Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit
CZ306080B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Marek Mráz Kateřina Černá Šárka Pospíšilová Jiří Mayer
Description
translated from
Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nové metodiky pro absolutní kvantifikaci miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, umožňující diagnostické využití miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150. Dále popisuje použití této metodiky pro stanovení prognózy u pacientů s diagnostikovanou CLL a dalšími B-buněčnými malignitami [folikulámí lymfom, FL; difúzní velkobuněčný B-lymfom, DLBCL (difuzní velkobuněčné B-lymfomy); Burkittův lymfom, BL; lymfom z plášťových buněk, MCL], stanovení jejich léčebné odpovědi na terapii a stanovení mutačního stavu TP53 u těchto pacientů.
Dosavadní stav techniky
Chronická lymfocytámí leukémie (CLL) je charakterizována jako monoklonální expanze zralých B-lymfocytů, které se hromadí v periferní krvi a lymfatických orgánech (Chiorazzi N et al. N Engl J Med. 2005;352:804-815). Donedávna se v klinické praxi k určení prognózy používal pouze staging podle Raie (Rai KR et al. Blood 1975;46:219-234) nebo podle Bineta (Binet JL et al. Cancer 1981;48:198-206). Tento empirický systém však není v současné době dostačující. Pacienti jsou diagnostikováni často ve velmi raném stádiu CLL a na základě prostého stagingu nelze odlišit pacienty, kteří budou rychle progredovat od pacientů s indolentní formou onemocnění. CLL a další B-buněčné lymfomy jsou klinicky značně heterogenní onemocnění a doba přežití se u jednotlivých pacientů velmi liší. Z tohoto důvodu se u CLL a některých FL pacientů bez klinických příznaků nemoci často doporučuje pouze sledování. Problematické je zejména včasné rozpoznání agresivní formy choroby, která se častěji projevuje u mladších pacientů. Během posledních deseti let byla onemocnění CLL věnována velká pozornost a výsledkem je soubor několika skupin parametrů, které CLL podrobně charakterizují a umožňují predikci průběhu nemoci. U dalších B-buněčných lymfomů je k dispozici jen velmi omezené množství prognostických markérů.
Dosud nejvýznamnějším prognostickým markérem se u CLL jeví mutační status genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgVH). Přítomnost nemutovaného genu pro IgVH (nukleotidová homologie se zárodečnou linií větší než 98 %) je spojena s horším průběhem a kratším přežíváním pacientů (8 let vs. 25 let u pacientů s mutovaným IgVH; Damle RNet al. Blood 1999,94:18401847; Hamblin TJet al. Blood 1999;94:1848-1854). Stanovení tohoto parametru nezbytného pro určení prognózy a léčby onemocnění je však vysoce technicky, časově i finančně náročné. Zároveň klinicky nej potřebnějším je stanovení predikce léčebné odpovědi na daný terapeuticky režim, což prakticky žádný z doposud používaných markérů neumožňuje spolehlivě. V případě FL se prognóza onemocnění prakticky výlučně v klinické praxi řídí tzv. Follicular Lymphoma International Prognostic Index (FLIPI), který je založen na kombinaci klinického vyšetření, věku pacienta a biochemickém parametru (hladina laktát dehydrogenázy; Solal-Celigny P et al Blood 2004;104:1258-1265). V případě DLBCL se využívá technicky velmi náročné a těžko reprodukovatelné metodiky na principu stanovení genové exprese několika genů pro rozdělení pacientů do skupin tzv. ABC vs. GC fenotypu B buněk (RosenwaldA et al. NEnglJMed. 2002;346:19371947).
MiRNA jsou 19 až 25 nukleotidů dlouhé evolučně zakonzervované regulátory genové exprese, které v buňce kontrolují na post-transkripční úrovni jak řadu fyziologických, tak patologických procesů. Onemocněním, u nějž byla v roce 2002 poprvé pozorována souvislost s miRNA, byla právě chronická lymfocytámí leukémie. Vzhledem k asociaci změny exprese miRNA a nádorových onemocnění je možné na základě exprese odlišné exprese miRNA odlišit nejen jednotlivá onkologická onemocnění, ale odlišit i subtypy v rámci jednoho onemocnění.
-1 CZ 306080 B6
MiR-34a byla identifikována již v dřívějších studiích jako miRNA významná pro biologii CLL a B-buněčných malignit (Zenz Tet al. Blood 2009; 113:3801-3808; Mraz Met al. Leukemia 2009; 23:1159-1163; Djikstra MK et al. Leukemia 2009; 23:625-627) a bylo také popsáno její zapojení do dráhy p53, jejíž deregulace má významný vliv u nádorů. miR-150 byla dříve popsána jakožto nejvíce exprimovaná miRNA u CLL (Mraz Met al. Blood. 2014;124:84-95), ale možnost jejího využití jako prognostického markéru v jiných B buněčných malignit a v kombinaci s miR34a nebyla zkoumána.
Asociace miR-34a a TP53 byla již pozorována a byla naznačena souvislost s prognózou onemocnění (Asslaber et al. Blood; 115(21):4191-7; Dufour et al. Blood 2013; 121(18):3650-7). Tyto studie však nebyly prospektivní, kohorty pacientů nebyly v jednotném režimu terapie a v případě abnormalit TP53 zahrnovaly malé množství nedostatečně charakterizovaných vzorků. Tyto studie využívaly pouze relativní stanovení exprese miRNA, které z principu nelze reprodukovat konstantě v jiné laboratoři. Tyto studie tedy není možno považovat za základ diagnostického a prediktivního využití miR-34a u CLL. Námi navrhovaná absolutní kvantifikace miR-34a a získaná data z prospektivně sbíraných vzorků od pacientů léčených nejčastějším terapeutickým protokolem (fludarabin+cyklofosfamid+rituximab=FCR) však umožňuje detekovat jednoduchým způsobem pacienty s nepříznivou odpovědí na léčbu, horší prognózou a abnormalitami v TP53 s vysokou specificitou a senzitivitou (delece a mutace ve více než 20 % buněk; specifita 82 %, senzitivitou 89 %). Pro použití hladiny miR-34a jakožto diagnostického markéru je potřeba zavedení reprodukovatelné metody pro její kvantifikaci.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález navrhuje způsob absolutní kvantifikace miR-34a a/nebo miR-150, jehož podstata spočívá v tom, že v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta se stanoví exprese miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, spolu s expresí endogenní kontroly, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, a endogenní kontroly o známých počtech molekul.
Jako endogenní kontrola může vzhledem k charakteru miRNA sloužit malá jadérková RNA (snoRNA; např. RNU38B, RNU6B, RNU44, RNU48) a/nebo stabilně exprimované miRNy (např. miR-16). Navrhli jsme syntetické standardy, a to dle evolučně konzervovaných sekvencí daných miRNA a snoRNA pro miR-34a, miR-150 a endogenní kontrolu. Tyto standardy o známém počtu molekul jsme analyzovali společně se vzorky a následně přepočítali přesné počty kopií miR-34a a miR-150 na milion molekul endogenní kontroly.
Pro stanovení exprese jsme s výhodou využili přepis miRNA do copyDNA (cDNA) a detekci metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qRT—PCR).
Výhodou miRNA jakožto markéru je jejich snadná dostupnost (např. z odběru periferní krve), dále možnost izolovat miRNA díky jejich vysoké stabilitě i z dlouhodobě archivovaných FFPE bločků a možnost využití miRNA cirkulujících v tělních tekutinách (plazma, sérum, moč, sputum).
Aplikace vynálezu je možná zejména v in vitro diagnostice CLL a dalších B-buněčných malignit, prognostice CLL a predikci léčebné odpovědi (např. na FCR terapii) CLL pacientů a pacientů s B-buněčnými malignitami, a rovněž je způsob podle vynálezu využitelný pro rychlé a snadné odhalení abnormalit TP53 v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta. Jako tento biologický vzorek může sloužit například vzorek periferní krve, plazmy, séra, moči, sputa, ale také vzorek získaný z FFPE bločku.
Dále je předmětem vynálezu použití způsobu podle vynálezu pro stanovení prognózy pacienta s B-buněčnou malignitou, přičemž se nejprve statistickým vyhodnocením vzorku pacientů získá
-2 CZ 306080 B6 rozdělení do prognostických skupin a prahové hodnoty exprese miR-34a a/nebo miR-150 (počty molekul ve vzorku) a prahové hodnoty doby přežití pro jednotlivé prognostické skupiny a při stanovení prognózy se potom kvantitativně stanoví exprese miR-34a a/nebo miR-150 ve vzorku odebraném z těla pacienta a určí jeho příslušnost do odpovídající prognostické skupiny. Exprese miR-34/miR-150 nižší než je prahová hodnota (daný počet molekul ve vzorku) indikuje agresivnější průběh onemocnění a tudíž zkrácenou dobu přežití. Prahová hodnota (počet molekul ve vzorku) se získá statistickým vyhodnocením vzorků pacientů s agresivním a indolentním průběhem onemocnění (viz např. v příkladu 2 je prahová hodnota=2047 kopií miR-34a/milion kopií RNU38B; Obr. 2).
Dále je předmětem použití stanovení exprese miR-34a pro predikci odpovědi na léčbu FCR. Predikce se provede na základě hladiny exprese miR-34a ve vzorku odebraném z těla pacienta (např. periferní krev). Nízká bazální exprese ve vzorku a stejně tak minimální indukce exprese miR-34a při sledování pacienta v průběhu léčby indikuje horší odpověď na terapii, agresivnější průběh onemocnění a zkrácenou dobu do progrese onemocnění. Hladina bazální exprese a indukce v průběhu terapie se stanoví na základě statistické analýzy exprese miR-34a u pacientů s agresivním a indolentním průběhem onemocnění (viz např. v příkladu 4 je normalizovaná exprese [NE] miR-34a u pacientů s kompletní remisí před terapií, [den 1 ]=30 % exprese RNU38B, indukce v průběhu terapie [den 3]=min. 50 % exprese RNU38B; Obr. 4a).
V současné době jsou známy některé markeiy, jejichž exprese koreluje s prognózou B-buněčných lymfomů. Nej významnějším faktorem je mutační stav TP53, přičemž pacienti s abnormalitami v TP53 vykazují nej agresivnější průběh onemocnění (Zenz T et al. Leuk Lymphoma. 2009; 50:510-513; Xie Y et al. Am J Clin Pathol. 2014; 141: 593-604; Sanchez-Gonzales B et al. Leuk Lymphoma. 2009; 50: 455-456). Pro stanovení abnormalit TP53 se tradičně využívá fluorescenční in situ hybridizace (FISH) pro stanovení deletovaných oblastí chromozomu 17, kde leží gen pro protein p53 a pro stanovení mutací je pak využíváno sekvenování této oblasti. Na základě hladiny miR-34a, která je přímým cílem p53, lze jednoduše a rychle na základě qRT-PCR vyhledat pacienty s abnormalitami TP53. Tito pacienti vykazují obecně nejnižší hladiny miR-34a. Pomocí sledování změny hladiny miR-34a lze také následně sledovat selekci těchto abnormalit v průběhu progrese onemocnění a odhalit tak pacienty s potenciálně agresivním onemocněním ještě před plnou manifestací abnormalit. Identifikace se provádí na základě stanovení absolutního počtu molekul miR-34a v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta. Pokud není dosažena prahová hodnota, lze předpokládat přítomnost/vznik abnormality TP53 v průběhu času. Prahová hodnota se stanoví na základě analýzy skupiny pacientů s/bez abnormalitami TP53, senzitivita a specificita metody se stanoví na témže souboru pacientů.
Obdobně lze z FFPE bloků lymfomové tkáně stanovit hladinu exprese miR-34a a/nebo miR-150. Na základě stanovení exprese a příslušnosti do skupiny s vysokou/nízkou expresí lze stanovit prognózu pacientů s ostatními B-buněčnými malignitami (např. FL, DLBCL) a predikovat transformaci do agresivnějších forem onemocnění. Například je možno použít kvantifikační metodu podle vynálezu tak, že se stanoví počet kopií miR-34a a/nebo miR-150 ve vzorku odebraném z těla pacienta trpícího FL, přičemž snížení počtu kopií v průběhu onemocnění indikuje transformaci FL do DLBCL. Výše zmíněným postupem lze detekovat a kvantifikovat cirkulující miRNA a na základě rozdělení pacientů do skupin s vysokou a nízkou expresí stanovit prognózu onkologických pacientů.
Kromě toho je předmětem vynálezu způsob stanovení úspěšnosti replacement miRNA terapie fungující na principu nahrazení nedostatečné exprese miRNA (Bader AG Front Genet. 2012; 3:120; Di Martino MT et al. Clin Cancer Res. 2012; 18:6260-6270). Spočívá ve stanovení exprese miR-34a (nebo jiné replacement miRNA) ve vzorku odebraném z těla pacienta, přičemž zvýšení oproti výchozím hladinám zjištěným na počátku replacement terapie nebo při dřívějších odběrech v rámci terapie znamená její úspěšný průběh. Vynález tak poskytuje způsob vyšetření absolutní hladiny miR-34a, jejíž exprese umožňuje odlišení pacientů s agresivním onemocněním
-3 CZ 306080 B6 bez ohledu na jiné známé prognostické markéry (včetně obou CLL skupin s odlišným IgVH statutem) a současně predikuje odpověď na terapii (konkrétně na FCR).
Nejvíce abundantní miRNA u CLL je miR-150 (Mraz Met al. Blood. 2014;124:84-95), jejíž kombinací s miR-34a získáme originální a jinak nedosažitelnou stratifikaci pacientů. Dále můžeme také využít hladiny miR-34a nebo kombinace miR-34a a miR-150 k predikci léčebné odpovědi u FL, DLBCL, BL a MCL. Kombinace stratifikace dle hladin miR-150 a miR-34a je nezávislým prediktorem v multivariační analýze přežití pacientů.
Byla tedy vyvinuta metodika pro absolutní kvantifikaci, která může sloužit nejen ke stanovení absolutního počtu kopií miR-34a a/nebo miR-150, ale i pro sledování pacientů v čase a záchyt abnormalit v TP53 v průběhu jejich selekce. Kvantitativní stanovení exprese miR-34a a/nebo miR-150 může umožnit i sledování úspěchu miRNA „replacement“ terapie.
Objasnění výkresů
Obr. la. Rozmezí Ct cyklů (resp. počtu kopií miRNA) pokryté syntetickými standardy (Příklad 1).
Obr. 1b. Rozmezí počtu molekul pokrytých syntetickými standardy (Příklad 1).
Obr. 2. Přežití pacientů v závislosti na míře exprese miR-34a (Příklad 2).
Obr. 3. Přežití pacientů v závislosti na míře exprese miR-150 v kombinaci s hladinou miR34a (Příklad 3).
Obr. 4a. Exprese miR-34a u pacientů s odlišnou finální odpovědí na terapii (KR=kompletní remise, n=31; PR=parciální remise, n=9; SO=stabilní onemocnění a horší odpověď, n=10) (Příklad 4)·
Obr. 4b. PFS (přežití bez zhoršení onemocnění, progression-free survival) ve skupině pacientů v terapii fiudarabinem (n=50) (Příklad 4).
Obr. 5a. Hladina miR-34a pozorovaná v odlišných cytogenetických podskupinách CLL (Příklad 5)·
Obr. 5b. Pokles počtu kopií miR-34a u 12 pacientů v průběhu progrese onemocnění doprovázenou vznikem abnormalit v TP53 (Příklad 5).
Obr. 6a. Přežití pacientů s FL v závislosti na základě bazální hladiny miR-150 (Příklad 6).
Obr. 6b. Hladina miR-150 u pacientů po transformaci z FL do DLBCL (Příklad 6).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
V naší studii jsme provedli analýzu exprese miR-34a u CLL buněk za účelem definování role miR-34a v biologii CLL a stanovení vhodné metodiky pro její absolutní kvantifikaci. Na rozdíl od relativní kvantifikace umožňuje absolutní kvantifikace přesné stanovení počtu kopií miRNA v daném vzorku a možnost toto provést reproducibilně v různých laboratořích. Pro přepočet počtu kopií jsme připravili standardní ředicí řady o známém počtu molekul, které pokryjí potřebné
-4CZ 306080 B6 množství cyklů qRT-PCR. Pro aplikaci qRT-PCR v oblasti miRNA je vzhledem ke specifickým vlastnostem miRNA nutná modifikace. Největší překážkou je už samotná délka miRNA, která odpovídá délce běžně používaných primerů, přičemž kratší primery nejsou použitelné. Aby se obešel problém s příliš nízkou teplotou tání primerů v duplexu s miRNA, využíváme například komerčně dostupné tzv. stem-loop neboli vlásenkové primery. Detekční systém TaqMan® MicroRNA Assay (Life Technologies) je založen na použití speciálně navržených primerů pro reverzní transkripci, při níž dojde k prodloužení miRNA a následně specifických sond pro qRTPCR. Reverzní transkripce slouží k syntéze ss cDNA (=single strand) z vyizolované totální RNA prostřednictvím TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kitu (Life Technologies). Vstupní množství RNA je přibližně 4 ng totální RNA v celkovém objemu reakce, který činí 7,5 μΐ. Jako endogenní kontrolu pro normalizaci exprese miRNA používáme malou jadérkovou RNA RNU38B a pro stanovení počtu molekul miR-34a a/nebo miR-150 syntetické miR-34a a/nebo miR-150 a RNU38B (dle miRBase v. 19; syntéza na zakázku firmou Sigma Aldrich). Analogicky lze využít RNU6B, RNU44, RNU48 a další snoRNA jako kontrolní RNA.
miR-34a: 5' - UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG U - 3' miR-150: 5' - UCU CCC AAC CCU UGU ACC AGU G - 3'
RNU38B: 5' - CCA GUU CUG CUA CUG AC A GUA AGU GAA GAU AAA GUG UGU CUG AGG AGA - 3'
Z těchto synteticky připravených RNA připravujeme cDNA, kterou ředíme v poměru 1:7 s vodou bez nukleáz a která při amplifikaci qRT-PCR pokryje téměř 20 cyklů a množství molekul v reakci přibližně od 70 do 18.106 molekul (Obr. la, b). K syntéze cDNA požíváme systém TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). Každý vzorek analyzujeme v triplikátu pomocí systému TaqMan® Gene Expression Assay (Life Technologies) podle instrukcí výrobce. Amplifikace cDNA následně detekujeme přístrojem 7900 Real Time PCR System (Life Technologies). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 (Life Technologies) a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B. Použití této endogenní kontroly jsme validovali společně s možným použitím dalších malých snoRNA, např. RNU6B, RNU44, RNU48 a stabilně exprimovaných miRNA (miR-16).
Příklad 2
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy používáme pouze vzorky s dobrými parametry (RIN>8, koncentrace>100 ng/μΐ). Pro stanovení množství miRNA ve vzorku využíváme postup z příkladu č. 1. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledovanou miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B.
Na základě hladiny miR-34a u skupiny pacientů s CLL (n= 158) jsme byli schopni rozdělit pacienty do dvou prognosticky odlišných skupin s odlišnou délkou přežití (medián 16.7 měsíců vs.
-5CZ 306080 B6 nedosaženo; p-0.0002; HR: 3.30 [CI: 1.69-6.41]; Obr. 2) a to nezávisle na ostatních prognostických faktorech běžně užívaných u CLL (del 17pl3, dell Iq, pohlaví, věk, IgVH; Tab. 1).
Tab. 1. Multivariační analýza prognostických faktorů.
| Tab. 1 | P | HR | Cl 95% | |
| miR-34a prahová hodnota (2047 molekul) | 0.002 | 2.82 | 1.17 | 6.82 |
| del17p13 | 0.752 | 1.17 | 0.44 | 3.15 |
| dell 1q | 0.306 | 0.67 | 0.31 | 1.45 |
| pohlaví (mužské=1; ženské=0) | 0.503 | 1.23 | 0.66 | 2.30 |
| věk (>medián=1; ^medián=0) | 0.128 | 1.57 | 0.88 | 2.81 |
| IgVH status (U=nemutovaný=1; M=mutovaný=0) | 0.112 | 1.80 | 0.87 | 3.76 |
Příklad 3
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy používáme pouze vzorky s dobrými parametry (RIN>8, koncentrace>100 ng/μΐ). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a, miR-150 a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení.
Na základě hladiny souběžného stanovení miR-34a a miR-150 u skupiny pacientů s CLL (n=100) jsme byli schopni rozdělit pacienty do prognosticky odlišných skupin s odlišnou délkou přežití (medián 138 měsíců vs. 257 měsíců) a to nezávisle na ostatních prognostických faktorech běžně užívaných u CLL (p<0.05 HR: 2.2 [Cl 1.1—4.9]; Obr. 3).
Příklad 4
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy spo
-6CZ 306080 B6 léčně umístíme vzorky pro sledovanou miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení.
Tímto způsobem jsme analyzovali skupinu 50 CLL pacientů v terapii, u nichž jsme sledovali výslednou odpověď na terapii v čase. Pacienti s nízkou hladinou miR-34a před zahájením terapie (den 1; NE miR-34a=15 % exprese RNU38B) a nejnižší indukcí v průběhu terapie (den 3; NE=30 % exprese RNU38B) vykazovali nejhorší odpověď na terapii a kratší čas do jejího selhání (Obr. 4a, b).
Příklad 5
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifiigace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledovanou miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B.
Tímto způsobem jsme charakterizovali skupinu 161 CLL pacientů. U pacientů s abnormalitami v TP53 (dell7pl3/mut p53) jsme detekovali nejnižší hladinu miR-34a oproti skupinám CLL pacientů s ostatními cytogenetickými abnormalitami stanovovanými u CLL (del 1 Iq, trizomie 12, normální karyotyp, samostatná dell3q!4; Obr. 5a). Na základě této analýzy lze předpokládat schopnost nízké hladiny miR-34a identifikovat pacienty s abnormalitami v TP53. Pomocí ROC analýzy jsme stanovili počet molekul miR-34a (prahová hodnota) identifikující pacienty s abnormalitou TP53 se specifickou 82 % a senzitivitou 89 %. Absolutní počet molekul miR-34a nám také umožnil sledování pacientů v čase a identifikaci pacientů s progresí onemocnění doprovázenou vznikem abnormalit v TP53 (Obr. 5b). Výše popsaným způsobem jsme analyzovali vzorky 12 pacientů (vzorek 1-12) s postupnou progresí onemocnění doprovázenou vznikem abnormality vTP53. Během této selekce jsme pozorovali pokles počtu kopií miR-34a ve vzorku při přechodu ze stavu νΛ-ΤΡ53 (wild-type; vzorek bez abnormalit) do fáze s abnormalitou v TP53 (Obr. 5b).
Příklad 6
MiRNA z FFPE tkáňových bloků izolujeme podle doporučení a s využitím chemikálií kitu High Pure miRNA Isolation Kit (Roche). Pro izolaci RNA z parafínu nejprve tkáň odparafinujeme a následně natrávíme působením proteáz. RNA v přítomnosti chaotropní soli guanidin thiokyanátu
-7 CZ 306080 B6 navážeme na skleněná vlákna ve filtru kolonky. Navázanou RNA sérií promývacích kroků zbavíme nečistot a následně eluujeme roztokem o nízké koncentraci solí (voda bez nukleáz). MiRNy získáme pouhou změnou koncentrace binding enhancer pufru, podporujícího vazbu na kolonku. Smícháním malého množství tohoto pufru dojde k zachycení dlouhých molekul RNA, zatímco miRNA kolonkou prochází. Následně zvyšujeme koncentraci binding enhanceru a v nové kolonce zachytíme miRNA.
Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a, miR150 a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B.
Zmíněným postupem jsme byli schopni rozdělit pacienty s FL do skupin s odlišnou délkou přežití (100 měsíců sledování: nízká hladina miR-150: 52 % přežívajících, vysoká hladina miR-150: 79% přežívajících; p=0.007; HR=3.0 [CI=1.3-6.8]; Obr. 6a). Analogicky je možné na základě počtu kopií miR-34a a/nebo miR-150 z FFPE bloků stanovit prognózy ostatních B-buněčných malignit a dalších onkologických onemocnění a sledovat transformaci FL do agresivnější formy DLBCL (Obr. 6b).
Příklad 7
Sérum (nebo plasmu) onkologických pacientů lyžujeme v QIAzol Lysis Reagent (Quiagen). Po přidání chloroformu se v lyzátu ustaví rozhraní vodné fáze obsahující RNA a spodní a hraniční organické fáze obsahující DNA a proteiny. Horní vodnou fázi odebereme a přidáme etanol. Vzorek dále přeneseme na kolonku RNeasy MinElute, kde se RNA váže na membránu a fenol a ostatní kontaminanty jsou odmyty. Izolovanou RNA následně eluujeme v malém množství vody bez nukleáz. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miRNA a endogenní kontroly. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly.
Na základě těchto analýz můžeme stanovit počet kopií cirkulujících miRNA u onkologických pacientů a na jeho základě dále stanovit prognózu.
Příklad 8
Nádorovou tkáň (buňky) před/v průběhu/po léčbě na základě miRNA replacement terapie odebíráme do roztoku RNAlater (Life Technologies), aby ve vzorku zůstala zachována kvalita RNA. MiRNA z těchto vzorků izolujeme podle doporučení a s využitím chemikálií kitu High Pure
-8CZ 306080 B6 rniRNA Isolation Kit (Roche). RNA v přítomnosti chaotropní soli guanidin thiokyanátu navážeme na skleněná vlákna ve filtru kolonky. Navázanou RNA sérií promývacích kroků zbavíme nečistot a následně eluujeme roztokem o nízké koncentraci solí (voda bez nukleáz). MiRNy získáme pouhou změnou koncentrace binding enhancer pufni, podporujícího vazbu na kolonku. Smícháním malého množství tohoto pufru dojde k zachycení dlouhých molekul RNA, zatímco miRNA kolonkou prochází. Následně zvyšujeme koncentraci binding enhanceru a v nové kolonce zachytíme miRNA.
Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miRNA a endogenní kontroly. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly.
Zmíněným postupem můžeme na základě počtu kopií miRNA z nádorové tkáně stanovit úspěšnost replacement terapie, resp. úspěšnost obnovení exprese miRNA na základě rostoucího počtu molekul v čase.
Claims (6)
Hide Dependent
translated from
Claims (6)
Hide Dependent
translated from
1. Způsob stanovení prognózy pacienta s B-buněčnou malignitou, vyznačující se tím, že nejprve se statistickým vyhodnocením vzorku pacientů získá rozdělení do prognostických skupin a prahové hodnoty exprese miR-34a a miR-150 a prahové hodnoty doby přežití pro jednotlivé prognostické skupiny, a při stanovení prognózy se potom kvantitativně stanoví exprese miR-34a a miR-150 v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta a určí se jeho příslušnost do odpovídající prognostické skupiny; přičemž se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví exprese miR-34a a miR-150, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miR-34a a miR-150 a endogenní kontroly o známých počtech molekul.
2. Způsob stanovení predikce odpovědi pacienta s B-buněčnou malignitou na léčbu FCR, vyznačující se tím, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví bazální exprese miR-34a, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miR-34a a endogenní kontroly o známých počtech molekul, přičemž bazální exprese miR-34a nižší než prahová hodnota získaná statistickým vyhodnocením vzorku pacientů predikuje špatnou odpověď na léčbu, zatímco exprese vyšší než prahová hodnota predikuje dobrou odpověď na léčbu.
3. Způsob sledování transformace FL do DLBCL u pacienta, vyznačující se tím, že se stanoví počet kopií miR-34a a/nebo miR-150 ve vzorku odebraném z těla pacienta trpícího FL tak, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví exprese miR-34a a/nebo miR150, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miR-34a a/nebo miR-150 a endogenní kontroly o známých počtech molekul, a přepočte se počet kopií na milion molekul endo
-9CZ 306080 B6 genní kontroly; přičemž snížení počtu kopií v průběhu onemocnění indikuje transformaci FL do DLBCL.
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že pro stanovení exprese se použije detekce hladiny miRNA prostřednictvím jejího přepisu do cDNA a detekce metodou qRT-PCR.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že malá jadérková RNA je vybrána ze skupiny zahrnující RNU38B, RNU6B, RNU44, RNU48 a/nebo stabilně exprimovaná miRNA je miR-16.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že biologický vzorek odebraný z těla pacienta je vybraný ze skupiny zahrnující vzorek periferní krve, plasmy, séra, moči, sputa, vzorky z FFPE bločků.