Oblast techniky
Vynález se týká oblasti biotechnologií a akvakultury, konkrétně živného roztoku pro kultivaci fotosyntetizujících mikroorganismů, způsobu jeho přípravy a použití.
Dosavadní stav techniky
Fotosyntetizující mikroorganismy, konkrétně sinice a řasy, mají velký potenciál použití v biotechnologii, díky své vysoké růstové rychlosti a možnosti průmyslového pěstování v masových suspenzních kulturách, které jsou snadno technicky ovladatelné. Navíc mohou být pěstovány i v lokalitách nevhodných pro klasické plodiny (pouště, slaniska, ploché střechy, atd.). Jejich výhodnou je, že nezabírají kvalitní půdu využitelnou pro pěstování zemědělských plodin.
Základem kultivací řas a sinic jsou živné roztoky, které musí obsahovat všechny prvky nezbytné pro jejich růst, jako P, N, Mg, K a další, včetně stopových prvků (Mo, Cu, Zn, atd.). Existují řádově desítky různých předpisů na složení živných roztoků. Základním zdrojem živin fotosyntetizujících mikroorganismů je uhlík, který je dodáván hlavně jako plynný CO2 většinou v kombinaci s uhličitany a hydrogenuhličitany. Pro zrychlení růstu mikroorganismů, zvýšení produkce biomasy a biotechnologicky využitelných látek probíhá v současné době výzkum různých stimulantů.
V současné době jsou testovány např. fytohormony a různé jiné chemické látky včetně metanolu, chloridu železitého, spermidinu či dokonce lokálních anestetik. Další možností stimulace je využití směsných kultur s bakteriemi nebo heterotrofní kultivace. Některé výše zmiňované možnosti jsou účinné, ale i ty s sebou nesou různé nevýhody jako zvýšené riziko bakteriální kontaminace, nutnost výroby stimulantu chemickou syntézou, nepříznivý vliv stimulantu na jiné organismy po uvolnění do prostředí, či vysoké náklady.
Úkolem vynálezu je poskytnout vhodný stimulant pro stimulaci růstu fotosyntetizujících mikroorganismů, především řas a sinic pro biotechnologické využití pro produkci biomasy, olejů a jiných metabolitů.
Podstata vynálezu
Tento úkol je vyřešen vytvořením živného roztoku pro kultivaci fotosyntetizujících mikroorganismů, zejména řas nebo sinic, podle předloženého vynálezu. Živný roztok obsahuje NaNO3, Ca(NO3)2.6H2O, K2HPO4, MgSO4.7H2O, Na2CO3, případně další potřebné živiny a stimulační činidlo a jeho podstata spočívá v tom, že stimulační činidlo obsahuje alespoň jeden prvek ze skupiny prvků vzácných zemin zahrnující skandium, yttrium, lanthan, cer, praseodym, neodym, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium a lutecium. Kovy vzácných zemin jsou v příslušné koncentraci schopny zrychlit růst některých řas a sinic. Jejich využitím lze zvýšit produkci biomasy mikroorganismů a v ní obsažených látek, například olejů.
Živný roztok je ve výhodném provedení na bázi roztoku Z8, případně směsi roztoku Z8 a Gaffronova roztoku mikroprvků, a obsahuje alespoň jeden prvek ze skupiny prvků vzácných zemin nebo jejich směs v množství od 0,1 pg do 1 g/1. Roztok Z8 a Gaffronův roztok mikroprvků jsou univerzální média pro kultivaci řas a sinic. Přidáním prvků vzácných zemin do roztoku Z8 nebo
- 1 CZ 306000 B6 jeho směsi s Gaffronovým roztokem mikroprvků se zvyšuje růstový potenciál pěstovaných mikroorganismů.
Živný roztok obsahuje prvky vzácných zemin ve formě čistých sloučenin, např. ve formě chloridů, jejichž výhodou je dobrá rozpustnost ve vodě. V případě přidání čistých sloučenin prvků vzácných zemin je jasně definováno složení kultivačního roztoku a může tak být jasně zhodnocen výsledný efekt pro jednotlivé prvky či synergický efekt v případě přidání několika různých prvků. Některé prvky vzácných zemin vykazovaly velmi vysokou stimulaci (Lu - 324 % při 0,01 mg/L, Pr - 260 % při 1 mg/L, Gd - 237 % při 0,3 mg/L, Sm - 184 % při 0,03 mg/L), tyto prvky jsou však vzácné a tudíž méně dosažitelné pro praxi.
V jiném výhodném provedení živný roztok obsahuje prvky vzácných zemin ve formě extraktu z monazitu. Monazit má desítky nalezišť včetně České Republiky (Údraž, Velká Kraš, středočeský permokarbon) a je možné jej získat i v tunových množstvích. Použitý extrakt z monazitu obsahuje yttrium, gadolinium, cer, lanthan, neodym, samarium a praseodym. Tato varianta provedení je ekonomicky jednoznačně výhodnější (1 g extraktu monazitu - řádově desítky Kč versus řádově tisíce Kč za 1 g čistých solí).
Předmětem vynálezu také je způsob přípravy živného roztoku pro kultivaci fotosyntetizujících mikroorganismů. Jeho podstata spočívá v tom, že do živného roztoku se přidá alespoň jeden prvek ze skupiny prvků vzácných zemin zahrnující skandium, yttrium, lanthan, cer, praseodym, neodym, promethium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium, lutecium. Kovy vzácných zemin jsou schopny v příslušné koncentraci zrychlit růst některých řas a sinic a tudíž i zvýšit produkci biomasy i olejů bez větších nákladů, neboť procentické zastoupení olejů v biomase i při zrychlení růstu stimulátorem zůstává konstantní. Koncentrace jednotlivých prvků nebo jejich směsí je nutno dávkovat v příslušné, otestované dávce pro jednotlivé kmeny řas a sinic, protože po jejím překročení je růst naopak inhibován.
Při přípravě živného roztoku se postupuje tak, že do živného roztoku na bázi roztoku Z8 nebo jeho směsi s Gaffronovým roztokem mikroprvků se přidá alespoň jeden prvek ze skupiny prvků vzácných zemin nebo jejich směs v množství od 0,1 pg do 1 g/L Prvky vzácných zemin se do živného roztoku přidávají ve formě čistých sloučenin, s výhodou ve formě chloridů. Velmi vysokou stimulaci vykazují tyto prvky Lu - 324 % při 0,01 mg/L, Pr - 260 % při 1 mg/L, Gd - 237 % při 0,3 mg/L, Sm - 184 % při 0,03 mg/L.
V jiném výhodném provedení se prvky vzácných zemin extrahují z monazitu horkou kyselinou sírovou a získaný extrakt se následně přidává do živného roztoku, přičemž použitý extrakt monazitu obsahuje yttrium, gadolinium, cer, lanthan, neodym, samarium, prasesodym.
Předmětem vynálezu také je použití alespoň jednoho prvku vzácných zemin nebo směsi prvků vzácných zemin jako stimulačního činidla do živného roztoku pro kultivaci fotosyntetizujících mikroorganismů.
Výhody vynálezu spočívají ve výrazné stimulaci růstu fotosyntetizujících mikroorganismů, zejména řas a sinic. Díky zvýšenému růstu mikroorganismů podle vynálezu se zvýší výnosy z produkce biomasy, olejů a jiných metabolitů produkovaných mikroorganismy.
Objasnění výkresů
Vynález bude blíže objasněn pomocí obrázků na výkresech, na nichž znázorňuje obr. 1 graf růstu řas a sinic v živném roztoku Z8 obohaceném extraktem monazitu pomocí H2SO4, a obr. 2 vliv koncentrace vybraných prvků vzácných zemin (0,001 až 100 mg/l živného roztoku) na přírůstek sušiny a zásobních olejů u řasy Trachydiscus minutus.
-2CZ 306000 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Rozumí se, že dále popsané konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu na uvedené případy. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána.
Příklad 1
Prvky vzácných zemin byly získány jako chloridy (p.a.) od firmy Sigma-Aldrich (Tab. 2). Příslušné koncentrace jednotlivých sloučenin byly naváženy do živného roztoku Z8 včetně mikroprvků (podle Staub 1961, Tab. 4). Test byl proveden mikrometodou podle Lukavský et al. (1995), tj. v jamkách sérologické destičky plněné po 0,2 ml/jamku. Poté byly destičky sterilizovány 30 min otevřené pod UV germicidní zářivkou a naočkovány jednotlivými inokuly příslušné řasy: Trachydiscus minutus, Stichococcus bacillaris, Raphidocelis subcapitata a Parachlorella kessleri (Tab. 1). Inokulum, 20 μΐ/jamku bylo naředěno tak, že počáteční koncentrace v jamce byla 100 000 buněk/ml. Celý sloupec tj. 6 jamek bylo vždy dávkováno jako opakování, což zaručuje chybu stanovení OD 750 nm ± 5 %. Kultivace probíhala při 26 °C, v nepřetržitém osvětlení 20 W/m2 FAR (fotosynteticky aktivní záření, tj. 400-750 nm) zářivkami, denní typ, v zařízení podle Lukavský (1974). CO2 byl udržován v kultivačním prostoru v koncentraci 2 % objemová. V pravidelných intervalech byl růst měřen přímo v destičkách čtečkou iEMS (Labscale, SF) při vlnové délce 750 nm. Protože médium s vyšším obsahem prvků vzácných zemin bylo obvykle zakaleno sraženými solemi, destičky byly ihned po naočkování změřeny a tato hodnota byla vždy odčítána jako blank. Obsah lipidů v řasové suspenzi byl stanoven spektrofotometricky pomocí specifické fluorescenční barvy Nile Red of fy. Sigma-Aldrich, Česká republika (Li et al. 2013).
Výsledky experimentů prokázaly stimulace řádově i v desítkách procent, které jsou však specifické pro jednotlivé druhy i prvky vzácných zemin (Tab. 5). Zelená řasa Parachlorella kessleri vykázala nejmenší odezvu, povětšinou inhibici, největší stimulace byly zjištěny pro řasu Trachydiscus minutus. Jelikož právě tato řasa je perspektivní v biotechnologii jako zdroj EPA (Lukavský et al. 2010) je toto zjištění významné.
Příklad 2
Příprava extraktu z monazitu, modifikovaná podle Borai et al. (2002), byla provedena následovně: monazit, pocházející z Číny (Česká geologická služba) byl velmi jemně rozetřen v třecí misce a 5 g bylo vařeno 20 min v 25 ml koncentrované H2SO4. Po ochlazení byl centrifugací oddělen extrahovaný roztok od nerozpuštěného zbytku a extrakt byl dávkován v logaritmické škále ředění do živného roztoku Z8 vč. stopových prvků (Tab. 4). Koncentrace prvků vzácných zemin v tomto extraktu jsou v Tab. 3. Příprava, plnění, očkování a kultivace sérologických destiček byla shodná s Příkladem 1. Od naměřených hodnot OD 750 nm nebyly v tomto případě odečítány blanky, protože extrakt byl vždy čirý. Extrakt monazitu byl testován na větším spektru organismů (Tab. 1), největší stimulace vyvolal u kmenů sinic (až 165 %, Obr. 1).
-3 CZ 306000 B6
Přehled tabulek
Tab. 1: Seznam použitých kmenů řas a sinic ze sbírky Botanického ústavu AV ČR v.v.i. v Třeboni (http://ccala.butbn.cas.cz/index.php).
Druh |
CCALA kód |
Kmen |
Synonymum |
Arthrospira maxima Setchell et Gardner |
027 |
COMPERE 1968/3786 |
Spirulina maxima |
Desmodesmus subspicatus (R. Chodat) E. Hegewald et A. Schmidt |
688 |
BRINKMANN 1953 |
Scenedesmus subspicatus |
Microcystis aeruginosa Kutzing |
796 |
ZAPOMĚLOVÁ 2006/2 |
- |
Parachlorella kessleri (Fott & Nováková) Krienitz, E.H.Hegewald, Hepperle, V.Huss, T.Rohr & M.Wolf |
253 |
LARG/1 |
Chlorella kessleri |
Raphidocelis subcapitata (Korshikov) Nygaard et al. |
433 |
SKULBERG 1959/1 |
Selenastrum capricornutum |
Stichococcus bacillaris
Naegeli |
493 |
H1NDÁK 1984/15 |
- |
Trachydiscus minutus (Bourr.) Ettl |
931 |
LUKAVSKÝ et PŘIBYL 2005/1. |
Pseudostaurastru m minutum |
-4CZ 306000 B6
Tab. 2: Chemikálie použité pro laboratorní testy mikrometodou v sérologických destičkách a navážky pro základní koncentrace odpovídající 100 mg kovu/Iitr. Všechny sloučeniny od fy. Sigma-Aldrich.
|
Atomová hmotnost kovu |
Molekulová hmotnost chloridu |
Navážka
(mg/100ml) |
ScCI3 |
44,96 |
151,33 |
336,611 |
YC13.6H2O |
88,91 |
303,36 |
341,161 |
LaCl3.6H2O |
138,90 |
371,37 |
267,346 |
CeCl3.6H2O |
140,12 |
372,58 |
265,901 |
PrCI3 |
140,91 |
247,27 |
175,468 |
NdCl3.6H2O |
144,24 |
358,69 |
248,676 |
SmCl3.6H2O |
150,36 |
364,81 |
242,511 |
EuCl3.6H2O |
151,97 |
366,41 |
241,107 |
GdCl3.6H2O |
157,25 |
371,70 |
236,902 |
TbCl3.6H2O |
158,93 |
373,38 |
234,934 |
DyCl3.6H2O |
162,50 |
376,95 |
231,969 |
HoCl3.6H2O |
164,93 |
379,38 |
230,011 |
ErCl3.6H2O |
167,26 |
381,71 |
228,214 |
TmCl3 |
168,93 |
275,29 |
162,961 |
YbCl3.6H2O |
173,04 |
387,49 |
223,931 |
LuCl3.6H20 |
174,97 |
389,42 |
222,538 |
Tab. 3: Složení extraktu monazitu v H2SO4, připraveného podle Příkladu 2. Koncentrace prvků byla stanovena metodou hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem.
Prvek_____Koncentrace (mg/1)
Y276,0
Fe139,0
Th26,8
Gd26,6
Ce24,5
La23,4
Nd15,9
Srn8,2
Pr3,8
-5CZ 306000 B6
Tab. 4: Tabulka složení zásobních roztoků pro přípravu média Z8 (Zehnder) podle Staub (1961): Příprava živného roztoku: Do 700 ml destilované vody přidáme po 10 ml jednotlivých makroelementů ze zásobních roztoků, 0,2 ml Fe-EDTA roztoku, 0,08 ml Gaffronova roztoku mikroele- mentů a doplníme destilovanou vodou na 1 litr.
Makroelementy (g/1)_____Gaffronův roztok mikroelementů (mg/100ml)
NaNO3 |
46,7 |
NiSO4(NH4)2SO4.6H2O |
19,8 |
KBr |
11,9 |
Ca(NO3)2.6H2O |
5,9 |
V2O4(SO4)3.16H2O |
3,1 |
H3BO3 |
31,0 |
K2HPO4 |
3,1 |
(NH^MovCW^O |
8,8 |
MnSO4.4H2O |
223 |
MgSO4.7H2O |
2,5 |
ZnSO4.7H2O |
28,7 |
Cr(NO3)3.7H2O |
3,7 |
Na2CO3 |
2,1 |
Cd(NO3)2.4H2O |
15,4 |
Co(NO3)2.6H2O |
14,6 |
|
|
A12(SO4)3K2SO4.24H2O |
47,4 |
KJ |
8,3 |
|
|
Na2WO4.2H2O |
3,3 |
CuSO4.5H2O |
12,5 |
Fe-EDTA roztok (do 500 ml): 0,138 mg FeCl3.6H2O in 5ml 0,lN HCI + 0,186 mg
Chelaton III v 5ml 0,1Ν HCI
Tab. 5: Stimulace růstu řas Trachydiscus minutus (CCALA 931), Stichococcus bacillaris io (CCALA 493), Raphidocelis subcapitata (CCALA 433) a Parachlorella kessleri (CCALA 253).
Kovy byly dodány jako chloridy, přídavky kovů do živného roztoku Z8jsou uvedeny v Tab. 2. Stimulace byly vypočteny jako % maximální hodnoty OD 750 nm oproti kontrole tj. nulovému přídavku, x = průměr pro kov nebo pro organismus (ze tří měření), - nestanoveno.
|
931
% |
konc. mg/l |
493
% |
konc. mg/l |
433
% |
konc. mg/l |
253
% |
konc. mg/l |
x kov
%___ |
Sc |
196,1 |
0,30 |
85,2 |
0,10 |
110,0 |
0,10 |
88,3 |
0,01 |
119,9 |
Y |
157,9 |
1,00 |
114,2 |
0,01 |
106,7 |
0,01 |
89,2 |
0,01 |
117,0 |
La |
154,6 |
0,01 |
104,7 |
0,10 |
104,4 |
1,00 |
98,0 |
1,00 |
115,4 |
Ce |
167,7 |
0,3 |
110,8 |
0,10 |
110,8 |
0,30 |
51,9 |
1,00 |
1103 |
Pr |
295,9 |
1,00 |
97,7 |
0,01 |
107,7 |
0,01 |
97,5 |
1,00 |
149,7 |
Nd |
135,7 |
0,03 |
117,5 |
0,30 |
134,1 |
0,10 |
97,7 |
0,01 |
1213 |
Sm |
184,0 |
0,03 |
85,3 |
0,10 |
104,9 |
0,01 |
97,4 |
0,01 |
117,9 |
Eu |
87,5 |
0,30 |
136,3 |
0,30 |
106,8 |
0,01 |
90,9 |
3,00 |
105,4 |
Gd |
237,6 |
0,30 |
144,6 |
0,10 |
118,6 |
0,01 |
95,2 |
3,00 |
149,0 |
Tb |
161,1 |
0,03 |
130,2 |
0,01 |
112,3 |
1,00 |
97,8 |
0,30 |
1253 |
Dy |
- |
- |
- |
- |
111,6 |
0,30 |
88,4 |
3,00 |
50,0 |
Ho |
111,3 |
0,30 |
188,9 |
0,30 |
107,1 |
0,30 |
91,8 |
3,00 |
124,8 |
Er |
154,0 |
0,03 |
116,7 |
0,03 |
113,6 |
0,03 |
93,4 |
0,10 |
119,4 |
Tm |
160,4 |
0,30 |
157,1 |
0,30 |
120,1 |
1,00 |
92,9 |
3,00 |
132,6 |
Yb |
154,7 |
0,30 |
127,9 |
0,30 |
107,4 |
1,00 |
99,8 |
0,01 |
122,5 |
Lu |
324,8 |
0,01 |
158.7 |
1,00 |
99,2 |
0,01 |
104,0 |
1,00 |
171,7 |
xorg.
% |
178,9 |
0,28 |
125,0 |
0,20 |
111,0 |
032 |
92,1 |
1,22 |
|
-6CZ 306000 B6
Průmyslová využitelnost
Živný roztok pro kultivaci fotosyntetizujících mikroorganismů, způsob jeho přípravy a použití podle vynálezu lze využít v biotechnologiích pro zvýšení produkce biomasy, olejů a jiných metabolitů z mikroorganismů.