DD239672A5

DD239672A5 - PROCESS FOR THE FRONTAL IDENTIFICATION OF PLANT DISEASES

Info

Publication number: DD239672A5
Application number: DD27924885A
Authority: DD
Inventors: Juergen Schumacher; Detlev Riesner
Original assignee: Schumacher,Juergen,De; Riesner,Detlev,De
Priority date: 1984-08-01
Filing date: 1985-08-01
Publication date: 1986-10-01

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Frueherkennung von Pflanzenkrankheiten. Es konnte gezeigt werden, dass in geschaedigten Pflanzen typische Veraenderungen im Nukleinsaeuremuster vorhanden sind. Unabhaengig vom Standort und Alter der Pflanzen treten bei zweidimensionaler gelenktrophoretischer Auftrennung der Nukleinsaeuren zusaetzliche Banden auf. Auf diese zusaetzlichen Nukleinsaeuren kann z. B. mit molekularen Hybridisierungstechniken getestet werden. Damit werden objektive Fruehdiagnosen, die rechtzeitige Gegenmassnahmen erlauben, sowie grossflaechige Kartierungen der Pflanzenschaeden, moeglich. Der Test ist zudem sehr einfach und eignet sich fuer Reihenuntersuchungen.The invention relates to a method for the early detection of plant diseases. It could be shown that in damaged plants typical changes in the nucleic acid pattern are present. Independent of the location and age of the plants, additional bands appear in two-dimensional gel-electrophoretic separation of the nucleic acids. On these additional nucleic acids z. B. be tested with molecular hybridization techniques. This enables objective early diagnosis, which allows timely countermeasures, as well as large-scale mapping of plant damage. The test is also very simple and is suitable for screening.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen .For this 2 pages drawings.

Field of application of the invention

Bei der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Früherkennung von Pflanzenkrankheiten, bei dem die Nukleinsäureextrakte aus gesunden und kranken Pflanzen miteinander verglichen werden und aus dem Auftreten oder der Abwesenheit bestimmter Nukleinsäuremoleküle auf den Gesundheitszustand der Pflanzen geschlossen werden kann.The invention relates to a method for the early detection of plant diseases in which the nucleic acid extracts from healthy and diseased plants are compared with each other and can be concluded from the occurrence or absence of certain nucleic acid molecules on the health of the plants.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen 'Characteristic of the known technical solutions'

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Die Früherkennung von Pflanzenkrankheiten ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Land- und Forstwirtschaft. In den letzten zehn Jahren wurden in Mitteleuropa zunehmend neuartige Erkrankungen an Waldbäumen beobachtet, die unter dem Begriff „Waldsterben" bekannt geworden sind. Trotz verstärkter Forschungen auf diesem Gebiet ist die Ursache der Erkrankungen und damit natürlich eine mögliche Therapie nicht eindeutig bekannt. Die Hauptschuld am Waldsterben wird zur Zeit der Luftverschmutzung gegeben. Hauptsächlich der saure Regen sowie hohe Konzentrationen an Ozon und Stickoxyden werden für die Erkrankungen verantwortlich gemacht. In zunehmenden Maße werden auch Infektionseinflüsse z. B. Pilze und Viren als mögliche Ursachen diskutiert. . The early detection of plant diseases is of great economic importance to agriculture and forestry. In the last ten years, more and more novel diseases have been detected in forest trees in Europe, known as "forest dying." Despite increased research in this area, the cause of the disease and, of course, possible therapy is not clearly known Forest fatality is presently the subject of air pollution, with acid rain and high levels of ozone and nitric oxide being blamed for the disease, and infections such as fungi and viruses are increasingly being discussed as possible causes.

Die Verluste durch Waldsterben wachsen mittlerweile in erschreckender Höhe. Von den insgesamt über 7 Millionen Hektar Waldfläche in der Bundesrepublik sind inzwischen etwa 40% geschädigt, das entspricht einem Vermögenswert von ungefähr 70 Milliarden DM. Die Tendenz ist weiter steigend. Damit sind auch die Arbeitsplätze der 800000 in der Forstwirtschaft Beschäftigten gefährdet. In absehbarer Zeit wird kein gesunder Baum mehr gefällt werden können, da zunächst die erkrankten_c Bäume herausgeschlagen werden müssen. Die Auswirkungen dieser Entwicklung auf die Holzwirtschaft sind noch nicht abzusehen. ' .The losses caused by forest dying are now growing to alarming levels. Of the total of more than 7 million hectares of forest land in the Federal Republic, about 40% are now damaged, which corresponds to an asset of about 70 billion DM. The trend is still rising. This puts the jobs of the 800,000 workers in the forestry sector at risk. In the foreseeable future, no healthy tree will be able to be felled anymore, because first the sick _c trees have to be knocked out. The effects of this development on the timber industry are not yet in sight. '.

Im Bereich der Landwirtschaft werden Infektionskrankheiten immer schwerwiegender. Dies ist unter anderem eine Folge des Anbäus hochveredelter Sorten in Monokulturen. Aktuelle Beispiele sind Pilzkrankheiten bei Getreide, Viruskrankheiten bei Kartoffeln, Zuckerrüben und Obstbäumen.In the field of agriculture, infectious diseases are becoming increasingly serious. This is, among other things, a consequence of the cultivation of highly refined varieties in monocultures. Current examples are fungal diseases in cereals, virus diseases in potatoes, sugar beets and fruit trees.

Um Schadenserhebungen bei Walderkrankungen durchzuführen sowie Aussagen über Art und Weise der Ausbreitung der Krankheit zu erhalten, ist es notwendig, in bestimmten Zeitintervallen den Zustand der Bäume zu überprüfen. Hierzu werden die Baumbestände von Forstbeamten in Augenschein genommen und in drei Schadstufen eingeteilt. Kriterien für die Beurteilung stellen dabei z.B. der Benadelungs- und Belaubungszustand der Kronen, Verfärbung von Nadeln und Blättern, sogenannte Angsttriebe sowie Veränderungen von Stamm und Rinde dar. Da die Symptonausprägung aber nur in den wenigsten Fällen eindeutig ist, muß die Einteilung in die Schadstufen subjektiv erfolgen. Auch eine Beurteilung des Waldzustandes aus der Luft mit Hilfe von Infrarotaufnahmen ist nicht ausreichend. Jüngere Bäume können mit dieser Technik z.B. nicht beurteilt werden. Gerade bei solchen Bäumen wäre eine objektive Beurteilung wünschenswert. Könnte (nan bereits bei Setzlingen erkennen, ob sie erkrankt sind, so könnte man sie rechtzeitig durch gesunde Pflanzen ersetzen ohne weiteren nutzlosen Kultivierungsaufwand.In order to carry out damage assessments in forest diseases as well as to obtain information about the way in which the disease spreads, it is necessary to check the condition of the trees at certain time intervals. For this purpose, the tree stands of forest officials are inspected and divided into three levels of damage. Criteria for the assessment are e.g. The Benadelungs- and foliage state of the crowns, discoloration of needles and leaves, so-called fear impulses and changes in the trunk and bark dar. Since the symptom manifestation is only in very few cases clearly, the classification into the damage levels must be subjective. Also an assessment of the forest condition from the air with the help of infrared images is not sufficient. Younger trees can be treated with this technique e.g. not be judged. Especially with such trees, an objective assessment would be desirable. If nan could already detect in saplings whether they are ill, they could be replaced by healthy plants in good time without further unnecessary cultivation effort.

Die Diagnose von Krankheiten bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen kann durch die Beurteilung der Symptomausprägung an den Pflanzen direkt oder nach Übertragung der Krankheit auf Testpflanzen erfolgen. Dieses Verfahren ist langwierig und subjektiven Einflüssen unterworfen. Durch geschultes Personal unter Verwendung von erheblichem apparativen Aufwand wie Mikroskop oder Elektronenmikroskop sind Diagnosen auch möglich. Die neueren immunologischen Verfahren, die hauptsächlich bei Viruserkranküngen Anwendungen finden, setzen eine gute Charakterisierung der Krankheitserreger voraus und werden oft durch die Pflanzeninhaltstoffe in ihrer Aussagekraft stark beeinträchtigt.The diagnosis of diseases in agricultural crops can be made by assessing the symptom severity of the plants directly or after transmission of the disease to test plants. This process is lengthy and subject to subjective influences. By trained personnel using considerable expenditure on equipment such as microscope or electron microscope diagnoses are also possible. The newer immunological methods, which are mainly found in viral diseases applications, require a good characterization of the pathogens and are often severely impaired by the plant ingredients in their informative value.

Ziel der Erfindung . . Object of the invention. ,

Mit der Erfindung sollen die Mangel des Standes der Technik beseitigt werden. Konkret soll ein gelektrophoretisches Verfahren bereitgestellt werden, mit dem u.a. eine sichere Unterscheidung zwischen kranken und gesunden Bäumen sehr frühzeitig möglich ist.With the invention, the deficiency of the prior art should be eliminated. Specifically, a gel electrophoretic method is to be provided, with the u.a. A safe distinction between sick and healthy trees is possible very early.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Erfindungsgemäß wird dieses Ziel dadurch erreicht, daß man Unterschiede im Nukleinsäuremuster zwischen kranken und gesunden Pflanzen zur Erkennung ausnutzt.According to the invention, this goal is achieved by exploiting differences in the nucleic acid pattern between diseased and healthy plants for detection.

Ausführungsbeispieleembodiments

Eine erfindungsgemäße gelektrophoretische Untersuchung ist beispielhaft in Fig. 1 dargestellt. Hierzu wurden jeweils 1 g Kiefernnadeln von einem augenscheinlich gesunden bzw. kranken Baum in einem Tris-HCL Puffer bei pH 8,0 und einer ionenstärke von 10OmM in Gegenwartvon2%SDSund25mM Mercaptoethanol zusammen mit Phenol und Chloroform in einem Ultra Turrax homogenisiert. Nach Filtration und Reextraktion mit PhenohChloroform wurde die Nukieinsäure aus dem Pflanzenextrakt durch Zugabe von Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde in 20OuI Elektrophoresepuffer gelöst. Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte in einer zweidimensionalen 5% Polyacrylamid-Gelektrophorese, wobei sie zunächst unter denaturierenden Bedingungen bei'8M Harnstoff und 5O⁰C und dann in der 2-Dimension ohne Harnstoff bei 2O⁰C liefen. Das Gel wurde anschließend mit Silbernitrat gefärbt. Deutlich ist in der Probe des erkrankten Baumes (Fig. 1 b) die durch den Pfeil markierte Bande zusätzlich zu den Banden der Probe des gesunden Baumes (Fig. 1a) erkennbar. Überraschenderweise zeigte sich, daß diese zusätzlichen Nukleinsäuren unabhängig vom Standort und Alter der Kiefern in allen vom „Waldsterben" betroffenen Bäumen nachgewiesen werden können. Ebenfalls deutliche Unterschiede im Bandenmuster nach der zweidimensionalen Gelektrophorese konnten inzwischen auch bei erkrankten Fichten und Buchen gefunden werden. in ähnlicherWeise kann das Verfahren auf die Diagnose von Krankheiten landwirtschaftlicher Nutzpflanzen angewendet werden. Beispiele hierfür sind Viruskrankheiten, welche bei Getreide, Kartoffeln,'Zuckerrüben, Obstbäumen und Weinreben auftreten. Das beschriebene Verfahren wurde bisher erfolgreich bei der Rizomania-Krankheit von Zuckerrüben, die durch das Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) hervorgerufen wird, und bei der Ademvergilbung von Äpfeln, die durch nicht charakterisierte Viren hervorgerufen wird, angewendet. Durch das weiter unten beschriebene Verfahren der Extraktion mit Hilfe eines wäßrigen Zweiphasensystems ist die durch die Krankheit verursachte zusätzliche Nukleinsäurebande bereits in der eindimensionalen Gelektrophorese sichtbar. Das Ergebnis ist durch Fig.2 belegt; die zusätzliche Bande in der Probe der kranken Pf lanze {linke Seite) im Vergleich zur Probe der gesunden Pflanze (rechte Seite) ist durch einen Pfeil markiert. Mit Hilfe des erwähnten wäßrigen Zweiphasensystems kann die Exktraktion der Nukleinsäuren mit großem Vorteil durchgeführt werden. Insbesondere, hat sich ein solches wäßriges Zweiphasensystem als geeignet erwiesen, das einerseits aus einer wäßrigen J-ösung eines neutralen Salzes und andererseits aus einer wäßrigen Polyethylenglykollösung besteht, wobei sich die Nukleinsäuren in der anderen, also der Solephase ansammeln. Beispielsweise werden dazu die durch Zugabe von Ethanol gefällten Nukleinsäuren in 8 Teilen H₂O gelöst und mit 21 Teilen 30% (w/w) Kaliumphosphat und 11 Teilen 30% (w/w) Polyethylenglykol 6000 gemischt. Zur Phasentrennung wird die Lösung kurz zentrifugiert. Die Nukleinsäuren befinden sich quantitativ in der unteren, der Salzphase, aus der sie rnit'0,1 % Cetyltrimethylammoniumbormid (CTAB) für 30min auf Eis ausgefällt werden. Der Cetyltrimthylammoniumbormid-Niederschlag wird zweimal mti 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in H₂O aufgenommen. Die Reinigung der Nukleinsäuren von den störenden Pflanzeninhaltsstoffen ist dabei so effektiv, daß Unterschiede im Nukleinsäuremuster bereits in der eindimensionalen Gelektrophorese sichtbar werden (s. Fig. 2). Die Verwendung der Extraktion mit Hilfe des wäßrigen Zweiphasensystems erspart bei allen Folgeschritten zusätzliche Reinigungsprozeduren.' . A gelectrophoretic examination according to the invention is shown by way of example in FIG. For this purpose, in each case 1 g of pine needles from an apparently healthy or unhealthy tree were homogenized in a Tris-HCl buffer at pH 8.0 and an ionic strength of 10 mM in the presence of 2% SDS and 25 mM mercaptoethanol together with phenol and chloroform in an Ultra Turrax. After filtration and re-extraction with phenol chloroform, the nucleic acid was precipitated from the plant extract by adding ethanol. The precipitate was dissolved in 20 μl of electrophoresis buffer. The separation of the nucleic acids was carried out in a two-dimensional 5% polyacrylamide gel electrophoresis, where they bei'8M urea and 5O ⁰ C, and then ran in the 2-dimension without urea at 2O ⁰ C initially under denaturing conditions. The gel was then stained with silver nitrate. Significantly, in the sample of the diseased tree (Figure 1 b), the band marked by the arrow can be seen in addition to the bands of the sample of the healthy tree (Figure 1a). Surprisingly, it was found that these additional nucleic acids can be detected independently of the location and age of the pines in all trees affected by "forest dying." Similar differences in the band pattern after the two-dimensional gel electrophoresis could also be found in diseased spruces and beech The method can be applied to the diagnosis of diseases of agricultural crops, for example virus diseases, which occur in cereals, potatoes, sugar beets, fruit trees and vines.This method has been successful so far in the Rizomania disease of sugar beet produced by the Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV), and in the yellowing of apples caused by uncharacterised viruses, by the method of extraction with an aqueous biphasic system described below The additional nucleic acid band caused by the disease is already visible in one-dimensional gel electrophoresis. The result is occupied by FIG. the additional band in the specimen of the diseased plant (left side) compared to the sample of the healthy plant (right side) is marked by an arrow. With the aid of the mentioned aqueous two-phase system, the extraction of the nucleic acids can be carried out with great advantage. In particular, such an aqueous two-phase system has proven to be suitable, which consists on the one hand of an aqueous solution of a neutral neutral salt and on the other hand of an aqueous polyethylene glycol solution, wherein the nucleic acids accumulate in the other, ie the brine phase. For example, the nucleic acids precipitated by the addition of ethanol are dissolved in 8 parts of H ₂ O and mixed with 21 parts of 30% (w / w) potassium phosphate and 11 parts of 30% (w / w) polyethylene glycol 6000. For phase separation, the solution is briefly centrifuged. The nucleic acids are quantitatively in the lower, the salt phase, from which they are precipitated with ice with 0.1% cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) for 30 min. The Cetyltrimthylammoniumbormid precipitate is washed twice with 70% ethanol, dried and taken up in H ₂ O. The purification of the nucleic acids from the disturbing plant constituents is so effective that differences in the nucleic acid pattern are already visible in the one-dimensional gel electrophoresis (see Fig. 2). The use of the extraction with the aid of the aqueous two-phase system saves additional cleaning procedures in all subsequent steps. ,

Es ist durchaus möglich, die Untersuchungen auf eine bestimmte RNA bzw. Nukleinsäuresequenz nicht nur gelektrophoretisch, sondern auch mit Hilfe moderner molekularer Hybridisierungstechniken durchzuführen. Findet sich dann in Blatt-oder Nadelproben eine solche Nukieinsäure, wie im vorgestellten Beispiel die zusätzliche RNA in Kieferngewerbe, so kann davon ausgegangen werden, daß der Baum erkrankt ist, auch wenn eine sichbare Sympto'nausprägung noch nicht stattgefunden hat. Damit erlaubt der Test eine objektive Früherkennung und Kartierung der Schaden, Bäume können rechtzeitig gefällt werden, bevor eine Minderung der Holzqualität, bedingt durch die Krankheit, eingesetzt hat. Resistente oder resistentere Bäume können frühzeitig erkannt werden. DerTest ist zudem sehr einfach und schnell durchzuführen und eignetsich für Reihenuntersuchungen einiger Hundert Bäume pro Tag pro untersuchende Person.It is quite possible to carry out the investigations on a specific RNA or nucleic acid sequence not only by gel electrophoresis but also by means of modern molecular hybridization techniques. If such nucleic acid is found in leaf or needle samples, as in the example presented, the additional RNA in the pine industry, it can be assumed that the tree is diseased, even if a visible symptomatology has not yet taken place. Thus, the test allows an objective early detection and mapping of the damage, trees can be felled in good time, before a reduction in the quality of wood caused by the disease has set. Resistant or more resistant trees can be detected early. The test is also very simple and quick to perform, and is suitable for screening hundreds of trees a day per examiner.

Claims

Claims: ~ · '

1. A method for the detection of plant diseases, characterized in that differences in the nucleic acid pattern between diseased and healthy plants are exploited for detection.

2. VerzerTTtach claim 1, characterized in that the serves for the detection of forest damage and differences in the nucleic acid pattern between diseased and healthy trees are used for detection.

3. Process according to claims 1 to 2, characterized in that the differences can be exploited before expression of the disease symptoms.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the differences can be detected by gel electrophoresis.

5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the differences can be detected by means of a two-dimensional gel electrophoresis in conjunction with a silver stain.

6. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the differences can be detected by means of molecular hybridization techniques. ,

7. Process according to claims 1 to 3 and 6, characterized in that the differences can be detected by means of dot blot hybridization. ,

A method according to claims 1 to 2, 6 and 7, characterized in that the hybridization probe used is the complementary sequence of one of the bands present in the diseased plant, absent in the healthy plant. '

9. A method for the extraction of nucleic acid from plants, in particular for a method according to one of claims 1 to 8, characterized in that an aqueous two-phase system is used. ,