CZ303500B6 - Príprava polysacharidové fólie s imunomodulacními úcinky, obsahující beta - (1-3), (1-6)-D-glukan - Google Patents

Abstract

Rešení se týká zpusobu prípravy fólií na bázi nativního, predem nesušeného .beta.-(1->3), (1->6)-D-glukanu z bunecných sten makromycet a mikromycet, s výhodou Saccharomyces cerevisiae, prípadne doplnených o další lécivé složky a alternativne spojených s dalšími obvazovými materiály, které slouží jako hojivý a krycí prostredek pri ošetrování ran, zanícených tkání, popálenin a dalších poškození, prípadne jako kosmetické prostredky.

Description

Technickým řešením je způsob přípravy polysacharidové fólie, obsahující nerozpustný (partikulární) β—(1 —>3), (l->6)-D-glukan, získaný z buněčných stěn makromycet a mikromycet, s výhodou ze stěn Saccharomyces cerevisiae, která může být použita jako hojivý a krycí prostředek při io ošetřování ran, zanícených tkání a popálenin.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že určité polysacharidy, izolované z různých přírodních zdrojů, především vyšších i nižších hub, modulují nespecifické mechanismy imunitního systému u živočichů, včetně člověka. Z ťarmakologického hlediska lze tyto látky zařadit do skupiny modífíkátorů biologické odpovědi (biological response modifíers, BRM). Mezi nejúěinnější modifikátory biologické odpovědi s pozitivním, immunostirnulačním účinkem náležejí polymery glukózy - větvené β—(l—>3), (1 ->6)-D—glukany, obvykle jednodušeji označované jako β-glukany. Immunomodulační účinek β-glukanů spočívá především v aktivaci profesionálních fagocytů - granulocytů, monocytů, dendritických buněk a především makrofágů (DiLuzio N. R., Trends Pharmacol Sci4, 344 (1983); Chihara G., Maeda Y. Y., Hamuro J., Int. J. Tissue Reac. IV, 207 (1982); Bohn J. A., BeMiller

J.N., Carbohydr. Polym. 28, 3 (1995); Novák M„ Chem. listy 101, 872 (2007); Novák M.,

Větvička V.,Immunotoxicol. 5, 47 (2008)).

Takovéto účinky vykazují β-glukany nejen při vnitřním, ale i při zevním použití. Byly popsány pozitivní účinky β-glukanu na hojení popálenin, rozsáhlých poranění, otevřených zlomenin a bércových vředů (Leibovich S. J. and Danon D., J. Reticuloendothel. Soc. 27, 1 (1978);

Wolk M., Danon D„ Med. Biol. 63, 73 (1985); Sang Bong Lee, etal Biomaterials 24, 2503 (2003). Je znám rovněž příznivý účinek β-glukanu na biosyntézu kolagenu pří hojení ran různého původu (Portera C. A., etal, Amer. Surgeon 63, 125 (1997); Hída Shunsuke etal Microbiol Immunol 50, 453 (2006)).

V odborné i patentové literatuře jsou popsány fólie sloužící jako kryty ran. připravené z různých β-glukanů, Často i v kombinaci s dalšími látkami (želatinou, kolagenem, polyvinylalkoholem ad., např. Delatte S. J., etal, J. Pediatr. Surg. 36, 1 13 (2001); Sang Bong Lee etal Biomaterials 24, 2503 (2003); Mei-Hua Huang a Ming-Chien Yang, Internát. .1. Pharmaceut. 346, 38 (2008); Williams J. M., Lawin T. P., U.S. patent 5676967 a řada dalších).

io

Publikované práce a patenty vycházejí nejčastěji z cereálních β-glukanů, případně z vodorozpustných fungálních β-glukanů. Cereální β-glukany, izolované nejčastěji z ovsa nebo ječmene, a fungální β-glukany, izolované z mikromycet (např. ze Saccharomyces cerevisiae) nebo vyšších hub (např. z Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus ad.), se liší svojí primární strukturou: biolo45 gicky účinné cereální β-glukany jsou lineární β—(1—>3), (1 >4)-D-glukany, zatímco fungální jsou větvené β—(1—>3), (1 ->6)-D-glukany. Vodorozpustnost fungálních β-glukanů je nepřímo úměrná velikosti molekuly. Na základě četných prací (např. Bohn J. A., BeMiller J. N., Carbohvdr. Polym, 28, 3 (1995); Bell S., etal, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 39, 189 (1999); Volman J. J,, Ramakers J. D„ Plat J„ Physiol Behav. 94 276 (2008)) je známo, že vyšší biologickou účinnost mají (1) β-glukany s větší molekulou (a tedy nerozpustné ve vodě), a (2) díky svojí struktuře fungální β-glukany ve srovnání s cereálními je β-glukan. izolovaný z buněčných stěn kvasinek

Saccharomyces cerevisiae.

Kromě zdroje β-glukanu má na jeho biologickou účinnost i způsob přípravy, který ovlivňuje jeho fyzikálně-chemické i biologické vlastnosti. Z řady prací (viz např. revíew Bohn J. A., BeMiller J. N., Carbohydr. Polym. 28, 3 (1995)) je známo, že na biologický účinek β-glukanu má podstatnou měrou vliv jeho konformace, tedy uspořádání polymerní molekuly do jednoduchého nebo trojitého helixu, případně do amorfní formy. Maximální účinek vykazuje konformace trojitého helixu; tato forma β-glukanu má vysoký stupeň krystalinity. Na přítomnost té či oné konformace v preparátu β-glukanu má podstatný vliv způsob přípravy β-glukanu, zejména finální fáze přípravy, sušení (lísková nebo sprejová sušárna, lyofilizace apod.); to je obecný závěr, platný i pro řadu dalších biologicky aktivních polysacharidů. Je popsáno, že sušení při teplotách nad 90 °C io působí pokles biologického účinku, a kromě toho snižuje elasticitu a viskozitu oproti nativnímu polysacharidů (Ginzberg A., Korin E., A rad S., Biotechnol. Bioeng. 99, 411 (2007)). Zřejmou příčinou je doložená skutečnost, že vysoká teplota při sušení (90 až 140 °C) vede k nevratným změnám trojhelixové konformace na konformací jednovláknového ohebného řetězce (Wang X.,

Zhang Y., Zhang L., Ding Y., J. Phys. Chem. B 113, 9915 (2009)).

V publikovaných odborných pracích a patentech, týkajících se přípravy fólií s β-glukanem a používaných jako krytu ran, se uvádí, že β-glukan byl zakoupen od určité firmy, zabývající se výrobou β-glukanu ve velkém. Je zřejmé, že se jednalo o sušený β-glukan, neboť výrobci nedistribuují jinou formu. Pro použití k přípravě fólie musí být tento produkt znovu rehydratován, ovšem rehydratace jednou usušeného β-glukanu ale nevede k obnovení původní krystalinity, ani stupně homogenity molekulární konformace, které vykazoval původní, nativní β-glukan (Kobayashí K., Kimura S., Togawa E., Wada M., Kuga S., Carbohydr. Polym. 80, 491 (2010)). Z toho vyplývá, že používání sušeného komerčního β-glukanu pro přípravu fólií vede ke snížení jeho biologické účinnosti a léčivé kvality z něho připravovaných krytů ran. Navíc se v důsledku změn makroskopické struktury sušeného preparátu v důsledku nedostatečné homogenity výchozí suspenze nebo naopak agregace částic se mění k horšímu i rnakrostruktura fólií, kvalita jejich povrchu a následně i jejich mechanická pevnost.

Podstata vynálezu

Podstatou předkládané přihlášky vynálezu je způsob přípravy zevní aplikační formy β-glukanu ve formě fólií, který minimalizuje až eliminuje nedostatky dosud užívaných postupů přípravy takovýchto fólií tím, že fólie jsou připraveny z nativního, předem nesušeného nerozpustného (partikulárního) β—<1—>3), (l-»6)-D-gIukanu, získaného z buněčných stěn makromycet nebo mikromycet. Vhodným a výhodným výchozím materiálem jsou buněčné stěny kulturních kvasinek Saccharomyces cerevisiae. β-Glukan, připravený ze stěn Saccharomyces cerevisiae má vysokou biologickou aktivitu a není třeba se obávat jeho kontaminace mykotoxiny. K přípravě nativního β-glukanu ze stěn 5. cerevisiae lze použít různé, v podstatě ekvivalentní metody, které

4o jsou vesměs založeny na alkalické digesci komerčního pekařského droždí, např. popsané v pracích Bell D. J. a Northcote D. H„ J. Chem. Soc. 1944-7 (1950), Baeon J. S. D., Farmer V. C\, Jones D.. Taylor I. F., Biochem. .1. 114, 557-567 (1969) nebo Misaki A., Johnson J.. Kirkwood S., Scaletti J. V., Smith F.. Carbohydr. Pes. 6 150-164 (1968).

Fólie se připraví tím, že se suspenze nativního, předem nesušeného β-(1 ->3), (1 —»6)-D-glukanu, získaného z různých mikromycet nebo makromycet, přímo bez předcházející dehydratace (sprejové sušení, lyofilizace apod., smísí s přídavkem látek, zvyšujících pružnost, ohebnost, pevnost a prodyšnost fólií, vybraných ze skupiny látek tvořené glyccroiem. sorbitolem, propylenglykolem. polyakrylátovými gely. tragantem, arabskou gumou, pektiny, sodnou solí karboxymethyl5o celulózy, estery- sorbitanu s vyššími mastnými kyselinami atd. v množství I až 70% hmotn..

vztaženo na hmotnost β-glukanu, směs se nalije na ohraničeny inertní povrch, přičemž množství glukanu v suspenzi je 1 až 20 mg.cm inertního povrchu a posléze se suspenze vvsuší při teplotě až 60 °C, například v horkovzdušné sušárně.

β-Glukan ve fólii může být případně dále smíšen kromě zmíněných látek s léčivy, kterými mohou být lokální antibiotika (např. erytromycin, clindamycin, neomycin, bacitracin aj.), chemoterapeutika (především sulfonamidy), lokální antimykotíka (např. clotrimazol, nystatin, pimaricin, terbinafin) a další účinné látky, volené podle účelu použití fólií, v takovém množství, aby se docí5 lilo jejich účinné lokální koncentrace podle příslušných doporučení Státního ústavu pro kontrolu léčiv.

Přehled obrázků na výkrese io

Obr. 1 snímek z elektronového mikroskopu zobrazuje fólii připravenou ze směsi 50 % hmotn. rehydratovaného, β-glukanu a 50 % hmotn. želatiny.

Obr. 2 snímek z elektronového mikroskopu zobrazuje fólii připravenou ze směsi 50% hmotn.

nativního β-gl ukanu a 50 % hmotn. želatiny.

Obr. 3 snímek z konfokálního mikroskopu zobrazuje fólii připravenou ze směsi 50 % hmotn. rehydratovaného, β-glukanu a 50 % hmotn. želatiny.

2o Obr. 4 snímek z konfokálního mikroskopu zobrazuje fólii připravenou ze směsi 50 % hmotn. nativního β -gl ukanu a 50 % hmotn. želatiny.

Příklady provedení

Příklad 1

Do suspenze obsahující 100 g nativního, předem nesušeného β-(1->3), (l->6)-D-glukanu, při30 praveného z intaktních buněk Saccharomyces cerevisiae alkalickou d i gescí, nejprve za normální teploty a poté za desetiminutového varu. neutralizací a několikanásobným promytím vodou, se přidá 50 g chemicky čistého glycerolu a dokonale se promíchá. Poté se směs vylije na vhodnou podložku s plochou takovou, aby konečná plošná hustota fólie byla 20 mg.cm“². Vše se umístí do sušárny a usuší při teplotě nepřevyšující 50 °C. Hotová fólie se opatrně sejme a rozdělí na díly potřebné velikosti.

Příklad 2 ao Obdobným způsobem jako v příkladu 1, byly získány fólie připravené ze směsi 50% hmotn, nativního β-glukanu a 50 % hmotn. želatiny a fólie připravené ze směsi 50 % hmotn. rehydratovaného předem usušeného β-glukanu a 50 % hmotn. želatiny. Získané fólie z nativního β-glukanu jsou homogenní ajejich povrch je relativné vysoce hladký. To dokládají snímky fólií připravených ze směsi 50 % hmotn. nativního β-glukanu a 50 % hmotn, želatiny v elektronovém (obr. 2) a konfokálním mikroskopu (obr. 4). Snímky z elektronového mikroskopu (obr. 1) a konfokálního mikroskopu (obr. 3) zobrazují fólie připravené ze směsi 50% hmotn. rehydratovaného, β-glukanu a 50 % hmotn. želatiny (rozměry výřezů resp. zvětšení jsou uvedeny na snímcích). Ze snímkuje patrná podstatně hrubší a nehomogenní struktura fólií, připravených z rehydratovaného, sušeného β-glukanu oproti fóliím připraveným z nativního glukanu.

Příklad 3 % g nativního, předem nesušeného β (1 ->3), (I- >6)-D-glukanu, připraveného podle Příkla5 dul, se smísí s 20 g chemicky čistého glycerolu a 5 g polyoxyethylen—(20) sorbitanmonolaurátu, promísí a zpracuje stejně jako v Příkladu 1 s tím, že plošná hustota fólie se upraví na 5 mg.cm ².

Příklad 4 o

K suspenzi, připravené podle Příkladu 1 se přidá 1 g 4-aminobenzensulfonamidu a po promíchání a rozpuštěné se postupuje jako v Příkladu 1.

is Příklad 5

K suspenzi, připravené podle Příkladu 1 se přidá 1 % hmotn. klindamycinu (jako Clindamycini phosphas) a po promíchání a rozpuštění se postupuje jako v Příkladu 1.

Příklad 6

Fólie, připravená způsobem podle Příkladu 1, 3, 4 nebo 5 se vloží na navlhčenou hydrofilní gázu a společně se usuší při teplotě do 50 °C tak, aby vznikl dvojvrstvý obvazový materiál, který se poté upraví na vhodnou velikost, neprodyšně uzavře ve vhodném obalu a vysterílizuje ozářením.

Průmyslová využitelnost

3() Fólie, díky tmunomodulačním účinkům daným obsahem β—(1 —>3), (1 —>6)-D-glukanu a případně hojivým účinkům, daným dalšími obsaženými léčivými látkami, může sloužit jako zevní hojivý a krycí prostředek při ošetřování ran, zanícených tkání, popálenin a dalších poškození. V modifikované podobě může být využita rovněž v kosmetice, například jako pleťová maska.

Claims (5)

1. Příprava polysacharidové fólie s imunomodulačními účinky, vyznačující se tím, že se suspenze obsahující nativní, předem nesušený β—(I —>3), (1 —>6)-D-glukan, smísí s přídavkem látek, zvyšujících pružnost, ohebnost, pevnost a prodyšnost fólií vybraných ze skupiny tvořené glycerolem, sorbitolem. propylenglykolem, polyakrylátovými gely, tragantem, arabskou gu45 mou, želatinou, kolagenem, pektiny. alkalickými solemi karboxymethylcelulózy, estery sorbitanu s vyššími mastnými kyselinami, v množství 1 až 70 % hmotn. (vztaženo na hmotnost β-glukanu), směs se nalije na ohraničený inertní povrch, přičemž množství glukanu v suspenzi je 1 až 20 mg.cm ' inertního povrchu a posléze se suspenze vysuší při teplotě 10 až 110 °C.

50

2. Příprava podle nároku I. vyznačující se tím, že nativní, předem nesušený β(l —>3), (1—>6)-D-glukan se získá z buněčných stěn kvasinek Saccharomyces cerevisiae.

3. Příprava podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím. že se suspenze vhodným způsobem vysuší, například v horkovzdušné sušárně s kontrolovanou teplotou.

-4 QZ 303500 B6

4. Příprava podle nároků l a 2, vyznačující se tím, že se suspenze nativního βglukanu smísí s dalšími lokálně působícími farmakologicky účinnými látkami, kterými mohou například být lokální antibiotika, chemoterapeutika, lokální antimykotika a další účinné látky,

5 volené podle účelu použití fólií, v takovém množství, aby se docílilo jejich účinné lokální koncentrace.

5. Příprava podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se připravená fólie kombinuje s dalšími obvazovými materiály vybranými ze skupiny tvořené tkanými, netkanými obvazy, io kompresy nebo tampony.