Zařízení pro kontinuální preparativní isoelektrickou fokusaci v porézním loži protékaném rozbíhavým tokem

Oblast techniky

Elektromigrační metoda isoelektrické fokusace, která se týká separace proteinů či dalších amfolytů.

Dosavadní stav techniky

Isoelektrická fokusace (dále jen IEF) je elektroforetická metoda pro separaci a fokusaci amfolytů. Využívá vlastnosti amfolytů, které v prostředí pH rovném jejich isoelektrickému bodu mají nulovou efektivní rychlost migrace. Proto se amfolyty analyzované směsi fokusují v místě systému, kde je pH rovnající se jejich isoelektrickému bodu. Součástí systému pro IEF je vytvoření pH gradientu podél elektrického pole. V současnosti jsou analyzovanými amfolyty převážně proteiny. Pro stále rostoucí význam jejich analýzy byly vyvinuty jak mikroanalytické varianty IEF gelová, kapilární, v mikrokanálu, tak preparativní metody diskontinuální i kontinuální. Dosavadní preparativní metody IEF jsou málo účinné nebo extrémně složité. V nedávné době byl zveřejněn princip isoelektrické fokusace v rozbíhavém toku. U presentovaného zařízení zdaleka nejsou optimalizovány základní parametry.

Podstata vynálezu

Dosavadní nevýhody odstraňuje navržená metoda a zařízení pro kontinuální preparativní isoelektrickou fokusaci v porézním loži protékaném rozbíhavým tokem. Navržené zařízení využívá principu separační metody kontinuální isoelektrické fokusace amfolytů, která probíhá vlivem vloženého stejnosměrného napětí mezi elektrodami. Na každé straně lože je v řadě připojeno několik elektrod (na jedné straně alespoň 2 anody a na druhé straně alespoň 2 katody) připojených na zdroj stejnosměrného napětí, přičemž napětí mezi elektrodami u vstupu lože je v řádu jednotek voltů a u výstupu lože je v řádu stovek voltů.

Při průchodu separovaného roztoku, od vstupu lože k výstupu lože, dochází autofokusací vhodných přítomných komponent k postupnému vytváření pH gradientu, který je kolmý na směr toku a rovnoběžný s příčně vloženým elektrickým polem. Dále dochází k fokusaci analyzovaných amfolytů, např. proteinů do míst, kde lokální pH odpovídá jejich isoelektrickému bodu. Separovaný roztok kontinuálně opouští výstup lože řadou proužků či vláken. V každé frakci jsou analyzované amfolyty s isoelektrickým bodem odpovídajícím intervalu části pH gradientu.

Separace probíhá na porézním loži zhotoveném z materiálu konstantních vlastností po celé ploše lože. Tloušťka lože klesá ve směru od vstupu lože k výstupu tak, že průřez lože je přibližně stálý nebo mírně klesá.

Materiálem pro zhotovení porézního lože je například tkaná či netkaná hydrofilní textilie, síť nebo celulózový či skelný papír nebo pěna z vhodného syntetického materiálu. Porézní lože spočívá na hydrofobní podložce nesmáčené pracovní kapalinou.

Sestava porézního lože a podložky je v prostoru umístěna tak, že vstup lože je vzhledem k výstupu ve sklonu a výstupní strana je vodorovná. Kapalina je přiváděna na vstup lože kapilárou pomocí čerpadla nebo samospádem. Na výstupní straně lože jsou realizovány výstupy kapaliny do jímacích nádobek.

- 1 CZ 307051 B6

Boční strany lože jsou v mechanickém a elektrickém kontaktu s pevnými elektrodami, kterými se vkládá napříč lože stejnosměrné napětí rostoucí od několika voltů u vstupu lože až do několika set voltů u výstupu lože (např. 500 V). Pevné elektrody jsou zhotoveny například z grafitu nebo platiny.

Zařízení pro preparativní kontinuální fokusaci podle vynálezu má oproti dosavadnímu stavu techniky řadu výhod. Je-li použit tok v porézním loži namísto toku ve volném kanále, dochází ke zmírnění až odstranění nežádoucích konvektivních toků (vliv parabolického profilu toku) vedoucích k podstatnému zhoršování fokusace. Dále použití vějířového tvaru lože s klesající tloušťkou a série elektrod o napětí rostoucím ve směru k výstupu umožňuje fokusaci velkým elektrickým proudem již od samého vstupu kapaliny rychle a bez nebezpečí přehřátí, zatímco u výstupu lze dosáhnout dobrého rozdělení analytů vlivem velkého příčného napětí. Lze tak separovat desetiny mililitru až mililitry kapaliny za minutu, což je nejméně desetkrát více než v dosavadních zařízeních pro preparativní kontinuální IEF. Při použití otevřeného systému zde neruší tvorba bublin u elektrod. Kombinace hydrofilního materiálu lože a hydrofobní podložky spolehlivě vymezuje průtok separované kapaliny. Lože je jednoduché a potenciálně levné, takže jej lze použít jednorázově, čímž odpadá nutnost čištění systému mezi jednotlivými analýzami. Tok a separace jsou v ustáleném stavu stabilní, což umožňuje automatický dlouhodobý provoz bez nutnosti obsluhy po dobu mnoha hodin až dní. Vzhledem k podstatnému snížení množství elektrické energie potřebné k dosažení určitého výkonu separace, není třeba použít jinak nutné aktivní chlazení separačního prostoru.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje půdorysný pohled na zařízení pro kontinuální preparativní isoelektrickou fokusaci v porézním loži protékaném rozbíhavým tokem.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Základem zařízení je lože 1 přibližně lichoběžníkovitého půdorysu o délce 10,00 cm, vstup 2 o straně 1,50 cm a výstup 3 o straně 7,50 cm zhotovené z vrstev netkané textile (materiál: polyester) tloušťky 0,10 mm. Na vstupu 2 lože 1 je pět vrstev, počet vrstev se směrem k výstupu postupně snižuje až na jednu. Na výstupu 3 lože 1 poslední vrstva plynule přechází ve 12 svislých výstupních proužků. Jejich konec je 10 cm pod výstupem 3 z lože L Lože 1 spočívá na podložce z bílé ohebné fólie z polyvinylchloridu tloušťky 0,25 mm.

Boční strany lože 1 jsou v kontaktu se dvěma páry uhlíkových elektrod 4, kterými se vkládá na lože stejnosměrné napětí, u vstupu 2 je napětí 75 V a proud 1,5 mA a u výstupu 3 375 V a proud 2 mA. Celkový dodávaný výkon je menší než 1 W, takže nedochází k pozorovatelnému ohřevu lože L

Separovaný roztok je na vstup 2 lože 1 přiváděn peristaltickým čerpadlem o průtoku 0,2 ml/min.

ml separovaného roztoku obsahuje 1,5 ml roztoku směsi 20 jednoduchých pufrů, 1,0 ml roztoku 0,1 mol/1 K₂SO₄, barevné amfolyty sloužící jako pí markéry, dále hemoglobin a cytochrom C jako modelové proteiny určené k separaci a fokusaci. Koncentrace každého proteinu ve vstupním roztoku je 0,5 mg/ml. Specifická vodivost separovaného roztoku je 1,05 mS.cm

Na loži 1 se během separace vytvoří barevné zóny odpovídající konkrétním isoelektrickým bodům (pl): oranžová - markér (pl = 3,0), fialová - markér (pl = 5,2), červená - markér (pí =

-2CZ 307051 B6

6,2), hnědá - separovaný protein (hemoglobin), oranžová - separovaný protein (cytochrom C), fialová - markér (pl =11). Dochází k dokonalé separaci a fokusaci uvedených komponent a jejich výstupu do příslušných výstupních proužků. Separovaný roztok z proužků kape do přistavených mikronádobek. Z tokové bilance vyplývá minimálně desetinásobné zkoncentrování separovaných látek ve výstupech oproti koncentraci ve vstupní kapalině.

Průměrná lineární rychlost separovaného roztoku v loži 1 byla změřená pohybem barevné skvrny, a to 0,8 cm/min. Relativní kolísání polohy vystupujícího zafokusovaného analytu byla během 15 hodin nepřetržitého provozu zjištěna menší než 3 % vzhledem k výstupní šířce lože 1.

Příklad 2

Základem zařízení je lože 1, jehož vstup 2 sestává z části obdélníkového půdorysu o délce 3,00 cm a šířce 1,00 cm a plynule navazující části lichoběžníkovitého půdorysu o délce 12,00 cm a výstupu 3 o straně 8,00 cm zhotovené z vrstev netkané textile - polyester, tloušťky 0,10 mm. Na vstupu 2 je lože 1 obdélníkové i lichoběžníkové části z 10 vrstev. Počet vrstev se směrem k výstupu 3 postupně snižuje až na jednu tak, aby průřez lože 1 byl stálý. Na výstupu 3 lože 1 plynule přechází ve 12 svislých výstupních proužků zhotovených ze stejného materiálu jako lože

1. Jejich konec je 10 cm pod výstupem z lože 1. Lože 1 spočívá na bílé ohebné fólii z polyvinylchloridu tloušťky 0,25 mm.

Boční strany obdélníkové části lože 1 jsou v kontaktu s párem uhlíkových elektrod 4, kterými se vkládá stejnosměrné napětí 25 V a proud 3 mA. Výstup 3 lichoběžníkové části je v kontaktu s párem elektrod 4, kterými se vkládá 600 V a proud 2 mA. Celkový dodávaný výkon je menší než 1,5 W, takže nedochází k pozorovatelnému ohřevu lože.

Separovaný roztok je na vstup 2 lože 1 přiváděn samospádem kapilárou průtokem 0,3 ml/min.

ml separovaného roztoku obsahuje 1,5 ml roztoku směsi 20 jednoduchých pufrů, 1,0 ml roztoku 0,1 mol/1 K₂SO₄, barevné amťolyty sloužící jako pí markéry, dále hemoglobin a cytochrom C jako modelové proteiny určené k separaci a fokusaci. Koncentrace každého proteinu v separovaném roztoku je 0,5 mg/ml. Specifická vodivost vstupního roztoku je 1,05 mS.cm

Na loži 1 se během separace vytvoří barevné zóny odpovídající konkrétním isoelektrickým bodům (pl): oranžová - markér (pí = 3,0), fialová - markér (pl = 5,2), hnědá - separovaný protein (hemoglobin), oranžová - separovaný protein (cytochrom C). Dochází k dokonalé separaci a fokusaci uvedených komponent a jejich putování do příslušných výstupních proužků. Z tokové bilance vyplývá minimálně desetinásobné zkoncentrování separovaných látek ve výstupech oproti koncentraci v separovaném roztoku.

Průměrná lineární rychlost kapaliny v loži 1, 1,125 cm/min byla změřená pohybem barevné skvrny. Oproti provedení podle příkladu 1 je patrno zdokonalení řešení kontaktu elektrod 4 s ložem 1 a změna geometrie umožňující zvýšení toku kapaliny ložem 1 a tím výkonu zařízení.

Průmyslová využitelnost

Zařízení je využitelné pro analýzy v potravinářství, biotechnologiích, farmacii, kde je potřeba izolovat proteiny či jiné amfolyty z biologických materiálů a čistit pro další analýzy.