DE10003673A1

DE10003673A1 - Verfahren zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen im basolateralen Bereich adhärenter Zellen und Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkonzentration

Info

Publication number: DE10003673A1
Application number: DE2000103673
Authority: DE
Inventors: Ulrich Rothe; Dagobert Glanz; Annelies Wolter
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2001-08-09
Anticipated expiration: 2020-01-29
Also published as: DE10003673C2

Abstract

Das Verfahren ermöglicht die Bestimmung von extrazellulären Ionenkonzentrationen und deren Änderungen im basolateralen Bereich adhärenter Zellen. Die Lösung besteht darin, daß ionenspezifische Fluoreszenzfarbstoffe in einer polymeren biokompatiblen, lichtdurchlässigen, hydrophilen Matrix immobilisiert werden. Diese Matrix wird als Dünnschicht auf eine lichtdurchlässige Unterlage aufgetragen und dient den Zellen somit als Substratum. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden durch Bestrahlen mit Licht der Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt, die Ionenkonzentrationen und deren Änderungen unter den Zellen werden mittels Fluoreszenzmessung erfaßt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung physiologischer bzw. extern induzierter Änderungen der äußeren Ionenkonzentration an kultivierten Zellen.

Zur Bestimmung von intrazellulären Ionenkonzentrationen sind verschiedene Verfahren bekannt [1-9, 11]. Sie beruhen auf dem Einsatz von ionensensitiven Mikroelektroden oder von Photoproteinen und Fluoreszenzindikatoren. Die letztgenannte Methode wird wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und dem Fehlen von mechanischen Eingriffen in die lebenden Zellen in breitem Maße angewendet. Mittels entsprechend ausgerüsteter Mikroskope (Laser- Scanning-Mikroskop, Bildaufzeichnung mit Videokamera) kann die Veränderung der Ionen konzentrationen im Echtzeitbetrieb zusammen mit ihrer räumlichen Ausdehnung erfaßt werden.

Zur Bestimmung von extrazellulären Ionenkonzentrationen im zellnahen Bereich werden zumeist auch Mikroelektroden benutzt. Für ausgesuchte Zwecke stehen Farbstoffe mit lipophilem Anker, z. B. Calcium Green C18, Molecular Probes, zur Verfügung. Sie eignen sich jedoch nicht zur Messung von Ionenkonzentrationen im basolateralen Bereich der Zellen. Dafür sind auf der ISFET-Technologie basierende Gerätesysteme entwickelt worden (z. B. Physiocontrol-Mikrosystem [11, 13, 14], Microphysiometer [9]). Die Zellen werden auf Objektträgern, auf denen ISFETs integriert sind, kultiviert und vermessen. Die Messungen sind jedoch mit einem hohen apparativen Aufwand verbunden.

Der in den Patentansprüchen angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, in einfacher Weise und mit geringem Aufwand die Bestimmung von extrazellulären Ionenkonzentrationen im basolateralen Bereich adhärenter Zellen zu ermöglichen.

Dieses Problem wird gemäß Patentansprüchen 1 und 5 gelöst durch matriximmobilisierte Fluoreszenzfarbstoffe auf einer lichtdurchlässigen Unterlage und Messung der Fluoreszenz. Die Immobilisierung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt mittels hochmolekularer, z. B. Dextran konjugierter Farbstoffe, wie etwa SNARF®-1 dextran oder Calcium Green™-1 dextran oder reaktiver, zu kovalenten Bindungen befähigter Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. Chlormethyl SNARF®-1.

Die Fluoreszenzfarbstoffe werden in eine polymere, biokompatible, lichtdurchlässige, hydrophile Matrix eingearbeitet. Als Matrices sind Collagen, Polylysin, kolloidales Kieselgel, kolloidales Kieselgel, welches einer Sol-Gel-Umwandlung unterzogen wurde oder auch andere Hydrogele, die als Wachstumssubstrate für verschiedene Zellen dienen, z. B. Stärke, Agar, Agarose, Elastin usw. sowie deren Kombinationen einsetzbar. Mit einer Mischung aus Matrix und Fluoreszenzfarbstoff werden unter sterilen Bedingungen Glasunterlagen oder andere lichtdurchlässige Unterlagen beschichtet. Nach dem Trocknen der fluorophorhaltigen Matrix sind die Unterlagen in steriler Verpackung lagerstabil. Vor der Testung werden die zu untersuchenden Zellen direkt auf den beschichteten Unterlagen kultiviert, wobei möglichst physiologische Bedingungen (pH, Temperatur, Nährstoffversorgung) einzuhalten sind. Das durch die lebenden Zellen im basolateralen Spalt generierte extrazelluläre Fluoreszenzsignal kann unter dem Fluoreszenzmikroskop bzw. mit Hilfe eines Fluoreszenzplattenreaders erfaßt werden. Die Auswertung der Meßsignale kann auf unterschiedlicher Weise erfolgen:

a) Mikroskopische Einzelzellbewertung oder Bewertung ausgewählter Areale innerhalb einer Zelle, gemessen gegen den nicht mit Zellen bedeckten Hintergrund.
b) Bildanalytische Auswertung aller Zellen im Bildfeld
c) Summensignal der gesamten Fluoreszenzintensität, Voraussetzung ist ein konfluent gewachsener Zellrasen auf der Unterlage

Anstelle eines Fluoreszenzfarbstoffs sind auch andere Farbstoffe, deren Lichtdurchlässigkeit bei einer ausgewählten Wellenlänge von der jeweiligen Ionenkonzentration abhängig, ist einsetzbar.

Das Verfahren und die Vorrichtung ermöglichen den Ersatz von Tierversuchen in der pharmazeutischen Forschung, z. B. im Wirkstoff bzw. Toxizitätsscreening, die individualspezifische Therapieoptimierung hinsichtlich einer Medikamenten-Dosis- und Kombinationsoptimierung unter Nutzung patienteneigener Zellen sowie Schadstoffuntersuchungen im Umweltbereich und in der Nahrungsmittelindustrie.

Ausführungsbeispiel 1. Beschichten von Deckgläschen

1 mg des Fluoreszenzfarbstoffs (SNARF®-1 dextran, Calcium Green™-1 dextran oder 5(and6)chlormethyl SNARF-1) werden in 20 µl HBS (HEPES-gepufferte Salzlösung [12]) gelöst und mit 980 µl der Lösung eines biokompatiblen Polymers (2 mg/ml Collagen oder 0,01% Polylysin) versetzt. Sterile Deckgläschen (Durchmesser 42 mm, Dicke 0,17 mm) werden mit 80 µl der farbstoffhaltigen Polymerlösungen beschichtet und getrocknet.

2. Zellkultur

Adhärente, polare Zellen (z. B. Linsenepithelzellen aus Rinderaugen, CHO-Zellen) werden auf Deckgläschen gemäß 1. eingesät (50000 Zellen/ml) und 24 h bei 37°C vorkultiviert.

3. Fluoreszenzmessungen

Die Fluoreszenzmessungen erfolgen am Laser Scanning Mikroskop (LSM 410, Zeiss). Anregungs- und Emissionswellenlänge(n) richten sich nach den Erfordernissen des gewählten Fluoreszenzfarbstoffs (für SNARF®-1 dextran ist λ_exc = 488 nm und λ_em = 525/660 nm, für Calcium Green™-1 dextran ist λ_exc = 488 nm und λ_em = 535 nm. Im Falle des SNARF®-1 dextran wird das Verhältnis beider Fluoreszenzintensitäten zur pH-Bestimmung verwendet (Dual Emission Dye) [10].

4. Ergebnisse 4.1. pH-Messungen

Nach Zugabe von NH₄Cl (final 10 mmol/l) zur Zellkultur verändern sich die Fluoreszenzintensitäten und damit die pH-Werte wie in den Fig. 1 bis 4 beschrieben.

Nach Zugabe von Fettsäuren (final 25 µmol/l) verändern sich die Fluoreszenzintensitäten und damit die pH-Werte wie in den Fig. 5 und 6 beschrieben.

4.2. Calcium-Messungen

Nach Zugabe von Calciumchlorid (final 10 mmol/l) steigt die extrazelluläre Calciumkonzentration, was aus dem Anstieg der Fluoreszenzintensität hervorgeht (Fig. 7).

Nach Zugabe von Calcimycin in EGTA-haltigem HBS wird das Calcium sowohl aus der polymeren Matrix als auch im basolateralen Bereich entfernt (Fig. 8).

Es zeigen:

Fig. 1 CHO-Zellen auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff: SNARF®-1 dextran Im zellfreien Bereich (○) steigt das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von NH₄Cl (→) an, was einer Verringerung des pH-Wertes entspricht. Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) erfolgt keine Veränderung.

Fig. 2 CHO-Zellen auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff: 5(and6)chlormethyl SNARF®-1 Im zellfreien Bereich (○) steigt das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von NH₄Cl (→) an, was einer Verringerung des pH-Wertes entspricht. Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) erfolgt keine Veränderung.

Fig. 3 bLEC auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff: 5(and6)chlormethyl SNARF®-1 Im zellfreien Bereich (○) steigt das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von NH₄Cl (→) an, was einer Verringerung des pH-Wertes entspricht. Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) erfolgt keine Veränderung.

Fig. 4 bLEC auf Poly-L-Lysin, Fluoreszenzfarbstoff: SNARF®-1 dextran Im zellfreien Bereich (○) steigt das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von NH₄Cl (→) an, was einer Verringerung des pH-Wertes entspricht. Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) erfolgt keine Veränderung.

Fig. 5 bLEC auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff: SNARF®-1 dextran Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) steigt das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von Ölsäure (→) an, was einer Verringerung des pH-Wertes entspricht. Im zellfreien Bereich (○) erfolgt keine Veränderung.

Fig. 6 bLEC auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff: SNARF®-1 dextran Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) steigt das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten nach Zugabe von Linolsäure (→) Stärker an, als im zellfreien Bereich (○).

Fig. 7 bLEC auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff: Calcium Green™-1 dextran Im zellfreien Bereich (○) steigt die Fluoreszenzintensität nach Zugabe von CaCl₂ (→) an, was einer Erhöhung der Calciumkonzentration entspricht. Im basolateralen Bereich der Zellen (⚫) erfolgt nur eine geringe Veränderung.

Fig. 8 bLEC auf Collagen, Fluoreszenzfarbstoff Calcium Green™-1 dextran Aus dem zellfreien Bereich (○) als auch aus dem basolateralen Bereich der Zellen (⚫) wird nach Zugabe von Calcimycin (→) Calcium entfernt. Die Fluoreszenzintesität sinkt auf ein Minimum.

Fig. 9 Geometrie der Meßanordnung

Fig. 10 Aufbau einer kontinuierlich arbeitenden Durchflußmeßzelle

Literatur

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[14] 5104804 Cell assay device used in a microphysiometer Humphries, G. M. K.; Miller, D. L.; Libby, J. M.; Schwartz, H. L.; 1992

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von extrazellulären Ionenkonzentrationen und deren Änderungen im basolateralen Bereich adhhärenter Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf eine Matrix, die einen ionenspezifischen, immobilisierten Fluoreszenzfarbstoff enthält und sich auf einer lichtdurchlässigen Unterlage befindet, aufgebracht werden und die Ionenkonzentration mittels Fluoreszenzmessung erfaßt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration freier Ionen auf der Basis der Fluoreszenzintensitäten, die durch Bestrahlen der adhärenten Zellen mit Licht der Anregungswellenlänge erzeugt werden, gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung diskontinuierlich erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Durchflußverfahren kontinuierlich gemessen wird.

5. Vorrichtung zur Bestimmung von extrazellulären Ionenkonzentrationen und deren Änderungen im basolateralen Bereich adhhärenter Zellen mittels Fluoreszenzmessung, gekennzeichnet durch eine lichtdurchlässige Unterlage, auf die ein ionensensitiver, in einer Matrix immobilisierter Fluoreszenzfarbstoff aufgebracht ist.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet durch Glas als Unterlage.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine lichtdurchlässige Mikrotiterplatte als Unterlage.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 bis 7, gekennzeichnet durch eine polymere, biokompatible, lichtdurchlässige, hydrophile Matrix.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 bis 8, gekennzeichnet durch Collagen oder Polylysin als Matrix.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 bis 8, gekennzeichnet durch kolloidales Kieselgel als Matrix.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 bis 8 und 10, gekennzeichnet durch kolloidales Kieselgel, welches einer Sol-Gel-Umwandlung unterzogen wird und dabei einen festen Überzug auf der Unterlage bildet, als Matrix.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 bis 11, gekennzeichnet durch reaktive, zu kovalenten Bindungen befähigte Fluoreszenzfarbstoffderivate als Fluoreszenzfarbstoff.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 bis 11, gekennzeichnet durch Dextran-konjugierte Farbstoffe als Fluoreszenzfarbstoff.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzintensität die Extinktion ist.