CZ376199A3

CZ376199A3 - Izolovaný polynukleotid který kóduje savčí Z cyto 7 polypeptid expresívní vektor, " protilátka a způsob její přípravy

Info

Publication number: CZ376199A3
Application number: CZ19993761A
Authority: CZ
Inventors: Scott R. Presnell; Terasa Gilbert; Theodore E. Whitmore; Donald C. Foster; Charles E. Hart; Joyce M. Lehner; Theresa Martinez; Ross C. Hoffmann
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2000-03-15

Abstract

Nové savčí Z cyto 7 polypeptidy, polynukleotidy kódující polypeptidy a příbuzné sloučeniny a metody zahrnující protilátky a anti-idiotypické protilátky.

Description

Izolovaný polynukleotid, který kóduje savci Z cyto 7 polypeptid, expresívní vektor, protilátka a způsob její přípravy

Oblast techniky

Tento vynález patří do skupiny růstových faktorů, cytokininů, ovlivňujících buněčný metabolizmus svou vazbou na protein, tj. působí zejména na proliferaci a diferenciaci buněk, zejména na proliferaci a diferenciaci buněk. Cytokininy jsou důležité při obnově normálních hladin, krevních buněk u pacientů trpících anemií nebo podstupujících chemoterapii nádorových onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Proliferace a diferenciace buněk mnohobuněčných organizmů je řízena hormony a polypeptidy růstových faktorů. Tyto difosní molekuly umožňují buňkám vzájemně komunikovat a fungovat ve vzájemné souhře ph tvorbě a regeneraci poškozených tkání. Příklady hormonů a růstových faktorů včetně steroidních hormonů (např. estrogen, testosteron), paraíhyroidní hormon, folikuly stimulující hormon, interleukiny, z krevních destiček odvozený růstový' faktor (PDGF = platelet derived growth factor), epidermální růstový faktor (EGF = epidermal growth factor), granuíocyi ~ makrofág kolonie stimulující faktor (GM - CSF), erythropoietin (EPO) a kaícitonin.

Hormony a růstové faktory ovlivňují buněčný metaholizmus vazbou na proteiny. Těmito proteiny mohou být integrální membránové proteiny', jež jsou napojeny na signální cesty v buňkách, tak jako druhé medíátorové systémy. Ostatní třídy proteinu jsou rozpustné molekuly stejně jako transkrípční faktory.

-2• · · ·

Středem zvláštního zájmu jsou cytokininy, molekuly, které podporují proliferaci a/nebo diferenciaci buněk. Příklady cytokininů zahrnují erythropoetin (EPO), který stimuluje vývoj červených krvinek, ihrombopoetin (TPO), který stimuluje vývoj buněčných linií makrofágú a granulocytové kolonie stimulující faktor (G-CSF), který stimuluje vývoj neutrofilů. Tyto cytokininy jsou důležité při obnově normálních hladin krevních buněk u pacientu trpících anemii nebo podstupujících chemoterapii nádorových onemocnění. Aktivity těchto cytokininů demonstrované in vivo představují jejich obrovský klinický potenciál a potřebu dalších cytokininů, cytokinin agonistů. a cytokinín antagonistu.

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález se obrací na tuto potřebu zajištění nového polypeptidů nazvaného cytokininů podobný faktor 7 (cytokinine-Iike factor 7),' dále zde uváděný jako Z cyto 7 a příbuzné sloučeniny a metody.

Tedy jednou stránkou navrho vaného vynálezu je zajistit izolovaný Z cyto 7 polypeptid mající sekvence aminokyselin, jak je dále uvedeno. Jsou známy lidská i myší cDNA. Lidské sekvence jsou definovány SEQ ID č. I a 2. Myší nukleotid a sekvence aminokyselin jsou definovány SEQ ÍD č. 11 a 12.

Nukleotidová sekvence SEQ ID č. 1 obsahuje otevřený Čtecí rámec kódující polypeptid s přibližné 180 aminokyselinami s počátečním Met, jak je vidět v SEQ ÍD č. 1 a SEQ ID č. 2. Předpovězená. signální sekvence je složena z aminokyselinových zbytků 1 až 20 a výsledný předpokládaný zralý Z cyto 7 , polypeptid je reprezentován sekvencí aminokyselin sahající od zbytku aminokyseliny 21, glutaminu ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 fenylalaninu,-též reprezentovaný SEQ ID č. 14. Údaje mapující peptidy ukazují, že zralý Z cyto 7 může být složen z mnoha N-koncových zralých variant obsahujících sekvence aminokyselin sahající od zbytku aminokyseliny 23·, argininu ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 SEQ ID c. 2, též definovaného SEQ ÍD č. 36; sekvenci aminokyselin sahající od zbytku aminokyseliny 27 šermu ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 SEQ ID c. 2, též definovaného SEQ ID č. 37; sekvence aminokyselin definované zbytkem aminokyseliny 30, lysmem ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 SEQ ÍD č. 2,

9 · · <9999999 • 9 · 9 9 9 ···· 9 ··· ···· ·· ·· též. definovaného SEQ ID č, 38: sekvence aminokyselin. sahající od aminokyseliny 28 lysinu ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 SEQ ID č. 2, také definovaný SEQ ID č. 41 a sekvence aminokyselin sahající od zbytku aminokyseliny 53 meťhioninu ke a včetně zbytku aminokyseliny 180, také definovaný SBQ ID ě. 42, Jediné pozorované štěpení na karboxyiovém konci je fenylalanin v poloze 180, který může být odštěpen. To se může stát u všech výše definovaných zralých Z eyto 7 polypeptidů, jejichž příklad je ukázán SEQ ID č. 43. Další varianty lidského Z cyto Ί jsou definovány SEQ ID č. 15 až 25. V dodatečném vyjádření obsahuje dále polypeptid afinitní přívěsek.

SEQ ID č. 11 a 12 definují myší Z cyto 7, kde zralý protein sahá od aminokyselinových zbytků zbytku aminokyseliny 21 histidinu ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 fenylalaninu, také definovaný SEQ ID č. 39 nebo jako náhradního spojovacího místa od zbytku aminokyseliny 23, argíninu, ke a včetně zbytku aminokyseliny 180 také definovaný SEQ ID č. 40. Navrhovaný vynález je též tvořen polypeptidy, které mají sekvenci aminokyselin alespoň z 90 % identickou, raději z 95 %, 97 % nebo 99 % identickou s výše definovanými Z cyto 7 polypeptidy.

Další vyjádření navrhovaného vynálezu se týká peptidů nebo polypeptidu, jehož aminokyselinová sekvence epitop nesoucí část Z cyto 7 polypeptidu má výše popsanou sekvenci aminokyselin. Peptidy nebo polypeptidy mající sekvencí aminokyselin epitop nesoucí části Z cyto 7 polypeptidu navrhovaného vynálezu včetně Částí takových polypeptidů. s alespoň devíti, raději alespoň 15a více, nejlépe alespoň 30 až 50 aminokyselinami, ačkoli epitop nesoucí polypeptidyjakékoli délky až do a včetně úplné sekvence aminokyselin polypeptidu navrhovaného vynálezu popsaného výše jsou též obsaženy v prezentovaném vynálezu. Příklady uvedených polypeptidů jsou definovány sekvencemi aminokyselin SEQ ID č. 25 - 35. Jsou. též nárokovány kterékoli z těch polypeptidů,, jež jsou připojeny k jinému polypeptidu nebo nosné molekule.

Navrhovaný vynález dále obsahuje polypeptid definovaný SEQ ID č. 15 až 25, kde aminové konce uvedených polypeptidů jsou modifikovány a začínají buď u zbytku aminokyseliny 3, argininem; zbytku aminokyseliny 7, serinem; zbytku aminokyseliny 8, lysinem; zbytku aminokyseliny 10, lysinem nebo zbytku aminokyseliny 33 methioninem.

Navrhovaný vynález dále obsahuje polypeptid, kde polypeptid je polypeptid definovaný SEQ ID č. 2,12, i 4 až 25 a 36 až 42, přičemž sekvence aminokyselin končí u isoleucinu při zbytku aminokyselin 179 SEQ ID č. 2, u zbytku aminokyselin 159 SEQ ÍD č. 14 až 25, který odpovídá zbytku aminokyselin 157 SEQ ÍD č. 36, zbytku aminokyselin 153 SEQ ID č. 37, zbytku aminokyselin 150 SEQ ID č. 38, zbytku aminokyselin 159 SEQ ÍD č. 39, zbytku aminokyselin 157 SEQ ID č. 40, zbytku aminokyselin 1.52 SEQ ID č. 42, zbytku aminokyselin 127 SEQ ID č. 42.

Navrhovaný vynález dále obsahuje izolovaný peptid nebo polypeptid z výše popsaných peptidů nebo polypeptid mající sekvenci aminokyselin modifikovanou adicí, delecí a/nebo přemístěním jednoho nebo více zbytků, aminokyselin a který řídí biologickou aktivitu uvedeného peptidu nebo polypeptidů.

Dalším zřetelem vynálezu je zajistit chimérický polypeptid skládající se nezbytně z první a druhé části spojených peptidovou vazbou. První část chimérického polypeptidů obsahuje nezbytně (a) Z cyto 7' polypeptid, jak je popsán výše, (b) aílelické varianty výše popsaných polypeptidů. Druhá Část chimérického polypeptidů obsahuje nezbytně jiný polypeptid tak jako afinitní přívěsek. V jednom vyjádření je afimtnim přívěskem imunoglobuiin F_cpolypeptid. Vynález též zajišťuje expresívní vektory kódované chimérickými polypeptidy a hostitelské buňky transfektované pro produkci chimérických polypeptidů.

Další aspekt navrhovaného vynálezu opatřuje pro izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující polynukleotid vybraný ze skupiny sestávající z: (a) nukleotidové sekvence kódující výše popsané Z cyto 7 polypeptidy; (b) nukleotidové sekvence kódující polypeptidy SEQ ID č. 14 až 40 a (c) nukleotidové sekvence komplementární. ke kterékoli z nukleotidových sekvencí v (a) nebo (b).

• · • · · ·

-5Následující vyjádřeni vynálezu zahrnuje izolované molekuly nukleové * kyseliny, která obsahuje polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci alespoň z 90 % identickou, raději z 95 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identickou ke kterékoli z nukleotidových sekvencí v (a), (b) nebo (c) uvedených výše nebo , polynukleotid, který hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek na polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci (a), (b) nebo (c) výše uvedenou. Přídavné vyjádřeni nukleových kyselin predidadaného vynálezu se vztahuje κ izolované molekule nukleové kyseliny obsanujicí aminoisyselinu epitop nesvuci části Z cyto 7 polypeptidů.

V dalším aspektu tohoto vynálezu je zajištěn expresívní vektor obsahující (a) transkripční promotor, (b) DNA segment kódující výše popsaný polypeptid, a (c) transkripční terminátor, kde promotor DNA segment a terminátor jsou operativně spojeny.

V tretim aspektu vynálezu je zajištěna kultivovaná eukaryotická buňka, do níž byl vpraven expresívní vektor, jak je uvedeno výše, přičemž tato buňka exprimuje protein polypeptidů kódovaného DNA segmentem.

V dalším vyjádření navrhovaného vynálezu je izolována protilátka, která se specificky váže k výše popsanému Z cyto 7 polypeptidů. Nárokován je též způsob přípravy protilátek, které se vážou k Z cyto 7 polypeptidů zahrnující očkováni savce Z tyto 7 polypeptidem nebo Z cyto 7 epitop nesoucím polypeptidem tak, že savec produkuje proti polypeptidů protilátky a tyto protilátky jsou izolovány.

Tyto a ostatní aspekty vynálezu se stanou zřejmými v odkazech k následujícímu podrobnému popisu.

Nauka všech zde citovaných odkazů je v plném rozsahu uvedena zde v odkazech.

-θ'

Φ · * φ · · ΦΦΦΦ·· • φ · · φ φ

ΦΦΦΦ · ΦΦΦ ΦΦΦΦ φ9 φφ

Termín, afmitní přívěsek je zde použit k označení segmentu polypeptidů, který může být připojen k druhému polypeptidů za účelem purifikace nebo detekce druhého polypeptidů nebo zajištění poloh pro připojení druhého polypeptidů k substrátu. V principu jakýkoli peptid nebo protein, pro který} e dostupná protilátka nebo jiné specificky vázané činidlo může být použit jako afinitní přívěsek. Afinitní přívěsky obsahují polyhistidinový úsek, protein A [Nilsson et al, BMBOJ. 4 : 1075^(1985); Ndsson et al., Methods Enzymol. i98 : 3 (1991)}, glutathion S transferázu. [Smith and Johnson, Gene 67 : 3.1 (1988)], Glu-Glu afinitní přívěsek (Grusseruneyer et al, Proč. Natí. Acad. Sci, USA 82 : 7952 - 4 (1985)], substanci P, FLAG™ peptid (Hopp et al., Biotechnology 6 : 1204 - '10 (1988), peptid vázající streptavidin, nebo jiný antigenní epitop nebo vazebnou doménu. Viz obecně Ford et al.. Protein Expression and Purification 2: 95 - 107 (1991). DNA kódující afinitní přívěsky jsou dostupné od komerčních dodavatelů (např. Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ).

Termín „alelická varianta“ označuje kterékoli dvě nebo více alternativních forem genů obsahujících stejný chromozomální lokus. Alelická variabilita se zvyšuje, přičemž mutací a výsledkem může být fenotypický polymorfizmus v populacích. Genové mutace mohou být skryté (nedochází ke změně v kódovaném polypeptidů) nebo mohou kódovat polypeptidy, které mají změněnou sekvenci aminokyselin. Termín alelická varianta je zde též použít k označení proteinu kódovaného alelrckou variantou genu.

Termín „expresivní vektor“ označuje DNA molekulu,, lineární nebo eírkulámí, která obsahuje segment kódující určitý- polypeptid operativně spojený s přídavnými segmenty tak, aby byla zajištěna jeho transkripce. Takové přídavné segmenty mohou obsahovat promotor a. sekvence terminátoru a mohou, případně obsahovat jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selektivních markérů, zesilovač transkripce, polyadenylacní signál a podobně. Expresivní vektory jsou obvykle odvozeny od plazmidu nebo virové DNA, nebo mohou obsahovat prvky obojí.

······ φ · · ·· ··

Termín „izolovaný“, je-li užit v souvislosti s molekulou polynukleotidu, označuje, že polynukleotid byl odebrán z jeho přirozeného genetického prostředí, tudíž bez jiných okolních nebo nežádoucích kódujících sekvenci, a nachází se ve formě vhodné pro použití v systémech produkce proteinů metodami genového inženýrství. Takové izolované molekuly jsou ty, které byly separovány z jejich přirozeného prostředí a zahrnují cDNA a genomické .klony. Izolované DNA molekuly tohoto vynálezu neobsahují ostatní geny, s nimiž jsou obvykle vázány, ale mohou obsahovat přirozeně se objevující 5' a 3’ nepřeložitelné úseky jako jsou promotory a terminátory. Identifikace vázaných úseků je zřejmá odborníkům v oboru. Viz například Dynan and Tijan, Nátuře 316 : 774 - 78 (1985). Je-li v souvislosti s proteinem užit termín „izolovaný“, znamená to, že byl protein nalezen v podmínkách jiných, než je jeho přirozené prostředí, jako je oddělení z krve a zvířecí tkáně. V přednostní formě izolovaný protein ve své podstatě neobsahuje jiné proteiny, zejména jiné proteiny zvířecího původu. To je upřednostňováno pro zajištění proteinů ve vysoce purifikované formě, např. vyšší čistota než 95 %, raději vyšší čistota než 99 %.

Termín „operativně vázaný“, pokud se týká DNA segmentů znamená, že segmenty jsou uspořádány tak, aby jejich funkce byla v souladu se zamýšleným účelem, např. transkripce začíná v promotoru a pokračuje přes kódovací eegm<snl k terminátoru.

lermín „polynukleotid“ znamená jedno- nebo dvouretězový polymer deoxyribonukleotidových nebo ribonukleotidových bází Čtených od 5’ k 3' konci. Poíynukleotidy obsahují RNA a DNA a mohou být izolovány z přírodních zdrojů syntetizovaných in vitro, nebo připravených z kombinace přírodních a syntetických molekul.

Termín „komplementy polynukleotidových molekul“ označuje polynukleotxdové molekuly, které mají komplementární sekvence bází a opačnou orientaci ve srovnání s referenční sekvencí. Například sekvence 5’ ATGCACGGG 3’ je komplementární k 5’ CCCGTGCAT 3\ • ·

-<s• · ♦ β

Termín „degenerovaná nuídeotidová sekvence“ označuje sekvenci nukleotidu, která obsahuje jeden nebo více degenerovaných kódů (jak lze srovnat s referenční poíynukleotidovou molekulou, jež kóduje polypeptid) Degenerovaný kód obsahuje odlišné triplety nukleotidů, ale kóduje stejný zbytek aminokyseliny (např. GAU a GAC triplety oba kóduji Asp).

Termín „promotér“ označuje část genu obsahujících DNA sekvence, která zajišťuje vazbu RNA polymerázy a iniciaci transkripce. Promotorové sekvence se obvykle, ale ne vždy, nachází v 5’ nekódujících úsecích genů.

Termín „sekreční signální sekvence“ označuje sekvenci DNA, která kóduje polypeptid („sekreční peptid“), jenž jako součást většího polypeptidu směruje větší polypeptid skrz sekreční cestu buňky, v níž je syntetizován. Větší peptid je obvykle štěpen, aby se odstranil sekreční peptid během přenosu sekreční cestou.

Termín „receptor“ označuje s buňkou spojený protein, který se váže k bioaktivní molekule (např. ligand) a zprostředkovává účinek ligandů na buňku. Membránově vázané receptory jsou charakterizované muitioblastní strukturou obsahující extracelulámí oblastní vázající ligand a intracelulámí efektorovou oblast, která je typickou součástí v signální transdukci.. Vazbou ligandů na receptor dochází ke konformační změně v receptoru, která způsobí interakce mezi efektorovou. oblastí a jinou (ými) molekulou (ami) v buňce. Tato interakce opět vede ke změně v metabolizmu buňky. Metabolické děje, které jsou vázány na interakce receptor - ligand, zahrnují genové transkripce, fosfotylaci, deforfoiylaci, zvyšuje se produkce cyklického AMP, mobilizace buněčného vápníku, mobilizace membránových lipidů, buněčná adheze (soudržnost), hydrolýza inositoliipidů. a hydrolýza fosfolipidů. Mnohé jaderné receptory též představují muitioblastní strukturu, obsahují aminový konec, transaktivační oblast, oblast vázající DNA a oblast vázající ligand. Obecně receptory mohou být membránově vázané, cytosolické nebo jaderné; monomerické (např. receptor thyroid stimulujícího hormonu, beía-adrenergický receptor) nebo multimerické (např. PDGF receptor, receptor růstového hormonu, IL - 3 receptor, GM - CSF receptor, G - CSF receptor, receptor erythropoetínu a IL - 6 receptor).

444 4

- qTermín „komplemmťantikomplement pár“ označuje neidentické skupiny, které za vhodných podmínek tvoří nekovalentně spojené stabilní péry. Například biotin a avidin (nebo streptavidin) jsou prototypickými zástupci komplemenVantikompiement páru. Jiné příkladné komplemenVantikompiement páry zahrnuji receptor/ligand páry, protiíátka/antigen (nebo hapten nebo epitop) páry, antikódující/kódující polynukleotidové páry a podobně. Tam, kde je požadována následná disociace komplemenVantikompiement páni, je * komplemenVantikompiement pár přednostně vázán afinitou < IO⁹ MA „Rozpustný protein“ je protein polypeptid, který není vázán k buněčné membráně.

V preferovaných ztělesněních tohoto vynálezu budou izolované polynukleotidy hybridizovány za. přísných podmínek na podobně velké úseky DNA SEQ ÍD č. 1 nebo sekvenci k ní komplementární. Obecně přísné podmínky jsou voleny tak, aby teplota byla asi o 5 °C nižší, než bod tepelného tání (T_m ~ íhermal melting point) specifické sekvence při definované iontové síle a pH. T_m je teplota (při definované iontové sile a pH), při níž 50 % cílové sekvence hybridi^uje na dokonale padnoucí vzorek. Typické přísné podmínky jsou takové, při nichž je koncentrace soli přibližně 0,02 M nebo méně při pH 7 a teplotě alespoň asi 60 °C. Jak bylo uvedeno dříve, izolované polynukleotidy tohoto vynálezu obsahují DNA a RNA. Metody izolace DNA a RNA jsou dobře známy v oboru. Celková RNA může být připravena za použití guanidin Hel extrakce následované izolací centrifugací v CsCl gradientu [Chirgwin etaí, Biochemistry 18 : 52 - 94 (1979)]. Póly (A)¹ RNA je připravena z celkové RNA za použití metody dle Aviv and Leder, Proč. Natí. Acad, Sci. USA. 69: 1408 1412 (1972). Komplementární DNA (cDNA) je připravena z póly (A)’’’ RNA použitím známých metod. Polynukleotidy kódující Z cyto 7 polypepíidy jsou pak. identifikovány a izolovány například hybridizací nebo PCR

Navíc polynukleotidy tohoto vynálezu mohou být syntetizovány použitím DNA syntetizátoru. Běžně je používána fosforamíditová metoda. Je-li pro aplikaci jako je syntéza genu nebo genových fragmentů požadována chemicky syntetizovaná dvouřetězová DNA, pak je každý komplementární řetězec t vořen odděleně. Příprava krátkých genů (60 až; 80 bp) je technicky přímočará, a může být provázena syntetizováním komplementárních řetězců a poté jejich spojením. Pro přípravu delších genů (> 300 bp) však musí být použita speciální strategie, protože schopnost párování každého cyklu během chemické syntézy DNA je zřídka 100 %. K překonání tohoto problému, byly sestaveny syntetické geny • ·

- 1ο • · · · · · · ···· • · · ··£«· • · · · · · ··«··· • · · · · · ···· · ··· ···· ·· ·« (dvouřetězové), a to v modulární formě z jednořetězových fragmentů o délce 20 až 100 nukleotidů. Kromě toho protein kódující sekvence, syntetické geny mohou být označeny koncovými sekvencemi, jež usnadňují inzerci do restrikčních endonukleázových míst kionovacího vektoru a mohly by být přidány jiné sekvence obsahující signály pro správnou iniciaci a terminaci transkripce a translace.

Viz Gíick, Bernard R. and Jack J. Pastemak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications ofRecombinant DNA, (ASM Press, Washington, D. C. 1994). ítakura, K. et al, Synthesis and use of synthetic oíigonucleotides. Annu. Aev. 8iochem. 33 : 323 - 336 (1984), and Climie, S. etal. Chemical synthesis of the thym idy latě synthase gene. Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87: 633 -637(1990).

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že sekvence uvedené v SEQ ÍD č, 1 a 2 představují jednoduchou lidskou alelu. Existuje mnoho přirozeně se vyskytujících zralých N - koncových variant, které mají vedoucí sekvenci rozštěpenou na odlišných pozicích. Obsahují sekvence definované SEQ ID č.

14, 36, 37 a 38. Alelicke varianty těchto sekvencí mohou být klonovány sondovací cDNA nebo poskytnuty genovými knihovnami od různých jednotlivců podle standartních procedur. Příklady variant lidského Z cyto 7 jsou reprezentovány poíypeptidy SEQ ÍD č.: 15 - 25.

Myší Z cyto 7 cDNA a protein jsou uvedeny SEQ ID č. 11 a 12, Zralý Z cyto 7 polypeptid je definován SEQ ID č. 39 a 40,

Tento vynález dále též zajišťuje doplňkové proteiny a polynukleotidy z jiných druhů („species orthologs“). Zvláštní pozornost zasluhují Z cyto 7 poíypeptidy z jiných druhů savců, zahrnujících myší, vepřové, ovčí, hovězí, psí, kočičí, koňské a ostatních primátů. „Species orthoíogs“ lidského Z cyto 7 proteinu mohou být klonovány za použití informací a sloučenin, které poskytuje tento vynález v kombinaci s konvenčními technikami klonování. Například cDNA může být klonována použitím mRNA získané z tkáně nebo buněčného typu, který exprimuje protein. Vhodné zdroje mRNA mohou být například identifikovány pomocí metody Nothemova přenosu s nukieotidovými sondami uspořádanými ze sekvencí zde zveřejněných. Protein kódující cDNA může pak být izolována různými metodami jako sondováním s úplnou nebo částečnou, lidskou nebo myší cDNA nebo s jednou nebo více degenerovanými

9 9

99* 999 • · • 9 · 9

9

- 4 4nukleotídovýmí sondami založenými na zde uvedených sekvencích. cDNA může být též klonována použitím polymerázové řetězové reakce nebo PCR (Mullis, U. S. Patent No. 4, 683, 202), použitím matricí uspořádaných ze zde uvedených sekvencí. V dalších metodách může být cDNA knihovna použita ke transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a exprese příslušné cDNA může být detegována pomocí protilátky k příslušnému proteinu. Podobné techniky mohou být též použity k izolaci genových klonů. Jak je použit a nárokován jazyk „izolovaný polynukleotid, který kóduje polypeptid, uvedený polynukleotid je definován SEQ ÍD č, 2“ obsahuje všechny alelické variant}·'· a „species orthologs“ polypeptidu SEQ ÍD č. 2.

Tento vynález zajišťuje též izolované proteinové polypeptidy, které jsou značně homologní vůči proteinovým polypeptidům SEQ ID č. 2 a jejich „species oríhologs“. „Izolované“ znamená protein nebo polypeptid nacházející se v jiných podmínkách nežli jeho přírodním prostředí, tak jako oddělené z krve a zvířecí tkáně. Je dávána přednost tomu, aby izolovaný polypeptid byl v podstatě bez ostatních polypeptidů, zvláště jsou-li živočišného původu (zvířecího). Je preferováno zajistit polypeptidy ve vysoce purifikované formě, např. vyšší stupeň čistoty než 95 %, lépe vyšší stupeň čistoty než 99 %. Termín „značně homologní“ („suhstantially homologous“) je zde použit k označení polypeptidů, které mají 50 %, raději 60 %, nejlépe alespoň 80 % sekvence identické se sekvencí ukázanou v SEQ ÍD č. 2 nebo jejích „species orthologs“ Žádanější je, aby takové polypeptidy byly alespoň z 90 % identické, nejlépe z 95 % nebo více identické se SEQ ID č. 2 nebo jejích „species orťhologs“. Procento identity sekvence se určuje konvenčními metodami. Viz například Aítschui etaí, Bull Math. Bio. 48: 603 - 616 (1986) a Henikoffi Proč. Natí Acad Sci. USA 89: 10915 - 10919 (1992). Stručně řečeno, dvě sekvence aminokyselin jsou seřazeny za účelem optimalizace orientace žlábků, použitím „a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 1 and the „blossom 62““ žlábková matrice dle Henikoffa a Henikoffa (tamtéž), jak je ukázáno v tabulce 2 (aminokyseliny jsou označeny standardními jednopísmenkovými kódy). Procento identity je pak vypočteno jako;

celkový počet identických protějšků

------------------------------------------ x j 00 [délka delší sekvence plus počet jamek vnesených do delší sekvence za. účelem seřazení dvou sekvencí]

1Ί.

9999

4« 44 » 4 4 4 » 4 4 4

444 444 • •444

Tabulka 2.

>

>1 £

E-* <Ό

CM řq rd

I cn

I

2

LD

LO

rd I

03 1

03

M

03

cn 1

rd

K

00

cn 1

rd J

03 l

O

VD

03

1

I

03 l

m

ω

in

03 1

O

cn 1

rd

03 1

σ

ω

CN

03 1

O

cn I

03 1

rd

o

υ

<

ΟΊ

ΓΌ 1

-tf 1

cn l

ΓΠ 1

rd 1

rd

cn 1

rd 1

Q

U3

cn

o

CN

rd 1

cn l

l

rd l

cn 1

£

vo

rd

ΓΩ 1

o

O

rd

O) 1

cn 1

O

03 1

Ph

LQ

o

CN 1

m 1

r—Í

O

03 1

O

m 1

03 1

03

rd 1

<

-tf

rd 1

CN I

CN 1

o

rd 1

O

Ol 1

rd 1

Pí

S

Q

CJ

CX

H

O

K

H

ι-Ί

£

			tn	03 1	03 i	O
			rd	cn 1	03 1	03 1
	o*	rd 1	rd 1	t	cn 1	03 1
VO	1	03 t	03 1	rd	cn	rd 1
O	03 1	rd 1	rd I	rd 1	rd 1	rd
cn 1	rd 1	O	rd 1	m j	03 t	03 1
o	cn 1	Ol 1	rd 1	03 1	rd 1	rd
o	cn 1	03 1	rd 1	cn 1	rd 1	cn
rd 1	03 1	rd 1	03 l	03 1	03	cn l
m 1	03 1	O	03 1	03	cn 1	cn 1
cn 1	rd 1	o	rd 1	cn i	03 1	03 1
cn 1	rd l	o	rd 1	03 1	rd 1	03 1
03 1	cn 1	rd 1	rd 1	03 1	03 1	rd
cn	rd 1	O	rd 1	1	cn 1	cn 1
cn 1	03 1	rd	O	sť	03 1	cn l
cn 1	03 1	rd 1	rd 1	m t	03 1	cn 1
03 1	rd	rd	O	cn 1	03 1	o
	CM	ω	H	Σ2		>

• · ··« ·

-/39 9 9 9 9 9

9 9 9 9 • · 999 9 9 9

9 9

9999 99 99

99999 9

Identita sekvencí polynukleotidových molekul je sestavena stejnými metodami užívajícími poměr uvedený výše.

Značně homologní proteiny a polypeptidy jsou charakterizovány tím, že mají jednu nebo více substitucí, delecí nebo adicí aminokyselin. Tyto změny jsou nejspíš méně přirozené, jsou to konzervativní substituce aminokyselin (viz tabulka 3) a jiné substituce, které významně neovlivňují konformaci nebo aktivitu proteinu nebo polypeptidu; malé delece typicky od jedné do 30 aminokyselin a malá prodloužení aminových nebo karboxylových konců tak, jako methioninový zbytek aminového konce, malý vazebný peptid do asi 20 až 25 zbytků nebo malé prodloužení usnadňující purifikaci (afinitní přívěsek), tak jako polyhistidinový úsek, protein A [Nilssonef ni, EMBOJ. 4: 1075 (1985); Nilsson etal., Methods Enzymol. 198: 3, (1991)], glutathion S transferáza [Smith and Johnson, Gene 57:31, (1988)], nebo jiná antigenní epitop nebo vazebná doména. Viz obecně Ford etal., Protein Expression and Purification 2: 95 - 107 (1.991). DNA kódující afinitní přívěsky jsou dostupné od komerčních dodavatelů (např. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

-1Ν »· 9 99 9 • · ·· · · « · • · • · · · · ·

Tabulka 3.

Konzervativní substituce aminokyselin

Zásadité;	argimn lysin histidin
Kyselé;	kyselina gíutamová kyselina asparagová
Polární;	glutamin asparagin
Hydrofobní;	leucin izoíeucin vaíin
Aromatické;	fenylalanin tryptofan tyrosín
Malé:	glycin aíanín serín threonin methíonín

Esenciální aminokyseliny přítomné v polypeptidech tohoto vynálezu mohou být identifikovány pomocí postupů známých v oboru tak jako místně cílená mutageneze nebo alaninem snímaná mutageneze (alanine · scanning mutagene&is) [Cunningham and Wells, Science 244: 1081 - 1085 (1989); Bass etal.. Proč. Natí. Acad. Sci, USA. 88: 4498 - 4502 (1991)]. V novějších technikách jsou uváděny jednoduché slaninové mutace u každého zbytku v molekule a výsledné mutované molekuly jsou testovány z hlediska biologické aktivity (např. ligand vázající a signální transdukce), abv byly identifikovány aminokyselinové zbytky; které jsou rozhodující pro aktivitu molekuly. Místa

- 159· · · · · • · · · · • « ftftft ftftft • · • ft ftft ftft interakce ligand - protein mohou být též určena alanýzou krystalových struktur, které se určují takovými technikami, jako jsou. nukleární magnetická rezonance, krystalografie nebo fotoafmitm značení. Viz například de Vos etal., Science 255 : 306 ~ 312 (1992); Smith etal, J. Mol. Biol. 224 : 899 - 904,1992; Wlodaver et al, FEBS Lett. 309 : 59 - 64 (1992). Identity esenciálních aminokyselin mohou být též vyvozeny z analýzy homologů s příbuznými proteiny.

Mnohočebié substituce aminokyselin mohou být provedeny a testovány pomoci známých metod mutageneze a třídění, tak jak je uvedeno v Reídhaar Oíson and Sauer, Science 241 ; 53 -57 (1988) nebo Bowie and Sauer, Proč. Nati Acad Sci. USA 86 ; 2152 - 2156 (1989),, Krátce, tito autoři uvádějí metody pro současné provedení náhodných mutací dvou nebo více pozic v polypeptidů, výběr funkčního polypeptidů a následné sekvencování mutagenizovaných polypeptidů za účelem určení spektra přípustných substitucí na každé pozicí. Jiné metody, které mohou být použity, zahrnují fágové zobrazení, např. Lowman etal, Biochem. 30 : 10832 ~ 10837 (1991); Ladner et al, U. S. Patent No. 5, 223, 409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204 a místně řízené mutageneze, Derbyshire etal, Gene 46 : 145 (1986); Ner etal, DNA 7: 127 (1988),

Výše uvedené metody mutageneze mohou být kombinovány s vysoce účinnými metodami třídění („scríningu“) pro detekci klonovaných, mutagenizovaných proteinů v hostitelských buňkách. Nej vhodnější stanovení v tomto ohledu zahrnují zkoušky buněčné proliferace a níže uvedené zkoušky s vázaným ligandem, jehož podstatou je biosenzor. Mutagenizované molekuly DNA, které kódují aktivní proteiny nebo jejich části (např.. ligand vážící fragmenty), mohou být znovu získány a rychle sekvmcovány s použitím moderního zařízení. Tyto metody umožňují rychle určit důležitosti jednotlivých zbytků aminokyselin ve sledovaném polypeptidů a mohou být použity u polypeptidů neznámé struktury.

Použitím výše diskutovaných metod může běžný odborník v oboru připravit různé polypeptidy, které jsou značně homologní vůči SEQ ID č. 2 nebo jejím alelickým variantám a udržují si vlastnosti proteinu standardního typu. Jak je vyjádřeno a nárokováno v tomto jazyce „polypeptid definovaný SEQ ID č. 2“ zahrnuje všechny alelické varianty a „species orthologs” polypeptidů.

· ·»·

-1ζ>• φ · · · · 9 9 9 9 9

9 · ····· • · · « ········ • · · · · · ···· · 999 9999 99 99

Další vyjádření tohoto vynálezu zajišťuje pro peptid .nebo polypeptid obsahujícím epitop nesoucí část polypeptidů tohoto vynálezu. Epitop této části polypeptidů je imunogenním nebo antigennún epitopem polypeptidů tohoto vynálezu. Oblast proteinu, k níž se protilátka může vázat, je definována jako „antigenní epitop“. Viz například Gevsen. Η. M. etaí, Proč, Natí Acad Sci. USA. 81 :3998 - 4002 (1984).

Pokud se jedná o výběr peptidů nebo polypeptidů nesoucích antigenní epitop (např. který obsahuje oblast proteinové molekuly, na níž se může 'vázat protilátka), jsou v oboru dobře známé ty relativně krátké syntetické peptidy, které imituji část proteinové sekvence a jsou vhodné pro rutinní získávání antiséra, které reaguje s částečně imitovaným proteinem. Viz Sutehfife, J. G. et al. Science 219 : 660 - 666 (1983). Peptidy schopné vyvolávat protein reaktivní sérum, jsou často zastoupeny v primární sekvenci proteinu, mohou být charakterizovány pomocí skupiny (skupinou) několika jednoduchých pravidel a nejsou vázány blízko imunodominantních oblastí neporušených proteinů (např. imunogenních epitopu) ani u aminových nebo karboxylových konců. Peptidy, které- jsou příliš hydrofobní a ty, které mají šest nebo méně zbytků, .jsou obvykle neúčinné při vzbuzování protilátek, které se vážou na imitovaný protein; delší rozpustné peptidy, zvláště ty, které obsahují prolinové zbytky, jsou obvykle účinné.

Peptidy nesoucí antigenní epitop a polypeptidy tohoto vynálezu jsou proto užitečné pro imunizaci včetně monoklonálních protilátek, které se specificky vážou k polypeptidů tohoto vynálezu. Peptidy nesoucí antigenní epitop a polypeptidy tohoto 'vynálezu obsahují sekvence alespoň devíti, raději mezi 15 až asi 30 aminokyselin, v nichž jsou obsaženy sekvence aminokyselin polypeptidů tohoto vynálezu. Nicméně peptidy nebo polypeptidy obsahující delší část sekvence aminokyseliny tohoto vynálezu, která obsahuje od 30 do 50 aminokyselin nebo jakoukoli délku až do a včetně úplné aminokyselinové sekvence polypeptidů tohoto vynálezu, jsou také užitečné pro vzbuzování protilátek, které rreagují s proteinem. Nejlépe, je-li aminokyselinová sekvence epitop nesoucího peptidu vybrána tak, aby zjistila podstatnou rozpustnost ve vodních rozpouštědlech (např. sekvencím obsahující relativně hydrofilní zbytky a. hydrofobní zbytky, je nejvhodnější se vyhnout); sekvence obsahující prolinové zbytky, jsou zvláště vhodné. Všechny polypeptidy uvedené v seznamu sekvencí obsahují antigenní epitopy za účelem použiti podle tohoto vynálezu, nicméně zvlášť upravené antigenní epitopy zahrnují peptidy definované SEQ ID č. 27-35.

·· ·«··

- 1ϊ~ • · · · · · · · • · · · · · ··· ··· • · · · · · ···· · *·» v··· ·· »·

Polynukleotidy, obecně cDNA sekvence uváděného vynálezu kódují výše popsané polypeptidy. Určitá cDNA sekvence, která kóduje polypeptid tohoto vynálezu, je složena ze série kodonů, každý aminokyselinový zbytek polypeptidů je kódován kodonem, přičemž každý kodon se skládá ze tří nukleotidů. Aminokyselinové zbytky jsou kódovány jejich příslušnými kodoňy, jak vidíme dále.

Alanin (Ala) je kódován GCA, GCC, GCG nebo GCT;

Cystein (Cys) je kódován TGC něho TGT;

Kyselina asparagová (Asp) je kódována GAC nebo GAT;

Kyselina glutamová (Glu) je kódována GAA nebo GAG;

Fenylaíanin (Phe) je kódován TTC nebo TTT;

Glycm (Gly) je kódován GGA, GGC, GGG nebo GGT;

Histidin (His) je kódován CAC nebo CAT; isoleucin (Ile) je kódován ATA, ATC nebo ATT;

Lysin (Lvs) je kódován AAA nebo AAG,

Leucin (Leu) je kódován TTA, TTG, CTA, CTC, CTG nebo CTT; Methionin (Met) je kódován ATG;

Asparagin (Asn) je kódován AAC nebo AAT;

Proiin (Pro) je kódován CCA, CCC, CCG nebo CCT;

Glutamin (Gin) je kódován CAA nebo CAG;

Arginin (Arg) je kódován AGA, AGG, CGA, CGC, CGG nebo CGT; Šerm (Ser) je kódován AGC, AGT, TCA., TCC, TCG nebo TCT; Threomin (Thr) je kódován ACA, ACC, ACG nebo ACT;

Valin (Val) je kódován GTA, GTC, GTG nebo GTT;

Tryptofan (Trp) je kódován TGG; a Tyrosin (Tyr) je kódován TAC nebo TAT.

Je třeba, aby bylo zřejmé, že podle tohoto vynálezu, kdy cDNA je nárokována jak je popsáno výše, se rozumí, že to, co je nárokováno, jsou oba smysly; řetězce, tj. „sense strand.“, „anti-sense stranci (negativní řetězec a pozitivní řetězec) a DNA jako dvouřetězová, jež má oba řetězce „the sense“ a „anti-sense“ (negativní a pozitivní) spojené pomocí příslušných vodíkových vazeb. Je také nárokována mediátorová RNA (mRNA), která kóduje polypeptidy tohoto vynálezu a kterážto mRNA je kódována výše popsanou cDNA. Mediátorová RNA (mRNA) bude kódovat polypeptid za použití

9·9· n

·· 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9 · ··· 99 4 • · · ···· «« 99 ·· ·

• 9 e

• r ·* stejných kodonů, které jsou definovány výše s tím rozdílem, že Kazdy nukleotid thymin (T) je nahrazen nukleotidem uracilem (Ό).

Proteinové polypeptidy tohoto vynálezu obsahující proteiny v pine délce, fragmenty proteinů (např. receptor vázající fragmenty) a smíšené polypeptidy mohou být produkovány v hostitelských buňkách upravených pomocí metod, genetického inženýrství za použití konvenčních technik tohoto oboru. Vhodné hostitelské buňky jsou takové typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfektovány exogenní DNA a pěstovány v kultuře, zaumují bakterie, plísňové buňky a kultivované vyšší eúkaiyotícke buňky. Eukaryodcké buňky, zejména kultivované buňky mnohobuněčných organizmů, jsou zvláště vhodné. Techniky pro manipulaci klonovaných DNA molexul a vkiadaiu exegenn* unA do různých hostitelských buněk jsou zveřejněny v Sambrook et al, Molecular Cloning: Á Laboratory Manual, (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory Prese, Cold Sptutg Harbor, NT, 1989), a An&uoeiéí al., tamtéž.

Obecně, sekvence DNA kódující Z cyto 7 polypeptid, je operativně vázána k ostatním genetickým prvkům, které jsou třeba pro její expresí , obecně obsahující transkripční promotor a terminátor s včleněným expresivním vektorem. Vektor by měl obsahovat též jeden nebo více volitelných markérů a jeden nebo více počátků replikace, ačkoli odborníkům v oboru je zřejmé, že v určitých systémech volitelné markéry mohou být opatřeny na oddělených vektorech a replikace exogenní DNA může být vedena integrací do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, volitelných markérů, vektorů a dalších prvků je záležitostí rutinní úpravy na úrovni běžných znalostí v oboru. Mnoho takových prvků je popsáno v literatuře a jsou dostupné prostřednictvím komerčních dodavatelů.

Směrování Z cyto 7 polypeptidů do sekrečního traktu hostitelské buňky, sekreční signální sekvence (též známá jako vedoucí sekvence, prepro sekvence nebo pre sekvence), je zajištěna v expresivním vektoru. Sekreční signální sekvence může být tím proteinem nebo může být odvozena z jiného sekretovaného proteinu (např. t-PA) nebo syntetizována de novo. Sekreční signální sekvence je připojena k Z cyto 7 DNA sekvenci ve správném čtecím rámci. Sekreční signální sekvence jsou obvykle umístěny 5^! k DNA sekvenci kódující uvedený polypeptid, ačkoli určité signální sekvence mohou být umístěny kdekoli v uvedené DNA sekvencí (viz např. Weich etal, U. S. Patent No. 5, 037, '743, Holland etaL U. S. Patent No. 5, 143, 830).

• · · · ·

79Kultivované savci buňky jsou nejvhodnějšími hostiteli v prezentovaném vynálezu. Metody pro vpravení exogenní DNA do savčích hostitelských buněk zahrnují fosforečnanem vápenatým zprostředkovaná transfekce, Wigler etai, Cell 14 ; 725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 : 603 (1981); Graham and Van der Eb, Virology 52 : 456 (1973), eíectroporation, Neumann etai, EMBO J. 1 : 841 - 845 (1982), D.EAE - dextran medíated transfection, Ausubel etai, eds,, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, lne., NY, 1987), a lipozomy zprostředkovaná transfekce (Hawley - Nelson, etai., Focus 15 : 73 (1993); Ciccaroneetal., Focus 15 ; 80 (1993). Příprava rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savčích buňkách je uvedená například v Levinson etai., U. S. Patent No. 4, 713, 339; Hagen et al., U. S. Patent No. 4, 784, 95G; Palmíter etai., U. S. Patent No. 4, 579, 821; a Ringold, U. S. Patent No. 4, 656,134. Vhodné kultivované savčí buňky zahrnují COS - 1 (ATCC No. CRL 1650), COS - 7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 [ATCC No. CRL, 1573; Graham etai, J. Gen. Virol. 36 : 59 - 72 (1977)] a buněčné Jáne vaječníku čínského křečka (např. CHO - KI; ATCC No. CCL 61). Další vhodné buněčné linie jsou známé v oboru a dostupné z veřejných depozitářů jako je the American Type Culture Collection, Rockville, Maryiand. Obecně jsou preferovány silné transkrípční promotory, tak jako promotory z SV - 40 nebo cytomegalovirus. Víz např. U. S. Patent No. 4, 956,288. Jiné vhodné promotory obsahují ty z metalothioneinových genů (U. S. Patent Nos, 4, 579, 821 and 4, 601, 978) a adenoviry hlavní pozdní promotor.

Výběr léku je obvykle použit k výběru kultivovaných savčích buněk, do kterých je vložena cizí DNA. Takové buňky jsou obvykle nazývány „transfektanty“ Buňky, které byly kultivovány v přítomnosti selektivního činidla a jsou schopny předávat řečené geny k jejich progenům, se nazývají „stabilní transfektanty“ Nejvhodnějším selektivním markérem je gen kódující rezistence k antibiotiku neomycin. Selekce je prováděna v přítomnosti léků typu neomycmu, jako je G -418 nebo podobné. Selekční systémy mohou být též použity ke zvýšení expresívní hladiny uvedených genů, tento proces se nazývá „amplifíkace“. Amplifíkace je prováděna s kultivovanými transfektanty v přítomnosti nízké hladiny selektivního činidla a pak zvýšením množství selektivního činidla, aby se vybraly buňky, které produkují vysoké hladiny produktů, vložených genu. Vhodným amplifikačním selektivním markérem je dihydrofolát reduktáza, která způsobuje rezistenci točí methotrexátu. Mohou být použity i geny rezistentní vůči jiným léčivům (např. hydromycínová rezistence, multiíéčivová rezistence, puromycin - acetvltransferáza).

• · · — 2.0• · · · · · · · ♦ • · · · · · · • · · · ····· • · · · • · · ······· ··

Jako hostitele mohou být použity i jiné vyšší eukaryotické buňky zahrnující buňky hmyzu, rostlinné buňky a ptačí buňky. Transformace buněk hmyzu a produkce cizích polypeptidu v nich je uvedena v Guarino et al,, U. S. Patent No. 5, 162, 222; Bang etal, U. S. Patent No. 4, 775, 624; a WIPO publikace WO 94/06463. Užití agrobacterium rhizogenes jako vektoru pro expresívní geny v rostlinných buňkách je zrekapitulováno v Sinkar etal., J, Biosci. (Bangalore) ll : 47 - 58 (1987).

Plísňové buňky včetně kvasničných buněk, zejména buňky rodu Saccharomyces mohou být též použity v tomto vynálezu jak pro produkcí proteinových fragmentů, tak i pro fuze polypeptidů. Metody pro transformaci buněk kvasinek exogenní DNA a produkce rekombinantních polypeptidů z nich jsou uvedeny například v Kawasaki, U. S. Patent No. 4, 599, 311; Kawasaki et al, U. S. Patent No. 4, 931, 373; Brake, U. S. Patent No. 4, 870, 008; Welch et al., U. S. Patent No. 5, 037, 743, aMurray etal., U. S. Patent No. 4, 845, 075. Transformované buňky jsou vybrány podle fenoíypu určeného pomocí selektivního markéru, obvykle lékové rezistence nebo schopnosti růst v nepřítomnosti určité živiny (např. leucinu). Vhodným vektorovým systémem pro použití v kvasinkách je POT 1 vektorový systém uvedený v Kawasaki et al, U. S. Patent No. 4, 931, 373, který umožňuje, aby transformované buňky byly vybrány podle růstu na mediu obsahujícím glukózu. Vhodné promotory a terminátory pro použití v kvasinkách jsou ze skupiny genů glykolytických enzymů (viznapř. Kawasaki, U. S. Patent No. 4, 599, 311; Kingsman etal., U. S. Patent No. 4, 615, 974; and Bitter, U. S. 'Patent No. 4, 977, 092) a genů aíkoholdehydrogenázy. Viz též U. S, Patenty Nos. 4, 990, 446; 5, 139, 936 and 4,661,454. Transformační systémy pro jiné kvasinky zahrnující Hansenula potymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii a Candida maltosa jsou známy v oboru. Viz například Gleeson et al., J. Gen. Microbiol 132 : 3459 - 3465 (1986) a Cregg, U. S. Patent No. 4, 882, 279. Buňky aspergillu mohou být využity podle metod uvedených v Mc Knight et al., U, S. Patent No. 4, 935, 349. Metody transformaceAcremonium chrysogenum jsou uvedeny v Sumino etal, U. S. Patent No. 5, 162, .228. Metody transformace Neurospora jsou uvedeny v Lambowitz, U. S. Patent No. 4, 486, 533, • · · · • · ·

Transformované nebo transíektované hostitelské buňky jsou kultivovány podle běžných postupů v kultivačním médiu obsahujícím živiny a jiné složky potřebné pro růst vybraných hostitelských buněk. V oboru jsou známy různé druhy vhodných médií zahrnující definovaná i komplexní média, která obvykle obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, vitamíny a minerály. Média mohou též obsahovat takové složky, jako jsou růstové faktory nebo sérum, dle požadavků. Růstové médium bude obvykle vybíráno pro buňky obsahující exogenně přidanou DNA. například léková selekce nebo nedostatek některé nezbytné živiny, která je doplněna selektivním markérem neseným na expresivním vektoru nebo ko-transfektovaná do hostitelské buňky.

Z hlediska jednoho aspektu uvedeného vynálezu je produkován buňkou nový protein a tato buňka je 'využita pro výběr receptorů nebo receptorů pro protein zahrnující přirozený receptor stejně jako agoništy a antagonisty přirozeného ligandu.

Exprimované rekombinantní polypeptidy (nebo chimérické polypeptidy) mohou být purifikovaný použitím frakcionace a/nebo konvenční purifikaění metody a média. Pro frakcionaci vzorků může být použito sráženi síranem amonným a kyselá nebo chaotropní extrakce, Purifikaění kroky mohou například obsahovat hydroxiapatit, vylučování na principu velikosti, chrom Biografické metody jako FPLC a vysoko účinnou kapalinovou chromatografii. v obrácené fázi (reverse»phase high performance Iiquid. chromatography). Vhodná média měniče aniontů zahrnují derivatizované dextrany, agarosu, celulózu, polyalaylamid, speciální kysličníky křemičité a podobně. PEI, DEAE, QAE aQ deriváty jsou nejvhodnější, zvláště pak jsou vhodné s DEAE Fast - Flow Sepharose (Pharmacia, Píscataway, NJ). Příklady chromalografiekýeh médií zahrnují ía média derivaíizovaná fenylovými, butylovými nebo oktylovými skupinami, jako jsou Pněny! - Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearí butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryviile, PA), Octy! Sepharose (Pharmacia) a podobně; nebo polyakrvlové pryskyřice, jako je Amberchrom CG 71 (Toso Haas) a podobné. Vhodné pevné nosiče zahrnují skleněné kuličky, pryskyřice založené na. křemičitanech, celulózové pryskyřice, agarozové kuličky, kuličky ze zesítěné agarózy, polystyrénové kuličky, zesítěné polyakrylamidové pryskyřice a podobné, které jsou nerozpustné za podmínek, při nichž mají být použity. Tyto nosiče mohou být (upraveny) modifikovány reaktivními, skupinami, což umožňuje navázání proteinů pomocí aminových

Ί/λ.skupin, karboxylových skupin, merkaptových skupin (- SH), hydroxylových a/nebo uhlovodíkových částí. Příklady párování chemikálií zahrnují bromkyanovou aktivaci, N - hydrosysukcinimidovou aktivaci, epoxidovou aktivaci, suífhydrylovou aktivaci, hydrazidovou aktivaci a karboxylové a aminové deriváty pro karbeimidové pérovací chemikálie. Tato a jiná pevná média jsou dobře známá a používaná v oboru a jsou dostupná u komerčních dodavatelů. Metody pro vázání receptorů polypeptidů na nosná média jsou též dobře známé v oboru. Výběr zvláštních metod je záležitostí rutinního návrhu a je určován částečně podle vlastností vybraného nosiče. Viz například Affimty Chromatography: Principles <£ Methods. (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988).

Polypeptidy uvedeného vynálezu mohou být izolovány využitím jejich vlastností. Například absorpční chromatografie immobilizovaných kovových iontů (immobilized metal ion adsorpíion chromaíography = IMAC) může být použita pro purifikaci problémů s vysokým obsahem histidinu. Krátce, gel je nejprve „naplněn⁴ dvojmocnými kovovými ionty, aby se vytvořil chelat [E. Sulko wski, Trends in Biochem. 3:1-7 (1985)].

Proteiny s vysokým obsahem histidinu budou na tuto matrici absorbovány s rozdílnými afinitami, závisejícími na použitých kovových iontech a budou chovány pomocí kompetitivní eluce, snižováním pH nebo použitím silných chelatačních činidel. Jiné metody purifikace zahrnují purifikaci glykozilovanýeh proteinů, pomocí lektinové afinitní chromatografie a iontoměničové chromatografie [Methods in Enzymol., Vol, 182 : 529 - 39J, „Guide to Protein Purificatiotťf M. Deutscher, (ed.), (Acad. Press, San Diego, 1990). Případně může být provedena fuze řečeného polypeptidů a afinitního přívěsku (např. poíyhisíidin, maltosu vázající protein, imunoglobuiin doména) pro usnadnění purifikace. Za účelem usnadnění purifikace vyloučeného receptorového polypeptidů může být též provedeno prodloužení aminového nebo karboxylového konce, kdy je použit polyhistidinový přívěsek, substance P, FLAG* peptid [Hopp etaí, Bio/Technology 6 : 1204 -1210 (1988)], dostupné od Eastman Kodak Co., NewHaven, CT), Glu - Glu afinitní přívěsek [Grussenmeyer etal., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 82 : 7952 -4(1985)1 nebo může být k Z cyto 7 fúzován jiný polypeptid nebo protein, pro který je protilátka nebo jiné specifické vázající činidlo dostupné, což přispívá k lepší purifikaci.

Analýzou norihernoveho přenosu expresí Z cyto 7 se prokázalo, že Z cyto 7 je exprimován zejména v míše. Analýzou míchy in šitu se prokázalo, že tato exprese je lokalizována v neuronech a dorzálníeh výběžcích ganglia. Z toho důvodu může Z cyto 7 hrát roli v udržování míchy zahrnující buď gíiáiní buňky nebo neurony. To znamená, že Z cyto 7 může být. použit k léčení různých neurodegenerati.vn.ich chorob, jako je amyotrofická laterámí skleróza (ALS) nebo dymyelinizační choroby včetně roztroušené sklerózy. Z cyto 7 může být též použit k léčeni smyslových neuropatií. Tkáňová specifita Z cyto 7 exprese naznačuje, že Z cyto 7 může být růstovým a/nebo udržovacím faktorem v míše.

Lokalizace genu Z cyto 7 na chromozonu 5 ukazuje, že Z cyto 7 je eytokinin, který může být k modulování aktivit buněk imunitního systému. Z cyto 7 může být též použit jako chemoreaktant neutrofilů v páteři. Mohl by být užitečný jako antiinfektivum ph infekcích páteře. Mohl by též pomáhat při regulaci jiných cytokininů v míše. Z cyto 7 může být též podáván při léčení periferních neuropatií, jako je „Charcot - Marie - Tooth“ (CMT) choroba, která je lokalizovaná ve stejné chromosomální oblasti 5q jako Z cyto 7.

Skutečnost, že Z cyto 7 potlačuje růst BAF - 3 a TF - I buněk, jak je ukázáno v příkladech 11 a 12 níže, naznačuje, že Z cyto 7 může být použit k léčeni autoimunitóch chorob a eventuelně takových nádorů, jako jsou leukemie.

Tento vynález též zajišťuje též reagencie, které naleznou využití v diagnostických aplikacích. Například. Z cyto 7 gen je silně exprimován v míše. Sonda obsahující Z cyto 7 DNA nebo RNA nebo jejích subsekvence může být použita k určení, zdaje gen Z cyto 7 přítomen na chromozomu 5 nebo zda došlo k mutaci.

Uvedený vynález zajišťuje též reagencie s význačnou terapeutickou hodnotou. Z cyto 7 polypeptid (přirozeně se vyskytující či rekombinantní), jeho fragmenty, protilátky a k nim anti idiotypické protilátky, spolu se sloučeninami, u nichž bylo zjištěno, že mají vazebnou afinitu k Z cyto 7 polypeptidů, mohou býí využity při léčení podmínek spojených s abnormální fyziologií nebo vývojem včetně abnormální proliferace, např. nádorové podmínky nebo degeneratřvní podmínky. Například choroby nebo poruchy spojené s

-34abnormální expresí nebo abnormální signalizací Z cyto 7 polypeptidů by mohly být pravděpodobným terčem pro agonistu nebo antagonistů Z cyto 7 polypeptidů.

Především, může být Z cyto 7 použit k léčení zánětů. Zánět je výsledkem .imunitní odpovědí na infekci nebo jako autoimunitní odpověď na vlastní antigen.

Léčebné dávky by měly být odměřeny tak, aby se optimalizovala bezpečnost a účinnost. Metody pro podávání zahrnují intravenózní, peritoneální, intramuseulámí, subdurábí, do míšní tekutiny nebo transdermální podávání.

Farmaceuticky přijatelné nosiče budou obsahovat vodu, fyziologický roztok pufry; bude jmenováno několik. Rozmezí dávek se bude obvykle pohybovat od 0,1 pg do 1 mg na kilogram tělesné váhy za den. Nejlépe 1 pg až. 100 pg za den. Nicméně lékař s běžnou znalostí v oboru může určit dle potřeby dávku vyšší nebo nižší. Úplnou diskuzi k složení léku a rozmezí dávkování lze nalézt v Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th Ed., (Mack Publishmg Co., Easton, Penn., 1.990) a Goodman and GilmanN The Pharmacologícai Bases of Therapeutics, 9^teEd. (Pergamon Press 1996).

Použití Z cyto 7 k povzbuzení růstu kosti a chrupavky

Bylo zjištěno, že Z cyto 7 stimuluje proliferaci ehondrocytň i osteoblasíů, jak ukazují níže uvedené příklady 7 a 9. Navíc Z cyto 7 stimuluje též ustálený stav hladiny glykosaminogiykanu přítomného v kulturách chondrocytů, jak ukazuje příklad 8, Tudíž Z cyto 7 může být použit ke stimulaci růstu kosti a chrupavky v mnoha různých terapeutických uspořádáních.

Z cyto 7 může být implantován do těla savců tak, že Z cyto 7 je v kontaktu, s osteoblasty tak, že dochází k proliferaci osteoblastů a je stimulován

- zy• · růst kosti.. Například Z cyío 7 může být umístěn do matrice fs nebo bez kostního morfogenního proteinu (BMP)]. BMP (bone morphogenic protein’) indukuje migrací mezenchymálních prekurzoru osteoblastů k místu a následně indukuje diferenciaci mezenchymálních buněk do osteoblastů. 2, cyío 7 pak dáie stimuluje proliferaci osteoblastů. 'Vhodná matrice je tvořena částicemi porézního materiálu. Póry musí být takových rozměrů, aby dovolily progenitorovou buněčnou migraci a následnou diferenciaci a proliferaci. Ideální velikost částice by mela být v rozmezí 70 - 850 mm, nejlépe 1.50 - 420 mm. Matrice obsahující Z cyío 7 může být formována, do tvaru obklopuj ícího kostní defekt. Příklady matricových materiálů jsou částicové, demineralizované, guanidinem extrahované zvláštní druhy kosti. Jiné potenciálně použitelné materiály pro matrici zahrnují kolagen, homopofymery a kopoíymeiy kyseliny, glykolové kyseliny a kyseliny mléčné, hydroxiapatít, trikalciumfosfát a jiné kalciumfosfáty. Z cyto 7 může být vpraven do matrice v koncentraci dostatečné pro podporu proliferace osteoblastů, nejraději v koncentraci alespoň I gg/rnl matrice. Roztok Z cyío 7 může být též přímo očkován do místa fraktury nebo defektu kosti včetně oblastní degenerace kosti za účelem urychlení uzdravení fraktury nebo defektu příslušného místa. Příklady BMPnů a použiti matricí pro výrobu jsou uvedeny v PCT application pubíication number WO 92/07073, publication No. WO 91/05802, U. S. Patent No. 5, 645, 591 a U. S. Patent No.

5, 108, 753..

Z cyto 7 může být dále použit k léčení osteoporózy podáváním terapeuticky účinného množství pacientům. Nejvhodnější dávka by měla být 1 pg Z cyto 7 na kilogram tělesné váhy za den.

Jak bylo popsáno výše, bylo zjištěno, že Z cyto 7 může být použit k povzbuzení produkce chrupavky díky své schopnosti stimulace proliferace chondrocytů. Z cyto 7 může být vstříknut přímo do místa, kde má dojít k růstu chrupavky. Například Z cyto 7 může být vstříknut přímo do kloubů, které byly postiženy osteoartritidou nebo jiným poškozením kloubů, při kterém byla chrupavka silně opotřebována Příkladem případu, kdy je třeba, aby dorostla nová. chrupavka, jsou ramena a kolena poraněných atletů.

Chrupavka může být též vypěstována z chondrocytů odebraných individuu, tyto chondrocyty jsou kultivovány s Z cyto 7 tak, Me proliferují a je možno chondrocyty reimplantovat zpět indivuduu tam, kde je třeba, aby byla produkována chrupavka.

0 0 0 ··

0 · 0 0 ·

0 0 0 0 0 0 000 000

0 0 0000« 00 00

Z cyto 7 může být též použit ke stimulaci regenerace dentínu nebo kosti, došlo-lí k jejich úbytku v závislostí na periodentální chorobě. K tomuto účelu by melo být okolí tkáně důrazně vyčištěno, podán roztok Z cyto 7, nejlépe injekčně, přímo do místa, které vyžaduje regeneraci dentinu

Protilátky k Z cyto 7 polypeptidu mohou být purifikovány a pak. podávány pacientovi. Tyto reagencie mohou být pro terapeutické použití kombinovány přídavnými aktivními nebo inertními přísadami, např. ve farmaceuticky přijatelných nosičích nebo rozpouštědlech a fyziologicky neškodnými stabilizátory a pomocnými látkami. Tyto kombinace mohou být sterilně filtrovány a uloženy do dávkové formy jako při íyofííizaci dávkovačích lahvičkách nebo uchovávány ve stabilizovaných vodních přípravcích. Tento vynález též uvažuje o použití protilátek, jejich vazebních fragmentů nebo jednořetězeových protilátek, protilátek zahrnujících formy, které nejsou vazebným komplemeníem .

Množství reagencií nezbytné pro účinné léčení závisí na mnoha rozdílných faktorech zahrnujících způsoby podávání, cílovém místě, psychologickém stavu pacienta a jiných podávaných medikacích. Tudíž používané dávky musí být odměřeny tak, aby se optimalizoval soulad bezpečnosti a účinnosti. Typické dávkování používané ň? vitro může být užitečným vodítkem pro množství užitečná při podávání těchto reagencií in vivo. Testování účinných dávek pro léčení konkrétních poruch na zvířatech zajišťuje následnou předpokládanou indikaci dávky u lidí. Metody pro podávání zahrnují orální, intravenózní, peritoneální, intramusculámí nebo transdermální podávání. Farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují vodu, fyziologický roztok, pufiy; bude jmenováno několik. Očekávaný rozsah dávek by měl být obvykle od 1 pg do '1 000 gg na kilogram tělesné váhy za den. Nicméně, dávky mohou být vyšší nebo nižší podle toho, jak urči ošetřující lékař s běžnou znalostí oboru. Pro úplnou diskuzi ke složení a rozmezí dávkování léku viz Remington.'s Pharmaceutical Sciences,

17* Ed,, (Mack Publishing Co., Easton, Perm., 1990), a Goodman and Gílmarťs: The Pharmacoíogical Bases o/Therapeutics, 9^th Ed, (Pergamen Press 1996).

• · · · · ·

-z? • · to to · to ······ • · ·· ·· • ••to · ··· ···« ·· ··

Léčebné použití založené na nukleových kyselinách

Je-li savec rnutantem nebo postrádá Z cyto 7 gen, může být složen Z cyto 7 gen do savčích buněk, V jednom z uspořádání je gen kódující Z cyto 7 polypeptid vložen in vivo do virového vektoru. Takové vektory obsahují zeslabené nebo defekíní DNA viry, jako jsou Herpes simplex virus (HSV), papillomavirus, virus Epstein Barrové (EBV), adenovirus, adenoasociovaný virus (.ÁAV) a podobně. Defekíní viry, kterým úplně nebo téměř úplně chybí virové geny, jsou preferovány. Defekíní virus není infekční, vloží-H se do buňky. Použiti' defektních virových vektorů dovoluje podávání k buňkám do specificky lokalizovaných oblastí bez nebezpečí, že by vektor mohl infikovat jiné buňky. Příklady konkrétních vektorů zahrnují, ale nelimitují, defekíní vektor defektního herpes viru 1 (HSV 1) [Kaplit et al., Malec. Cell Neurosci.., 2 : 320 ~ 330 (1991)], vektor oslabeného adenoviru, tak jak je vektor popsán v Stratford Perricaudeteřa/., J. Clin. Invest, 90 : 626 - 630 (1992) a vektor defektního adenoasociovaného viru [Samulski et al., J. Viroi, 61 : 3096 - 3101 (1987); Samulski et al. J. Viroi.. 63 : 3822 - 3828 (1989)].

V jiném uspořádání může být gen vložen do retrovirového vektoru, např. jak je popsáno v Anderson etal., U. S. Patent No. 5, 399, 346; Mann etal. Cell 33 : 153 (1983); Temin etal, U. S. Patent No. 4, 650, 764; Temin etal., U. S. Patent No. 4, 980,289; Markowitzeřa/.. «Ζ Virol., 62: 1120 (1988); Temin etal, U. S. Patent No. 5, 124, 263, International Patent Publication No. WO 95/07358, published March 16,1995 by Dougheríy eía/,, &Blood, 82 : 845 (1993).

Vektor může být též vložen pomocí lipofekce in vivo & použitím lipozomů. K přípravě lipozomů pro in vivo transfekci genu kódujícího markér mohou být použity syntetické kationtové lipidy [Felgner et al, Proč; Natí Acad Sci. USA, 84 : 7413 - 7417 (1987); vizMackeyetal, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85 : 8027 -- 8031 (1988)]. Použití lipofekce k vkládání exogenních genů do specifických orgánů in vivo má určité parciální výhody. Molekulární cílení liposomňke specifickým buňkám představuje jednu z oblasti (využití) užitku.

Je zřejmé, že směrování transfekce ke konkrétním buňkám představuje jednu oblast, užitku. Je zřejmé, že směrování transfekce ke konkrétním typům buněk by bylo zvláště výhodné ve tkáni, s buněčnou. heterogenitou, jako jsou pankreas, játra, ledviny a mozek. Lipidy mohou být chemicky spojovány s jinými

-289 9 9 99 9 • · 99 9 9 9 9 • 9 9

999 99 99 molekulami cílení. Cílené peptidy, např. hormony nebo neurotransmiteiy a proteiny jako protilátky nebo nepeptidové molekuly mohou být chemicky připojeny k lipozómům.

Je možné vyjmout buňky z těla a vložit do nich vektor jako je holý DNA plazmid a pak reimplantovat takto transformované buňky do těla. Holý DNA vektor pro genovou terapií může být vložen do požadované hostitelské buňky pomocí metod dobře známých v oboru, např. transtěkce, elektroporace, mikroinjekce, transdukce, buněčná fáze, DEAE dextran, kaiciumfosfátová precípitace , použitím genového díla nebo použitím DNA vektorového transportéru [viz např. NLnet aí, J. Biol. Chem,, 26? : 963 -967 (1992); Wueta/., J. Biol. Chem., 263 ; 14621 - 14624 (1988)].

Z cyto 7 polypeptidy mohou být též použity k přípravě protilátek, které se specificky vážou na Z, cyto 7 polypeptidy. Tyto protilátky mohou pak. být použity k přípravě antiidioíypiekých protilátek. Termín „protilátky“ jak je zde použit, zahrnuje polykíonální protilátky, monoklonální protilátky, jejich antigen - vázající fragmenty, jako jsou F (ab')₂ a .Fab fragmenty a podobné protilátky připravené metodami genetického inženýrství. Protilátky jsou definovány tak, aby při jejich specifické vazbě na Z cyto 7 polypeptid byla K_a větší nebo rovná 10⁷/M. Afinita monoklonální protilátky může být snadno určena jednou z metod běžných v oboru (viz například Scatchard, ibid.}.

Metody přípravy polyklonálních a monoklonálních protilátek jsou dobře známé v oboru (víz například Sambrook et aí, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition) (Cold Spring Harbor, NY, 1989); a Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybrídotna Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, lne., BocaRaton, FL, 1982). Jak je zřejmé pracovníku s běžnými znalostmi v oboru, polykíonální protilátky mohou být vytvářeny různých teplokrevných živočichů, jako jsou koně, krávy, kozy, ovce, psi, kuřata, králíci, myši a krysy. ímunogenicitu Z cyto 7 polypeptidu lze zvýšit pomocí použití adjuvants, jako je Freundsovo úplné nebo neúplné adjuvants. K detekci protilátek, které se specificky vážou na Z cyto 7 polypeptidy, mohou být využity rozličné zkoušky známé pracovníkům v oboru. Příklady takových zkoušek jsou detailně popsány v Antibodies: A Laboratory Manual, Haríow and Lané (Eds.), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Reprezentativní příklady takových zkoušek. obsahují; souběžné imunoelektroforézy, radioimunologické zkoušky, radioimunoprecipítace, zkoušky s enzymem vázaným na imunosorbentu (enzyme - linked immunosorbent assays ELISA), «· ···· • * · · · · · · · · · • · · ····« • » 4 · ·»·····» • · · · · » ···· · ··· ···· ·· ··

-3-1metody bodového přenosu (dot blot assays), zkoušky inhibice nebo kompetice a sendvičová stanovení.

Jak by mělo být zřejmé pracovníkům s běžnou znalostí v oboru, poiyklonální poiyklonální protilátky mohou být vytvořeny očkováním různých tepiokrevných zvířat, jako jsou koně, krávy, kozy, ovce, psi, kuřata, králíci, myši, křečci, guinejská prasata a krysy, Z cyto 7 polypeptidem nebo jeho fragmenty. ímunogenita Z cyto 7 polypeptidů může být zvýšena použitím odjuvants, jakoje alum (aluminum hydroxid) nebo Freundsova kompletního nebo nekompletního adjuvants. Polypeptidy užitečné pro imunizaci zahrnují též fúzované polypeptidy jako jsou fůze Z cyto 7 nebo jeho částí s imunoglobalinovým polypeptidem nebo s proteinem vázajícím maltózu. Polypeptidový imunogen může být použit v plné délce molekuly nebo její části. Je-li Část polypeptidů „hapíenového typu“, pak může být část výhodně spojena nebo vázána na makromolekulami nosič (tak jako porézní přílipkový hemocyanin (KLH), hovězí sérový albumin (BSA) nebo tetanový toxoíd) vhodný pří imunizaci.

Termín „protilátky“, jak je zde použit, zahrnuje poiyklonální protilátky, afinitně puntíkované poiyklonální protilátky, monoklonáíní protilátky a antigen vázající fragmenty jako F(ab')2 ^a F<ih proteolytické fragmenty. Metodami genetického inženýrství připravené intaktní protilátky nebo fragmenty jako jsou chimérické protilátky, Fv fragmenty, jednořetězcové protilátky a podobné stejně jako syntetické antigen vázající peptidy a. polypeptidy jsou též obsaženy. Nehumánní protilátky mohou být humanizovány roubováním nehumánních CDR na humánní základní strukturní a konstantní úseky nebo včleněním úplných nehumánních variabilních domén, [případně jejich potažení („cloaking“), tzv. „human - like“ povrchem při odstranění přečnívajících zbytků, kde výsledkem je maskovaná („veneered“) protilátka]. V některých případech mohou humanizované protilátky obsahovat nehumánní zbytky uvnitř variabilních úseků základních struktur domén, vhodností pro zvýšení vazebných charakteristik. Prostřednictvím humanizovaných protilátek lze zvýšit biologický poločas přeměny, tím snížena možnost nepříznivých imunitních reakcí při podávání lidem.

Jme techniky pro tvoření nebo výběr protilátek zde užitečné zahrnují vystavení lymfocytů vlivu Z cyto 7 proteinu nebo peptidů m vitro a. výběr protilátky z fagů nebo podobných vektorů na display genové banky (například, pomocí imobilizovaného nebo značeného Z cyto 7 proteinu nebo peptidů).

9* 9*9»

-30• 9 ··

Geny kódující polypeptidy, které mají potenciální Z cyto 7 polypeptid vázající domény mohou být získány šerem ingem v bance náhodných peptidů zobrazených nafágu („phage display⁴’) nebo na bakterii jako je E. coli. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy mohou být získány mnoha způsoby, tak jako pomocí náhodné mutageneze a náhodné polynukleotidové syntézy. Tyto náhodné peptid zobrazující knihovny mohou být wužíty pro třídění (sereening) peptidů, které interagují se známými cílykterými může být protein nebo polypeptid, tak. jako ligand a. nebo receptor, biologická nebo syntetická makromolekula, nebo organické či anorganické látky, Techniky pro tvorbu a třídění (sereening) takových zobrazovacích knihoven náhodných peptidů jsou dobře známé v oboru (Ladner et al, US Patent NO. 5, 223,409; Ladner ěí a/., US Patent NO. 4,946, 778; Ladner etal, US Patent NO. 5,403, 484 a Ladner et al., US Patent NO. 5, 571, 698) a zobrazovací banky náhodných peptidů a soupravy pro sereening takových knihoven jsou komerčně dostupné například odClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne. (San Diego, CA), New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia LKB Biotechnology lne. (Piscataway, NJ'). Zobrazovací knihovny náhodných peptidů mohou být tříděny pomocí zde uvedených Z cyto 7 sekvencí za účelem identifikace proteinů, které se vážou na Z cyto 7. Tyto „vazebné proteiny⁴’, které interagují s Z cyto 7 polypeptidy mohou být použity pro značkovací buňky;, pro izolování homologních polypeptidů pomocí afinitní purifikace, mohou být přímo nebo nepřímo navázány na léky, toxiny, radionukiidy a podobné. Tyto vazebné proteiny mohou být též použity v analytických metodách tak jako pro sereening expresivních knihoven a neutralizační aktivity. Vazebné proteiny mohou být použity pro diagnostické zkoušky, pro určení cirkulujících hladin polypeptidů, pro detekci akvantitaci rozpustných polypeptidů jako markérů skrytých patologií nebo nemocí. Tylo vazebné proteiny se mohou též účastnit jako Z cyto 7 „antagonisté⁴’ k blokování Z cyto 7 vázající a signální transdukce in vitro a in vivo.

Protilátky mohou být též tvořeny genovou terapií. Zvířeti je podávána DNA nebo RNA, která kóduje Z cyto 7 nebo jeho imunogenní fragment tak, že buňky zvířat jsou transfektovány nukleovou kyselinou a exprimuje se protein, který' v důsledku toho vyvolává imunogenní odpověď. Protilátky, které jsou. pak zvířetem produkovány, jsou izolovány ve formě poiykionálních nebo monoklonálních protilátek.

Protilátky k Z cyto 7 mohou být použity pro značkovací buňky, které exprimiyí protein, pro afinitní punnkacb v diagnostických zkouškách při urrčení cirkulačních hladin rozpustných proteinových polypeptidů a jako antagonísty k blokování ligand vázající a signální transdukce in vitro a in vivo.

Radiační hybridní mapování je technika genetiky somatických buněk vyvinutá pro konstrukci styčných map savčích chromozomů s vysokým rozlišením [Cox etal., Science 250 ; 245 - 250 (1990)]. Částečná nebo úplná znalost sekvence genů umožňuje sestavení PCR primerů vhodných pro použití s mapujícími panely diromozomálních radiačních hybridů. Komerčně dostupné radiační hybrid mapující panely, které pokrývají úplný lidský genom tak jako the Stanford G3 RH Panel a ťhe Gene Bridge 4 RH Panel (Research Genetics, lne,, Huntsviíle, AL) jsou k dispozici. Tyto panely umožňují rychlou, na PCR založenou chromozomálni lokalizaci a uspořádání genů, sekvencemi značených míst (STSs) a jiných nepoíymorfických a polymorfických markérů v oblasti zájmu. Ta zahrnuje stanovení přímo úměrných fyzikálních vzdáleností mezi nově objevenými geny z oblasti zájmu a, především mapované markéry. Dokonalá znalost pozic (umístění) genů může být v mnoha případech zahrnujících: 1) určeni, zdaje sekvence částí existujících přilehlých sekvencí a připravených obklopujících genetických sekvencí v různých formách jako jsou YAC-, BAC- nebo cDNA klony, 2) opatření možného kandidáta genu pro nedědíčné choroby, který vykazuje vazbu ke stejnému chromozomálnímu úseku, 3) pro křížené referenční organizmy jako myši, které mohou pomoci určit jakou funkci by mohl mít určitý gen.

Tento vynález též zajišťuje reagencie, které nacházejí uplatnění v diagnostických aplikacích. Například Z cyto 7 gen byl mapován na chromozomu 5 q 3 L Vzorek Z cyto 7 nukleové kyseliny by mohl být použit ke zkoušce abnormalit na 5. chromozomu. Například, vzorek obsahující Z cyto 7 DNA nebo RNA nebo jejich subsekvence může být určen ke zjištění, zda Z cyto 7 gen je přítomen na chromozomu 5 q 31 nebo zda došlo k mutaci. Detegovatelné chromozomálni aberace v místě genu Z cyto 7 zahrnují aneuploidy, množství změn v kopírování genů, inzerce, delece, restikční změny .míst a přeskupení. Takové aberace mohou být delegovány pomocí polynukleotidu tohoto vynálezu s využitím technik molekulární genetiky jako je analýza poiymorfie délky restrikčních fragmentů (Rf LP), analýza krátké tandemové repetice (STR) využívající PCR technik a jiné techniky geneticky vázaných analýz známé v oboru [Sambrook etal., ibidx Aasubel. et. al, ibid: Marian, A. J., Chest, 108: 255 - 265, (1995)].

Z cyto 7 mapy v úseku 5 q 31, který je „genovým shlukem („gene cluster“), který obsahuje skupinu cytokininů a eytokininových receptorů. Cytokininy zde shromážděné obsahují IL - 3, IL - 4, IL - 5, IL - 13, GM - CSF a M - CSF. Tento výsledek prokazuje pravost Z cyto 7' jako cytokininů.

Tento vynález je dále ilustrován několika následujícími příklady, jejichž výčet však není zdaleka úplný.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Klonování Z cyto 7

Z cyto 7 byl identifikován z expritiovaného sekvenčního přívěsku (EST) definovaného SEQ ID č. 3 na základě jeho homologností k. Interleukinu -17, Klon cDN A byl získán z banky cDNA lidský srdcí plodů. Plazmid obsahující cDNA byl naočkován (do proužků) na misky s LB 100 pg/ml ampicilinu a 100 pgZml methicilinu. Vložený úsek (insert) byl určen tak, aby měl délku 717 párů bází se 180 aminokyselinami otevřeného čtecího rámce a předpokládanými 20 aminokyselinami signálního peptidu.

-33 • · · ·

Příklad 2: Analýza northemového přenosu

Byly zkoušeny lidské násobné tkáňové přenosy 1, 2, 3 (Ciontech), aby se urcilo tkáňové rozdělení Z cyto 7, BcoRi/Notí fragment obsahující úplný Z cvío 7 kódující úsek byl vytvořen z EST 582069 klonu a použit pro zkoušku. Plazmický prep. EST 582069 byl připraven z 5 mí LB 100 pg/ml ampicilinu kultivách přes noc při 37 °C s použitím QIA prep Spin Miniprep Kit (Qiagen). 12 μί ze 100 mí bylo vyluhováno s 5 μί H bufru (Boehringer Mannheim), 12,5 jednotek EcoRl (Gibco BRL) a 12,ř jednotek Not 1 (New England Biolabs) v 50 μί reagovalo 2 hodiny při 37 °C. Výluh byl podroben elektroforéze na 0,7 % TBE agarózovém gelu a fragment byl vyříznut. K získání dalšího materiálu byl výluh opakován za stejných podmínek jako výše s tím rozdílem, že ve druhém výluhu bylo použito 24 μΐ LIST 582069. Druhý výluh byl podroben elektroforéze na 0,7 % TBE agarózovém gelu a fragment byl vyříznut DNA byla extrahována z obou plátků, gelu pomocí rychlé soupravy pro geiovou extrakci (QIA quick Gel Extraction Kit) (Qiagenj. 135 ngtéto DNA bylo označeno pomocí P³² za použití Multipríme DNA Labeling Systém (Amersham) a nezačleněná radioaktivita byla odstraněna na Nuc Trap Probe Purification Column (Straiagene). Mnohonásobné tkáňové přenosy a základní přenos lidské RNA byly prehybndizovány 3 hodiny s 10 mí Express Hyb Solution (Ciontech) obsahujícím 1 mg DNA. ze spermatu lososa, která, byla, povařena 5 minut, pak zmražená i minutu a přidána k 10 mi Express Hyb Solution, promíchána a přidána k přenosům. Hybridizace byla vedena přes noc při 65 °C. Podmínky na počátku proraývání byly následující: 2.X SSC, 0,05 % SDS RT po dobu 40 minut s několika výměnami roztoku, pod 0,IX SSC, 0,1 % SDS pří 50 °C po dobu 40 mírnit, 1 výměna roztoku. Přenosy byly pak exponovány na film při -80 ®C po dobu 5 hodin. Pak byla provedena cross hybridiza.ee/pozadi přenosy (skvrny) byly následně promyty při 55 ^eC, pak pří 65 °C 0,1 % X SSC, 0,1 % SDS po dobu 1 hodiny každý. Mícha vykazovala velmi vysokou expresi Z cyto 7 mRNA, zatímco průdušnice vykazovala slabou expresi m RN A. Velikost trafskripee byla průměrně 0,75 kb.

-34• ·

I

Příklad 3: Značení a umístění chromozomů Z cyto 7.

Z cyto 7 byl mapován na chromozomu 5 s použitím komerčně dostupného „Gene Bridge 4 Radiation Hybrid Panel“ (Research Genetics, ínc., Huntsville, AL). „Gene Bridge 4 Radiation Hybrid Panel“ obsahuje PCR. (PC detegovatelné) DNA ze všech 93 klonů radiálních hybridů plus dvě kontrolní DNA (HFL donor a A23 recipient), Veřejně dostupný WWW zásobník (http: ll wtw - genome. wi. mít. edu/cgibin/contig/rhmapper. pl) umožňuje mapování v poměru k Whitehead Institute/MÍT Center for Genome Research’» map radiálních hybridů. lidského genomu (the „WICGR“ radiation hybrid map of the human genome), které byly konstruovány pomocí Gene Bridge 4 Radiation Hybrid Panel.

Pro mapování Z cyto 7 pomocí „Gene Bridge 4 RH Panel“ byly nasazeny 20 μΐ reakce na PCR (detegovatelné) 96 - jamkové mikrotttrační desky (Stratagene,, La Joíla, CA) a použity do „Robo Cycíer Gradient 96“ tepelného cvkleru (Stratagene). Každá z 95 PCR reakcí obsahovala po 2 μΐ 10 X Klen Taq PCR reakční pufr (CLONTECH Laboratories, lne., Palo Aíto, CA), 1. ,6 μΐ dNTPs mix (2,5 mM každá, PERKÍN - ELMER, Poster City, CAý í μΐ negativního primerů SEQ ID č. 4,1 μΐ pozitivního primerů SEQ ID e. 5,2 μΐ „Redi Load“ (Research Genetics, ínc., Huntsville, AL), 0,4 μί 50X Advantage Klen Taq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, ínc.), 25 ng DNA z jednotlivého hybridního klonu nebo kontrolního a χ μί ddHfo) deptit do celkového objemu 20 μί. Reakce byly převrstveny stejným množstvím minerálního oleje a uzavřeny. Podmínky v PCR. cyklem byly následující: počáteční 1 cyklus 5 minut denaturace pří 95 °C, 35 cyklů po 1 minutě denaturace při 9.5 °C, 1 minuta temperování při 52 ^dC a 1 minuta temperování extenze při 72 C následován posledním 1 cyklem extenze 7 minut při 72 °C. Reakce byly separovány elektroforézou na 3 % Nu Sieve GTG agarózovém gelu (BMC Bíoproducts, Rockland, ME).

Výsledky ukazují, že Z cyto 7 mapy 490.89 cR. z vrcholu lidského chromozomu 5 vážou skupinu na WÍCGR mapě radiačních hybridů. Jejím nejbližším proximálním markérem vzhledem k centromeru je D5S413 a její nejbíižsí distální markér je WI - 5208. Použitím obklopujících markérů byl Z cyto 7 umístěn na úseku 5q 31.3 -q32 na integrované LDB mapě chromozomu

- 3^4 · · ·

4 4 4 4 4 • · ·» 3 • · ► · <

k·· 4· 44 (The Genetic Location DataBase, University of Southhainpton, WWW server; hííp; // cedar. genetics. soton. ac. uk/ public Jiíml·').

Přiklad. 4; Konstrukce Z cyto 7 expresívních vektorů

Byly provedeny dvě konstrukce vektorů. Z cyto 7 do FLAG sekvence aminokyselin (SEQ ID S. 10) a byly vloženy do N - koncových nebo C koncových konců Z cyto 7 polypeptidů. Pro konstrukci, v níž byla připojena FLAG sekvence aminokyselin k N - konci Z cyto 7 byl vytvořen 473 bp Z cyto 7 PCR DNA fragment pomocí 1 μΐ na 1/4 zředěného EST 582069 plazmid prepu příkladu 2 a 20 pikomolů (pm) příměru SEQ ID č. 6 a 20 pm primerů SEQ ID č. 7. PCR reakce byla inkubována při 94 °C po dobu I minuty, pak proběhlo 5 cyklů, přičemž jednotlivý cyklus zahrnoval po 20 sekundách při 94 °C a 2 minuty při 64 °C, Pak následovalo 22 cyklů, přičemž každý cyklus zahrnoval 20 sekund při 94 °C a, 2 minuty při 74 ^eC. Reakce byla ukončena inkubací při 74 °C po dobu 10 minut. 50μ1 PCR reakční směsí bylo vyluhováno s 30 jednotkami Bam H! (Boehringer Mannheim) a 120 jednotkami Xhol (Boehringer Mannheim) při 37 °C po dobu 2 hodiny. Vytoužená reakční směs byla podrobena elektroforéze na 1 % TBE gelu, DNA proužek byl vyříznut žiletkou a DNA, byla. z gelu extrahována pomocí soupravy Qíaquick® Gel Extraction Kít (Qiagen). Vyříznutá· DN A byla subklonována do plazmidu ηφζρ9, který byl řezán s Bam a Xho, Nfpzp9 je expresívní vektor savčích buněk zahrnující expresívní kazetu obsahující myší inetallothionein 1 promotor, sekvenci kódující vedoucí tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA), pak FLAG peptid (SEQ ID č. 10) a četná redukční místa. Dále následoval terminátor lidského růstového hormonu, A coli počátek replikace a savčí jednotka savčího selektivního markéru exprese obsahující SV 40 promotor, zvyšovač a spouštěč replikaci.;, dihydrofolát reduktázový gen (DHFR) a SV 40 terminátor.

Pro konstrukci Z cyto 7 genu, do kterého byl vložen C - konec FLAG na C - konec Z cyto 7 polypeptidů byl vytvořen 543 bp Z cyto 7 PCR fragment s l ul 1/4 ředěným EST 582069 plazmidového přípravku popsaného v příkladu I a po 20 pm od každého primerů. SEQ ID c. 8 a SEQ ID š. 9. PCR reakce byla

-3G~ • · · · · · · · • · · · · · • · · ······ • · · · ······« ·· ·♦ inkubována při 94 °C po dobu 1 minuty, pak proběhlo 5 cyklů, přičemž každý cyklus zahrnoval 20 sekund při 94 °C a 2 minuty při 55 °C. Pak následovalo 22 cyklů, přičemž každý cyklus zahrnoval 20 sekund při 94 ^eC a 2 minuty při 74 °C. Reakce byla ukončena 10 minutovou extenzí pri 74 °C. Úplná reakční směs byla nanesena na 1 % ΊΒΒ gel, pak byla DNA vyříznuta žiletkou a DNA z, gelu byla extrahována za použití QIAQUICK^ gelové extrakční soupravy. 20 μί se 35 μί získaných tímto způsobem bylo vyluhováno s 10 jednotkami Bam H1 (Boehringer Mannheim) a 10 jednotkami BcoRÍ (Gibco BRL) po dobu. 2 hodin při 37 °C. Vytoužená PCR směs byla. podrobena elektroforéze na 1 % nin TBE gelu. DNA proužek byl vyříznut žiletkou a DNA byla z gelu za použití soupravy QIA quick ® Gel Extraction Kit (Qiagen). Extrahovaná DNA byla subklonována do plazmidu cřpzp9, který byl vyříznut pomocí BcoRÍ a BamHl. Plazmid cfpzp9 je savci expresívní vektor obsahující expresívní kazetu, která má myší metaUothionein -1 promotor, Četná restrikční místa, pro vkládání kódujících sekvencí, sekvenci kódující FLAG peptid. (SEQ ID Č. 10), stop kodon, terminátor lidského růstového hormonu, £ coli počátek replikace, jednotku savčího selektivního markéru exprese obsahující SV 40 promotor, zvyšovač a spouštěč replikace, DHFR. gen a SV 40 terminátor.

Použitím protilátek k FLAG pofypeptidům mohou být separovány FLAG - značené Z cyto 7 polypeptidy z buněčné supernatantové kapaliny.

Příklad 5: Klono váni myšího Z cyto 7

Myší Z cyto 7 byl identifikován z EST SEQ ID č, 14 na základě své homologie k lidskému Z cyto 7. Byl objeven cDNA klon v knihovně myší embryonální cDNA. přičemž embrya byla 13,5 až 14,5 dne stará Tato cDNA byla poskytnuta jako agarový „vpich“ obsahující E. coli transfekíovenou plazmidem obsahujícím uvedenou cDNA, pak naočkována (do proužků) na misky obsahující LB Í00 pg/mí ampicilinu, 25 pg/ml methiciliinu, cDNA vložená do EST 660242 byla sekvencována. Bylo stanoveno, že inzert obsahuje 785 párů bází s otevřeným čtecím rámcem 180 aminokyselin a předpokládaných 20 aminokyselin signálního peptidu. Sekvence jsou definovány sekvencemi SEQ ID č. 11 a SEQ ÍD Č. 1.2.

• · · · • · · · • · · · · · • · • · ··

-?>3 -

Příklad 6; Tkáňové rozdělení myšího Z cyto 7

Pro určování tkáňového rozdělení myšího Z cyto 7 byly zkoušeny tyto metody: myší násobný tkáňový nothemový přenos (Clonteeh, Palo Aíto, CA), myší nothemový bodový přenos (Clonteeh), myší embryonální nothemový přenos a bodový přenos myší míchy.

Myší embryonální RNA byla izolována z myších embryí, která byla stará 6 až 9 dni od data fertiliza.ee, přičemž byla použita souprava PÓLY (A) PURE* mRNA. isoiation kit (Ambion). 100 mg každého myšího embrya bylo rozštěpeno v 1 ml štěpícího pufru,. pak homogenizováno a podrobeno vsádkové metodě (batch) podle výrobního protokolu. Pro northemový přenos bylo naneseno 2 pg RNA na 1,5 %ní agarózový gel s 2,2 M formaldehydu. Gel byl provozován při 60 V po dobu čtyř hodin, a 30 minut. RNA byla transferována přes noc na Nytranovou membránu, která byla předem zvlhčena v 20 X SSC. RNA byly zesítěny na membránu pomocí UV světla a vypáleny při 80 ®C po dobu I hodiny.

Myší míšní RNA byla též připravena pomocí izolační soupravy PÓLY (A) PURE* mRNA isoiation kit (Ambion). Bodový přenos myší míchy byl proveden nanesením skvrn bodů s I, 2 a 3 μί RNA při koncentraci 1 pg RNA/μΙ na Nytranovou membránu.

Notl/EcoRI fragment obsahující úplný Z cyto 7 kódující úsek byl vytvořen z klonu obsahuj ícího S EQ ID č. 1.2 (dále referován jako SEQ ID č. 12 klon) a byl použit pro zkoušku. Plazmidový prep SEQ ID č. 12 klonu byl připraven z 5 ml LB 100 pg/ml ampicilinu kultivovaného přes noc při 37 °C za použití soupravy QIAPREP ŠPÍN MfNíPREP kit (Qiagen). 4,66 pg bylo vyluhováno s 8 μί pufru s vysokou pufrovací schopností (Boehringer Mannheim), 20 jednotkami Not 1 (Bioíabs) a 20 jednotkami EcoRI (Gibco

-38 BRL) v 80 μί reakčního objemu pn 37 °C po dobu 2 hodiny. Výluh byl podroben elektroforéze na 1,0 %ním TBE gelu a fragment s DNA byl vyříznut. DNA byla extrahována z gelového plátku za použití soupravy QIAQUICK® gel extraction kit (Qiagen). 98,8 ng tohoto fragmentu, bylo označeno pomocí p³² za použití značícího systému MULTÍMPRÍME* DNA laheling systom (Amersham) a nezačleněná radioaktivita byla odstraněna na patronové purifíkační koloně NUCTRAP® (Stratagene).

Dva prepy northemového přenosu a dva prepy bodového přenosu byly prehybridizovány po dobu 3 hodiny při 65 °C následujícím způsobeni 1 mg spermata lososa byl povařen 5 minut, zchlazen 1 minutu, smíchán s 10 ml EXPRES SHÝB® roztokem a přidán k přenosům. Hybridizace byla vedena přes noc při 65 °C. Počáteční podmínky vymývání byly následující: 2 X SSC, 0,1 % SDS po dobu 40 minut při pokojové teplotě, pak 0,1 X SSC, 0,1 % SDS po dobu 40 minut při 50 °C. Přenosy byly exponovány na film přes noc při 80 °C. Nothemové přenosy a myší bodový přenos byly dále vymyty s 0,1 % SSC, 0,1 % SDS při 60 °C, aby se odstranilo pozadí. Bodový přenos myší míchy byl promyt znova důrazněji s 0,1 % X SSC, 0,1 % SDS pří 65 °C za účelem potvrzení včasnějších výsledků.

Výsledky: Exprese myšího Z cyto 7 byla patrná v míše, slinné žláze a epididymis. Myši embryo vykazovalo expresi Z cyto 7 počínaje dnem 12 s maximem v 16. dni a končící 17. dnem od data fertilizace. Velikost transkripce byla průměrně 1 kb.

Příklad 7: Proliferace chondrocytů použitím Z cyto 7

Byla provedena zkouška proliferace chondrocytů za účelem určení účinku, jaký by mohl mít Z cyto 7 na proliferaci chondrocytů. Zkouška byla provedena s 20 %ními «tekavými kulturami. Pro kontrolní pokus byl přidán ke kultuře chondrocytů hovězí sérový albumin místo Z cyto 7. Zkouškou byla měřena inkorporacé 3H - thymidinu DNA vznikající v ehondroeytecb, Wahl et ai, Mol. Cell. Biol. 8 : 5016 - 5025 (1988).

··· 0 0 00 • 00 « ·

31Výsledky: Po vystavení kultury chondrocytů 1 pg/ml Z cyto 7 byla pozorována 3,5 až. 9 násobná stimulace proliferace chondrocytů. Stimulace chondrocytů pomocí Z cyto 7 byla pozorována u mnoha, přípravků proteinů a byla pozorovatelná, všeobecně u řady druhů. Naproti tomu kontrolní experiment s použitím BS A (hovězí sérový albumin) nevykazoval žádnou stimulaci chondrocytů.

Příklad 8; Příprava glykozaminoglykanu pomocí chondrocytů ošetřených Z cyto 7

Byla připravena 20 %ní stékavá kultura chondrocytů a byl aplikován Z cyto 7 v koncentraci 1 pg/ml Ve druhém pokusu by i navíc k Z cyto 7 k buněčné kultuře aplikován ÍL - 1 fl. Ke kontrolní skupině byl ke kultuře chondrocytů přidán BSA. Hladina giykozaminogiykanu (GAG) produkovaného kulturou chondrocytů byla pak určena pomocí zkoušky s 1,9 dimethylmethylenovým modrým barvivém, Fardaleetal, Biochem. Biophys. Afen 888 : 173 - 177 (1987).

Výsledky: Chondrocyty, které byly kultivovány s Z cyto 7, vykazovaly 50 %ní zvýšení stálé přítomnosti GAG v kultuře chondrocytů.· Navíc, jestliže bvíy chondrocyty kultivovány s Z cyto 7 a interleukinem - 1 fl (ÍL - 1β), zvýšila se produkce GAG 2,5krát ve srovnání s tím, byly-li chondrocyty kultivovány buď se Z cyto 7 nebo ÍL - Ifl samostatně. Buňky., které byly kultivovány s přídavkem BSA, nevykazovaly žádné zvýšení produkce GAG.

·· » ♦ ♦ · ► · · · t « · « · · λ

• · 9 · 9

-Hopříklad 9: Stimulace osteoblastů pomocí Z cyto 7

Buněčná linie CCC4 je osřeoblastům podobná buněčná linie odvozená z p53 omráčené myši. Linie CCC-4 byía transíektována pomocí plazmidu obsahujícího indukovatelný element sérové odpovědi (SRE = sérum response element) řídícího expresi luciferázy. Stimulace SRE a následná exprese luciferázy naznačuje, že chemická entita pravděpodobně stimuluje osteoblasty.

CCC4 buňky byly kultivovány v přítomnosti I gg Z cyío 7/ml kultivačního média. Kontrolní BSA, fíbrobíastový růstový faktor (FGF) a plateletami derivovaný růstový faktor (PDGF) byly přidány k různým kulturám CCC4 buněk. BSA byla negativní kontrola a FGF a PDGF byly pozitivní kontroly, protože jsou známé tím, že podporují proliferaci. osteoblastů. Aktivita luciferázy byla určena přídavkem 40 μί Promega luciferáze substrátu s použitím „2 second integrated read on Labsystes LUMINOSKAN*“.

Výsledky: Z cyto 7 stejně jako FGF a PDGF stimulují expresi luciferázy ve zkouškách ukazujících, že stimulují osteoblasty. Kontrolní pokus s BSA byl v této zkoušce negativní.

Příklad 10: Účinek Z cyto 7 na růst fibroblastů

Stěkavé kultury lidských kožních, piicních a fekálních piicních fibroblastů byly zaočkovány Z cyto 7, aby se určil účinek Z cyío 7 na růst fibroblastů. Jako pozitivní kontrola bvl použit FGF a jako negativní kontrolní pokus byl použit BSA.

Výsledky: Z cyto 7 neměl žádný účinek na růst fibroblastů.

Pokus 11; Účinek Z cyto 7 na růst BaF.3 buněk

Buňky BaF3, myší pre - B buněčné linie závislé na proliferaci ÍL - 3 byly několikrát promyty základním médiem a pak umístěny do 96 - jamkové plotny, každá jamka obsahovala průměrně 5 500 buněk/jamku. Buňky byly ošetřeny buď I pg/ml Z cyto 7 nebo 1 - 2 pg/ml IL - 3 nebo kombinací obou Z cyto 7 a ÍL - 3. V odděleném pokuse byly též přidány do jamek místo Z cyto 7 0,1 -10 ng/ml TGFB. Po inkubaci plotny pří 37 °C po dobu 3-6 dnů v přítomnosti 5 % CO₂ bylo přidáno 20 μΐ „ALAMAR blue“ do každé jamky a plotna byla inkubována 15 až 24 hodin při 37 °C, Plotna byla vyhodnocena pomocí fluorometru při excitační vlnové délce'544 nm a emisní vlnové délce 590 nm. Před přídavkem „ALMAR blue“ byla zkouška též posouzena prostým okem z hlediska stimulace nebo inhibice proliferace buněk. Základní médium obsahovalo RPMÍ 1 640 + 10 % HIA - PBS + L - glutamin + Na pyruvát.

Výsledky: Z cyto 7 a TGFfi význačně inhibují ÍL - 3 řízenou proliferaci buněk BaF3. Nicméně jestliže byly přidány protilátky neutralizující TGFfi spolu s Z cyto 7, byla Z cyto 7 inhibice proliferace buněk BaF3 eliminována

Příklad 12; Účinek Z cvío 7 narůst TF -1 buněk.

Buňky TF - .1, lidská leukemická buněčná linie, která je závislá na GM CSF nebo ÍL - 1β, byly několikrát promyty základním médiem a umístěny na 96 - jamkovou plotnu, přičemž každá jamka obsahovala průměrně 7 000 buněk/na jamku. Buňky byly kokultivovány s 1 pg/ml Z cyto 7 a 100 - 200 pg/ml IL - Ifi. V odděleném experimentu byl do jamek místo Z cyto 7 přidán TGFfi. Po • · • * • · • · • · · · » « Φ φ · · • · · · · φ · φφφ φφφ • · · • Φ φ Φ Φ Φ Φ inkubaci plotny při 37 °C po dobu 3 až 6 dnů v přítomnosti 5 % CCL bylo do každé jamky přidáno 20 ul „ALMAR blue“ a protna byla inkubována 15 až 24 hodin pří 37 °C. Pak byla plotna vyhodnocena pomocí fíuorometru při excitační vlnové délce 544 nm a. emisní vlnové délce 590 nm. Před přídavkem „ALMAR blue“ bylo též provedeno posouzeni prostým okem z hlediska stimulace nebo inhibice proliferace buněk. Základní médium obsahovalo RPMI. 1 640 + 10 % ΗΪ.Α - FBS +· L - glutamin + Na pyruvát.

Výsledky: IL - Ifí stimulace TF - i buněk je inhibována jak Z cyto 7, tak i TGF β.'Koncentrace Z cyto 7, při níž se objevila inhibice, byla vyšší, než 200 ng/ml; a koncentrace TGF - β, při které se objevila inhibice proliferace byla okolo 50 pg/ml.

4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 »4444444 • 4 4 4 4 4

4444 · 4·4 4444 44 44

SEZNAM SEKVEN

Μ-Λ (i) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) ŽADATEL,; Zymo Genetics, ínc.

1201 Eastlake Avenue Bašt

Seattíe

Wa

USA

98102 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU; izolovaný polynukleotid, který kóduje savci Z cyto 7 polypeptid, expresivní vektor, protilátka a způsob její přípravy.

(iii) POČET SEKVENCÍ; 43 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA;

(A) ADRESÁT; Zymo Genetics, ínc, (B) ULICE: 1201 Eastlake Avenue East (C) MĚSTO; Seattíe (D) STÁT: WA (E) ZEMĚ; USA (F) ZIP: 98102 (v) FORMULÁŘ ČITELNÝ POČÍTAČEM:

(A) Typ média: disketa (B) POČÍTAČ: IBM Compatibíe (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: DOS (D) SOFTWARE: Fast SEQ pro Windows Version 2.0 (vin) PRÁVNÍ ZÁSTUPCE z AGENT INFORMACE;

(A) JMÉNO: Lunn, Paul G (B) REGISTRAČNÍ ČÍSI,O: 32, 743 (C) ODKAZY ί ČÍSLO PŘIHRÁDKY; 97-15 PC • 9 9 9

9 9

999 999

9

99

9 9 99 9

9

9 ·

9 9 9 9 (2) INFORMACE PRO SEQ ID ¢.: i;

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 736 páru bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZENÍ: Jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV / KLÍČ: Kódující sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 57 ... 596 (D) JINÉ INFORMACE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č.: I

GAATTCGGCA CGAGGAGGCG GGCAGCAGCT GCAGGCTGAC CUGCAGCU GGCGGA ATG 59 Met

GAC

TGG

CCT

CAC

AAC

CTG

TTT

CU

ACC

AU

TCC

ATC

UC

CTG

107

Asp

Trp

Pro

His

Asn

Leu

Phe

Leu

Thr

Ile

Ser

Ile

Phe

Leu

5

10

15

GGG

CTG

GGC

GAG

CCC

AGG

AGC

CCC

AAA

AGC

AAG

AGG

AAG

GGG

CAA

GGG

155

Gly

Leu

Gly

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

20

25

30

CGG

CCT

GGG

CCC

CTG

GCC

CCT

GGC

CCT

CAC

CAG

GTG

CCA

CTG

GAC

CTG

203

Arg

Pro

Gly

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

35

40

45

GTG

TCA

CGG

ATG

AAA

CCG

TAT

GCC

CGC

ATG

GAG

TAT

GAG

AGG

AAC

251

Val

Ser

Arg

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

50

55

60

65

- 95~ • · · · * · » · * · · • » ·*· ·♦*

4 ·· • · * • · ♦ · • · · >«·· · 999 9

ATC GAG GAG ATG GTG GCC CAG CTG AGG AAC AGC TCA GAG CTG GCC CAG Ile Glu Glu Met Val Ala Gin Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gin ' 75 80

AGA AAG TGT GAG GTC AAC KG CAG CTG TGG ATG TCC AAC AAG AGG AGC

Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gin Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser

90 95

CTG TCT CCC TGG GGC TAC AGC ATC AAC CAC GAC CCC AGC CGT ATC CCC

Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro

100 105 110

GTG GAC CTG CCG GAG GCA CGG TGC CTG TGT CTG GGC TGT GTG AAC CCC

Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro

115 120 125

TTC ACC ATG CAG GAG GAC CGC AGC ATG GTG AGC GTG CCG GTG TTC AGC

Phe Thr Met Gin Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser

130 135 140 145

CAG GTT CCT GTG CGC CGC CGC CTC TGC CCG CCA CCG CCC CGC ACA GGG

Gin Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly

150 155 160

CCT TGC CGC CAG CGC GCA GTC ATG GAG ACC ATC GCT GTG GGC TGC ACC

Pro Cys Arg Gin Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr

165 170 175

TGC ATC TTC TGAATCACCT GGCCCAGAAG CCAGGCCAGC AGCCCGAGAC CATCCTCCT Cys Ile Phe ,180

TGCACCTTTG TGCCAAGAAA GGCCTATGAA AAGTAAACAC TGACTTTTGA AAGCCAGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAATT CCTGCGGCCG C (2) INFORM ACE PRO SEQ ID č.: 2;

299

347

395

443

491

539

587

645

705

736 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA; 180 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘBTEZENJ: Jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

130

999 9

99 » · * · > · · · ··· ♦·· « · ·« «·

115

SEK	:ve;	l\ Y.- i 2	SE	:qii	5 č.:
Pro	His	Asn	Leu	Leu	Phe	Leu	Leu
	5					10
Gly	Gin	Pro	Arg	Ser	Pro	Lys	Ser
20					25
Gly	Pro	Leu	Ala	Pro	Gly	Pro	His
				40
Arg	Met	Lys	Pro	Tyr	Ala	Arg	Met
			55
Glu	Met	Val	Ala	Gin	Leu	Arg	Asn
		70					75
Cys	Glu	Val	Asn	Leu	Gin	Leu	Trp
	85					90
Pro	Trp	Gly	Tyr	Ser	Ile	Asn	His
100					105
Leu	Pro	Glu	Ala	Arg	Cys	Leu	Cys
				120
Met	Gin	Glu	Asp	Arg	Ser	Met	Val
			135
Pro	Val	Arg	Arg	Arg	Leu	Cys	Pro
		150					155

Thr Ile

Lys Arg

Ser Ile Phe 15

Lys Gly Gin 30

140

Val	Pro	Leu	Asp
45
Glu	Tyr	Glu	Arg
Ser	Glu	Leu	Ala
			80
Ser	Asn	Lys	Arg
		95
Pro	Ser	Arg	Ile
	110
Gly	Cys	Val	Asn
125
Val	Pro	Val	Phe
Pro	Pro	Arg	Thr

145 150 155 160

Gly Pro Cys Arg Gin Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys 165 170 175

Thr Cys Ile Phe 180 (2) INFORMACE PRO SEQ ÍD č.: 3:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA;

(A) DÉLKA; 39? párů bází (B) TYP; nukleová kyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY; jiný (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ÍD č.: 3:

AGGCGGGCAN

GCTGTTTCTT

AGAGGAAGGG

TGGTGTCACG

TGGTGGCCCA

AGCTGCAGGC

CTTACCATTT

GCAAGGGCGG

GATGAAACCG

GCTGAGGAAC

TGACCTTGCA

CCATCTTCCT

CCTGGGCCCN

TATGCCCGCA

AGCTCANAAG

GCTTGGCGGA

GGGGCTGGGC

TGGCCTGGCC

TGGAGGAGTA

CTGGCCCAGA

CTCACAACCT

CCCAAAAGCA

CCACTGGACC

ATCGAGGAGA

GGTCAACTTG

120

180

240

300

ATGGACTGGC

AGCCAGGAGC

TCACCAGGTG

TGAGAGGAAC

GAAAGTGTGA

99

9 ·» ··« *

‘ll GTCTCCCne GGGCTACA^pfCAtaÁ AElJ U

CGACCCCAGC CGTATCCCCG TGGGACCTTG CCGGGAC 397 (2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiný (Vil) PŘÍMÝ ZDROJ:

(B) KLON: ZC 13265 (xi.) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 4:

TTACCATTTC CATCTTCC (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 5;

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY;

(A) DÉLKA: 18 párů bázi (B) TYP: nuklová kyselina (C) .ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (11) TYP MOLEKULY; Jiný (vil) PŘÍMÝ ZDROJ:

(B) KLON: ZC 13266 (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID Č.: 5:

CCCTTCCTCT TGCITTTG (2) INFORMACE PRO SEQ ID C.: 6;

(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 29 párů. bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETBZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) ΊΎΡ MOLEKULY: Jiný (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

•to ···· • · · · · to · <

• · i ···· ·· ··

LON; ZC 13326 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č,; 6:

CAAGGAICCC AGC.'CC'AGGAG CCCCAÁAAG (2) INFORMACE PRO AEQ ID Q: 7:

(Ϊ) SEKVENČNÍ CH ARAKTERÍSTÍKY:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (Β) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: Imeámi (ii) TYP MOLEKULY': Jiný (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

(B) KLON: ZC 3330 (xi) POPIS STAVU: SEQ ID ČU 7:

GACCTCGAGT C AG :AGGíGCAGgC (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 8:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová, kyselina (C) ŘETĚZENI: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: Jiný (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

(B) KLON: ZC 13325 (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID Č,; 8;

GTCGAATTCÁ TGGACTGGCC TCACAACCTG (2) INFORMACE PRO SEQ ID C,; 9:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP; nukleová kyselina (C) ŘETEZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

- */9• · ♦ ♦ · * · • · 4 »

444 444

4

44 • · • ·· · » (ii) TYP MOLEKULY; Jiný (vii) PŘÍMÝ ZDROJ;

(B) KLON: ZC 13327 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID G; 9: .

GAAGGATCCG AAGATGCAGG TGCAGCC (2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 10;

(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA:

(B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (η) TYP Y 'í0í_/E.K.u.1jY . peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Č.: 10:

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser I ’ ' 5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 11:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY;

(A) DÉLKA: 692. párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: 1 Kódující sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 50 ... 589 (D) JINÉ INFORMACE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Q: 1 L

GGGGTTCCTG GCGGGTGGCA GCTGCGGGCC TGCCGCCTGA _5θCTTGGTGGG ATG GAC TGG Met Asp Trp • · ··«9

		• • 9 · 9	9 · 9 9 9 *	• •	• 9 9 9 9 9 999
CCG CAC AGC CTG CTC	KC CTC CTG GCC ATC TCC ATC KC	CTG GCG	CCA	106
Pro His Ser Leu Leu	Phe Leu Leu Ala Ile Ser Ile Phe	Leu Ala	Pro
5	10 ’ 15
AGC CAC CCC CGG AAC	ACC AAA GGC AAA AGA AAA GGG CAA GGG AGG	CCC	154
Ser His Pro Arg Asn	Thr Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gin	Gly Arg	Pro
20	25 30			35
AGT CCC KG GCC CCT GGG CCT CAT CAG GTG CCG CTG GAC	CTG GTG	TCT	202
Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Val Pro Leu Asp	Leu	Val	Ser
40	45		50
CGA GTA AAG CCC TAC GCT CGA ATG GAA GAG TAT GAG CGG	AAC	CK GGG	250
Arg Val Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg	Asn	Leu	Gly
•55	60	65
GAG ATG GTG GCC CAG	CTG AGG AAC AGC TCC GAG CCA GCC	AAG	AAG	AAA	298
Glu Met Val Ala Gin	Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala	Lys	Lys	Lys
70	75 80
TGT GAA GTC AAT CTA	CAG CTG TGG KG TCC AAC AAG AGG	AGC	CTG	TCC	346
Cys Glu Val Asn Leu	Gin Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg	Ser	Leu	Ser
85	90 95
CCA TGG GGC TAC AGC	ATC AAC CAC GAC CCC AGC CGC ATC	CCT GCG	GAC	394
Pro Trp Gly Tyr Ser	Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile	Pro Ala	Asp
100	105 110			115
KG CCC GAG GCG CGG	TGC CTA TGT KG GGT TGC GTG AAT CCC	KC	ACC	442
Leu Pro Glu Ala Arg	Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro	Phe Thr
120	125		130
ATG CAG GAG 'GAC CGT AGC ATG GTG AGC GTG CCA GTG KC AGC	CAG	GTG	490
Met Gin Glu Asp Arg	Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser	Gin	Val
135	140	145
CCG GTG CGC CGC CGC	CTC TGT CCT CAA CCT CCT CGC CCT GGG	CCC	TGC	538
Pro Val Arg Arg Arg	Leu Cys Pro Gin Pro Pro Arg Pro	Gly	Pro	Cys
150	155 160
CGC CAG CGT GTC GTC	ATG GAG ACC ATC GCT GTG GGT TGC	ACC	TGC	ATC	586
Arg Gin Arg Val Val	Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys	Thr	Cys	Ile
165	170 175

—5799 »999

9 9 9 9 * 9 999 999 ···· *

TTC TGAGCCAACC ACCAACCCGG TGGCCTCTGC AACAAC CCTCCCTGCA. CCCACT Phe 180

GrGACCCTCA AGGCTGATAA ACAGTAAACG CTGTTCTTTG· TAAAGGA

692

645 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 12;

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY (A) DÉLKA: 180 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (h) TYP MOLEKULY; protein (v) TYP FRAGMENTU; vnitřní

(xi)	POPIS SEKVENCE;	SB	•-J á.Á.V V , ,	• 9· í, ,
Met Asp Trp Pro His Ser	Leu	Leu Phe	Leu Leu Ala	Ile	Ser	Ile Phe
1	5			10					15
Leu Ala Pro Ser His Pro	Arg	Asn Thr	Lys Gly Lys Arg Lys Gly Gin
	20		25					30
Gly Arg Pro Ser Pro Leu	Ala	Pro Gly	Pro	His	Gin	Val	Pro Leu Asp
	35		40				45
Leu	Val Ser Arg Val Lys	Pro Tyr Ala	Arg	Met	Glu	Glu Tyr Glu Arg
	50	55				60
Asn	Leu Gly Glu Met Val	Ala	Gin Leu	Arg	Asn	Ser	Ser	Glu	Pro Ala
65	70				75					80
Lys	Lys Lys Cys Glu Val	Asn	Leu Gin	Leu	Trp	Leu	Ser	Asn	Lys Arg
	85			90					95
Ser	Leu Ser Pro Trp Gly Tyr	Ser Ile	Asn	His	Asp	Pro	Ser	Arg	Ile
	.100		105					110
Pro	Ala Asp Leu Pro Glu	Ala	Arg Cys	Leu	Cys	Leu	Gly Cys	Val	Asn
	115		120				125
Pro	Phe Thr Met Gin Glu Asp Arg Ser	Met	Val	Ser	Val	Pro	Val	Phe
	130	135				140
Ser	Gin Val Pro Val Arg Arg Arg Leu	Cys	Pro	Gin	Pro	Pro	Arg	Pro
145	150				155					160
Gly	Pro Cys Arg Gin Arg Val	Val Met	Glu	Thr	Ile	Ala	Val	Gly Cys

165

170

Thr Cys

Ile Phe 180 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č,; 13;

·· ?··«

-57.' • ·«·* • · · • · ·*· · ··· ··« • · «· ·· (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 497 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZENI: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární topologie (iij TYP MOLEKULY; cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Č.: 13;

GGGGTTCCTG GCGGGTGGCA GCTGCGGGCC TGCCGCCTGA CTTGGTGGGA TGGACTGGCC 60

GCACAGCCTG CTCTTCCTCC TGGCCATCTC CATCTTCCTG GCGCCAAGCC ACCCCCGGAA 120

CACCAAAGGC AAAAGAAAAG GGCAAGGGAG GCCCAGTCCC TTGGCCCCTG GGCTCATCAG 180

GTGCCGCTGG ACCTGGTGTC TCGAGTAAAG CCCTACGCTC GAATGGAAGA GTATGAGGGG 240

AACCTTGGGG AGATGGTGGC CCAGCTGAGG AACAGCTCCG AGCCAGCCAA GAAGAAATGT ' 300

GAAGTCAATC TACAGCTGTG GTTGTCCAAC AAGAGGAGCC TGTCCCCATG GGGCTACAGC 360

ATCAACCACG ACCCCAGCCG CATCCCTGCG GACTTGCCCG AGGCGCGGTG CCTATGTTTG 420

GGTTGCGTGA ATCCCTTCAC CATGCAGGAG GACCGTAGCA TGGTGAGCGT GCCAGTGTTC 480 AGCCAGGTGC CGGTGCG 497 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č: 14:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTÍKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 14:

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

·· ····

-£•3 • 4 • · • · • · t »·· ·

•	··	··	··
• 4	4 ·	Λ ·	• ·
•	•	4 4	4 ·
•	•	4 44·	• 44
•	•	4	4
		• 4	··

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

VaT

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRD SEQ ÍD Č.: 15;

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENI; jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYT MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ÍD Č.: 15;

Gin

Pro

Arg

Ala

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

. Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 16: (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

ft · • · · · · « ·

-CH(A) DÉLKA; 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID G; 16:

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ala

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 17:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 1.60 aminokyselin (B) TYP: am inokyseíma (C) ŘETĚZENÍ; jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ÍD O; 17:

Gin Pro .Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gin Gly Arg Pro Aía 1 5 10 15 • · • · • 9 • · • · • 999 9

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

•Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(Z) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č'.; 18:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETEZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

4OLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.:

'8:

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ala

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100 105 110 • · · · • 9

99 9 9

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Pro Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 19:

TIKY (i) SEKVENČNÍ CHARAKTE (A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID Č.: 19:

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID O: 20:

(i.) SEK VENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina • · · · ·· • * (C) ŘETĚZENI', jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi

) PC

>PIS

SET

CVE

NCE

$; S E

íQ B

D C.

• 20:

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Leu

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145 150 155 160 (2) INFORMACE PRO SEQ ID C.: 21:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY.

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETEZENI: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č: 2,1:

Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gin Gly Arg

5 10

Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Val Pro Leu Asp Leu Val 20 25 30

Pro Gly 15

Ser Arg

- Sš• · ·

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

‘Ser

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin.

Arg

Phe

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 22 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘbTEZtíNí: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP M(

2LEKUL SEKVET

, Y: protein CE: SEQ ID Č.: 22:

(xi)

- POPIS;

Gin

Pro

Arg Ser Pro

Lys

Ser

Lys Arg Lys

Gly

Gin

Gly Arg Pro Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Gly Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly Tyr

Ser Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg Cys

Leu

Cys

Leu

Gly Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp Arg Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg 130 135 HO

Gin Arg Ala Val Met Glu Thr'lle Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe 145 150 155 160

(.2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 23:

(!) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 23;

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Ser

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115.

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 24 (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (€) ŘETEZENÍ: jednoduché .

(D) TOPOLOGIE; lineami ·· · ·· · rry? ρτζ ./ Χ.··.ί,ν

KULY; protein EQ ] (xi) POPIS SEKVENCI

V.·,

Gin

Pro

Arg

Ser

Pro

Lys

Val

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

85

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 25:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY (A) DÉLKA: .160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (π) IYP MOLEKULY; protein (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID Č.: 25:

Gin

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

35

40

45

Met Val Ala Gin Leu Arg Asn 50 55

Glu Val Asn Leu Gin Leu Trp 65 70

Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His

Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys 100

Gin Glu Asp Arg Ser Met Val 115

Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro 130 135

Gin Arg Ala Val Met Glu Thr 145 150

Ser Ser	Glu Leu	Ala Gin Arg Lys Cys 60
Met	Ser	Asn	Lys Arg	Ser	Leu Ser	Pro
			75					80
Asp	Pro	Ser Arg	Ile	Pro	Val Asp	Leu
		90					95
Leu	Gly Cys	Val	Asn	Pro	Phe Thr	Met
	105					110
Ser	Val	Pro	Val	Phe	Ser	Gin	Val	Pro
120					125
Pro	Pro	Pro	Arg	Thr	Gly	Pro	Cys Arg
				140
Ile	Ala	Val	Gly Cys	Thr	Cys	Ile	Phe
			155					160

(2) INFORMACE PRD SEQ ID O: 26:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 97 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETEZBNÍ; jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY: protein.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Č.: 26;

Cys Glu Val Asn Leu Gin Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser ¹ 5 10 15

Pro Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp - 20 25 30

Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr 35 . 40 45

Pro Val Phe Ser Gin Val 60

Pro Arg Thr Gly Pro Cys 75 80

Val Gly Cys Thr Cys Ile 95

Met Gin Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val 50 55

Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro 65 70

Arg Gin Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala 85 90

Phe (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 27:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY ·· :

• ·

- 62« « · · · · • · · · · » · ··· · · · • · · • · · · · · *· • ♦ (A) DtíLKÁ; 100 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární («) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEO ÍD Ů: 27:

Pro	Arg	Ser	Pro	Lys	Ser	Lys	Arg
1				5
Leu	Ala	Pro	Gly	Pro	His	Gin	Val
			20
Lys	Pro	Tyr	Ala	Arg	Met	Glu	Glu
	35.					40
Val	Ala	Gin	Leu	Arg	Asn	Ser	Ser
	50					55
Val	Asn	Leu	Gin	Leu	Trp	Met	Ser
65					70
Gly	Tyr	Ser	Ile	Asn	His	Asp	Pro
				85
Glu	Ala	Arg	Cys
			100

Lys	Gly	Gin	Gly Arg	Pro	Gly	Pro
10				15
Pro	Leu	Asp	Leu Val	Ser	Arg	Met
25			30
Tyr	Glu	Arg	Asn Ile	Glu	Glu	Met
		45
Glu	Leu	Ala	Gin Arg	Lys	Cys	Glu
			60
Asn	Lys	Arg	Ser Leu	Ser	Pro	Trp
	75				80
Ser	Arg	Ile	Pro Val	Asp	Leu	Pro
	90				95

(2) INFORMACE PRO SEQ ID C.: 28:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina.

(C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY; peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Č.: 28:

Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys GIv Gin Gly Arg Pro GIv Pro Leu (2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 29:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin • · · · · ·

• « · • · · • · » · · • 9 » 9 9 ~(o3(B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY; peptid (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ÍD Č.: 29;

Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn ile Glu Glu 1 5 10 15 (2) INFORMACE PRO SEQ ID C.; 30;

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ; jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY; peptid (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID Č.: 30:

Asn His Asp Pro Ser Arg tle Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Árg Cys i 5 I<f 15 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 31:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYT: aminokyselina (C) ŘETĚZENÉ jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY; peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Č.: 31:

Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gin 1 5 10 15

Arg · 9 · (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.; 32;

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY;

(A) DÉLKA; 47 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptide (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 32:

Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro ¹⁵ 10 15

Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met 20 25 30

Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu 35 40 45 (2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 33:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 70 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina.

(C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č

Arg

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

1

5

10

15

Glu

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

20

25

30

Cys

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

35

40

45

Pro

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

50

55

60

Leu

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

70 (2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 34: (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 61 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ; jednoduché ÍDt TOPOLOGIE: lineární \ s (ií) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SbQ ID č,: j4:

Asn

His

Asp

Pro Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

Pro

Glu Ala

Arg

Cys

1

5

10

15

Leu

Cys

Leu

Gly Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

Gin

Glu Asp

Arg

Ser

20

25

30

Met

Val

Ser

Val Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

Val

Arg Arg

Arg

Leu

35

40

45

Cys

Pro

Pro Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

Gin

Arg

50

55

60

(2)

i INt

‘ORj

MACE F

^SRO

SEC

í ID

č.: 35:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 35:

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

1

5

10

15

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

20

25

30

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

Val

Arg

Leu

35

40

45

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

Gin

Arg

Ala

Val

Met

50

55

60

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

65

70

(2) INFORMACE PRO SEQ ÍD Č.: 36:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 158 aminokyselin • * · · · · — 66 • 4 9 9 9 4 • · · · ♦ • 4 49 4 94 4

4 9 ·»♦4 9 9 44 (P>j IIP. aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ jednoduché (D_? TOPOLOGIE; lineární (u) TYP MOLEKi (xi) POPIS SEKVI

ŇN; protein ICE; SEQ ÍD Č.:

36;

Arg Ser Pro Lys

Ser

Lys Arg

Lys Gly

Gin

Gly Arg Pro Gly

Pro

Leu

1

5

10

15

Ala Pro Gly Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val Ser

Arg

Met

Lys

20

25

30

Pro Tyr Ala Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile Glu

Glu

Met

Val

35

40

45

Ala Gin

Leu Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg Lys Cys

Glu

Val

50

55

60

Asn Leu

Gin Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys Arg

Ser

Leu Ser

Pro Trp Gly

65

70

75

80

Tyr Ser

Ile Asn

His

Asp

Pro

Ser Arg

Ile

Pro

Val Asp

Leu

Pro

Glu

85

90

95

Ala Arg Cys Leu

Cys

Leu

Gly Cys

Val

Asn

Pro

Phe Thr

Met

Gin

Glu

100

105

110

Asp Arg

Ser Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin Val

Pro

Val

Arg

115

120

125

Arg Arg

Leu Cys

Pro

Arg

Thr

Gly Pro Cys Arg

Gin

Arg

130

135

140

Ala Val

Met Glu

Thr

Ile Ala

Val

Gly Cys

Thr Cys Ile Phe

145

150

155

\ T'\T'QHjT

> Ν Λ A

r>r> C

λ cm tt

v \ Z“⁵ .

4-¼ f~Í

GVIAL-n

rkl

) C.;

i Γ.

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTI.

(A) DÉLKA: 154 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENI: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

Cíi) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Ů: 37:

Ser Lys Arg Lys Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro

10 15

His Gin Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg 20 25 30

6?·· toto··

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

35

40

45

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin'

Arg

Lys

Cys

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

50

55

60

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

65

70

75

80

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

85

90

95

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

100

105

110

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

Val

Arg

Leu

Cys

115

120

125

Pro

Arg

Thr·

Gly

Pro

Cys

Arg

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

130

135

140

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

(2) INFORMACE PRD SEQ ID Č.: 38: (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY;

(A) DÉLKA; 151 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETEZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY; protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Č.: 38:

Lys	Gly	Gin	Gly	Arg	Pro	Gly	Pro	Leu	Ala	Pro
1			5					10
Pro	Leu	Asp	Leu	Val	Ser	Arg	Met	Lys	Pro	Tyr
		•20					25
Tyr	Glu	Arg	Asn	Ile	Glu	Glu	Met	Val	Ala	Gin
	³⁵					40
Glu	Leu	Ala	Gin	Arg	Lys	Cys	Glu	Val	Asn	Leu
	50					55
Asn	Lys	Arg	Ser	Leu	Ser	Pro	Trp	Gly	Tyr	Ser
65				70					75
Ser	Arg	Ile	Pro	Val	Asp	Leu	Pro	GTu	Ala	Arg
			85					90
Cys	Val	Asn	Pro	Phe	Thr	Met	Gin	Glu	Asp	Arg
		100					105
Pro	Val	Phe	Ser	Gin	Val	Pro	Val	Arg	Arg	Arg
		115					120

Gly Pro His Gin Val 15

Ala Arg Met Glu Glu 30

Leu Arg Asn Ser Ser 45

Gin Leu Trp Met Ser 60

Ile Asn His Asp Pro 80

Cys Leu Cys Leu Gly 95

Ser Met Val Ser Val 110

Leu Cys Pro Pro Pro 125 • · ··*♦

- 6$^ • · · · · · · f · · · »» · 9 9 9 9 9

9999 · 9 999 999

9 9 9 9 9

9999 9 ·*· ···* ·« «·

Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gin Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala 130 135 ₁₄₀

Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe'

145 150 (2) INFORMACE .PRO SEQ ÍD C,: 39:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETEZENI: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xí) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD Ů: 39:

His

Pro

Arg

Asn

Thr

Lys

Gly

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Ser

1

5

10

15

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

20

25

30

Val

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Leu

Gly

Glu

35

40

45

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Pro

Ala

Lys

Cys

50

55

60

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Leu

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Ala

Asp

Leu

⁸⁵

90

95

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

·,

100

105

110

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

115.

120

125

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Gin

Pro

Arg

Pro

Gly

Pro

Cys

Arg

130

135

140

Gin

Arg

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

155

160

(.2) INFORMACE PRO SEQ ID č.: 40:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 158 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETBZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · · · • · · 9 999999

9 9 9 9 9

9999 9 999 9999 99 99

(.ii) TYP MOLEKULY; protein (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ÍD Č.; 40;

Arg

Asn

Thr

Lys

Gly

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Ser

Pro

Leu

1

5

10

15

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

Val

Lys

20

25

30

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Leu

Gly

Glu

Met

Val

35

40

45

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Pro

Ala

Lys

Cys

Glu

Val

50

55

60

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Leu

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

Trp

Gly

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Glu

85

90

95

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

Gin

Glu

100

105

110

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

Val

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Cys

Pro

Gin

Pro

Arg

Pro

Gly

Pro

Cys

Arg

Gin

Arg

130

135

140

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145 150 ' 155 (2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.; 41:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY;

(A) DÉLKA; 153 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché » (D) TOPOLOGIE: lineární ¹ (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ÍD č.: 41.

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Pro

His

1

5

10

15

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

20

25

30

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

35

40

45

- 7Ό • 4 ·

4

444 4 • 4 • 4 44

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

Glu

Val Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

50

55

60

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

'Ser

Pro

Trp

Gly Tyr

Ser

Ile

Asn

His

65

70

75

80

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

Pro

Glu Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

85

90

95

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

Gin

Glu Asp

Arg

Ser

Met

Val

100

105

110

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

Val

Arg Arg

Arg

Leu

Cys

Pro

115

120

125

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

Gin

Arg Ala

Val

Met

Glu

Thr

130

135

140

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

145

150

(2)

INFORMACE F

^řRO

SEfi

5 ID

V··..

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY;

(A) DÉLKA: .128 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ; jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 42:

Met

Lys

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

1

5

10

15

Met

Val

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

20

25

30

Glu

Val

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

35 .

40

45

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

50

55

60

Pro

Glu

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

65

70

75

80

Gin

Glu

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

85

90

95

Val

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

100

105

110

Gin

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

Phe

(2) INFORMACE PRO SEQ ID Č.: 43:

115 120 125 • · ·» *· • 9 · · · · ♦ · • · · ·♦·· ·· ·· (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERÍS (A) DÉLKA; 157 aminokyselin

Á jLj?

KY:

(B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZENÍ: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xn POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 43;

Arg

Ser

Pro

Lys

Ser

Lys

Arg

Lys

Gly

Gin

Gly

Arg

Pro

Gly

Pro

Leu

1

5

10

15

Ala

Pro

Gly

Pro

His

Gin

Val

Pro

Leu

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

Met

Lys

,2.0

25

30

Pro

Tyr

Ala

Arg

Met

Glu

Tyr

Glu

Arg

Asn

Ile

Glu

Met

Val

35

40

45

Ala

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Gin

Arg

Lys

Cys

Glu

Val

50

55

60

Asn

Leu

Gin

Leu

Trp

Met

Ser

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Ser

Pro

Trp

Gly

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Ser

Arg

Ile

Pro

Val

Asp

Leu

Pro

Glu

85

90

95

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Leu

Gly

Cys

Val

Asn

Pro

Phe

Thr

Met

Gin

Glu

100

105

110

Asp

Arg

Ser

Met

Val

Ser

Val

Pro

Val

Phe

Ser

Gin

Val

Pro

Val

Arg

115

120

125

Arg

Leu

Cys

Pro

Arg

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

Gin

Arg

130

135

140

Ala

Val

Met

Glu

Thr

Ile

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

Cys

Ile

145

150

155

·#·♦

Claims

1. Izolovaný polynukleotid, který kóduje savčí Z cyto 7 polypeptid nebo jeho varianty.

2. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde uvedený polynukleotid kóduje polypeptid vybraný ze skupiny SEQ ID c.: 2, SEQ ID č.: 12, SEQ ÍD č.: 14 - 27 a SEQ ID č.: 36-43.

3. Polynukleotid nároku 2, kde polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotídem je definovaný SEQ ID č.; 15 - 25, kde aminové konce uvedených polypeptidů začínají u obou aminokyselinových zbytků 3, argininem; aminokyselinového zbytku 7, serinu; aminokyselinového zbytku 8, lysinu; aminokyselinového zbytku 10, lysin nebo aminokyselinový zbytek 33 methionin.

4. Polynukleotid podle nároku 2, kde polypeptid kódovaný uvedeným poíynukleotidem je polypeptid. definovaný SEQ íD č: 2,12,14 - 25 a 36 až 42, kde konec aminokyselinových sekvencí u izoleucinů u aminokyselinového zbytku 179 SEQ ID ¢.: 2, u aminokyselinového zbytku 159 u SEQ ID č.: 14 25, který odpovídá aminokyselinovému zbytku 157 SEQ ÍD ě.i 36, aminokyselinovému zbytku 153 SEQ ID č.: 37, aminokyselinovému zbytku. 150 SEQ ID c.: 38, aminokyselinovému zbytku 159 SEQ ID č.; 39, aminokyselinovému zbytku 157 SEQ ID ¢.: 40, aminokyselinovému zbytku 152 SEQ ID č.: 42, aminokyselinovému zbytku 127 SEQ ID ¢.: 42.

5. izolovaný polynukleotid kódující peptid nebo polypeptid, který má alespoň 15 aminokyselinových zbytků obsahujících epitop - nesoucí část polypeptidu SEQ ID č.: 2, 14 - .27 a 36 - 43.

-?3~

Μ 0 0 0 0

00 00

0 0 0 0

000 000

0 0

00 00

6. Izolovaný polynukleotid podle nároku 5, kde je peptid nebo polypeptid vybraný ze skupiny skládající se ze SEQ ÍD č.: 28 - 35.

7, Polynukleotid podle nároku 5 nebo 6, kde peptid nebo polypeptid je fúzován k nosnému polypeptidu. nebo jiné nosné molekule.

8. Polynukleotid, který kóduje peptid nebo polypeptid, který je z 90 %, 95 % nebo 99 % identický s polypeptidy podle nároků 1-7.

9. Expresivní vektor obsahující následující operativně vázané prvky; transkripční promotor;

DNA segment definovaný podle nároku 1 - 8; a transkripční terminátor.

10. Expresivní vektor obsahující následující operativně vázané prvky;

(a) transkripční promotor;

(b) DNA segment kódující chimérický polypeptid, kde se uvedený chimérický polypeptid nezbytně skládá z první a druhé části spojené peptidovou vazbou, uvedená první část obsahuje savčí polypeptid, jenž je aminokyselinovými sekvencemi SEQ ID č.: 2,12, 14 - 43 a uvedená druhá část je druhý polypeptid nebo protein.

(c) transkripční terminátor.

11. Izolovaný savčí Z cyto 7 polypeptid nebo jeho varianty.

12. Izolovaný Z cyto 7 polypeptid podle nároku 11 vybraný ze skupiny sekvence aminokyselin skládajících se ze SEQ ÍD č. ; 2, 12, 14 - 27 a 36 - 43.

~ΤΑ9 9 9999

9 · · · 9 9 999 99 9 • · · · 9 9 ···· * 499 4444 49 44

13, Polypeptid podle nároku 12., kde polypeptid je polypeptid definovaný SEQ ID č. 15 ~ 25, kde aramové konce uvedených polypeptidů jsou modifikovány a začínají buď na aminokyselinovém zbytku 3 argininem; aminokyselinovém zbytku 7, serinem; aminokyselinovém zbytku 8 lysinem; aminokyselinovém zbytku 10 lysinem nebo na aminokyselinovém zbytku 33 methionínera.

14. Polypeptid podle nároku 12, kde polypeptid je polypeptid definovaný SEQ ID č.: 2, 12, 14 - 25 a 36 až 42, kde sekvence aminokyselinového konce u izoleucinů u aminokyselinového zbytku 179 SEQ ID č,: 2, u aminokyselinového zbytku. 159 SEQ ID č.: 14 -· 25, který odpovídá aminokyselinovému zbytku 157 SEQ ID č,.; 36, aminokyselinovému zbytku 153 SEQ ÍD č.: 37, arainokyselmovému zbytku 150 SEQ ID 38, aminokyselinovému zbytku 159 SEQ ID Č,; 39, aminokyselinovému zbytku 157 SEQ ID č.: 40, aminokyselinovému zbytku 152 SEQ ID č.: 42, aminokyselinovému zbytku 127 SEQ ID Č,; 42,

15. izolovaný peptid nebo polypeptid, jenž má alespoň 15 aminokyselinových zbytků obsahujících epitop nesoucí část polypeptidů Z cyto 7 polypeptidů.

16. Peptid nebo polypeptid podle nároku 15, kde je uvedený peptid nebo polypeptid epitop nesoucí část polypeptidů SEQ ÍD Č.: 2,14 - 27 a 36 - 43,

17. Izolovaný peptid nebo polypeptid podle nároku 16, kde je peptid. nebo polypeptid vybrán ze skupiny sekvence aminokyselin skládající se ze SEQ íDč,:28-35.

18. Izolovaný peptid nebo polypeptid, který je 90 %m 95 % nebo 99 % identický s peptidy nebo polypeptidy podle nároků 12 - 17.

99 ···· ·· • · • ···· » ·· » · * · * · · ·

999 ··· • 9

99 99

19. Izolovaný peptid nebo polypeptid podle nároků 12 - 17, mající sekvenci aminokyselin modifikovanou adicí, delecí a/nebo přemístěním jednoho nebo více aminokyselinových zbytků a které řídi biologickou aktivitu uvedeného peptidu nebo polypq

20. Protilátky, .které se specificky vážou na savčí polypeptid, uvedený * polypeptid je definovaný sekvencemi aminokyselin podle nároků 12 - 20.

21, Způsob přípravy protilátky, která se specificky váže na peptid nebo polypeptid podle nároků 12 -19 zahrnující očkování zvířete uvedeným peptidem nebo poíypeptidem nebo nukleovou kyselinou, která kóduje uvedený peptid nebo polypeptid, vyznačující se tím, že uvedené zvíře produkuje protilátky proti uvedenému peptidu nebo polypeptidu a. izolací této protilátky.

22. Protilátka podle nároku 21, kde uvedená protilátka je buď polyklonální nebo .monoklonální protilátkou.

23, Fragmenty protilátky, jednoduché řetězce protilátek nebo humanizované protilátky protilátek podle nároků 20 a 21.

24. Anti-idiotypická protilátka protilátky podle nároků 21 -23.