CZ306080B6 - Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit - Google Patents
Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit Download PDFInfo
- Publication number
- CZ306080B6 CZ306080B6 CZ2015-106A CZ2015106A CZ306080B6 CZ 306080 B6 CZ306080 B6 CZ 306080B6 CZ 2015106 A CZ2015106 A CZ 2015106A CZ 306080 B6 CZ306080 B6 CZ 306080B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mir
- expression
- patient
- mirna
- molecules
- Prior art date
Links
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 108091029119 miR-34a stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 20
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title abstract description 13
- 108091057645 miR-15 stem-loop Proteins 0.000 title 1
- 108091046841 MiR-150 Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 35
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 12
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 claims description 6
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims 2
- 101150017740 B6 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 abstract description 20
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 abstract description 19
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 41
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 40
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 39
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 39
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 6
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 5
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 4
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102100039341 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710102159 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101100170173 Caenorhabditis elegans del-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010063092 Trisomy 12 Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108091074487 miR-34 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091092493 miR-34-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091059780 miR-34-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje způsob absolutní kvantifikace exprese mmiRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, kdy se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví exprese miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, a endogenní kontroly o známých počtech molekul. Řešení dále poskytuje použití tohoto způsobu kvantifikace v in vitro diagnostice B-buněčných malignit, prognostice B-buněčných malignit a predikci léčebné odpovědi pacientů s B-buněčnými malignitami, zejména CLL, identifikaci abnormalit TP53.
Description
Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nové metodiky pro absolutní kvantifikaci miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, umožňující diagnostické využití miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150. Dále popisuje použití této metodiky pro stanovení prognózy u pacientů s diagnostikovanou CLL a dalšími B-buněčnými malignitami [folikulámí lymfom, FL; difúzní velkobuněčný B-lymfom, DLBCL (difuzní velkobuněčné B-lymfomy); Burkittův lymfom, BL; lymfom z plášťových buněk, MCL], stanovení jejich léčebné odpovědi na terapii a stanovení mutačního stavu TP53 u těchto pacientů.
Dosavadní stav techniky
Chronická lymfocytámí leukémie (CLL) je charakterizována jako monoklonální expanze zralých B-lymfocytů, které se hromadí v periferní krvi a lymfatických orgánech (Chiorazzi N et al. N Engl J Med. 2005;352:804-815). Donedávna se v klinické praxi k určení prognózy používal pouze staging podle Raie (Rai KR et al. Blood 1975;46:219-234) nebo podle Bineta (Binet JL et al. Cancer 1981;48:198-206). Tento empirický systém však není v současné době dostačující. Pacienti jsou diagnostikováni často ve velmi raném stádiu CLL a na základě prostého stagingu nelze odlišit pacienty, kteří budou rychle progredovat od pacientů s indolentní formou onemocnění. CLL a další B-buněčné lymfomy jsou klinicky značně heterogenní onemocnění a doba přežití se u jednotlivých pacientů velmi liší. Z tohoto důvodu se u CLL a některých FL pacientů bez klinických příznaků nemoci často doporučuje pouze sledování. Problematické je zejména včasné rozpoznání agresivní formy choroby, která se častěji projevuje u mladších pacientů. Během posledních deseti let byla onemocnění CLL věnována velká pozornost a výsledkem je soubor několika skupin parametrů, které CLL podrobně charakterizují a umožňují predikci průběhu nemoci. U dalších B-buněčných lymfomů je k dispozici jen velmi omezené množství prognostických markérů.
Dosud nejvýznamnějším prognostickým markérem se u CLL jeví mutační status genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgVH). Přítomnost nemutovaného genu pro IgVH (nukleotidová homologie se zárodečnou linií větší než 98 %) je spojena s horším průběhem a kratším přežíváním pacientů (8 let vs. 25 let u pacientů s mutovaným IgVH; Damle RNet al. Blood 1999,94:18401847; Hamblin TJet al. Blood 1999;94:1848-1854). Stanovení tohoto parametru nezbytného pro určení prognózy a léčby onemocnění je však vysoce technicky, časově i finančně náročné. Zároveň klinicky nej potřebnějším je stanovení predikce léčebné odpovědi na daný terapeuticky režim, což prakticky žádný z doposud používaných markérů neumožňuje spolehlivě. V případě FL se prognóza onemocnění prakticky výlučně v klinické praxi řídí tzv. Follicular Lymphoma International Prognostic Index (FLIPI), který je založen na kombinaci klinického vyšetření, věku pacienta a biochemickém parametru (hladina laktát dehydrogenázy; Solal-Celigny P et al Blood 2004;104:1258-1265). V případě DLBCL se využívá technicky velmi náročné a těžko reprodukovatelné metodiky na principu stanovení genové exprese několika genů pro rozdělení pacientů do skupin tzv. ABC vs. GC fenotypu B buněk (RosenwaldA et al. NEnglJMed. 2002;346:19371947).
MiRNA jsou 19 až 25 nukleotidů dlouhé evolučně zakonzervované regulátory genové exprese, které v buňce kontrolují na post-transkripční úrovni jak řadu fyziologických, tak patologických procesů. Onemocněním, u nějž byla v roce 2002 poprvé pozorována souvislost s miRNA, byla právě chronická lymfocytámí leukémie. Vzhledem k asociaci změny exprese miRNA a nádorových onemocnění je možné na základě exprese odlišné exprese miRNA odlišit nejen jednotlivá onkologická onemocnění, ale odlišit i subtypy v rámci jednoho onemocnění.
-1 CZ 306080 B6
MiR-34a byla identifikována již v dřívějších studiích jako miRNA významná pro biologii CLL a B-buněčných malignit (Zenz Tet al. Blood 2009; 113:3801-3808; Mraz Met al. Leukemia 2009; 23:1159-1163; Djikstra MK et al. Leukemia 2009; 23:625-627) a bylo také popsáno její zapojení do dráhy p53, jejíž deregulace má významný vliv u nádorů. miR-150 byla dříve popsána jakožto nejvíce exprimovaná miRNA u CLL (Mraz Met al. Blood. 2014;124:84-95), ale možnost jejího využití jako prognostického markéru v jiných B buněčných malignit a v kombinaci s miR34a nebyla zkoumána.
Asociace miR-34a a TP53 byla již pozorována a byla naznačena souvislost s prognózou onemocnění (Asslaber et al. Blood; 115(21):4191-7; Dufour et al. Blood 2013; 121(18):3650-7). Tyto studie však nebyly prospektivní, kohorty pacientů nebyly v jednotném režimu terapie a v případě abnormalit TP53 zahrnovaly malé množství nedostatečně charakterizovaných vzorků. Tyto studie využívaly pouze relativní stanovení exprese miRNA, které z principu nelze reprodukovat konstantě v jiné laboratoři. Tyto studie tedy není možno považovat za základ diagnostického a prediktivního využití miR-34a u CLL. Námi navrhovaná absolutní kvantifikace miR-34a a získaná data z prospektivně sbíraných vzorků od pacientů léčených nejčastějším terapeutickým protokolem (fludarabin+cyklofosfamid+rituximab=FCR) však umožňuje detekovat jednoduchým způsobem pacienty s nepříznivou odpovědí na léčbu, horší prognózou a abnormalitami v TP53 s vysokou specificitou a senzitivitou (delece a mutace ve více než 20 % buněk; specifita 82 %, senzitivitou 89 %). Pro použití hladiny miR-34a jakožto diagnostického markéru je potřeba zavedení reprodukovatelné metody pro její kvantifikaci.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález navrhuje způsob absolutní kvantifikace miR-34a a/nebo miR-150, jehož podstata spočívá v tom, že v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta se stanoví exprese miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, spolu s expresí endogenní kontroly, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miRNA, s výhodou vybrané z miR-34a a/nebo miR-150, a endogenní kontroly o známých počtech molekul.
Jako endogenní kontrola může vzhledem k charakteru miRNA sloužit malá jadérková RNA (snoRNA; např. RNU38B, RNU6B, RNU44, RNU48) a/nebo stabilně exprimované miRNy (např. miR-16). Navrhli jsme syntetické standardy, a to dle evolučně konzervovaných sekvencí daných miRNA a snoRNA pro miR-34a, miR-150 a endogenní kontrolu. Tyto standardy o známém počtu molekul jsme analyzovali společně se vzorky a následně přepočítali přesné počty kopií miR-34a a miR-150 na milion molekul endogenní kontroly.
Pro stanovení exprese jsme s výhodou využili přepis miRNA do copyDNA (cDNA) a detekci metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qRT—PCR).
Výhodou miRNA jakožto markéru je jejich snadná dostupnost (např. z odběru periferní krve), dále možnost izolovat miRNA díky jejich vysoké stabilitě i z dlouhodobě archivovaných FFPE bločků a možnost využití miRNA cirkulujících v tělních tekutinách (plazma, sérum, moč, sputum).
Aplikace vynálezu je možná zejména v in vitro diagnostice CLL a dalších B-buněčných malignit, prognostice CLL a predikci léčebné odpovědi (např. na FCR terapii) CLL pacientů a pacientů s B-buněčnými malignitami, a rovněž je způsob podle vynálezu využitelný pro rychlé a snadné odhalení abnormalit TP53 v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta. Jako tento biologický vzorek může sloužit například vzorek periferní krve, plazmy, séra, moči, sputa, ale také vzorek získaný z FFPE bločku.
Dále je předmětem vynálezu použití způsobu podle vynálezu pro stanovení prognózy pacienta s B-buněčnou malignitou, přičemž se nejprve statistickým vyhodnocením vzorku pacientů získá
-2 CZ 306080 B6 rozdělení do prognostických skupin a prahové hodnoty exprese miR-34a a/nebo miR-150 (počty molekul ve vzorku) a prahové hodnoty doby přežití pro jednotlivé prognostické skupiny a při stanovení prognózy se potom kvantitativně stanoví exprese miR-34a a/nebo miR-150 ve vzorku odebraném z těla pacienta a určí jeho příslušnost do odpovídající prognostické skupiny. Exprese miR-34/miR-150 nižší než je prahová hodnota (daný počet molekul ve vzorku) indikuje agresivnější průběh onemocnění a tudíž zkrácenou dobu přežití. Prahová hodnota (počet molekul ve vzorku) se získá statistickým vyhodnocením vzorků pacientů s agresivním a indolentním průběhem onemocnění (viz např. v příkladu 2 je prahová hodnota=2047 kopií miR-34a/milion kopií RNU38B; Obr. 2).
Dále je předmětem použití stanovení exprese miR-34a pro predikci odpovědi na léčbu FCR. Predikce se provede na základě hladiny exprese miR-34a ve vzorku odebraném z těla pacienta (např. periferní krev). Nízká bazální exprese ve vzorku a stejně tak minimální indukce exprese miR-34a při sledování pacienta v průběhu léčby indikuje horší odpověď na terapii, agresivnější průběh onemocnění a zkrácenou dobu do progrese onemocnění. Hladina bazální exprese a indukce v průběhu terapie se stanoví na základě statistické analýzy exprese miR-34a u pacientů s agresivním a indolentním průběhem onemocnění (viz např. v příkladu 4 je normalizovaná exprese [NE] miR-34a u pacientů s kompletní remisí před terapií, [den 1 ]=30 % exprese RNU38B, indukce v průběhu terapie [den 3]=min. 50 % exprese RNU38B; Obr. 4a).
V současné době jsou známy některé markeiy, jejichž exprese koreluje s prognózou B-buněčných lymfomů. Nej významnějším faktorem je mutační stav TP53, přičemž pacienti s abnormalitami v TP53 vykazují nej agresivnější průběh onemocnění (Zenz T et al. Leuk Lymphoma. 2009; 50:510-513; Xie Y et al. Am J Clin Pathol. 2014; 141: 593-604; Sanchez-Gonzales B et al. Leuk Lymphoma. 2009; 50: 455-456). Pro stanovení abnormalit TP53 se tradičně využívá fluorescenční in situ hybridizace (FISH) pro stanovení deletovaných oblastí chromozomu 17, kde leží gen pro protein p53 a pro stanovení mutací je pak využíváno sekvenování této oblasti. Na základě hladiny miR-34a, která je přímým cílem p53, lze jednoduše a rychle na základě qRT-PCR vyhledat pacienty s abnormalitami TP53. Tito pacienti vykazují obecně nejnižší hladiny miR-34a. Pomocí sledování změny hladiny miR-34a lze také následně sledovat selekci těchto abnormalit v průběhu progrese onemocnění a odhalit tak pacienty s potenciálně agresivním onemocněním ještě před plnou manifestací abnormalit. Identifikace se provádí na základě stanovení absolutního počtu molekul miR-34a v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta. Pokud není dosažena prahová hodnota, lze předpokládat přítomnost/vznik abnormality TP53 v průběhu času. Prahová hodnota se stanoví na základě analýzy skupiny pacientů s/bez abnormalitami TP53, senzitivita a specificita metody se stanoví na témže souboru pacientů.
Obdobně lze z FFPE bloků lymfomové tkáně stanovit hladinu exprese miR-34a a/nebo miR-150. Na základě stanovení exprese a příslušnosti do skupiny s vysokou/nízkou expresí lze stanovit prognózu pacientů s ostatními B-buněčnými malignitami (např. FL, DLBCL) a predikovat transformaci do agresivnějších forem onemocnění. Například je možno použít kvantifikační metodu podle vynálezu tak, že se stanoví počet kopií miR-34a a/nebo miR-150 ve vzorku odebraném z těla pacienta trpícího FL, přičemž snížení počtu kopií v průběhu onemocnění indikuje transformaci FL do DLBCL. Výše zmíněným postupem lze detekovat a kvantifikovat cirkulující miRNA a na základě rozdělení pacientů do skupin s vysokou a nízkou expresí stanovit prognózu onkologických pacientů.
Kromě toho je předmětem vynálezu způsob stanovení úspěšnosti replacement miRNA terapie fungující na principu nahrazení nedostatečné exprese miRNA (Bader AG Front Genet. 2012; 3:120; Di Martino MT et al. Clin Cancer Res. 2012; 18:6260-6270). Spočívá ve stanovení exprese miR-34a (nebo jiné replacement miRNA) ve vzorku odebraném z těla pacienta, přičemž zvýšení oproti výchozím hladinám zjištěným na počátku replacement terapie nebo při dřívějších odběrech v rámci terapie znamená její úspěšný průběh. Vynález tak poskytuje způsob vyšetření absolutní hladiny miR-34a, jejíž exprese umožňuje odlišení pacientů s agresivním onemocněním
-3 CZ 306080 B6 bez ohledu na jiné známé prognostické markéry (včetně obou CLL skupin s odlišným IgVH statutem) a současně predikuje odpověď na terapii (konkrétně na FCR).
Nejvíce abundantní miRNA u CLL je miR-150 (Mraz Met al. Blood. 2014;124:84-95), jejíž kombinací s miR-34a získáme originální a jinak nedosažitelnou stratifikaci pacientů. Dále můžeme také využít hladiny miR-34a nebo kombinace miR-34a a miR-150 k predikci léčebné odpovědi u FL, DLBCL, BL a MCL. Kombinace stratifikace dle hladin miR-150 a miR-34a je nezávislým prediktorem v multivariační analýze přežití pacientů.
Byla tedy vyvinuta metodika pro absolutní kvantifikaci, která může sloužit nejen ke stanovení absolutního počtu kopií miR-34a a/nebo miR-150, ale i pro sledování pacientů v čase a záchyt abnormalit v TP53 v průběhu jejich selekce. Kvantitativní stanovení exprese miR-34a a/nebo miR-150 může umožnit i sledování úspěchu miRNA „replacement“ terapie.
Objasnění výkresů
Obr. la. Rozmezí Ct cyklů (resp. počtu kopií miRNA) pokryté syntetickými standardy (Příklad 1).
Obr. 1b. Rozmezí počtu molekul pokrytých syntetickými standardy (Příklad 1).
Obr. 2. Přežití pacientů v závislosti na míře exprese miR-34a (Příklad 2).
Obr. 3. Přežití pacientů v závislosti na míře exprese miR-150 v kombinaci s hladinou miR34a (Příklad 3).
Obr. 4a. Exprese miR-34a u pacientů s odlišnou finální odpovědí na terapii (KR=kompletní remise, n=31; PR=parciální remise, n=9; SO=stabilní onemocnění a horší odpověď, n=10) (Příklad 4)·
Obr. 4b. PFS (přežití bez zhoršení onemocnění, progression-free survival) ve skupině pacientů v terapii fiudarabinem (n=50) (Příklad 4).
Obr. 5a. Hladina miR-34a pozorovaná v odlišných cytogenetických podskupinách CLL (Příklad 5)·
Obr. 5b. Pokles počtu kopií miR-34a u 12 pacientů v průběhu progrese onemocnění doprovázenou vznikem abnormalit v TP53 (Příklad 5).
Obr. 6a. Přežití pacientů s FL v závislosti na základě bazální hladiny miR-150 (Příklad 6).
Obr. 6b. Hladina miR-150 u pacientů po transformaci z FL do DLBCL (Příklad 6).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
V naší studii jsme provedli analýzu exprese miR-34a u CLL buněk za účelem definování role miR-34a v biologii CLL a stanovení vhodné metodiky pro její absolutní kvantifikaci. Na rozdíl od relativní kvantifikace umožňuje absolutní kvantifikace přesné stanovení počtu kopií miRNA v daném vzorku a možnost toto provést reproducibilně v různých laboratořích. Pro přepočet počtu kopií jsme připravili standardní ředicí řady o známém počtu molekul, které pokryjí potřebné
-4CZ 306080 B6 množství cyklů qRT-PCR. Pro aplikaci qRT-PCR v oblasti miRNA je vzhledem ke specifickým vlastnostem miRNA nutná modifikace. Největší překážkou je už samotná délka miRNA, která odpovídá délce běžně používaných primerů, přičemž kratší primery nejsou použitelné. Aby se obešel problém s příliš nízkou teplotou tání primerů v duplexu s miRNA, využíváme například komerčně dostupné tzv. stem-loop neboli vlásenkové primery. Detekční systém TaqMan® MicroRNA Assay (Life Technologies) je založen na použití speciálně navržených primerů pro reverzní transkripci, při níž dojde k prodloužení miRNA a následně specifických sond pro qRTPCR. Reverzní transkripce slouží k syntéze ss cDNA (=single strand) z vyizolované totální RNA prostřednictvím TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kitu (Life Technologies). Vstupní množství RNA je přibližně 4 ng totální RNA v celkovém objemu reakce, který činí 7,5 μΐ. Jako endogenní kontrolu pro normalizaci exprese miRNA používáme malou jadérkovou RNA RNU38B a pro stanovení počtu molekul miR-34a a/nebo miR-150 syntetické miR-34a a/nebo miR-150 a RNU38B (dle miRBase v. 19; syntéza na zakázku firmou Sigma Aldrich). Analogicky lze využít RNU6B, RNU44, RNU48 a další snoRNA jako kontrolní RNA.
miR-34a: 5' - UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG U - 3' miR-150: 5' - UCU CCC AAC CCU UGU ACC AGU G - 3'
RNU38B: 5' - CCA GUU CUG CUA CUG AC A GUA AGU GAA GAU AAA GUG UGU CUG AGG AGA - 3'
Z těchto synteticky připravených RNA připravujeme cDNA, kterou ředíme v poměru 1:7 s vodou bez nukleáz a která při amplifikaci qRT-PCR pokryje téměř 20 cyklů a množství molekul v reakci přibližně od 70 do 18.106 molekul (Obr. la, b). K syntéze cDNA požíváme systém TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). Každý vzorek analyzujeme v triplikátu pomocí systému TaqMan® Gene Expression Assay (Life Technologies) podle instrukcí výrobce. Amplifikace cDNA následně detekujeme přístrojem 7900 Real Time PCR System (Life Technologies). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 (Life Technologies) a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B. Použití této endogenní kontroly jsme validovali společně s možným použitím dalších malých snoRNA, např. RNU6B, RNU44, RNU48 a stabilně exprimovaných miRNA (miR-16).
Příklad 2
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy používáme pouze vzorky s dobrými parametry (RIN>8, koncentrace>100 ng/μΐ). Pro stanovení množství miRNA ve vzorku využíváme postup z příkladu č. 1. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledovanou miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B.
Na základě hladiny miR-34a u skupiny pacientů s CLL (n= 158) jsme byli schopni rozdělit pacienty do dvou prognosticky odlišných skupin s odlišnou délkou přežití (medián 16.7 měsíců vs.
-5CZ 306080 B6 nedosaženo; p-0.0002; HR: 3.30 [CI: 1.69-6.41]; Obr. 2) a to nezávisle na ostatních prognostických faktorech běžně užívaných u CLL (del 17pl3, dell Iq, pohlaví, věk, IgVH; Tab. 1).
Tab. 1. Multivariační analýza prognostických faktorů.
| Tab. 1 | P | HR | Cl 95% | |
| miR-34a prahová hodnota (2047 molekul) | 0.002 | 2.82 | 1.17 | 6.82 |
| del17p13 | 0.752 | 1.17 | 0.44 | 3.15 |
| dell 1q | 0.306 | 0.67 | 0.31 | 1.45 |
| pohlaví (mužské=1; ženské=0) | 0.503 | 1.23 | 0.66 | 2.30 |
| věk (>medián=1; ^medián=0) | 0.128 | 1.57 | 0.88 | 2.81 |
| IgVH status (U=nemutovaný=1; M=mutovaný=0) | 0.112 | 1.80 | 0.87 | 3.76 |
Příklad 3
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy používáme pouze vzorky s dobrými parametry (RIN>8, koncentrace>100 ng/μΐ). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a, miR-150 a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení.
Na základě hladiny souběžného stanovení miR-34a a miR-150 u skupiny pacientů s CLL (n=100) jsme byli schopni rozdělit pacienty do prognosticky odlišných skupin s odlišnou délkou přežití (medián 138 měsíců vs. 257 měsíců) a to nezávisle na ostatních prognostických faktorech běžně užívaných u CLL (p<0.05 HR: 2.2 [Cl 1.1—4.9]; Obr. 3).
Příklad 4
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy spo
-6CZ 306080 B6 léčně umístíme vzorky pro sledovanou miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení.
Tímto způsobem jsme analyzovali skupinu 50 CLL pacientů v terapii, u nichž jsme sledovali výslednou odpověď na terapii v čase. Pacienti s nízkou hladinou miR-34a před zahájením terapie (den 1; NE miR-34a=15 % exprese RNU38B) a nejnižší indukcí v průběhu terapie (den 3; NE=30 % exprese RNU38B) vykazovali nejhorší odpověď na terapii a kratší čas do jejího selhání (Obr. 4a, b).
Příklad 5
Periferní krev pacienta s diagnózou CLL odebíráme do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin/EDTA). Mononukleámí buňky separujeme pomocí gradientově centrifiigace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předchází inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Ze separovaných CLL lymfocytů (CD19+, CD5+) připravujeme lyzát v TRI Reagentu (Sigma Aldrich). Pomocí BCP (Molecular Research Center, lne.) izolujeme totální RNA z lyzátu CLL buněk. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledovanou miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B.
Tímto způsobem jsme charakterizovali skupinu 161 CLL pacientů. U pacientů s abnormalitami v TP53 (dell7pl3/mut p53) jsme detekovali nejnižší hladinu miR-34a oproti skupinám CLL pacientů s ostatními cytogenetickými abnormalitami stanovovanými u CLL (del 1 Iq, trizomie 12, normální karyotyp, samostatná dell3q!4; Obr. 5a). Na základě této analýzy lze předpokládat schopnost nízké hladiny miR-34a identifikovat pacienty s abnormalitami v TP53. Pomocí ROC analýzy jsme stanovili počet molekul miR-34a (prahová hodnota) identifikující pacienty s abnormalitou TP53 se specifickou 82 % a senzitivitou 89 %. Absolutní počet molekul miR-34a nám také umožnil sledování pacientů v čase a identifikaci pacientů s progresí onemocnění doprovázenou vznikem abnormalit v TP53 (Obr. 5b). Výše popsaným způsobem jsme analyzovali vzorky 12 pacientů (vzorek 1-12) s postupnou progresí onemocnění doprovázenou vznikem abnormality vTP53. Během této selekce jsme pozorovali pokles počtu kopií miR-34a ve vzorku při přechodu ze stavu νΛ-ΤΡ53 (wild-type; vzorek bez abnormalit) do fáze s abnormalitou v TP53 (Obr. 5b).
Příklad 6
MiRNA z FFPE tkáňových bloků izolujeme podle doporučení a s využitím chemikálií kitu High Pure miRNA Isolation Kit (Roche). Pro izolaci RNA z parafínu nejprve tkáň odparafinujeme a následně natrávíme působením proteáz. RNA v přítomnosti chaotropní soli guanidin thiokyanátu
-7 CZ 306080 B6 navážeme na skleněná vlákna ve filtru kolonky. Navázanou RNA sérií promývacích kroků zbavíme nečistot a následně eluujeme roztokem o nízké koncentraci solí (voda bez nukleáz). MiRNy získáme pouhou změnou koncentrace binding enhancer pufru, podporujícího vazbu na kolonku. Smícháním malého množství tohoto pufru dojde k zachycení dlouhých molekul RNA, zatímco miRNA kolonkou prochází. Následně zvyšujeme koncentraci binding enhanceru a v nové kolonce zachytíme miRNA.
Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miR-34a, miR150 a RNU38B. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme z hodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly RNU38B.
Zmíněným postupem jsme byli schopni rozdělit pacienty s FL do skupin s odlišnou délkou přežití (100 měsíců sledování: nízká hladina miR-150: 52 % přežívajících, vysoká hladina miR-150: 79% přežívajících; p=0.007; HR=3.0 [CI=1.3-6.8]; Obr. 6a). Analogicky je možné na základě počtu kopií miR-34a a/nebo miR-150 z FFPE bloků stanovit prognózy ostatních B-buněčných malignit a dalších onkologických onemocnění a sledovat transformaci FL do agresivnější formy DLBCL (Obr. 6b).
Příklad 7
Sérum (nebo plasmu) onkologických pacientů lyžujeme v QIAzol Lysis Reagent (Quiagen). Po přidání chloroformu se v lyzátu ustaví rozhraní vodné fáze obsahující RNA a spodní a hraniční organické fáze obsahující DNA a proteiny. Horní vodnou fázi odebereme a přidáme etanol. Vzorek dále přeneseme na kolonku RNeasy MinElute, kde se RNA váže na membránu a fenol a ostatní kontaminanty jsou odmyty. Izolovanou RNA následně eluujeme v malém množství vody bez nukleáz. Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miRNA a endogenní kontroly. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly.
Na základě těchto analýz můžeme stanovit počet kopií cirkulujících miRNA u onkologických pacientů a na jeho základě dále stanovit prognózu.
Příklad 8
Nádorovou tkáň (buňky) před/v průběhu/po léčbě na základě miRNA replacement terapie odebíráme do roztoku RNAlater (Life Technologies), aby ve vzorku zůstala zachována kvalita RNA. MiRNA z těchto vzorků izolujeme podle doporučení a s využitím chemikálií kitu High Pure
-8CZ 306080 B6 rniRNA Isolation Kit (Roche). RNA v přítomnosti chaotropní soli guanidin thiokyanátu navážeme na skleněná vlákna ve filtru kolonky. Navázanou RNA sérií promývacích kroků zbavíme nečistot a následně eluujeme roztokem o nízké koncentraci solí (voda bez nukleáz). MiRNy získáme pouhou změnou koncentrace binding enhancer pufni, podporujícího vazbu na kolonku. Smícháním malého množství tohoto pufru dojde k zachycení dlouhých molekul RNA, zatímco miRNA kolonkou prochází. Následně zvyšujeme koncentraci binding enhanceru a v nové kolonce zachytíme miRNA.
Kvalitu a koncentraci získané totální RNA stanovujeme spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro stanovení absolutní genové exprese využíváme qRT-PCR. Na jedné desce vždy společně umístíme vzorky pro sledované miRNA a endogenní kontrolu od daného vzorku spolu s řadou standardů pro stanovení absolutního počtu molekul miRNA a endogenní kontroly. cDNA nanášíme v triplikátech. Pro vyloučení kontaminace zařazujeme duplikáty, v nichž je cDNA nahrazena vodou bez nukleáz. Pro srovnání desek mezi sebou využíváme interní standard, kterým je vzorek pacientské RNA (tzn. vždy stejná RNA, detekce stejné endogenní kontroly a miRNA). Data hodnotíme v programu SDS v2.4 a následně exportujeme ve formátu tabulky Excel (Microsoft Office XP). Pokud je odchylka hodnoty v triplikátu vyšší než 0,3 cyklu, tuto odlehlou hodnotu vyřazujeme zhodnocení. Následně provádíme přepočet počtu molekul miRNA na milion molekul endogenní kontroly.
Zmíněným postupem můžeme na základě počtu kopií miRNA z nádorové tkáně stanovit úspěšnost replacement terapie, resp. úspěšnost obnovení exprese miRNA na základě rostoucího počtu molekul v čase.
Claims (6)
1. Způsob stanovení prognózy pacienta s B-buněčnou malignitou, vyznačující se tím, že nejprve se statistickým vyhodnocením vzorku pacientů získá rozdělení do prognostických skupin a prahové hodnoty exprese miR-34a a miR-150 a prahové hodnoty doby přežití pro jednotlivé prognostické skupiny, a při stanovení prognózy se potom kvantitativně stanoví exprese miR-34a a miR-150 v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta a určí se jeho příslušnost do odpovídající prognostické skupiny; přičemž se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví exprese miR-34a a miR-150, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miR-34a a miR-150 a endogenní kontroly o známých počtech molekul.
2. Způsob stanovení predikce odpovědi pacienta s B-buněčnou malignitou na léčbu FCR, vyznačující se tím, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví bazální exprese miR-34a, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miR-34a a endogenní kontroly o známých počtech molekul, přičemž bazální exprese miR-34a nižší než prahová hodnota získaná statistickým vyhodnocením vzorku pacientů predikuje špatnou odpověď na léčbu, zatímco exprese vyšší než prahová hodnota predikuje dobrou odpověď na léčbu.
3. Způsob sledování transformace FL do DLBCL u pacienta, vyznačující se tím, že se stanoví počet kopií miR-34a a/nebo miR-150 ve vzorku odebraném z těla pacienta trpícího FL tak, že se v biologickém vzorku odebraném z těla pacienta stanoví exprese miR-34a a/nebo miR150, spolu s expresí endogenní kontroly, kterou je malá jadérková RNA či stabilně exprimovaná miRNA, a zároveň se stanoví exprese syntetických standardů miR-34a a/nebo miR-150 a endogenní kontroly o známých počtech molekul, a přepočte se počet kopií na milion molekul endo
-9CZ 306080 B6 genní kontroly; přičemž snížení počtu kopií v průběhu onemocnění indikuje transformaci FL do DLBCL.
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že pro stanovení exprese se použije detekce hladiny miRNA prostřednictvím jejího přepisu do cDNA a detekce metodou qRT-PCR.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že malá jadérková RNA je vybrána ze skupiny zahrnující RNU38B, RNU6B, RNU44, RNU48 a/nebo stabilně exprimovaná miRNA je miR-16.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že biologický vzorek odebraný z těla pacienta je vybraný ze skupiny zahrnující vzorek periferní krve, plasmy, séra, moči, sputa, vzorky z FFPE bločků.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-106A CZ306080B6 (cs) | 2015-02-17 | 2015-02-17 | Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-106A CZ306080B6 (cs) | 2015-02-17 | 2015-02-17 | Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2015106A3 CZ2015106A3 (cs) | 2016-07-27 |
| CZ306080B6 true CZ306080B6 (cs) | 2016-07-27 |
Family
ID=56611756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-106A CZ306080B6 (cs) | 2015-02-17 | 2015-02-17 | Způsob absolutní kvantifikace exprese miRNA, zejména miR-34a a/nebo miR-150, a jeho použití v diagnostice a prognostice B-buněčných malignit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ306080B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ309489B6 (cs) * | 2018-10-14 | 2023-02-22 | Masarykova Univerzita | Způsob stanovení prognózy u pacientů s folikulárním lymfomem |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014085906A1 (en) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | St. Michael's Hospital | Microrna biomarkers for prostate cancer |
-
2015
- 2015-02-17 CZ CZ2015-106A patent/CZ306080B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014085906A1 (en) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | St. Michael's Hospital | Microrna biomarkers for prostate cancer |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| H.D. VanGuilder et al. :"Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis" Biotechniques 25th Anniversary 44 (5) s. 619-626 (2008) * |
| K. Cerná: "Úloha microRNA v apoptóze u chronické lymfocytární leukemie" MU PrF ÚEB, Brno 2013 * |
| N. Kmetová: "Význam mikroRNA v patogenezi mnohocetného lymfomu" MU PrF ÚB Brno 2013 * |
| T.C Roberts et al. :"Detection and quantification of extracellular microRNAs in murine biofluids" Biological Procedures Online 16:5 (2014) http://www.biologicalproceduresonline.com/content/16/1/5 * |
| U. Bissels et al: "Absolute quantification of microRNAa by using a universal reference" RNA 15 (12) 2375-2384 (2009) * |
| V. Mayerová : "Úloha microRNA v molekulárních drahách u chronické lymfocytární leikemie" MU PrF ÚEB Brno 2012 * |
| Y.M. Youssef et al: "Accurate Molecular Classification of Kidney Cancer Subtypes Using MicroRNA Signature" European Urology 59 s. 721-730 (2011) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ309489B6 (cs) * | 2018-10-14 | 2023-02-22 | Masarykova Univerzita | Způsob stanovení prognózy u pacientů s folikulárním lymfomem |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2015106A3 (cs) | 2016-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Visone et al. | miR-181b is a biomarker of disease progression in chronic lymphocytic leukemia | |
| Wang et al. | Advances in circular RNAs and their roles in breast Cancer | |
| Sebastiani et al. | Circulating microRNAs and diabetes mellitus: a novel tool for disease prediction, diagnosis, and staging? | |
| Lau et al. | Alteration of the micro RNA network during the progression of Alzheimer's disease | |
| Ouillette et al. | Integrated genomic profiling of chronic lymphocytic leukemia identifies subtypes of deletion 13q14 | |
| Armstrong et al. | MicroRNA molecular profiling from matched tumor and bio-fluids in bladder cancer | |
| Scian et al. | MicroRNA profiles in allograft tissues and paired urines associate with chronic allograft dysfunction with IF/TA | |
| US20190249254A1 (en) | Methods and Compositions for Assessing Patients with Preeclampsia-Related Conditions Using MicroRNA | |
| Rossi et al. | microRNA fingerprinting of CLL patients with chromosome 17p deletion identify a miR-21 score that stratifies early survival | |
| Zhao et al. | microRNA expression profile and identification of miR-29 as a prognostic marker and pathogenetic factor by targeting CDK6 in mantle cell lymphoma | |
| Tahiri et al. | Deregulation of cancer-related miRNAs is a common event in both benign and malignant human breast tumors | |
| Long et al. | Characterization of serum microRNAs profile of PCOS and identification of novel non-invasive biomarkers | |
| Cañadas-Garre et al. | Genomic approaches in the search for molecular biomarkers in chronic kidney disease | |
| Wang et al. | Gene networks and microRNAs implicated in aggressive prostate cancer | |
| Gao et al. | MiR-15a, miR-16-1 and miR-17-92 cluster expression are linked to poor prognosis in multiple myeloma | |
| JP6211511B2 (ja) | ｍｉＲＮＡに基づくユニバーサルスクリーニングテスト（ＵＳＴ） | |
| Gao et al. | hsa_circ_0007841: a novel potential biomarker and drug resistance for multiple myeloma | |
| Husby et al. | miR-18b overexpression identifies mantle cell lymphoma patients with poor outcome and improves the MIPI-B prognosticator | |
| Izquierdo et al. | Prognostic value of microRNA expression pattern in upper tract urothelial carcinoma | |
| Van de Vrie et al. | Urinary microRNA as biomarker in renal transplantation | |
| Yang et al. | Long non-coding RNA p10247, high expressed in breast cancer (lncRNA-BCHE), is correlated with metastasis | |
| Backes et al. | Blood born miRNAs signatures that can serve as disease specific biomarkers are not significantly affected by overall fitness and exercise | |
| Lim et al. | MicroRNAs as potential biomarkers for noninvasive detection of fetal trisomy 21 | |
| US10815528B2 (en) | MiRNAs as non-invasive biomarkers for inflammatory bowel disease | |
| Bockmeyer et al. | Comparison of different normalization strategies for the analysis of glomerular microRNAs in IgA nephropathy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20240217 |