DD292545B5 - Anordnung zur Bildung des Mittelwertes bei der Messung mit Biosensoren - Google Patents

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Signale von substratspezifischen Biosensoren zur Bestimmung von Substanzen in Lösung und wird in der analytischen Chemie, der chemischen Prozeßkontrolle, der Biotechnologie sowie der medizinischen Diagnostik angewendet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Meßsignale von Biosensoren, die über Transdukturelemente auf potentiometrischer oder amperometrischer Grundlage verfügen, werden gewöhnlich mit Hilfe von Empfängern gewonnen, die Potentiostaten oder Galvanostaten zur Grundlage haben, in vereinfachter Form aber auch als übliche Spannungs- oder Strommesser ausgeführt sind („Biosensors" Ed. A. F. Turner, I. Karube, G. S. Wilson, Oxford Univ. Press 1987; „Biosensors International Workshop", GBF Monographs Vol. 10, Braunschweig 1987). Diese Art der Signalwandlung wird auch bei Ausführungen zur Differenzmessung und mit miniaturisierten Elektroden beibehalten („Biosensors" Ed. A. F. Turner, I. Karube, G. S. Wilson, Oxford Univ. Press; „Biosensors International Workshop", GBF Monographs Vol. 10, Braunschweig 1987). Als miniaturisierte Sensoren sind weiterhin ionensensitive Feldeffekttransistoren mit üblicher Transistormeßtechnik bekannt, die mit biologisch aktiven Komponenten gekoppelt wurden (Anal. Chem. 52 [1980] 1935; Chem. Pharm. Bull. 33 [1985] 2556; Anal. Chim. Acta 136 [1982] 93; Anal. Chim. Acta 185 [1986] 179/195; Anal. Lett. 20 [1987] 81/875) und auch in Verfahren zur Differenzmessung zum Einsatz kommen.

(Anal. Chem. 52 [1980] 1935, Proc. Int. Meet, on Chem. Sensors Japan [1983] D 216; Sensors and Actuators 7 [1985] 1; Anal. Sc. Dec. 2 [1986] 517; Proc. 2nd Int. Meet, on Chem. Sens. France [1986] 576; Sensors and Actuators 13 [1988] 165). Aus der DE 2 934 093 C2 ist die Verwendung eines Ringoszillators im Zusammenhang mit frequenzanalogen Sensoren bekannt, indem der Ringoszillator und der Sensor als Einzelbauelemente zusammengeschaltet werden. Die Schaltungsanordnung soll den frequenzanalogen Sensor unempfindlich gegenüber mechanischen und elektrischen Störungen machen.

Nachteil alter bekannten Meßverfahren ist es, daß nur das Signal aus einem Sensorkanal, maximal aus zwei Kanälen in Differenzschaltung simultan verwendet werden kann. Sollen Signale aus mehreren Kanälen verarbeitet werden, kann dies bisher nur mit rechentechnischen Mitteln im time shearing-Prinzip erfolgen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist,eine vergleichsweise einfache Anordnung zu schaffen, die ein sicheres Verfahren bei der Auswertung der Messungen mit statistisch streuenden Biosensoren ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die bisher fehlende statistische Sicherheit der ein- und maximal zweikanaligen Messungen durch ein vielkanaliges Meßverfahren mit einer Aussage zur statistischen Sicherheit möglich zu machen und den apparativen Aufwand, der durch Rechnerschaltungen zur Statistik notwendig wäre, zu verringern. Sie soll die gleichzeitige Messung einer Vielzahl von unabhängig arbeitenden Biosensoren, die auf einem Bauelement integriert und dem gleichen Analyten ausgesetzt sind, ermöglichen.

Zur Lösung dieser Aufgabe werden erfindungsgemäß eine ungerade Zahl von mindestens drei Meßkanälen als Elektroden oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren auf einem Bauelement angeordnet und insgesamt mit einem biologisch aktiven Material z. B. einer Enzymmembran beschichtet. In Abhängigkeit von der Analytkonzentration werden entsprechend bekannten elektrochemischen Prinzipien an den potentiometrischen Elektroden sowie an den Feldeffekttransistoren Spannungen und an den amperometrischen Elektroden Ströme durch die Produkte der biochemischen Stoffwandlung in den aktiven Membranen erzeugt. Diese Primärsignale werden erfindungsgemäß in die Lastkreise eines Ringoszillators implementiert, der so aufgebaut ist, daß sich an die Meßkanäle jeweils eine Schalterstufe einer Ringoszillatorstufe ankoppelt, so daß jeder Meßkanal mit der Schalterstufe zu einer Ringoszillatorstufe ausgebildet ist. Für die Messungen mit den vielkanaligen Elektroden und Multigate-Feldeffekttransistoren werden zur Gewinnung eines Bezugspotentials üblicherweise elektrochemische Bezugselektroden, wie z. B. Kalomel- oder Ag/AgCI-Elektroden, als gemeinsame Referenz benutzt. In diesem Falle ist die Frequenzverstimmung des Ringoszillators mit Eichlösungen des Analyten zu normieren oder ein zweiter Ringoszillator mit Lastkreisen, in denen die Referenz eingekoppelt ist, zu versehen. Dieser zweite Ringoszillator wirkt mit seiner Schwingfrequenz als Referenz.

Auf die voluminösen Bezugselektroden kann verzichtet werden, wenn auf dem gleichen Bauelement oder auch örtlich getrennt in der gleichen Meßlösung eine identische Anordnung von elektrochemischen Sensoren (Multikanalelektroden oder Multigate-ISFET) mit inaktiver Enzym- oder Biomembran oder auch unbeschichtet sowie eine Edelmetallhilfselektrode angeordnet werden, die mit einem zweiten Ringoszillator identisch zur oben beschriebenen Anordnung verknüpft werden. Dieses sensitive Element mißt alle Störgrößen in gleicher Weise wie das vorher beschriebene aber nicht die durch die biochemische Umsetzung des Analyten hervorgerufene erwünschte Meßgröße und kann daher als Referenzsignal genutzt werden.

Prinzipiell ist es auch möglich, mit dem zweiten Ringoszillator eine in der Meßlösung in konstanter Konzentration gehaltene Substanz als Referenzgröße zu erfassen, auf die der erste Ringoszillator nicht anspricht. Die Anwendung der letzteren Variante ermöglicht es, auf das bei Differenzmessungen übliche strukturierte Beschichten mit biologisch aktiven Komponenten zugunsten einer technologisch einfacheren homogenen Beschichtung über alle Bauelemente zu verzichten. Der Vorteil der Erfindung besteht darin, daß simultan und parallel eine große Zahl von elektrochemischen Meßkanälen erfaßt und ohne zusätzlichen rechentechnischen Aufwand zum präzisionsverbessernden Mittelwert verarbeitet werden. Der hohe Integrationsgrad des Ringoszillators ermöglicht vorteilhaft eine Kombination mit Sensorelementen in Chiptechnologie. Das Verfahren ist weiter vorteilhaft als Differenzmeßverfahren auszuführen und spart in diesem Fall den Aufwand für diskrete Referenzelemente.

Ausführungsbeispiele

Figur 1 zeigt fünf Meßkanäle 1 bis 5. Sie bestehen aus je einem Teilsensor 6, der als ionensensitiver Feldeffekttransistor ausgebildet ist, und einer an ihm angeschlossenen MOS-Transistorschaltstufe 7. Alle MOS-Transistorstufen 7 sind zu einem Ringoszillator zusammengeschaltet, der die Frequenz f_A abgibt. Der Widerstand R und die Kapazitäten C sind frequenzbestimmend.

Beispiel 1

Ein ionensensitiver Feldeffekttransistor mit fünf Gates (Teilsensoren 6), die als Meßkanäle wirken, wird an fünf MOS-Transistorschaltstufen 7 eines Ringoszillators angekoppelt (Figur 1).

Auf den zur Meßlösung offenen Gates der ionensensitiven FETs wird eine homogene Schicht mit 0,25 U/cm² immobilisierter Glucoseoxidase GOD aufgebracht. Der Sensor wird in einer gerührten Meßzelle mit 2 ml einer Lösung von 100 mmol/l in ЮО^тоІ/І Phosphatpuffer pH 6,2 fixiert.

Das Gate-Potential der pH-Transistoren wird gegen das Referenzpotential einer separaten Kalomelelektrode in der Meßlösung auf den Arbeitspunkt eingestellt und nach dem Erreichen einer konstanten Potentialdifferenz werden 20 μΙ einer Glucoselösung zugegeben. Die Änderung der Frequenz des Ringoszillators wird erfaßt, die Meßzelle gereert, gespült und für die nächste Messung gefüllt. Auf diese Weise werden Glucose-Standardlösungen von 0,01 mmol/l, 0,1 mmol/l von 0,5 mmol/l, 1 mmol/l und 3 mmol/l gemessen und eine Glucose-Eichkurve erstellt. Zur Bestimmung des Glucosegehaltes einer unbekannten Probe werden 20 μΙ dieser Probe in die Meßzelle mit 2 ml einer Lösung von 100 mmol/l NaCI in 100 mmol/l Phosphatpuffer pH 6,2 gegeben, aus der Frequenzveränderung kann mit Hilfe der Eichkurve auf die gesuchte Glucosekonzentration als statistisches Mittel der Meßwerte der fünf Meßkanäle (Teilsensoren 6) geschlossen werden. Dabei ist die Summe der Zeitverzögerungen der Meßkanäle reziprok proportional der doppelten Frequenz des Ringoszillators. Dividiert durch die Anzahl fünf der Meßkanäle bzw. Ringoszillatorstufen ergibt sich der Mittelwert der Messung.

Beispiel 2

Eine enzymbeschichtete Sensoranordnung entsprechend Beispiel 1 wird gemeinsam mit einer identischen aber mit inaktiver GOD beschichteten Sensoranordnung und mit einer separaten oder integrierten Goldhilfselektrode zur Potentialbildung der ISFETs in eine gerührte Meßzelle eingebracht. Zur Ermittlung des glucoseabhängigen Meßsignals wird die Differenzfrequenz der Ringoszillatoren beider Sensoranordnungen bestimmt und wie in Beispiel 1 geeicht.

Beispiel 3

Ein ionensensitiver Multigate-Feldeffekttransistor, bestehend aus drei protonen- und drei fluoridsensitiven Feldeffekttransistoren wird homogen mit einem Gemisch von 0,1 U/cm² Lactatoxidase und 0,4 U/cm² Peroxidase beschichtet und gemeinsam mit einer separaten oder integrierten Feldhilfselektrode in eine gerührte Meßzelle eingebracht. Die zur Hilfselektrode eingestellten Potentiale der pH- und der pF-FETs werden getrennt je einem Ringoszillator entsprechend Beispiel 1 eingekoppelt. In 0,1 mol/l Phosphatpuffer wird das konstante Ausgangssignal der pH-FETs gegen das von der

Lactatkonzentration abhängige Signal der pH-FETs zur Differenzbildung analog Beispiel 2 genutzt. Zur Ermittlung der Lactat-Eichkurve werden die Meßgrößen für Lösungen von 100 pmol/l, 200 pmol/l, 500 μιηοΙ/Ι, Immol/I, 2 mmol/l und 10 mmol/l Lactat in 100 mmol/l Phosphatpuffer pH 6,8 mit 10 mmol/l Pentafluorphenol sowie 100 mmol/l NaCI registriert. Zur Ermittlung des Lactatgehaltes einer unbekannten Probe werden 20 μΙ der Meßprobe in die mit 2 ml einer Lösung von 10 mmol/l Pentafluorphenol und 100 mmol/l NaCI in 100 mmol/l Phosphatpuffer pH 6,8 gefüllte Meßzelle gegeben. Aus den Differenzsignalen kann mit Hilfe der Lactat-Eichkurve der gesuchte Lactatgehalt ermittelt werden.

Beispiel 4

Eine Array aus 25 Platinelektroden auf einem Si-Chip mit gemeinsamer Pt-Gegenelektrode wird entsprechend Beispiel 1 beschichtet und gemeinsam mit einer Kalomelhilfselektrode eine gerührte Meßzelle positioniert. Jede der 25 Elektroden wird an einen Ringoszillator über die Elektroden der Schalttransistoren angekoppelt. Die weitere Signalgewinnung und die Glucoseeichung erfolgen entsprechend Beispiel 1.

Beispiel 5

Die Elektroden-Sensoranordnung mit Ringoszillator wie in Beispiel 4 beschrieben wird zur Differenzmessung mit einer zweiten identischen Elektroden-Sensoranordnung mit Ringoszillator kombiniert, wobei die Beschichtung analog der der beiden FET-Sensorelemente in Beispiel 2, ausgeführt wird. Die Differenz der Frequenzen der beiden Ringoszillatoren wird, wie in Beispiel 2, zur Eichung und Glucosemessung genutzt.

Claims (3)

1. Anordnung zur Bildung des Mittelwertes bei der Messung mit Biosensoren, bei welchen elektrochemisch aktive Sensoren mit einem Film aus immobilisierten biologisch aktiven Komponenten überzogen sind, welche bei Reaktion mit einem Analyt elektrochemisch aktive Produkte bilden, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung eines gemittelten Meßsignals (f_A) als Frequenzänderung proportional dem zu messenden Analyten ein

Ringoszillator verwendet wird, an dessen Schalterstufen (7) die in mehrere ungeradzahlige Meßkanäle aufgeteilten elektrochemischen Sensoren (6) gekoppelt sind.

2. Anordnung zur Bildung des Mittelwertes bei der Messung mit Biosensoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Produkte, deren Konzentration sich im Ergebnis der Reaktionen zwischen dem Film und dem Analyt verändert, auf den aktiven sensoraktiven Gebieten von ISFET oder Elektroden meßbar sind.

3. Anordnung zur Bildung des Mittelwertes bei der Messung mit Biosensoren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine biochemisch aktive und eine biochemisch inaktive Sensoranordnung mit je einem Ringoszillator zur Differenzbildung zusammengeschaltet sind.