CZ310053B6 - Heterocyklické purinové deriváty cytokininů, jejich použití při hojení ran a farmaceutické kompozice obsahující tyto deriváty - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití heterocyklických purinových derivátů cytokininů obecného vzorce I a II při hojení ran, přičemž R6 je vybraný ze skupiny sestávající z: furfurylu, 4-hydroxybenzylu, 3,3-dimethylallylu, (Z)-4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-ylu a (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-ylu, a R3 a R9 je glukopyranosylová skupina. Řešení se dále týká použití farmaceutických přípravků obsahujících tyto deriváty. Uvedené sloučeniny stimulují migraci endotelových buněk, angiogenezi a vaskularizaci a vykazují také protizánětlivé vlastnosti.

Description

Heterocyklické purinové derivaty cytokininû, jejich pouziti pri hojeni ran a farmaceutické kompozice obsahujici tyto derivaty

Oblast techniky

Vynalez se tÿka heterocyklickÿch purinovÿch derivatù cytokininû, jejich pouziti pro hojeni ran a farmaceutickÿch pripravkù obsahujicich tyto derivaty.

Dosavadni stav techniky

Cytokininy jsou fytohormony identifikované pùvodne jako latky, které podporuji deleni rostlinnÿch bunek v pritomnosti dalsiho fytohormonu, auxinu. Pokud jde o jejich chemickou strukturu, rostlinné cytokininy jsou derivaty adeninu substituované v poloze N⁶ bud isoprenoidnim nebo aromatickÿm postrannim retezcem. Isoprenoidni cytokininy zahrnuji cis - a trans-zeatin ( tZ) a jejich analogy s nasycenÿm postrannim retezcem (dihydrozeatin) nebo bez hydroxylové skupiny (N⁶-isopentenyladenin). Zatimco isoprenoidni cytokininy jsou pritomny ve vsech rostlinach, aromatické cytokininy s N⁶-benzylovÿmi substituenty byly nalezeny pouze u nekterÿch taxonù. Krome 6-benzylaminopurinu (BAP) byly popsany jeho hydroxylované derivaty, tj. topoliny. Kinetin (K), prvni identifikovanÿ cytokinin, ma furfurylovÿ postranni retezec. Kinetin byl poprvé rozpoznan jako latka zodpovedna za cytokininovou aktivitu autoklavovanÿch spermii slede, ktera byla pripisovana tepelnému poskozeni DNA.

Protoze aktivita K proti starnuti byla pozdeji prokâzâna na koznich fibroblastech, stejne jako v pripade trans-zeatinu ( tZ), byly provedeny cetné studie k vyhodnoceni uzitecnosti cytokininovÿch bazi pri ochrane kùze v experimentech in vitro a in vivo. Experimenty s bunecnÿmi kulturami napriklad naznacuji, ze tZ by mohl zlepsit hydrataci pokozky a také zabranit skodlivÿm ùcinkùm starnuti na tyto procesy (Ji et al. 2010, Int J Mol Med 26:257-263). Osetreni tZ bylo také schopné do znacné miry zlepsit UV-indukovanÿ pokles koncentraci AQP3 proteinu a propustnosti vody membranou. Ukazalo se, ze pnrodni cytokininy (napr. kinetin a zeatin) a 6,9-disubstituované derivaty cytokininù maji biologické aktivity souvisejici se starnutim. Viz napriklad patenty US 5021422 (4. cervna 1991), US 5371089 (6. prosince 1994), US 5602139 (11. ùnora 1997), patent US 5614407 (zverejneni 8. brezna a 25. brezna 2005), z nichz vsechny jsou zde zahrnuty odkazem. Bylo také prokazano, ze cytokininové baze podporuji diferenciaci keratinocytù. Kinetin (40 az 200 μΜ) indukoval zastaveni rùstu a zmeny v nekolika markerech diferenciace v lidskÿch keratinocytech pestovanÿch v bunecné kulture (Berge et al. 2006, Ann N Y Acad Sci 1067: 332-336). Ùcinek byl zesilen pritomnosti Ca²⁺ iontù. Ostatni markery diferenciace (trans-glutaminaza) byly nezmeneny, coz naznacuje, ze diferenciace indukovana K je pravdepodobne zprostredkovana cestami odlisnÿmi od cest aktivovanÿch jinÿmi cinidly indukujicimi diferenciaci. V navazujici studii Berge et al. (Exp Gerontol 43: 658-662, 2008) uvadi, ze osetreni K zlepsila citlivost starnoucich keratinocytù na diferenciacni ùcinky iontù Ca²⁺. Pozitivni vliv K na hladiny filaggrinu, dalsiho markeru diferenciace keratinocytù, byl pozorovan u in vitro rekonstruovaného kozniho ekvivalentu (Vicanova et al. 2006, Ann N Y Acad Sci 1067: 337-342). Na rozdil od 2D kultury, K podporoval rùst keratinocytù, jak je indikovano zvÿsenim poctu Ki67-pozitivnich bunek. Dalsi dermatologické/kosmetické aplikace cytokininù se tÿkaji terapie poruch pigmentace. Zatimco se uvadi, ze K snizuje hyperpigmentaci u psù (Kimura a Doi 2004, Rejuvenation Res 7: 32-39), BAP byl rozpoznan jako stimulator melanogeneze (Kim et al. 2009, Arch Dermatol Res 301: 253-258).

Ackoli heterocyklické purinové cytokininy, zejména kinetin a zeatin, maji vÿznamné vlastnosti proti starnuti a dalsi vlastnosti, bylo by zadouci poskytnout dalsi biologické aktivity a pouziti techto pnrodnich sloucenin. Stale zùstâvâ totiz zadouci poskytnout dalsi cytokininové slouceniny, které mohou bÿt pouzity v siroké skale terapeutickÿch a kosmetickÿch aplikaci a pokud tyto slouceniny maji zlepsenou selektivitu a ùcinnost (tj. méne toxické a/nebo ùcinnëjsi)

- 1 CZ 310053 B6 nez v soucasnosti pouzivané 6-substituované aminopuriny. Pfedklâdanÿ vynâlez poskytuje takové slouceniny pro hojeni ran.

Podstata vynâlezu

Pfedmëtem tohoto vynâlezu jsou heterocyklické purinové derivâty obecného vzorce I a II

R₃ (II) nebo jejich farmaceuticky pfijatelné soli s alkalickÿmi kovy, amoniem nebo aminy, ve formé racemâtù nebo opticky aktivnich izomerû cukrû (β-D, a-D, β-L, a-L), pro pouziti pri hojeni ran, kde

R6 je vybranÿ ze skupiny sestâvajici z: furfùrylu, 4-hydroxybenzylu, 3,3-dimethylallylu, (Z)-4hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylu a (£)-4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylu, a

R3 a R9 je glukopyranosylovâ skupina.

Zvlâstë vÿhodnÿmi jsou heterocyklické purinové derivâty cytokininù obecného vzorce I a II vybrané ze skupiny sestâvajici z: 6-fürfurylamino-3^-D-glukopyranosylpurin, 6-(4hydroxybenzylamino)-3^-D-glukopyranosylpurin, 6-(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-3^-D-glukopyranosylpurin, 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-3^-Dglukopyranosylpurin, 6-fürfürylamino-9^-D-glukopyranosylpurin, 6-(4-hydroxybenzylamino)9^-D-glukopyranosylpurin, 6-(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9^-Dglukopyranosylpurin, 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9^-Dglukopyranosylpurin a jejich farmaceuticky pfijatelné soli s alkalickÿmi kovy, amoniakem nebo aminy, ve formé racemâtù nebo izomerù opticky aktivnich cukrù (β-D, a-D, β-L, a-L), jakoz i jejich adiëni soli s kyselinami pro pouziti pfi hojeni ran.

Heterocyklické derivâty cytokininù obecného vzorce I a II se pouzivaji k podpofe migrace endotelovÿch bunëk. Proto se vynâlez vjedné nebo vice formâch zamëfuje, i kdyz ne vÿluënë, na léëbu ran a podporu hojeni ran.

-2CZ 310053 B6

Heterocyklickÿ cytokininovÿ dérivât obecného vzorce I a II je vhodnÿ pro pouziti k lécbe stavû koznich chorob.

Dale je heterocyklickÿ cytokininovÿ dérivât obecného vzorce I a II vhodnÿ pro pouziti pri stimulaci angiogeneze endotelovÿch bunek, pro urychleni a podporu angiogeneze, a tedy pro poskytnuti v podstate okamzité ùlevy od bolesti a hojeni ran.

Priklady typû endotelovÿch bunek, které mohou bÿt indukovany k migraci heterocyklickÿm derivatem cytokininû obecného vzorce I a II zahrnuji endotelové bunky lidské pupecnikové zily, lidské mikrovaskularni endotelové bunky a endotelové bunky aorty. Mohou mit i rûznÿ savci pûvod.

Jeste dalsim aspektem vynalezu je heterocyklickÿ derivat cytokininû obecného vzorce I a II pro pouziti pro hojeni ran a/nebo cinidla modifikujici vzdalenost propojeni pri lécbe ran, vcetne akutnich, subakutnich, chronickÿch ran a ran se zpozdenÿm hojenim.

Predkladanÿ vynalez také poskytuje heterocyklické derivaty cytokininû obecného vzorce I a II pro zvÿseni rychlosti, rozsahu a/nebo kvality hojeni ran pouzitim jednoho nebo vice heterocyklickÿch derivatû cytokininû a jednoho nebo vice terapeutickÿch cinidel, cinidel uzitecnÿch pro hojeni ran a/nebo cinidla upravujici zaceleni ran.

Heterocyklickÿ derivat cytokininû obecného vzorce I a II je rovnez vhodnÿ pro pouziti pri stimulaci migrace fibroblastû, vaskularnich endotelovÿch bunek nebo epitelovÿch bunek do rany, pricemz pouziti zahrnuje chemokinezi a stimulaci fibroblastû, vaskularnich endotelovÿch bunek, epitelovÿch bunek, nebo jejich kombinace.

V jeste dalsim aspektu vynalez poskytuje pouziti heterocyklickÿch derivatû cytokininû obecného vzorce I a II pro podporu nebo zlepseni hojeni ran, léceni, prevenci a zmirneni fibrôzy nebo jinÿch fibrotickÿch stavû ran, zahrnujici podavani jednoho nebo vice heterocyklickÿch cytokininovÿch agens a jedno nebo vice terapeutickÿch cinidel, cinidel uzitecnÿch pro hojeni ran a/nebo cinidel modifikujicich zaceleni ran u nemocnÿch pacientû.

Ve vÿhodném provedeni ma kombinované pouziti jednoho nebo vice heterocyklickÿch derivatû cytokininû a jednoho nebo vice terapeutickÿch cinidel, cinidel uzitecnÿch pro hojeni ran a/nebo cinidel modifikujicich zaceleni ran aditivni, synergickÿ nebo superaditivni ùcinek pri podpore léceni ran.

Ve vÿhodném provedeni se heterocyklickÿ derivat cytokininû obecného vzorce I a II pouziva jako lécivo a/nebo kosmetika pro podporu migrace endotelialnich bunek u subjektu, kterÿ to potrebuje, zahrnujici lécbu subjektu alespon jednim derivatem cytokininu.

Dalsim aspektem vynalezu jsou heterocyklické derivaty cytokininû obecného vzorce I a II pro pouziti pri regeneraci kûze, zahrnujici podavani ùcinného mnozstvi slouceniny podle vynalezu subjektu, které zvysuje sekreci proteinû, cimz podporuje regeneraci kûze.

Tkanova mista a rany, které mohou bÿt léceny v souladu s vynalezem, zahrnuji akutni a chronické rany, popaleniny vcetne popalenin vzniklÿch vystavenim ionizujicimu zareni, chemické rany, chirurgické rany, oralni rany, poraneni kûze a svalû, otevrené kozni rany, diabetické kozni vredy vcetne diabetickÿch vredû na noze, diabetickÿch naturopatickÿch vredû na noze, ischemické tkane vcetne ischemickÿch naturopatickÿch vredû na noze, vredû ze staze zil, dekubitû a hypoxické tkane. Priklady ischemickÿch a hypoxickÿch tkani zahrnuji ischemickou srdecni tkan a hypoxické tkane spojené s mrtvici. Stavy, pri kterÿch mûze bÿt proces hojeni ran podporovan podavanim heterocyklickÿch derivatû cytokininû, zahrnuji i okolnosti opozdeného hojeni ran, kdy je hojeni naruseno nebo je mu zabraneno napriklad hypoxii tkani, opakovanÿm traumatem nebo systémovÿmi pricinami, jako je diabetes a cévni mozkové

- 3 CZ 310053 B6 prihody. Jak je zde pouzito, chronicka rana mùze oznacovat napriklad ranu, ktera je charakterizovana alespon castecne jednim nebo vice z nâsledujicich stavù: 1) chronickÿm samopretrvavajicim stavem zanetu rany, 2) deficitnim a defektnim extracelularni matrix (ECM) rany, 3) spatne reagujici (senescentni) poranené bunky, zejména fibroblasty, omezujici produkci ECM a 4) selhani reepitelizace castecne kvùli nedostatku nezbytnÿch slozek ECM a nedostatku tkanové infrastruktury pro migraci. Chronické rany zahrnuji bércové vredy, arterialni vredy, dekubity, vaskulitické vredy a diabetické vredy.

Krome vÿse uvedené definice mùze termin rana také zahrnovat napriklad poraneni kùze a podkozni tkane iniciovana rùznÿmi zpùsoby (napr. otlaky z prodlouzeného odpocinku na lùzku a rany zpùsobené traumatem) a s rùznÿmi charakteristikami. Rany mohou bÿt klasifikovany do jednoho ze ctyr stupnù v zavislosti na hloubce rany: i) Stupen I: rany omezené na epitel; ii) Stupen II: rany zasahujici do dermis; iii) Stupen III: rany zasahujici do podkozni tkane; a iv) Stupen IV (nebo rany plné tloustky): rany, kde jsou odhaleny kosti. Termin „rana s castecnou tloustkou“ se tÿka ran, které zahrnuji stupne I az III; priklady ran s castecnou tloustkou zahrnuji popaleniny, otlaky, vredy ze staze zil a diabetické vredy. Termin „hluboka rana“ zahrnuje rany III. i IV. stupne. Prostredky a zpùsoby podle predkladaného vynalezu uvazuji o lécbe vsech typù ran, vcetne hlubokÿch ran a chronickÿch ran. Termin chronicka” rana se tÿka rany, ktera se nezhojila. Mezi chronické kozni rany patri napriklad dekubity, vredy, brisni vredy, diabetické vredy, bércové vredy, vaskulitické vredy, arterialni vredy a smisené vredy. Chronicka rana mùze bÿt arterialni vred, kterÿ obsahuje ulcerace vyplÿvajici z ùplné nebo castecné arterialni blokady. Chronicka rana mùze bÿt venôzni stazovÿ vred, kterÿ zahrnuje ulcerace zpùsobené poruchami funkce zilni chlopne a souvisejici vaskulârni onemocneni. Chronicka rana mùze bÿt traumatem vyvolanÿ vred, diabetickÿ vred nebo vaskulitickÿ vred.

Ve vÿhodném provedeni je predmetem vynalezu farmaceutickÿ pripravek pro pouziti pri hojeni ran, obsahujici jeden nebo vice heterocyklickÿch derivatù cytokininù obecného vzorce I a II nebo jejich farmaceuticky prijatelnÿch soli s alkalickÿmi kovy, amoniem nebo aminy, ve forme racematù nebo opticky aktivnich izomerù nebo jejich adicni soli s kyselinami, a jeden nebo vice excipientù.

Pouziti pro hojeni ran ma rovnez kompozice obsahujici jeden nebo vice heterocyklickÿch derivatù cytokininu obecného vzorce I a II nebo jejich farmaceuticky prijatelné soli s alkalickÿmi kovy, amoniem nebo aminy, ve forme racematù nebo opticky aktivnich izomerù, nebo jejich adicni soli s kyselinami a jeden nebo vice excipientù urcenÿch pro lécbu stavù koznich chorob.

Uvedena kompozice je také uzitecna pro lécbu stavù souvisejicich se zanetem, jako je zanet, léze (napr. urychleni jejich hojeni), bolest a dalsi imunologické reakce vyplÿvajici ze zanetu (napr. poskytnuti jeho ùlevy) a/nebo lécbu zanetu kùze.

Dalsi vhodné pouziti latek podle vynalezu je pro lécbu chorobnÿch stavù u savcù, pricemz uvedené pouziti zahrnuje aplikaci mnozstvi nového heterocyklického derivatu cytokininù obecného vzorce I a II podle tohoto vynalezu na savci bunky a tkane.

Pouziti pro hojeni ran ma rovnez kompozice obsahujici jeden nebo vice heterocyklickÿch cytokininovÿch derivatù obecného vzorce I a II nebo jejich farmaceuticky prijatelnÿch soli s alkalickÿmi kovy, amoniem nebo aminy, ve forme racematù nebo opticky aktivnich izomerù, nebo jejich adicni soli s kyselinami a jeden nebo vice excipientù urcenÿch pro hojeni ran savcich epitelovÿch bunek.

Predmetem predkladaného vynalezu jsou rovnez heterocyklické derivaty cytokininù obecného vzorce I a II pro pouziti pri hojeni ran, pricemz se pouzije kombinace alespon dvou vÿse definovanÿch heterocyklickÿch purinovÿch derivatù cytokininù.

- 4 CZ 310053 B6

Predmetem predklâdaného vynâlezu jsou rovnez heterocyklické derivâty cytokininû obecného vzorce I a II pro pouziti pri hojeni ran, pricemz se pouzije kombinace 6-furfurylamino-3-e-Dglukopyranosylpurinu s trans-zeatinem a/nebo 6-furfurylamino-3-e-D-glukopyranosylpurinu s 6(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-ylamino)-9-β-D-glukopyranosylpurinem a/nebo 6fUrfUrylamino-9-β-D-glukopyranosylpurin s 6-( E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-ylamino)-9-eD-glukopyranosylpurinem.

Farmaceutické a kosmetické pripravky

Farmaceutickÿ pripravek obsahuje od 1 do 95 % aktivni lâtky, pricemz jednorâzové dâvky obsahuji prednostne od 20 do 90 % aktivni lâtky a pri zpûsobech aplikace, které nejsou jednorâzové, obsahuji prednostne od 5 do 20 % aktivni lâtky. Jednotkové dâvkové formy jsou napr. potahované tablety, tablety, ampule, lahvicky, cipky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou napr. masti, krémy, pasty, peny, tinktury, rtenky, kapky, spreje, disperze atd. Prikladem jsou tobolky obsahujici od 0,05 g do 1,0 g aktivni lâtky.

Vÿhodne jsou cinidla podle vynâlezu kombinovâna s farmaceuticky prijatelnÿm nosicem nebo redidlem za vzniku farmaceutické kompozice. Vhodné nosice a redidla zahrnuji izotonické solné roztoky, napriklad fosfâtem pufrovanÿ fyziologickÿ roztok. Vhodnâ redidla a excipienty také zahrnuji napriklad vodu, fyziologickÿ roztok, dextrôzu, glycerol a podobne a jejich kombinace. Krome toho, pokud je to zâdouci, mohou bÿt pritomny také lâtky, jako jsou smâcedla nebo emulgâtory, stabilizacni pufrovaci cinidla.

Termin farmaceuticky prijatelnÿ nosic se tÿkâ jakéhokoliv farmaceutického nosice, kterÿ sâm o sobe neindukuje produkci protilâtek skodlivÿch pro jedince, kterému je kompozice podâvâna, a kterÿ mûze bÿt podâvân bez nezâdouci toxicity. Vhodné nosice mohou bÿt velké, pomalu metabolizované makromolekuly, jako jsou proteiny, polysacharidy, polymlécné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerni aminokyseliny a kopolymery aminokyselin. Mohou bÿt také pritomny farmaceuticky prijatelné soli, napr. soli minerâlnich kyselin, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, fosfâty, sulfâty a podobne; a soli organickÿch kyselin, jako jsou acetâty, propionâty, malonâty, benzoâty a podobne.

Vhodné nosicové materiâly zahrnuji jakÿkoli nosic nebo vehikulum bezne pouzivané jako zâklad pro krémy, plet’ové vody, gely, emulze, plet’ové vody nebo barvy pro topické podâvâni. Priklady zahrnuji emulgâtory, inertni nosice vcetne uhlovodikovÿch bâzi, emulgacni bâze, netoxickâ rozpoustedla nebo ve vode rozpustné bâze. Zvlâste vhodné priklady zahrnuji pluronics, HPMC, CMC a dalsi slozky na bâzi celulôzy, lanolin, tvrdÿ parafïn, tekutÿ parafïn, mekkÿ zlutÿ parafïn nebo mekkÿ bilÿ parafïn, bilÿ vceli vosk, zlutÿ vceli vosk, cetostearylalkohol, cetylalkohol, dimethikony, emulgacni vosky, isopropyl myristât, mikrokrystalickÿ vosk, oleylalkohol a stearylalkohol.

Vÿhodne je farmaceuticky prijatelnÿm nosicem nebo vehikulem gel, vÿhodne neiontovÿ polyoxyethylen-polyoxypropylenovÿ kopolymerovÿ gel, napriklad gel Pluronic, vÿhodne Pluronic F-127 (BASF Corp.). Tento gel je zvlâste vÿhodnÿ, protoze je kapalnÿ pri nizkÿch teplotâch, ale rychle tuhne pri fyziologickÿch teplotâch, coz omezuje uvolnovâni cinidla na misto aplikace nebo bezprostredne sousedici s timto mi stem.

Pomocnâ lâtka, jakÿmi jsou kasein, zelatina, albumin, lepidlo, alginât sodnÿ, karboxymethylcelulôza, methylcelulôza, hydroxyethylcelulôza nebo polyvinylalkohol, mohou bÿt také zahrnuty do formulace podle vynâlezu. Dalsi vhodné formulace zahrnuji pluronic gel, formulace na bâzi karboxymethylcelulôzy (CMC) a formulace na bâzi hydroxypropylmethylcelulôzy (HPMC). Kompozice mûze bÿt formulovâna pro jakoukoliv pozadovanou formu podâvâni, vcetne topického, instilacniho, parenterâlniho, intramuskulârniho, subkutânniho nebo transdermâlniho podâvâni. Dalsi uzitecné formulace zahrnuji pripravky s pomalÿm nebo zpozdenÿm uvolnovânim.

- 5 CZ 310053 B6

Farmaceutické pripravky podle predlozeného vynalezu jsou pripravovany znamÿm zpûsobem, napr. beznÿm michanim, granulaci, potahovanim, rozpoustecimi nebo lyofilizacnimi procesy.

Prednostne jsou pouzivany roztoky aktivnich latek a dale také suspenze nebo disperze, obzvlaste izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou bÿt pripraveny pred pouzitim, napr. v pripade lyofilizovanÿch preparatû obsahujicich aktivni latku samotnou nebo s nosicem jako je mannitol. Farmaceutické pripravky mohou bÿt sterilizovany a/nebo obsahuji excipienty, napr. konzervacni pripravky, stabilizatory, zvlhcovadla a/nebo emulgatory, rozpousteci cinidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou pripravovany znamÿm zpûsobem, napr. beznÿm rozpoustenim nebo lyofilizaci. Zminené roztoky nebo suspense mohou obsahovat latky zvysujici viskozitu, jako napr. sodnou sûl karboxymethylcelulôzy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo zelatinu.

Olejové suspense obsahuji jako olejovou slozku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekcni ùcely. Oleje, které zde mohou bÿt zmineny, jsou obzvlaste kapalné estery mastnÿch kyselin, které obsahuji jako kyselou slozku mastnou kyselinu s dlouhÿm retezcem majicim 8 az 22, s vÿhodou pak 12 az 22 uhlikovÿch atomû, napr. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovidajici nenasycené kyseliny, napr. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, pripadne s pridavkem antioxidantû, napr. vitaminu E, βkarotenu nebo 3,5-di-terc-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholova slozka techto esterû mastnÿch kyselin nema vice nez 6 uhlikovÿch atomû a je mono- nebo polyhydricka, napr. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavne glykol a glycerol. Estery mastnÿch kyselin jsou s vÿhodou napr. ethyl oleat, isopropyl myristat, isopropyl palmitat, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleat, Gattefoseé, Pariz), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy pripravené alkoholÿzou oleje z merunkovÿch jader a slozené z glyceridû a esterû polyethylen glykolu; Gattefoseé, Pariz), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy pripravené alkoholÿzou TCM a slozené z glyceridû a esterû polyethylen glykolu; Gattefoseé, Pariz) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycenÿch mastnÿch kyselin s délkou retezce C8 az C12 od Hûls AG, Nemecko) a zvlaste rostlinné oleje jako bavlnikovÿ olej, mandlovÿ olej, olivovÿ olej, ricinovÿ olej, sezamovÿ olej, sôjovÿ olej a zejména olej z podzemnice olejné. Gely nebo zelé mohou bÿt vyrobeny za pouziti vhodného gelovaciho cinidla, vcetne, ale bez omezeni na uvedené, zelatiny, tragantu nebo derivatu celulôzy a mohou zahrnovat glycerol jako zvlhcovadlo, zmekcovadlo a konzervacni cinidlo. Masti jsou polotuhé pripravky, které se sklâdaji z aktivni slozky zaclenené do mastného, voskového nebo syntetického zakladu. Priklady vhodnÿch krémû zahrnuji, aniz by byl vÿcet omezujici, emulze vody v oleji a olej ve vode. Krémy typu voda v oleji mohou bÿt formulovany za pouziti vhodného emulgacniho cinidla s vlastnostmi podobnÿmi vlastnostmi mastnÿch alkoholû, jako je cetylalkohol nebo cetostearylalkohol, a emulgacnim voskem. Krémy typu olej ve vode mohou bÿt formulovany za pouziti emulgacniho cinidla, jako je emulgacni vosk cetomacrogol. Vhodné vlastnosti zahrnuji schopnost modifikovat viskozitu emulze a jak fyzikâlni, tak chemickou stabilitu v sirokém rozmezi pH. Ve vode rozpustnÿ nebo misitelnÿ krémovÿ zaklad mûze obsahovat stlacovaci systém Vative a mûze bÿt také pufrovan pro udrzeni prijatelného fyziologického pH.

Priprava injekcniho pripravku se provâdi za sterilnich podminek obvyklÿm zpûsobem, napr. plnenim do ampuli nebo lahvicek a uzaviranim obalû.

Napr. farmaceutické pripravky pro orâlni pouziti se mohou ziskat smichanim aktivni latky s jednim nebo vice tuhÿmi nosici, pripadnou granulaci vÿsledné smesi, a pokud je to pozadovano, zpracovânim smesi nebo granuli do tablet nebo potahovanÿch tablet pridavkem dalsich neutrâlnich latek.

- 6 CZ 310053 B6

Vhodné nosice jsou obzvlâste plnidla jako cukry, napr. laktôza, sacharôza, mannitol nebo sorbitol, celulôzové preparâty a/nebo fosforecnany vâpniku, s vÿhodou fosforecnan vâpenatÿ nebo hydrogenfosforecnan vâpenatÿ, dâle pojiva jako skroby, s vÿhodou kukuricnÿ, psenicnÿ, rÿzovÿ nebo bramborovÿ skrob, methylcelulôza, hydroxypropylmethylcelulôza, sodnâ sùl karboxymethylcelulôzy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud pozadovâno desintegrâtory jako vÿse zminené skroby a dâle karboxymethylovÿ skrob, zesitenÿ polyvinylpyrrolidin, alginovâ kyselina a jeji soli, s vÿhodou alginât sodnÿ. Dalsi neutrâlni lâtky jsou regulâtory toku a lubrikanty, s vÿhodou kyselina salicylovâ, talek, kyselina stearovâ a jeji soli jako stearât horecnatÿ a/nebo vâpenatÿ, polyethylen glykol nebo jeho derivâty.

Jâdra potahovanÿch tablet mohou bÿt potazena vhodnÿmi potahy, které mohou bÿt odolné vùci zaludecni st’âve, pricemz pouzivané potahy jsou mezi jinÿmi koncentrované roztoky cukrù, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titanicitÿ, dâle potahovaci roztoky ve vhodnÿch organickÿch rozpoustedlech nebo smesich rozpoustedel, ci pro pripravu potahù odolnÿch vùci zaludecni st’âve roztoky vhodnÿch celulôzovÿch preparâtù jako acetylcelulôzaftalât nebo hydroxypropylmethylcelulôzaftalât. Barviva nebo pigmenty jsou primichâvâny do tablet nebo potahovanÿch tablet napr. pro identifikaci nebo charakterizaci rùznÿch dâvek ùcinné slozky.

Farmaceutické pripravky, které mohou bÿt uzivâny orâlne, jsou také tvrdé tobolky ze zelatiny nebo mekké uzavrené tobolky ze zelatiny a zmekcovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivni lâtku ve forme granuli, smichanou napr. s plnidly jako je kukuricnÿ skrob, pojivy nebo lubrikanty jako talek nebo stearât horecnatÿ, a se stabilizâtory. V mekkÿch tobolkâch je aktivni lâtka prednostne rozpustena nebo suspendovâna ve vhodnÿch kapalnÿch lâtkâch neutrâlni povahy jako mazaci tuk, parafïnovÿ olej nebo kapalnÿ polyethylen glykol ci estery mastnÿch kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, pricemz je také mozno pridat stabilizâtory a detergenty napr. typu esterù polyethylen sorbitanovÿch mastnÿch kyselin.

Dalsi formy orâlniho podâvâni jsou napr. sirupy pripravované beznÿm zpùsobem, které obsahuji aktivni slozku napr. v suspendované forme a v koncentraci okolo 5 az 20 %, prednostne okolo 10 % nebo podobné koncentrace, kterâ umoznuje vhodnou individuâlni dâvku, napr. kdyz je mereno 5 nebo 10 ml. Ostatni formy jsou napr. prâskové nebo kapalné koncentrâty pro pripravu koktejlù, napr. v mléce. Takovéto koncentrâty mohou bÿt také baleny v mnozstvi odpovidajicim jednotkové dâvce.

Farmaceutické pripravky, které mohou bÿt pouzivâny rektâlne, jsou napr. cipky, které obsahuji kombinaci aktivni lâtky se zâkladem. Vhodné zâklady jsou napr. prirodni nebo syntetické triglyceridy, parafïnové uhlovodiky, polyethylen glykoly nebo vyssi alkoholy.

Pripravky vhodné pro parenterâlni podâni jsou vodné roztoky aktivni slozky ve forme rozpustné ve vode, napr. ve vode rozpustnâ sùl nebo vodnâ injekcni suspenze, kterâ obsahuje lâtky zvysujici viskozitu, napr. sodnou sùl karboxymethylcelulôzy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizâtory tam, kde je to vhodné. Aktivni lâtka mùze bÿt také pritomna ve forme lyofilizâtu spolecne s excipienty, kde je to vhodné, a mùze bÿt rozpustena pred parenterâlni aplikaci pridânim vhodnÿch rozpoustedel. Roztoky, které jsou pouzity pro parenterâlni aplikaci, mohou bÿt pouzity napr. i pro infuzni roztoky. Preferovanâ konzervovadla jsou s vÿhodou antioxidanty jako kyselina askorbovâ, nebo mikrobicidy kyselina sorbovâ ci benzoovâ.

Masti jsou emulze oleje ve vode, které obsahuji ne vice nez 70 %, ale prednostne 20 az 50 % vody nebo vodné fâze. Tukovou fâzi tvori zejména uhlovodiky, napr. vazelina, parafinovÿ olej nebo tvrdé parafiny, které prednostne obsahuji vhodné hydroxyslouceniny jako mastné alkoholy a jejich estery, napr. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s vÿhodou lanolin pro zlepseni kapacity pro vâzâni vody. Emulgâtory jsou odpovidajici lipofilni slouceniny jako sorbitanové estery mastnÿch kyselin (Spany), s vÿhodou sorbitan oleât nebo sorbitan isostearât. Aditiva k

- 7 CZ 310053 B6 vodné fâzi jsou napr. smâcedla jako polyalkoholy, napr. glycerol, propylen glykol, sorbitol a/nebo polyethylen glykol, nebo konzervacni prostredky ci prijemne vonici lâtky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahuji jako bâzi hlavne uhlovodiky, napr. parafin, vazelinu nebo parafïnovÿ olej, a dale prirodni nebo semisyntetické tuky, napr. hydrogenované kokosové triglyceridy mastnÿch kyselin nebo, s vÿhodou, hydrogenované oleje, napr. hydrogenovanÿ ricinovÿ olej nebo olej z podzemnice olejné, a dale castecné glycerolové estery mastnÿch kyselin, napr. glycerol mono- a/nebo distearat. Dale obsahuji napr. mastné alkoholy, emulgâtory a/nebo aditiva zminena v souvislosti s mastmi, ktera zvysuji prijem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vode, které obsahuji vice nez 50 % vody. Pouzivané olejové bâze jsou zejména mastné alkoholy, napr. lauryl, cetyl nebo stearyl alkoholy, mastné kyseliny, napriklad palmitova nebo stearova kyselina, kapalné a pevné vosky, napriklad isopropyl myristat, lanolin nebo vceli vosk, a/nebo uhlovodiky, napriklad vazelina (petrolatum) nebo parafinovÿ olej. Emulgatory jsou povrchove aktivni slouceniny s prevazne hydrofilnimi vlastnostmi, jako jsou odpovidajici neiontové emulgatory, napr. estery mastnÿch kyselin polyalkoholù nebo jejich ethylenoxy adukty, napr. estery polyglycerickÿch mastnÿch kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween) dale polyoxyethylenové etery mastnÿch alkoholù nebo polyoxyethylenové estery mastnÿch kyselin, nebo odpovidajici iontové emulgatory, jako alkalické soli sulfâtù mastnÿch alkoholù, s vÿhodou laurylsulfât sodnÿ, cetylsulfât sodnÿ nebo stearylsulfât sodnÿ, které jsou obvykle pouzivany v pritomnosti mastnÿch alkoholù, napr. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fâzi jsou mimo jiné cinidla, ktera chrani krémy pred vyschnutim, napr. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dale konzervacni cinidla a prijemne vonici latky.

Pasty jsou krémy nebo masti obsahujici praskové slozky absorbujici sekreci jako jsou oxidy kovù, napr. oxidy titanu nebo oxid zinecnatÿ, a dale talek ci silikaty hliniku, které maji za ùkol vazat pritomnou vlhkost nebo sekreci.

Peny jsou aplikovany z tlakovÿch nadob a jsou to kapalné emulze oleje ve vode v aerosolové forme, pricemz jako hnaci plyny jsou pouzivany halogenované uhlovodiky, jako polyhalogenované alkany, napr. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo prednostne nehalogenované plynné uhlovodiky, vzduch, N2O ci oxid uhlicitÿ. Pouzivané olejové faze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou pouzivana aditiva tam zminena.

Tinktury a roztoky obvykle obsahuji vodne-etanolickou bazi, ke které jsou primichana zvlhcovadla pro snizeni odparovani, jako jsou polyalkoholy, napr. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dale promazavadla jako estery mastnÿch kyselin a nizsich polyethylen glykolù, tj. lipofilni latky rozpustné ve vodné smesi nahrazujici tukové latky odstranené z kùze etanolem, a pokud je to nutné, i ostatni excipienty a aditiva.

Tento vynâlez dâle poskytuje veterinâmi pripravky obsahujici nejméne jednu aktivni slozku spolecne s veterinâmim nosicem. Veterinârni nosice jsou materiâly pro aplikaci pripravku a mohou to bÿt lâtky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertni nebo prijatelné ve veterinârni medicine a jsou kompatibilni s aktivni slozkou. Tyto veterinârni pripravky mohou bÿt podâvâny orâlne, parenterâlne nebo jakoukoli jinou pozadovanou cestou.

Vynâlez se také vztahuje na procesy nebo metody pro léceni nemoci zminenÿch vÿse. Lâtky mohou bÿt podâvâny profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve forme farmaceutickÿch pripravkù, prednostne v mnozstvi, které je efektivni proti zminenÿm nemocem, pricemz u teplokrevnÿch zivocichù, napr. cloveka, vyzadujiciho takovéto osetreni, je lâtka pouzivâna zejména ve forme farmaceutického pripravku. Na telesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikovâna denni dâvka lâtky okolo 0,1 az 5 g, s vÿhodou 0,5 az 2 g. Vhodné cesty pro aplikaci jsou orâlni, rektâlni, vazâlni mistni (zahrnujici okulârni, bukâlni a sublinguâlni), vaginâlni a parenterâlni (zahrnujici subkutânni, intramuskulârni, intravitreôzni, nitrozilni, intradermâlni,

- 8 CZ 310053 B6 intrathekalni a epiduralni). Preferovanÿ zpùsob podani zavisi na stavu pacienta, toxicité slouceniny a miste infekce, krome ostatnich ohledù znamÿch klinikovi.

Objasneni vÿkresù

Obr. 1 ukazuje stimulaci migrace normalnich lidskÿch fibroblastù (BJ) in vitro cytokininy. V rÿhovÿch testech stimuluje trans-zeatin (tZ), trans-zeatin-9-glukosid (tZ9G) a kinetin-3glukosid (K3G) pri 10 μΜ migraci bunek po 24 hodinach. Neosetrené bunky jsou oznaceny jako kontrolni (Ko). Vÿsledky jsou porovnany s kontrolnimi bunkami stimulovanÿmi vaskularnim endotelovÿm rùstovÿm faktorem (VEGF, pozitivni kontrola) nebo bunkami osetrenÿmi 2methoxyestradiolem (MeO, negativni kontrola).

Obr. 2 znazornuje zvÿsenou migraci normalnich lidskÿch fibroblastù (BJ) in vitro po aplikaci cytokininù v rùznÿch kombinacich. V rÿhovém testu jak 10 μM trans-zeatin-9-glukosidu ( tZ9G), tak kinetin-3-glukosidu (K3G) a zejména jejich kombinace silne stimuluji migraci bunek po 24 hodinach. Neosetrené bunky jsou oznaceny jako kontrolni (Ko). Vÿsledky jsou porovnany s kontrolnimi bunkami stimulovanÿmi vaskularnim endotelovÿm rùstovÿm faktorem (VEGF, pozitivni kontrola) nebo bunkami osetrenÿmi 2-methoxyestradiolem (MeO, negativni kontrola).

Obr. 3 ukazuje stimulaci migrace hladovejicich normalnich lidskÿch fibroblastù (BJ) in vitro po 24 hodinach osetreni kinetinem. Bunky byly ponechany hladovet po dobu 48 hodin a poté byl k bunkam pridan kinetin (K). V rÿhovém testu 10 μΜ K silne stimuluje bunky po dalsich 24 hodinach. Vÿsledky jsou porovnany s bunkami s/bez fetalniho bovinniho séra (FBS) ve dvou rùznÿch médiich (DMEM nebo M199). Neosetrené bunky jsou oznaceny jako kontrolni (Ko). Bunky osetrené 2-methoxyestradiolem (MeO) byly pouzity jako negativni kontrola.

Obr. 4 ukazuje, ze kinetin snizuje expresi cyklooxygenazy-2 (COX-2) v BJ bunkach stimulovanÿch tumor nekrotizujicim faktorem-α (TNF-a) po dobu 30 minut, 1, 6, 12 a 24 hodin. Pokles COX-2 mùze bÿt spojen s protizanetlivou aktivitou a byl detekovan analÿzou Western Blot. α-Tubulin indikuje rovnomerné naneseni proteinù. Neosetrené bunky jsou oznaceny jako kontrolni (Ko). Alaptid (A) byl pouzit jako pozitivni kontrola (sloucenina znama z dosavadniho stavu techniky pro stimulaci hojeni ran u savcù).

Obr. 5 ukazuje indukci migrace endotelovÿch bunek z lidské pupecnikové zily (HUVEC) in vitro po aplikaci cytokininù v rùznÿch kombinacich. V rÿhovém testu jiz po 8 hodinach silne stimuluje migraci bunek kombinace dvou cytokininù, a to 10 μΜ K (kinetin) a tZ ( trans-zeatin) nebo K9G (kinetin-9-glukosid) a tZ9G (trans-zeatin-9-glukosid). Vÿsledky jsou porovnany s kontrolnimi bunkami stimulovanÿmi vaskularnim endotelovÿm rùstovÿm faktorem (VEGF, pozitivni kontrola) nebo bunkami osetrenÿmi 2-methoxyestradiolem (MeO, negativni kontrola).

Obr. 6 ukazuje stimulaci vaskularizace in vitro cytokininy. Tvorba trubicovitÿch struktur byla indukovana K, K3G, tZ, tZ9G a jejich kombinacemi. Bunky byly nasazeny na Matrigel® a osetreny cytokininy (10 μM nebo 10 μM + 10 μM). Indukce tvorby tubulù byla porovnana s pozitivni kontrolou (bunky s vaskularnim endotelovÿm rùstovÿm faktorem - VEGF) nebo negativni kontrolou (bunky s 10 μM 2-methoxyestradiolu - MeO). Snimky byly porizeny po 16 hodinach.

Obr. 7 ukazuje, jak cytokininy stimuluji adhezi bunek HUVEC in vitro. VE-cadherin nezbytnÿ pro kontakty endotelovÿch bunek byl upregulovan vlivem aplikace K a K3G. Bunky byly osetreny cytokininy (10 M) po dobu 24 hodin, fixovany a obarveny pomoci primarni monoklonalni protilatky a sekundarni konjugované protilatky. Indukce exprese VE-cadherinu byla porovnana s kontrolnimi bunkami.

- 9 CZ 310053 B6

Obr. 8 ukazuje vaskularizacni ùcinky heterocyklickÿch cytokininù v testu choriolantoidni membrâny (CAM). Oplodnenâ slepici vejce byla stimulovâna samotnÿm VEGF (1 ng) nebo nebo testovanÿmi cytokininy (45 pg), v daném poradi. Vsechny slouceniny vÿznamne indukovaly vaskularizaci v porovnani s VEGF.

Priklady uskutecneni vynâlezu

Nâsledujici priklady slouzi k objasneni vynâlezu, aniz by omezovaly jeho rozsah. Veskeré cytokininové derivâty podle tohoto vynâlezu jsou bezne se vyskytujici lâtky, jejichz priprava je odbornikovi v oboru znâmâ.

Zkratky a chemické nàzvy

3G: 3-p-D-glukopyranosyl;

9G: 9-p-D-glukopyranosyl;

K: kinetin (6-furfurylaminopurin);

K3G: kinetin-3-glukosid

2iP: 6-isopentenylaminopurin;

BAP: 6-benzylaminopurin;

Z: zeatin

Z3G: zeatin-3-glukosid tZ: trans-zeatin;

tZ9G: trans-zeatin-9-glukosid cZ: cis-zeatin;

pT: para -topolin (6-(4-hydroxybenzylamino)purin;

pT9G: para -topolin-9-glukosid mT: meta-topolin (6-(3-hydroxybenzylamino)purin;

mT9G: meta -topolin-9-glukosid oT: ortho -topolin (6-(4-hydroxybenzylamino)purin;

MemT: para-methoxytopolin (6-(4-methoxybenzylamino)purin;

MeoT: ortho-methoxytopolin (6-(2-methoxybenzylamino)purin;

iP 6-(3,3 -dimethylallylamino)purin;

4MeOK: 4-methoxykinetin: 6-(4-methoxyfurfurylamino)purin;

HUVEC: endotelové bunky lidké pupecnikové zily ;

FCS: fetâlni teleci sérum;

DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;

VEGF: vaskulârni endotelovÿ rùstovÿ faktor;

SEM, SE: stredni chyba prùmeru;

SDS: dodecylsiran sodnÿ;

RIPA pufr: Radio Immuno Precipitation Assay buffer;

Tris-HCl: Tris (hydroxymethyl) aminomethan hydrochlorid;

EDTA: kyselina ethylendiamintetraoctovâ;

EGTA: ethylenglykol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraoctovâ kyselina;

NaCl: chlorid sodnÿ;

NaF: fluorid sodnÿ;

PMMSF: fenylmethylsulfonyl fluorid;

BSA: Bovine Serum Albumin;

TBS: Tris buffered saline;

PBS: Phosphate buffered saline;

BJ: normâlni lidské fibroblasty;

COX-2: cyklooxygenâza-2;

TNF-α: tumor nekrotizujici faktor α;

DMSO: dimethylsulfoxid;

CAM: kureci chorioalantoidâlm membrâna;

- 10 CZ 310053 B6

TCS: tumor cells survival;

cAMP: cyklickÿ 3',5'-adenosinmonofosfat.

Bunecné kultury

HUVEC byly pripraveny stepenim pupecnikovÿch zil pomoci 0,1 g/l kolagenazy A (Roche, Mannheim, Nemecko), jak bylo popsano drive, a kultivovany v médiu pro rûst endotelialnich bunek (ECGM, Provitro, Berlin, Nemecko) obsahujicim 10 % FCS (Biochrom, Berlin, Nemecko). Experimenty byly provedeny s pouzitim bunek v pasazi 3.

Statistickà analÿza

Pocet nezavisle provedenÿch experimentû a pouzité statistické testy jsou uvedeny v prislusné legende obrazku. Jsou ukâzâny reprezentativni experimenty. Ùdaje z grafu predstavuji prûmery ± SEM. Statisticka analÿza byla provedena pomoci Microsoft Excel. Statisticka vÿznamnost se predpoklâdâ, pokud p<0,05.

Priklad 1

Rÿhovÿ migracni test

Konfluentni HUVEC byly seskrâbâny pipetovaci spickou a okamzite osetreny bud plnÿm endotelovÿm rûstovÿm médiem (HUVEC) nebo DMEM (BJ) obsahujicim rûzné cytokininy podle vynalezu nebo médiem bez rûstovÿch faktorû M199 (bez séra, negativni kontrola; PAN Biotech, Aidenbach, Nemecko). Po 16 hodinach inkubace byly bunky fixovany pomoci 4% formaldehydu a obarveny Coomasie Blue. Snimky byly porizeny mikroskopem (IX51, Olympus, Tokio, Japonsko). Migrace byla vypoctena pomoci vlastniho softwaru a vyjadrena jako pomer mezi pixely pokrytÿmi bunkami a celkovÿm poctem pixelû v oblasti rany. Bunky osetrené cytokininy v rûznÿch casovÿch bodech byly porovnany s bunkami neosetrenÿmi, stimulovanÿmi (pozitivni kontrola - 10 ng/ml vaskularniho endotelového rûstového faktoru, VEGF) nebo inhibovanÿmi (negativni kontrola - 10 pM 2-methoxyestradiol, MeO). Relativni plocha rany byla hodnocena po dobu 16 hodin po skrabnuti. Uvedené ùdaje jsou prûmery ± standardni chyba (SE) ziskané z alespon tri nezavislÿch experimentû provedenÿch v triplikatech.

Tvorba trubek

Ibidi 15-jamkova μ-sklicka (ibidi, Mnichov, Nemecko) byla potazena Matrigelem® (Corning, Tewksbury, MA, USA). 1 χ 10⁴ bunek HUVEC bylo osetreno cytokininy a vyseto na Matrigel. Po 16 hodinach inkubace byly snimky zachyceny pomoci mikroskopu (IX51, Olympus, Japonsko). Uvedena data jsou prûmery ± SE ziskané ze tri nezavislÿch experimentû provedenÿch v triplikatech.

SDS-polyakrylamidovà gelovà elektroforéza a imunoblotovâni

Pro imunoblotovani byly sklizené bunky lyzovany v RIPA pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 100 mM NaCl, 2 mM NaF, 0,2 % Nonidet P-40, 30 mM PMMSF, 1 mM 10 mg/ml aprotininu a leupeptinu). Proteiny v lyzatech byly kvantifikovany Bradfordovou metodou a poté zredeny Laemmliho elektroforéznim pufrem. Proteiny byly poté separovany na SDS-polyakrylamidovÿch gelech, preneseny na nitrocelulôzové membrany (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) a obarveny Ponceau S, aby se zkontrolovalo rovnomerné naneseni proteinu. Membrany byly blokovany 5% (hmotn./obj.) BSA a 0,1% Tween-20 v TBS po dobu 2 hodin a inkubovany pres noc se specifickÿmi primarnimi protilatkami. Po promyti v TBS a TBS obsahujicim 0,1 % Tween-20 byly membrany inkubovany se sekundarnimi protilatkami konjugovanÿmi s krenovou peroxidazou a vizualizovany chemiluminiscencnim detekcnim cinidlem West Pico Supersignal (Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA). Pro potvrzeni

- 11 CZ 310053 B6 rovnomerného naneseni proteinû byla provedena imunodetekce s anti-a-tubulinovou monoklonâlni protilâtkou. Experimenty byly opakovâny trikrât. Exprese proteinu v osetrenych bunkâch byly porovnany s neosetrenymi kontrolami.

Metody imunofluorescencniho znaceni

Osetrené bunky v 8-jamkovych ibidi μ-sklickâch (ibidi, Mnichov, Nemecko) byly promyty PBS, fixovany na sklickâch 10% formaldehydem (obj./obj.) po dobu 10 minut, oznaceny primârni protilatkou (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) a fluorescencne konjugovanou sekundârni protilâtkou (Thermo Fisher Scientific) a fixovâny pomoci média FluorSave (Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Nemecko). Bunky byly poté vizualizovâny pomoci fluorescencniho mikroskopu (IX51, Olympus, Japonsko).

Vysledky

Nekolik cytokininû zvysilo migraci lidskych fibroblastû a endotelovych bunek in vitro (obr. 1 az 6). V ryhovém testu stimulovaly tZ, tZ9G, K3G, pT9G, Z3G a mT9G v 10 pM migraci bunek po 24 hodinâch (obr. 1). Krome toho cytokininy v rûznych kombinacich vyrazne zvysily migraci normâlnich lidskych fibroblastû (BJ). Pri pouziti ryhového testu stimulovala kombinace 10 pM K3G a tZ9G silne migraci bunek (3-krât ve srovnâni s kontrolnimi bunkami s VEGF) po 24 hodinâch (obr. 2). Navic byla kinetinem silne indukovanâ migrace hladovejicich normâlnich lidskych fibroblastû (BJ) in vitro po 24 hodinâch. Bunky byly ponechâny hladovet po dobu 48 hodin. Poté byl k bunkâm pridân kinetin (K). V ryhovych testech 10 pM K silne stimuluje bunky po dalsich 24 hodinâch (obr. 3). Vysledky jsou porovnâny s bunkami s/bez fetâlniho bovinniho séra (FBS) ve dvou rûznych médiich (DMEM nebo M199), aby se prokâzal stimulacni potenciâl cytokininû. Krome toho cytokininy v rûznych kombinacich zvysily také migraci endotelovych bunek lidské pupecnikové zily (HUVEC) in vitro. V ryhovych testech kombinace obou 10 pM K a tZ nebo K9G a tZ9G silne stimuluje migraci bunek jiz po 8 hodinâch (obr. 5). Vysledky ve srovnâni s kontrolnimi bunkami stimulovanymi VEGF (pozitivni kontrola) opet potvrdily indukci bunecné migrace.

Pomoci testu tvorby tubulû byla merena schopnost bunek tvorit trojrozmerné struktury. Ve srovnâni s kontrolnimi bunkami s 10 ng/ml VEGF byla tvorba trubic u bunek osetrenych cytokininem vyznamne indukovâna (obr. 6). Silny ùcinek byl detekovân pro 10 pM K, K3G, tZ, tZ9G a jejich kombinace. Sifovâni bunek (spojeni), jejich tlousfka, pocet trubicek a tedy i celkovâ délka trubicek se projevila po 16 hodinâch od osetreni cytokininy. Cytokininy také zvysovaly bunecnou adhezi HUVEC in vitro. VE-cadherin, endotelove specifickâ adhezni molekula umistenâ na spojich mezi endotelovymi bunkami, nezbytnâ pro kontakty endotelovych bunek, byla viditelnejsi v bunkâch s 10 pM K a K3G po 24 hodinâch (obr. 7). Krome svych adhezivnich funkci VE-cadherin reguluje rûzné bunecné procesy, jako je bunecnâ proliferace a apoptôza, a moduluje funkce receptoru vaskulârniho endotelového rûstového faktoru. V dûsledku toho je VE-cadherin nezbytny behem embryonâlni angiogeneze (Vestweber, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008:223-32).

Krome toho kinetin snizoval expresi cyklooxygenâzy-2 (COX-2) v BJ bunkâch stimulovanych tumor nekrotizujicim faktorem-α (TNF-a) po dobu 12 hodin (obr. 4). Pokles COX-2 mûze byt spojen s protizânetlivou aktivitou a byl detekovân analyzou Western bloting.

Tabulka 1: Stimulacni aktivity vybranych heterocyklickych cytokininû pro endotelové bunky HUVEC po 11 hodinâch osetreni 10 nebo 100 pM testovanych sloucenin.

- 12 CZ 310053 B6

AMINOPURINOVY SUBSTITUENT	Stimulace migrace HUVEC
Zkratka	R6	R3	R9	10 pM (% kontrola + VEGF)	100 pM (% kontrola + VEGF)
	Control			61	61
	Co+DMSO			55	55
	Co+VEGF (pozitivni kontrola)			100	100
	Co+MeO (negativni kontrola)			34	34
K	furfurylamino	H	H	69	60
2iP	i sopentenylamino	H	H	61	56
BAP	benzylamino	H	H	62	57
tZ	(E)-(4-hydroxy-3 -methylbut-2en-1-ylamino)	H	H	106	56
cZ	(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2en-1-ylamino)	H	H	87	64
pT	4-hydroxybenzylamino	H	H	82	73
mT	3-hydroxybenzylamino	H	H	75	58
oT	2-hydroxybenzylamino	H	H	60	56
MemT	3-methoxybenzylamino	H	H	61	58
MeoT	2-methoxybenzylamino	H	H	58	58
iP	3,3-dimethylallylamino	H	H	102	72
4MeOK	4-methoxyfurfurylamino	H	H	63	60
K9G	furfurylamino	β-D-glukopyranosyl	H	106	56
BAP9G	benzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	58	56
tZ9G	(E)-(4-hydroxy-3 -methylbut-2en-1-ylamino)	β-D-glukopyranosyl	H	75	94
cZ9G	(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2en-1-ylamino)	β-D-glukopyranosyl	H	55	64
pT9G	4-hydroxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	72	63
mT9G	3-hydroxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	61	56
oT9G	2-hydroxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	58	55
MeomT9G	3-methoxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	57	56
MeopT9G	2-methoxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	56	58
iP9G	3,3-dimethylallylamino	β-D-glukopyranosyl	H	58	59
4MeOK9G	4-methoxyfurfurylamino	β-D-glukopyranosyl	H	56	60
K3G	furfurylamino	H	β-D-glukopyranosyl	185	750
BAP3G	benzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	58	57
tZ3G	(E)-(4-hydroxy-3 -methylbut-2en-1-ylamino)	H	β-D-glukopyranosyl	301	159
cZ3G	(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2en-1-ylamino)	H	β-D-glukopyranosyl	72	74
pT3G	4-hydroxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	76	68
mT3G	3-hydroxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	62	61
oT3G	2-hydroxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	59	56
MeomT3G	4-hydroxy-3methoxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	56	55
MeopT3G	3-hydroxy-4methoxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	57	54
iP3G	3,3-dimethylallylamino	H	β-D-glukopyranosyl	58	56
4MeOK3G	4-methoxyfurfurylamino	H	β-D-glukopyranosyl	59	60

HUVEC - endotelové bunky, % kontrol: kontrola =100%; 3G: 3-P-D-glukopyranosyl; 9G: 9-P-D-glukopyranosyl; K: kinetin(6-furfurylaminopurin); 2iP: 6-isopentenylaminopurin; BAP: 6-benzylaminopurin; tZ: trans-zeatin; cZ: cis 5 zeatin; pT: para-topolin (6-(4-hydroxybenzylamino)purin; mT: meta-topolin (6-(3-hydroxybenzylamino)purin; oT:

ortho-topolin (6-(4-hydroxybenzylamino)purin; MemT: para-methoxytopolin (6-(4-methoxybenzylamino)piurine; MeoT: ortho-methoxytopolin (6-(2-methoxybenzylamino)purin; iP 6-(3,3-dimethylallylamino)purin; 4MeOK: 4methoxykinetin: 6-(4-methoxyfurfurylamino)purin.

- 13 CZ 310053 B6

Priklad 2

Ex vivo a in vivo vaskularizacni ùcinky

Vaskularizacni ùcinky heterocyklickÿch cytokininù byly také testovâny na slozitejsich modelech ex vivo a in vivo. V tomto ohledu byl pouzit test tvorby cév v zârodecném terciku vajicek slepic (CAM test - choriolantoidni membrâny). Choriolantoidni membrâna, znâmâ také jako chorioalantois, je vysoce vaskularizovanâ membrana nachâzejici se ve vejcich nekterÿch amniotù, jako jsou ptaci a plazi. Je tvorena fuzi mezodermâlnich vrstev dvou extra membran chorionu a alantois. Test choriolantoidni membrany (CAM): Oplodnenâ slepici vejce White Leghorn (Lohmann Tierzucht, Cuxhaven, Nemecko) byla inkubovana pri 37 °C po dobu 72 hodin pri konstantni vlhkosti. Vejce byla prenesena do misek, inkubovana dalsich 72 hodin a stimulovana VEGF ( 1 ng/disk) nebo VEGF a uvedenÿmi slouceninami (45 pg) za pouziti malÿch celulôzovÿch diskù. Nâsledujici den byly CAM fotografovany pomoci stereomikroskopu (Olympus, Mnichov, Nemecko). Cytokininy v zavislosti na davce zvÿsily puceni endotelialnich bunek z prstencù aorty (obr. 8). Aplikaci CAM testù jsme zjistili silnou indukci tvorby cév vlivem vaskularniho endotelového rùstového faktoru (VEGF), kterÿ byl také stimulovan pri kombinovaném osetreni cytokininy (obr. 8). Jako konecnÿ in vivo dùkaz principu byl pouzit mikrokapkovÿ test mysi rohovky. Intraperitonealne podavanÿ kinetin silne indukoval neovaskularizaci in vivo.

Priklad 3

In vitro cytotoxicka aktivita novÿch sloucenin

Nizka cytotoxicita sloucenin je hlavni vlastnosti urcujici jejich kosmetické a terapeutické pouziti. Jednim z parametrù pouzivanÿch jako zaklad pro testy cytotoxicity je metabolicka aktivita zivotaschopnÿch bunek. Napriklad mikrotitracni test, kterÿ pouzivâ Calcein AM, je nyni siroce pouzivân ke kvantifikaci bunecné proliferace a cytotoxicity. Tento test se napriklad pouzivâ v programech screeningu lékù a pri testovâni chemosenzitivity. Protoze Calcein AM stepi pouze metabolicky aktivni bunky, tyto testy detekuji vÿhradne zivotaschopné bunky. Mnozstvi redukovaného Calceinu AM odpovidâ poctu vitâlnich bunek v kulture.

Bunecné linie: lidské T-lymfoblastické leukémie CEM; promyelocytârni HL-60 a monocytârni U937 leukémie; bunecné linie karcinomu prsu MCF-7, BT549, MDA-MB-231; glioblastomové bunky U87MG; bunky cervikâlniho karcinomu HELA; sarkomové bunky U2OS a Saos2; hepatocelulârni karcinom HepG2; mysi fibroblasty NIH3T3; BJ, lidské fibroblasty; mysi imortalizované makrofâgy kostni drene B2.4 a B10A.4; leukémie P388D1 a L1210; melanomy B16 a B16F10; lidskÿ osteosarkom HOS; lidskâ myeloidni leukémie K-562; melanom lidské kùze G-361 byly pouzity pro rutinni screening sloucenin. Bunky byly udrzovâny v TPP 80 cm² plastovÿch lahvich pro tkânové kultury a kultivovâny v bunecném kultivacnim médiu (DMEM s 5 g/l glukôzy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 x g/ml streptomycinu, 10 % fetâlniho teleciho séra a hydrogenuhlicitanem sodnÿm).

Bunecné suspenze, které byly pripraveny a naredeny podle konkrétniho bunecného typu a ocekâvané cilové bunecné hustoty (2500 az 30 00 bunek na jamku na zâklade charakteristik rùstu bunek), byly pridâny pipetou (80 μ 1) do 96-jamkovÿch mikrotitracnich desticek. Inokulâtùm byla ponechâna predinkubacni doba 24 hodin pri 37 °C a 5% CO2 pro stabilizaci. Ctyrnâsobnâ redeni zamÿslené testované koncentrace byla pridâna v case nula ve 20 pl alikvotech do jamek mikrotitracni desticky. Obvykle byla testovanâ sloucenina hodnocena v sesti 4-nâsobnÿch redenich. Pri rutinnim testovâni byla nejvyssi koncentrace v jamce 166,7 pM, ale lze ji zmenit v zâvislosti na lâtce. Vsechny koncentrace léciv byly zkoumâny v duplikâtech. Inkubace bunek s testovanÿmi slouceninami trvala 72 hodin pri 37 °C, v atmosfére 5% CO2 a 100 % vlhkosti. Na konci inkubacni doby byly bunky testovâny pomoci Calceinu AM. Sto mikrolitrù zâsobniho

- 14 CZ 310053 B6 roztoku bylo napipetovâno do kazdé jamky a inkubovâno po dobu 1 hodiny. Fluorescence (FD) byla merena pomoci Labsystem FIA Reader Fluoroscan Ascent (UK). Preziti nâdorovÿch bunek (IC50) bylo vypocteno za pouziti nâsledujiciho vÿpoctu: TCS = (FD_jamka vystaveni lécivu/prùmer FDkontrolnich jamek) x 100 %. Hodnota GI50, koncentrace léciva letâlni pro 50 % nâdorovÿch bunek, byla vypoctena ze ziskanÿch krivek odezvy na dâvku.

Nulovâ cytotoxicita novÿch sloucenin je zâkladnim predpokladem pro aplikace pri hojeni ran. Cytotoxicita novÿch sloucenin byla testovâna na panelu bunecnÿch linii rùzného histogenetického a druhového pùvodu (tabulka 2). Ukazujeme zde, ze stejné aktivity byly nalezeny ve vsech testovanÿch nâdorovÿch bunecnÿch liniich, avsak nemaligni bunky, napr. NIH3T3 fibroblasty a normâlni lidské fibroblasty byly odolné vùci cytotoxicité indukované heterocyklickÿmi cytokininy. Slouceniny uvedené v tab. 2 lze rozdelit do 2 skupin. Prvni skupina obsahuje „klasické volné cytokininové bâze“ reprezentované 6-substituovanÿmi aminopuriny (které jsou znâmé ze stavu techniky). Druhâ skupina obsahuje nové heterocyklické derivâty cytokininu substituované bud v poloze 3 nebo 9 glukôzou. Vÿsledky ukazuji, ze substituce v poloze 3 nebo 9 purinového skeletu obecne vedla k ùplné ztrâte cytotoxické aktivity ve srovnâni s analogy „klasickÿch cytokininovÿch bazi“. Jak ukazuje tabulka 2, IC50 pro fibroblasty BJ (normâlni lidské fibroblasty) a mysi fibroblasty NIH3T3 byla vzdy vyssi nez 166,7 μΜ. Nové derivâty nevykazuji zâdnou toxicitu pro normâlni a nâdorové bunky v koncentracich do 166,7 μΜ, a proto jsou pro kosmetické a farmaceutické aplikace dokonce vhodnejsi nez pnrodni cytokininy (6-substituované derivâty aminopurinu).

Tabulka 2: Cytotoxicita novÿch sloucenin pro rùzné normâlni a rakovinné bunecné linie

	Testovana bunëcnâ linie / IC50 (Limol I.)
R6	R3	R9	HOS	K-562	MCF7	BJ	NIH-3T3
furfurylamino	H	H	>166,7	164,1	>166,7	>166,7	155.1
isopentenylamino	H	H	>166,7	146,9	>166,7	>166,7	102.2
benzylamino	H	H	>166,7	138,9	166,1	>166,7	145,7
(E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -ylamino)	H	H	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7
(Z)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -ylamino)	H	H	>166,7	128,4	>166,7	>166,7	>166,7
4-hydroxybenzylamino	H	H	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	149,2
3-hydroxybenzylamino	H	H	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7
2-hydroxybenzylamino	H	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
3-methoxybenzylamino	H	H	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7
2-methoxybenzylamino	H	H	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7
3,3-dimethylallylamino	H	H	>166,7		>166,7	>166,7
4-methoxyfiirfurylamino	H	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
furfurylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
benzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
(E)-(4-hydroxy-3- methylbut-2-en-1 -ylamino)	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
(Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -ylamino)	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
4-hydroxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
3-hydroxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166,7
2-hydroxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7	>166.7
3-methoxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7
2-methoxybenzylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7
3,3-dimethylallylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7
4-methoxyfurfurylamino	β-D-glukopyranosyl	H	>166,7		>166,7	>166,7
furfurylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7
benzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7	>166,7

- 15 CZ 310053 B6

(E)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -ylamino)	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
(Z)-(4-hydroxy-3methylbut-2-en-1 -ylamino)	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
4-hydroxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
3-hydroxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
2-hydroxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
3-methoxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
2-methoxybenzylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
3,3-dimethylallylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7
4-methoxyfirrfurylamino	H	β-D-glukopyranosyl	>166,7		>166,7	>166,7

BJ: normalni lidské fibroblasty; NIH-3T3: bunècné linie mysich embryonalnich fibroblastic HOS: lidsky osteosarkom; MCF7: bunècné linie karcinomu prsu; K-562: lidska myeloidni leukémie.

Priklad 4

Protizânètlivâ aktivita

Krysi gliom C6 (ATCC c. CCL107) byl kultivovan jako monovrstva v bezsérovém chemicky definovaném médiu obsahujicim Hamovo F10-minimalni zakladni médium (1:1 v/v), 2 mM Lglutamin, 1 % (v/v) minimâlni esenciâlni médium vitaminy (100x), 1 % (v/v) minimalni esenciâlni médium neesenciâlni aminokyseliny (100x), 100 U/ml penicilin, 100 pg/ml streptomycin a 30 nM selenicitan sodny. Inkubace byla provedena pri 37 °C ve zvlhcené atmosfére. Testy byly provadèny v logaritmické rùstové fâzi pri hustotè 2,5x10⁵ bunèk/cm². Intracelulârni syntéza cAMP byla indukovana pridanim 5 pM (-)isoproterenolu. Po 30 minutach inkubace pri 37 °C bylo médium odstranèno a bunècné mnozstvi cAMP bylo stanoveno pomoci cAMP-enzymového imunotestu Amersham kit. Hodnota I50 byla stanovena z krivky davkaodpovèd’ v duplikatech. Ùcinek novych heterocyklickych purinù byl mèren po soucasném pridani isoproterenolu. Klasické cytokininy, znamé v dosavadnim stavu techniky, byly neaktivni.

Tabulka 3: Modulace aktivity β-adrenergnich receptorù substituovanymi puriny

Testovana sloucenina	I50 (pM)	Ùcinek
R6	R9
H	H		n.a.
H	9d-D-glukopyranosyl		n.a.
furfurylamino	H	47 mM	0,7-nasobna aktivace
4-hydroxybenzylamino	H	42 mM	0,8-nasobna aktivace
(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1 -ylamino)	H	27 mM	1,7-nasobna aktivace
furfurylamino	9d-D-glukopyranosyl	7,8 mM	2,3-nasobna aktivace
(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1 -ylamino)	9d-D-glukopyranosyl	5,6 mM	2,6-nasobna aktivace

n. a. znamena neaktivni

Protoze purinorgenni receptory podobné P2Y1 a A2, negativnè a pozitivnè navazané na adenylâtcyklâzu, v tomto poradi, jsou pritomny v potkanim gliomu C6, zbyva urcit, zda je modulace syntézy cAMP zpùsobena inhibici aktivace -adrenergnich receptorù isoproterenolem, nebo v dùsledku aktivace purinogernich receptorù. Slouceniny vzorce I a II, které maji protizanètlivé aktivity, mohou byt pouzity pro lécbu zânètlivych poranèni.

- 16 CZ 310053 B6

Priklad 5

Suché tobolky

5000 tobolek, kazda obsahujici jako aktivni slozku 0,25 g jedné ze sloucenin zminenÿch v predchazejicich prikladech, se pripravi nasledujicim postupem:

Slozeni

Aktivni slozka 1250g

Talek 180g

Psenicnÿ skrob 120g

Magnesium stearat 80g

Laktôza20 g

Postup pripravy: Rozetrené latky jsou protlaceny pres sito s velikosti ok 0,6 mm. Davka 0,33 g smesi je prenesena do zelatinové tobolky pomoci pristroje na plneni tobolek.

Priklad 6

Mekké tobolky

5000 mekkÿch zelatinovÿch tobolek, kazda z nich obsahujici jako aktivni slozku 0,05 g jedné z 25 latek zminenÿch v predchazejicich prikladech, se pripravi nasledujicim postupem:

Slozeni

Aktivni slozka 250 g

Lauroglykol 2 litry

Postup pripravy: Prâskovâ aktivni latka je suspendovana v Lauroglykolu® (propylenglykol laurat, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetrena ve vlhkém pulverizatoru na velikost castic asi 1 az 3 mm. Davka o velikosti 0,419 g smesi je potom prenesena do mekkÿch zelatinovÿch 35 tobolek pomoci pristroje na plneni tobolek.

Priklad 7

Mekké tobolky

5000 mekkÿch zelatinovÿch tobolek, kazda z nich obsahujici jako aktivni slozku 0,05 g jedné ze sloucenin obecného vzorce I zminenÿch v predchazejicich prikladech, se pripravi nasledujicim postupem:

Slozeni

Aktivni slozka 250 g

PEG 400 1 litr

Tween 80 1 litr

Postup pripravy: Praskova aktivni slozka je suspendovana v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurat, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodâvâ Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetrena ve vlhkém pulverizatoru na castice o velikosti 1 az 3 mm. Davka o velikosti 0,43 g smesi je potom 55 prenesena do mekkÿch zelatinovÿch tobolek pomoci pristroje na plneni tobolek.

- 17 CZ 310053 B6

Pfiklad 8

Vÿvoj masti

Formulace masti byla testovana behem pilotai klinické studie na 4 dobrovolnicich s psoriatickÿmi koznimi poruchami. Nazvy slozek formulace jsou uvedeny podle terminologie registrujicich organû a jejich mnozstvi je v gramech na 100 g.

Mast /100g trans-zeatin ( tZ) 1,0g butylhydroxytoluen (Nipanox BHT) 0,2g butylparaben (Nipabutyl) 0,2g diethylenglykolmonoethylether (Transcutol P) 10,0g glycerol dibehenat (Compritol 888 ATO) 22,0g propylenglykol laurat (Lauroglycol FCC) 66,6g

Dobrovolnici hodnotili: Pnpadnou konzistenci masti lze dale upravit pndanim vaselinum album. Ocekâvâ se, ze transdermalni systém Transcutol P/Lauroglycol FCC zvÿsi ùcinnost trans-zeatinu.

Pfiklad 9

Gelovÿ pnpravek

Formulace masti byla testovana behem pilotni klinické studie se 4 dobrovolniky rûzi, coz je onemocneni kûze. Slozky jsou uvedeny v gramech na 100 g.

Latka	Obsah
trans-zeatin	1,0 g
butylhydroxytoluenum	0,2 g
butylparaben	0,2 g
diethyleneglykol monoethyl ether	10,0 g
silica colloidalis anhydrica	5,0 g
propylen glykol laurat	83,6 g

Gel této konzistence mûze bÿt navic modifikovan pfidanim oxidu kfemicitého, silica colloidalis anhydrica. Také se opet pfedpoklâdâ, ze transdermalni systém Transcutol P/Lauroglycol FCC zvÿsi ùcinnost mesylatové soli para-topolinu. Oxid kfemicitÿ colloidalis anhydrica pravdepodobne zpomali penetraci ùcinné latky.

Pfiklad 10

Postup pfipravy kozni masti

Slozky masti jsou uvedeny v gramech na 200 g:

Latka	Obsah
trans-zeatin	2,0 g
butylhydroxytoluenum	0,4 g
butylparaben	0,4 g
diethyleneglycol monoethyl ether	20,0 g
glycerol dibehenat	44,0 g
propylene glycol laurate	132,2 g

Doporucenÿ postup

- 18 CZ 310053 B6

Faze A: 2 g mesylatové soli para-topolinu se rozpusti ve 20 g Transcutol P za stalého michani pri teplote mistnosti v oddelené sklenené nebo nerezové nadobe. Proces rozpousteni mûze bÿt urychlen zahnvanim roztoku na maximalni teplotu 40 °C.

Faze B: 0,4 g Nipanox BHT a 0,4 g Nipabutyl se rozpusti za stalého michani ve 133,2 g Lauroglycolu FCC pri teplote priblizne 70 °C, v dalsi samostatné sklenené nebo nerezové nadobe. Cirÿ olejovitÿ roztok se zahrivâ na teplotu priblizne 80 °C a 44 g Compritol 888 ATO se tavi v nem, za stalého michani. Cirÿ olejovitÿ roztok se ochladi na cca 60 °C za stalého michani a ochlazeni a smisi se s fazi A. Vznikla belava mast je rozdelena na priblizne 15 g porce a plni se do predem pripravenÿch plastovÿch nâdob.

Priklad 11

Formulace pripravku pro lokalni aplikaci na kûzi

Prostredek pro mistni aplikaci na kûzi obsahuje nasledujici slozky podle hmotnostnich %:

Aktivni slozka:	trans-zeatin	0,1 %
Olejova faze:	Cetylalkohol	5,0 %
	Glycerylmonostearat	15,0 %
	Sorbitanmonooleat	0,3 %
	Polysorbat 80 USP	0,3 %
Vodna faze:	Methylcelulôzova 100 cps	1,0 %
	Methylparaben	0,25 %
	Propylparaben	0,15 %
	Vycistena voda q.s. na	77,9 %

Methylparaben a propylparaben se rozpusti v horké vode a nasledne se v ni disperguje i methylcelulôza. Smes se pak ochladi na 60 °C, dokud se methylcelulôza nerozpusti. Smes se potom zahrivâ na 72 °C a prida se do olejové faze, ktera se zahrivâ na teplotu 70 °C za stalého michani. Mesylâtovâ sûl para -topolinu se prida pri teplote 35 °C a vÿsledna smes se micha az do okamziku rozptÿleni. Tento prostredek se aplikuje na kûzi prinejmensim kazdÿ den, dokud se nedosahne pozadovaného zmirneni starnuti kûze (proti starnuti).

Claims (6)

1. Heterocyklické purinové derivâty cytokininù obecného vzorce I a II 'NH

Rs (I)

r₃ (Π) nebo jejich farmaceuticky pfijatelné soli s alkalickÿmi kovy, amoniakem nebo aminy, ve forme racemâtù nebo opticky aktivnich izomerû cukrù (b-D, a-D, b-L, a-L), pro pouziti pfi hojeni ran, pricemz

R6 je vybranÿ ze skupiny sestâvajici z: fùrfurylu, 4-hydroxybenzylu, 3,3-dimethylallylu, (Z)-4hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 -ylu a (E)-4-hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 -ylu,

R3 a R9 je glukopyranosylovâ skupina.

2. Heterocyklické derivâty cytokininù obecného vzorce I a II pro pouziti podle nâroku 1, vybrané ze skupiny sestâvajici z: 6-furfùrylamino-3-P-D-glukopyranosylpurin, 6-(4-hydroxybenzylamino)3 -β-D-glukopyranosylpurin, 6-(Z)-(4-hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 -ylamino)-3 -β-D- glukopyranosylpurin, 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-3-β-D-glukopyranosylpurin, 6-fürfürylamino-9^-D-glukopyranosylpurin, 6-(4-hydroxybenzylamino)-9^-Dglukopyranosylpurin, 6-(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9^-D-glukopyranosylpurin a 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)-9^-D-glukopyranosylpurin.

3. Heterocyklické derivâty cytokininù obecného vzorce I a II pro pouziti die nâroku 1, kde uvedenâ râna je popâlenina, ischemickÿ vfed, prolezenina, vfed vzniklÿ infekcnim procesem, vfed vzniklÿ v dùsledku zânëtlivého procesu, poranënâ ùstni tkân, zânëtlivâ poranëni kùze.

4. Heterocyklické derivâty cytokininù obecného vzorce I a II pro pouziti podle nâroku 1, pfiëemz se pouzije kombinace alespon dvou heterocyklickÿch purinovÿch derivâtù cytokininù defmovanÿch v nâroku 1 nebo 2.

-20CZ 310053 B6

5. Heterocyklické derivaty cytokininù obecného vzorce I a II pro pouziti podle naroku 1, pricemz se pouzije kombinace 6-fùrfùrylamino-3-β-D-glukopyranosylpurinu s trans-zeatinem a/nebo 6fùrfùrylamino-3-β-D-glukopyranosylpurinu s 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-ylamino)-9-eD-glukopyranosylpurinem a/nebo 6-furfùrylamino-9-β-D-glukopyranosylpurin s 6-(E)-(4-hydroxy-

5 3 -methylbut-2-en-1 -ylamino)-9-β-D-glukopyranosylpurinem.

6. Farmaceutickÿ pnpravek pro pouziti pri hojeni ran, kterÿ obsahuje alespon jeden heterocyklickÿ purinovÿ derivat cytokininù obecného vzorce I a II nebo jejich farmaceuticky prijatelné soli s alkalickÿmi kovy, amoniakem nebo aminy, ve forme racematù nebo opticky aktivnich izomerù, nebo jejich adicnich soli s kyselinami, definované v naroku 1 nebo 2, a dale alespon jeden 10 farmaceuticky prijatelnÿ nosic nebo redidlo.