anzahl der installierten Detektionskanäle kann es sich um Auto- oder Kreuzkorrelationsanalysen handeln.Depending on the number of installed detection channels, these may be auto or cross-correlation analyzes.

Hierbei werden am aktuellen Probenort beispielsweise Diffusionszeiten, Teilchenzahlen, Lebensdauern, Anteile von Komponenten ermittelt.In this case, for example, diffusion times, particle numbers, lifetimes, proportions of components are determined at the current sample location.

Die Datenaquise wird für beide Detektionseinheiten von der gleichen Kontrolleinheit CU und einem Computer C mit geeignetem Programm gesteuert. Ebenso erfolgt die Steuerung des Probentisches T, der vertikalen Objektiveinstellung des Objektives O und der Strahlumschaltungseinheit BS durch diese computergesteuerte Kontrolleinheit. Durch die Integration einer FCS-Detektionseinheit in ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop-System ergibt sich somit die Möglichkeit, auch FCS-Analyseergebnisse von Messungen an verschiedenen Probenorten zu einem bildhaften Ergebnis zu kombinieren. Dadurch ergibt sich eine vorteilhafte Anordnung, die geeignet ist, FCS-Meßorte probenschonend mit hoher Genauigkeit festzulegen und andererseits auch FCS-Analysenergebnisse von Messungen an verschiedenen Orten zur Bildgebung zu verwenden.The data acquisition is for both detection units of the same control unit CU and a computer C controlled by a suitable program. Likewise, the control of the sample table takes place T , the vertical lens setting of the lens O and the beam switching unit BS through this computerized control unit. By integrating a FCS Detection unit in a confocal laser scanning microscope system thus gives the possibility, too FCS -Analysis results from measurements at different sample sites to combine a pictorial result. This results in an advantageous arrangement which is suitable FCS Specify -Meßorte sample gentle with high accuracy and on the other hand FCS Analysis results from measurements at different locations to use for imaging.

Beispielsweise ist es vorteilhaft möglich, über unterschiedliche Farbgebung eine farbige flächenhafte oder räumliche Darstellung der Diffusionzeiten oder anderer Analysenergebnisse in Abhängigkeit vom Meßort zu erzeugen.For example, it is advantageously possible to produce a colored areal or spatial representation of the diffusion times or other analysis results as a function of the measuring location via different colors.

Weiterhin kann durch speichermäßige Zuordnung das aufgenommene FCS Bild beispielsweise als Zusatzfarbe bildlich mit kanalweise andersfarbigen LSM-Bildern verknüpft werden.Furthermore, by recorded allocation the recorded FCS For example, as an additional color, the image can be graphically linked with channel-specific LSM images of different colors.

Es können auch FCS/LSM Differenz- oder Quotientenbilder oder anderweitige Kombinationen gebildet und dargestellt werden.It is also possible to form and display FCS / LSM difference or quotient images or other combinations.

Die erfindungsgemäße Modifikation des Laser-Scanning-Mikroskopes und die wirkungsmäßige Verbindung mit der FCS-Geräteeinheit erfolgt durch geeignete Programme im Computer mittels einer für alle Komponenten gemeinsamen Gerätesteuereinheit. Scaneinheit, FCS-Einheit, Mikroskopeinheit und Probenpositionssystem sind mechanisch, optisch und elektronisch aufeinander abgestimmt und verkoppelt.The inventive modification of the laser scanning microscope and the operative connection with the FCS Device unit is made by appropriate programs in the computer by means of a device control unit common to all components. Scanning unit, FCS Unit, microscope unit and sample position system are mechanically, optically and electronically matched and coupled.

Nach dem Scannen der Probe können Bildpunkte markiert und in die Meßposition für die FCS-Einheit gebracht und vermessen werden.After scanning the sample, pixels can be marked and placed in the measuring position for the FCS Unit be brought and measured.

Die Auswahl der interessierenden Punkte kann automatisch nach vorgegebenen Kriterien (z.B. Raster, Strukturerfassung des Bildes) oder durch den Benutzer nach individueller Bewertung des mit der Scaneinheit aufgenommenen Bildes erfolgen.The selection of the points of interest may be done automatically according to predetermined criteria (e.g., halftone, texture detection of the image) or by the user after individual evaluation of the image taken with the scanning unit.

Der vorgeschlagene Aufbau ermöglicht die gezielte Auswahl mikroskopisch kleiner Meßorte in der mit der FCS-Methode zu untersuchenden Probe. Außerdem ist es möglich, aus einer systematischen Folge von FCS-Messungen die räumliche Variation der FCS-Analysenergebnisse bildhaft zu erfassen, darzustellen und dem LSM-Bild zuzuordnen.The proposed structure allows the targeted selection of microscopic sites in the with the FCS Method to be examined sample. Moreover, it is possible from a systematic sequence of FCS Measurements the spatial variation of the FCS Image analysis to capture and represent the LSM image.

Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert. Bild 1 zeigt ein erstes erfindungsgemäßes FCS-Mikroskop.The invention will be explained in more detail with reference to the accompanying drawings. Figure 1 shows a first invention FCS -Microscope.

Mit einer Mikroskopeinheit MU (hier ein inverses Mikroskop zur Beobachtung einer auf einem in x-, y- und z-Richtung verstellbaren Tisch T befindlichen Probe P über ein unterhalb der Probe angeordnetes Objektiv O und eine Tubuslinse TL) wird mit Hilfe einer Scaneinheit SU Licht aus einer Laserlichtquelle LLS mit einer oder mehreren Wellenlängen direkt oder durch eine Lichtleitfaser LF über eine Kollimationsoptik KO sowie einen primären Strahlteiler STPS in eine Probe fokusiert. Der Scanner S erlaubt das Ablenken des Lichtstrahles in x- und y-Richtung, die Erfassung unterschiedlicher Probenschichten kann durch die vertikale Verstellung des Probentisches T oder des Objektives O erfolgen. Das von der Probe kommende Licht durchläuft wieder den Scanner S und wird mittels der sekundären Strahlteiler STSS 1...N den Detektionskanälen DES1...N zugeordnet und in elektrische Signale zur Auswertung über eine Kontrolleinheit CU in einem Computer C umgewandelt. Die gemessenen Signale werden zur Gewinnung von Bildinformationen genutzt. Mit Hilfe einer Strahlumschaltungseinheit BS, beispielsweise eines ein- und ausschwenkbaren Vollspiegels oder teildurchlässigen Spiegels wird Licht LLF aus einer Laserlichtquelle mit einer oder mehreren Wellenlängen mit Hilfe einer FCS-Einheit FU über einen primären Strahlteiler STPF in die Probe fokussiert.With a microscope unit MU (in this case an inverted microscope for observing a table which can be adjusted in the x, y and z directions T located sample P via an objective arranged below the sample O and a tube lens TL ) is using a scanning unit SU Light from a laser light source LLS with one or more wavelengths directly or through an optical fiber LF via a collimation optics KO and a primary beam splitter STPS focused in a sample. The scanner S allows the deflection of the light beam in x- and y-direction, the detection of different sample layers can be achieved by the vertical adjustment of the sample stage T or the objective O respectively. The light coming from the sample goes through the scanner again S and is using the secondary beam splitter STSS 1 ... N the detection channels DES 1 ... N and into electrical signals for evaluation via a control unit CU in a computer C transformed. The measured signals are used to obtain image information. With the help of a beam switching unit BS For example, a one-and-swing full or semi-transparent mirror light LLF from a laser light source with one or more wavelengths using a FCS -Unit FU via a primary beam splitter STPF focused in the sample.

Die Lichtquellen LLS und LLF können auch identisch sein, deren Licht über geeignete Umlenk- und Schaltelemente in die Einheiten SU bzw. FU eingekoppelt wird.The light sources LLS and LLF may also be identical, their light via suitable deflection and switching elements in the units SU respectively. FU is coupled.

Das von der Probe kommende Fluoreszenzlicht wird durch sekundäre Strahlteiler STSF 1...N in einen oder mehrere FCS-Detektionskanäle DEF 1... N geleitet und zur Auswertung in elektrische Signale umgewandelt und der Kontrolleinheit CU übermittelt. Die Signale werden zur FCS-Analyse verwendet.The fluorescent light coming from the sample is separated into one or more by secondary beam splitters STSF 1... N FCS -Detektionskanäle DEF 1 ... N passed and converted into electrical signals for evaluation and the control unit CU transmitted. The signals become FCS Analysis used.

In Bild 2 ist eine zweite erfindungsgemäße Anordnung dargestellt.Figure 2 shows a second arrangement according to the invention.

Hier ist an/in einer gemeinsamen Einheit SFU eine gemeinsame Lasereinheit LLSF vorgesehen sowie ein gemeinsamer Primärstrahlteiler STPFS. Dargestellt sind separate Strahlteiler und Detektoren DEF, STSF und DES, STSS für die LSM- und FCS-Detektion. Vorteilhaft können die Detektoren DEF und DES baugleich sein. Der Meß- und Auswertemodus kann mittels der Kontrolleinheit CU gewählt werden.Here is at / in a common unit SFU a common laser unit LLSF provided as well as a common primary beam splitter STPFS , Shown are separate beam splitters and detectors DEF . STSF and OF . STSS for the LSM - and FCS Detection. Advantageously, the detectors DEF and OF be identical. The measuring and evaluation mode can by means of the control unit CU to get voted.

Die vorteilhafte Anordnung ergibt sich durch die gemeinsame Lokalisation der LSM-und der FCS-Detektionskanäle in einer Einheit. Ähnlich dem Aufbau, der in Bild 1 beschrieben wurde, wird Laserlicht einer oder mehrerer Wellenlängen mit Hilfe einer Kollimationsoptik und des primären Strahlteilers durch eine Scaneinheit in die Probe fokusiert. Ein besonderer Vorteil dieses Aufbaus ist, daß auch der Meßort für die FCS-Messung mit Hilfe der Scanner gewählt werden kann. Insbesondere ist es dadurch möglich, die FCS-Analysenmethode zu einem bildgebenden Verfahren (Scanning FCM: S-FCSM) vorteilhaft zu erweitern. Reflektiertes Licht und Fluoreszenzlicht wird vom Objektiv aufgefangen, durchläuft wiederum die Scanner und wird von einem oder mehreren sekundären Strahlteilern in einen oder mehrere LSM-Detektionskanäle oder FCS-Detektionskanäle umgeleitet. Dabei kann eine Trennung nach spektralen Eigenschaften oder Polarisationseigenschaften erfolgen. Das detektierte Licht induziert elektrische Signale, die zur Kontrolleinheit mit angeschlossenem Computer nebst geeignetem Programm geleitet und dort zur FCS-Analyse bzw. zur Bildrekonstruktion verwendet werden.The advantageous arrangement results from the common localization of the LSM and the FCS Detection channels in one unit. Similar to the structure described in FIG. 1, laser light of one or more wavelengths is focused into the sample by means of collimating optics and the primary beam splitter by a scanning unit. A particular advantage of this structure is that the place of measurement for the FCS Measurement can be selected with the help of the scanner. In particular, this makes it possible for the FCS Analysis Method for an Imaging Method (Scanning FCM : S-FCSM) advantageous to expand. Reflected light and fluorescent light is captured by the lens, in turn passes through the scanners and is transmitted from one or more secondary beam splitters into one or more LSM detection channels or FCS Detection channels redirected. In this case, a separation according to spectral properties or polarization properties can take place. The detected light induces electrical signals, which are routed to the control unit with a computer connected to a suitable program and there for FCS Analysis or image reconstruction.

Das Laser-Scanning-Mikroskop ist hier so modifiziert, daß es Komponenten und Auswerteverfahren enthält, die es erlauben, auch FCS-Messungen durchzuführen. Scankomponenten und FCS-Komponenten sind erfindungsgemäß so kombiniert, daß eine Strahlteilung bzw. Strahlumschaltung, wie sie im Bild 1 dargestellt wurde, entfallen kann. Der Vorteil dieser Anordnung besteht darin, daß zur Durchführung der FCS-Analysen an den vorher ausgewählten Punkten keine Probenbewegungen mehr erforderlich sind, da der Meßort mit Hilfe der Scanner und durch vertikale Verstellung des Objektivs eingestellt werden kann.The laser scanning microscope is modified here so that it contains components and evaluation methods that allow it, too FCS To carry out measurements. Scanning components and FCS Components are combined according to the invention so that a beam splitting or beam switching, as shown in Figure 1, can be omitted. The advantage of this arrangement is that for carrying out the FCS -Analysen at the previously selected points no more sample movements are required because the measurement site using the scanner and by vertical adjustment of Lens can be adjusted.

Die wirkungsmäßige Verbindung der Betriebsmodi erfolgt, indem entweder direkt während des Scanvorganges der Scanner angehalten wird und an dem hierdurch eingestellten Probenpunkt eine FCS- Auswertung verfolgt oder nach dem Scanvorgang durch Einstellen der Spiegel oder Verstellen des Tisches bei stehenden Scannerspiegeln an bestimmten Punkten eine FCS Auswertung erfolgt. Durch die Anordnung gemäß Bild 2 sind FCS-Messungen mit hoher Positioniergenauigkeit in kürzerer Folge möglich. Dieser vorgeschlagene Aufbau stellt ein scannendes Fluoreszenz-Korrelations-Mikroskop (S-FCM) dar, welches erfindungsgemäß sowohl strukturelle als auch biochemische Informationen bildhaft darstellen kann.The operative connection of the operating modes takes place either by the scanner being stopped directly during the scanning process and by the sample point set thereby FCS - Evaluation tracked or after scanning by adjusting the mirrors or adjusting of Table with stationary scanner mirrors at certain points one FCS Evaluation takes place. By the arrangement according to Figure 2 are FCS -Measurements with high positioning accuracy possible in less time. This proposed design provides a scanning fluorescence correlation microscope (S FCM ), which according to the invention can represent both structural and biochemical information.

Claims (10)

Verfahren zur ortsaufgelösten Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) mit einer Probe (P), mit (a) einer bildgebenden Laser-Scanning-Mikroskopeinheit, LSM-Einheit, mit mindestens einem LSM-Detektor, (b) einer Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopieeinheit, FCS-Einheit, zur Analyse molekularer Wechselwirkungen in kleinen Volumina mittels der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, dadurch gekennzeichnet, dass (c) Messorte für die Analyse molekularer Wechselwirkungen mithilfe des bildgebenden Verfahrens mindestens zweidimensional bestimmt und ausgewählt werden, (d) sowohl die bildgebende LSM-Einheit als auch die FCS-Einheit mit einer gemeinsamen Steuereinheit (CU) betrieben werden, (e) die Analyseergebnisse dem Bild der bildgebenden LSM-Einheit zugeordnet werden und (f) über die Steuereinheit (CU) und einen Computer (C) mindestens die Analyseergebnisse der FCS-Einheit bildhaft dargestellt werden, (g) wobei die Probe (P) punktweise mindestens zweidimensional mit Beleuchtungslicht abgescannt wird, (h) das von der Probe (P) kommende Licht über mindestens einen ersten Detektor detektiert wird und (i) während des Scanvorganges und/oder nach dem Scanvorgang für mindestens einen Probenpunkt eine FCS-Auswertung erfolgt wobei die FCS-Einheit zwischen dem Scanner (S) der LSM-Einheit und der Probe (P) in den Beleuchtungsstrahlengang der LSM-Einheit eingekoppelt ist.A method for spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy (FCS) with a sample (P), comprising (a) a laser scanning microscope unit, LSM unit, with at least one LSM detector, (b) a fluorescence correlation spectroscopy unit , FCS unit, for the analysis of molecular interactions in small volumes by means of the Fluorescence correlation spectroscopy, characterized in that (c) measuring sites for the analysis of molecular interactions are determined and selected at least two-dimensionally using the imaging method, (d) both the LSM imaging unit and the FCS unit having a common control unit ( CU); (e) the analysis results are associated with the image of the LSM imaging unit and (f) the control unit (CU) and a computer (C) at least display the analysis results of the FCS unit; the sample (P) is scanned spotwise at least two-dimensionally with illumination light, (h) the light coming from the sample (P) is detected via at least one first detector, and (i) during the scanning process and / or after the scanning process for at least one sample point FCS evaluation is performed with the FCS unit between the scanner (S) of the LSM unit and the sample (P) in the illumination beam input of the LSM unit is coupled. Vorrichtung zur ortsaufgelösten Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie- (FCS) mit einer Probe (P), mit (a) einer bildgebenden Laser-Scanning-Mikroskopeinheit (LSM) mit mindestens einem LSM-Detektor (DES1, ..., DESN), (b) einer Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopieeinheit (FCS) mit mindestens einem von dem mindestens einen LSM-Detektor verschiedenen FCS-Detektor (DEF1, ..., DEFM) zur Analyse molekularer Wechselwirkungen in kleinen Volumina, (c) einer gemeinsamen Laser-Scanner-Anordnung (S) für die ortsaufgelöste Beleuchtung der Probe (P), (d) einer gemeinsamen Steuereinheit (CU) für die LSM-Einheit und die FCS-Einheit und (e) einer Einrichtung (C) zur zumindest zweidimensionalen Darstellung des von der LSM-Einheit erzeugten Bildes und der örtlich zugeordneten Analyseergebnisse der FCS-Einheit aus den Signalen der LSM- und FCS-Detektoren, (f) wobei der Laser-Scanner-Anordnung (S) über einen gemeinsamen Strahlengang die LSM-und die FCS-Detektoren (DES bzw. DEF) nachgeschaltet sind.Device for spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy (FCS) with a sample (P), with (a) an imaging laser scanning microscope unit (LSM) with at least one LSM detector (DES1, ..., DESN), (b) a fluorescence correlation spectroscopy unit (FCS) having at least one FCS detector (DEF1, ..., DEFM) different from the at least one LSM detector for analyzing molecular interactions in small volumes, (c) a common laser scanner arrangement (S) for the spatially-resolved illumination of the sample (P), (d) a common control unit (CU) for the LSM unit and the FCS unit and (e) means (C) for at least two-dimensional representation of the image generated by the LSM unit and the spatially associated analysis results of the FCS unit from the signals of the LSM and FCS detectors, (F) wherein the laser scanner arrangement (S) via a common beam path downstream of the LSM and the FCS detectors (DES and DEF). Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Steuereinheit die Betriebsweise des mindestens einen LSM-Detektors (DES) ortsaufgelöst auf FCS-Auswertung umschaltet.Device after Claim 2 , wherein the control unit switches the operation of the at least one LSM detector (DES) spatially resolved to FCS evaluation. Verfahren zur ortsaufgelösten Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) einer Probe (P) mit einer Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, mit den folgenden Verfahrensschritten: (a) zumindest zweidimensionales Bestimmen und Auswählen von Messorten für die Analyse molekularer Wechselwirkungen mithilfe des bildgebenden Verfahrens, (b) Betreiben sowohl der LSM-Einheit als auch der FCS-Einheit mit der gemeinsamen Steuereinheit (CU), (c) Zuordnen der Analyseergebnisse dem Bild der bildgebenden LSM-Einheit und (d) bildhaftes Darstellen mindestens der Analyseergebnisse der FCS-Einheit über die Steuereinheit und einen Computer (C), (e) wobei die Probe punktweise mindestens zweidimensional mit Beleuchtungslicht abgescannt wird, (f) das von der Probe kommende Licht über mindestens einen ersten Detektor detektiert wird und (g) während des Scanvorganges und/oder nach dem Scanvorgang für mindestens einen Probepunkt eine FCS-Auswertung erfolgt.Method for spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy (FCS) of a sample (P) with a device according to Claim 2 or 3 method, comprising the following method steps: (a) at least two-dimensional determination and selection of measurement sites for the analysis of molecular interactions by means of the imaging method, (b) operation of both the LSM unit and the FCS unit with the common control unit (CU), ( c) assigning the analysis results to the image of the LSM imaging unit and (d) visualizing at least the analysis results of the FCS unit via the control unit and a computer (C), (e) scanning the sample point by point at least two-dimensionally with illumination light, ( f) the light coming from the sample is detected via at least one first detector and (g) an FCS evaluation is carried out during the scanning process and / or after the scanning process for at least one test point. Verfahren nach Anspruch 4, wobei im Verfahrensschritt (g) aus einer Folge von FCS-Messungen die räumliche Variation der FCS-Analyseergebnisse bildhaft erfasst, dargestellt und dem LSM-Bild zugeordnet wird.Method according to Claim 4 , wherein in step (g) from a sequence of FCS measurements, the spatial variation of the FCS analysis results pictorially recorded, displayed and assigned to the LSM image. Verfahren nach Anspruch 1, 4 oder 5, wobei die Auswahl des Probenortes für die FCS-Messung mit Hilfe eines verfahrbaren Probentisches und/oder vertikaler Verstellung des Objektivs manuell und/oder automatisch erfolgt.Method according to Claim 1 . 4 or 5 , wherein the selection of the sample location for the FCS measurement by means of a movable sample stage and / or vertical adjustment of the lens is done manually and / or automatically. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, oder 4 bis 6, wobei die Auswahl des Probenortes für die FCS-Messung manuell und/oder automatisch mit Hilfe von mindestens einem Scanner erfolgt.Method according to one of Claims 1 , or 4 to 6, wherein the selection of the sample location for the FCS measurement is done manually and / or automatically by means of at least one scanner. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, oder 4 bis 7, wobei für mindestens einen Probenpunkt eine Abspeicherung und speichermäßige Zuordnung sowohl des beim Scannen detektierten Wertes als auch mindestens eines bei der FCS-Auswertung detektierten Wertes erfolgt.Method according to one of Claims 1 , or 4 to 7, wherein for at least one sample point, a storage and memory allocation of both the detected during scanning value and at least one detected in the FCS evaluation value. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, oder 4 bis 8, wobei die obenstehenden Verfahrensschritte für mehrere automatisch und/oder manuell vorgewählte Probenpunkte erfolgen.Method according to one of Claims 1 , or 4 to 8, wherein the above method steps for several automatically and / or manually preselected sample points done. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, oder 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass entweder direkt während des Scanvorganges der Scanner angehalten wird und an dem hierdurch eingestellten Probenpunkt eine FCS-Auswertung erfolgt oder nach dem Scanvorgang durch Einstellen der Spiegel oder Verstellen des Tisches bei stehenden Scannerspiegeln eine FCS-Auswertung erfolgt.Method according to one of Claims 1 , or 4 to 9, characterized in that either directly during the scanning process, the scanner is stopped and at the sample point thereby set an FCS evaluation or after scanning by adjusting the mirror or adjusting the table with standing scanner mirrors an FCS evaluation ,
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