Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Antigenní peptidy odvozené od telomerázy
CZ303215B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Gaudernack@Gustav Amund Eriksen@Jon Moller@Mona Klemp Gjertsen@Marianne Seterdal@Ingvil Seboe-Larsen@Stein
Description
translated from
Vynález se týká proteinů nebo peptidů, které vyvolávají imunitní odpověď zprostředkovanou T buňkami, vakcín proti rakovinným onemocněním a kompozic pro léčbu rakovinných onemocnění, které obsahují tyto proteiny nebo peptidové fragmenty. Vynález se také týká farmaceutických kompozic obsahujících proteiny nebo peptidy a způsobu přípravy T-lymfocytů schopných io rozeznávat a ničit nádorové buňky u savců.
Dosavadní stav techniky
Rakovinné onemocnění se vyvíjí v několika krocích a zahrnuje určité případy mutace. Tyto mutace ústí v pozměněnou expresi nebo funkci genů spadajících do dvou kategorií: onkogeny a geny nádorového supresoru. Onkogeny se odvozují původně od proto-onkogenů bodovou mutací nebo translokací, a tím ústí v transformovaný stav buňky, která nese mutaci. Všechny onkogeny kódují a projevují se přes proteiny. Proto-onkogeny jsou normální geny buňky, které mají potenciál stát se onkogenem. Ve většině případů se ukazuje, že proto-onkogeny jsou komponenty signálních transdukčních cest. Onkogeny působí dominujícím způsobem. Geny nádorového supresoru na druhou stranu působí recesivní mírou, například přes ztrátu funkce a přispívají konkogenezi pokud obě alely kódující funkční protein jsou pozměněny tak, že produkují nefunkční genový produkt.
Současné působení kombinace pozměněných onkogenů a genů nádorových supresorů ústí v buněčnou transformaci a vývoj maligního fenotypu. Tyto buňky mají nicméně sklon ke stárnutí a mají omezenou životnost. Ve většině případů rakovinných onemocnění imortalízace nádorových buněk vyžaduje vyřazení enzymových komplexů nazvaných telomerázy. U somatických jo buněk není katalytická podjednotka tohoto enzymu normálně exprimována. Další události, jako je působení proteinů kódovaných nádorovými viry nebo demetylace spících promotorových míst, mohou ústit v expresi funkčního telomerázového komplexu v nádorových buňkách.
V oblasti lidské imunologie rakovinných onemocnění je v posledních dvou desetiletích vidět intenzívní snaha charakterizovat pravé antigeny specifické pro rakovinné onemocnění. Snahy jsou věnovány zvláště analýze protilátek vůči lidským nádorovým antigenům. Dosavadní znalosti naznačují, že tyto protilátky by mohly být použity pro diagnostiku a terapeutické účely, například ve spojení s protirakovinnými látkami. Nicméně protilátky se mohou pouze vázat na nádorové antigeny, které jsou vystaveny na povrchu nádorových buněk. Z tohoto hlediska snahy o léčbu rakovinných onemocnění založenou na imunitním systému těla byly méně úspěšné, než se očekávalo.
Základní rys imunitního systému je takový, že může rozeznat vlastní od nevlastního a normálně nereaguje vůči vlastním molekulám. Bylo ukázáno, že rejekce tkání nebo orgánů přenesených z jiných individuí je způsobena imunitní odpovědí vůči cizím antigenům na povrchu přenesených buněk. Imunitní odpověď je obecně tvořena humorální odpovědí zprostředkovanou protilátkami a buněčnou odpovědí. Protilátky jsou produkovány a sekretovány B-lymfocyty a obvykle rozpoznávají volné antigeny v nativní konformaci. Mohou potenciálně rozpoznat téměř jakékoliv místo na povrchu antigenů. Na rozdíl od protilátek, T-buňky, které zprostředkovávají buněčnou část imunitní odpovědi, rozpoznávají antigeny pouze v kontextu MHC molekul (molekuly hlavního histokompatibilitního systému) a to pouze po vhodném zpracování antigenů. Toto zpracování antigenů obvykle zahrnuje proteolytickou fragmentaci proteinu, která ústí v peptidy, jenž se mohou vázat do žlábku MHC molekul. To umožňuje T buňkám také rozpoznávat peptidy odvozené od intracelulámích antigenů.
- 1 CZ 303215 B6
T buňky umí rozeznat pozměněné peptidy odvozené od jakýchkoliv v nádorové buňce v kontextu MHC molekul na povrchu nádorových buněk. T buňky mohou být následovně aktivovány za účelem inaktivace nádorových buněk obsahujících pozměněný peptid. U experimentálních modelů zahrnujících myší nádory bylo ukázáno, že bodové mutace v intracelulámích konstitučních proteinech („šelf* proteinech) mohou zvýšit množství antigenů pro rejekci nádoru, které se skládají z peptidů lišících se v jedné aminokyselině od normálních peptidů. T buňky rozeznávající peptidy v kontextu MHC molekul na povrchu nádorových buněk jsou schopné usmrtit nádorové buňky a tak odvrhnout nádor z hostitele (Boon et al., 1989, Cell 58,293-303).
MHC molekuly u člověka jsou běžně uváděny jako HLA molekuly (human leucocyte associated antigen). Existují dvě základní třídy HLA molekul, třída I a třída 11. HLA molekula I třídy jsou kódovány sublokusy HLA A, B a C a primárně aktivují CD8+ cytotoxické T buňky. HLA molekuly II třídy na druhou stranu aktivují primárně CD4+ T buňky a jsou kódovány sublokusy DR, DP a DQ. Každé individuum normálně vykazuje šest různých HLA molekul I třídy, obvykle dvě alely z každé ze tří podskupin A, B a C, ačkoliv v některých případech je počet různých HLA molekul 1 třídy redukován díky dvounásobnému výskytu stejné HLA alely.
HLA genové produkty jsou vysoce polymorfní. Různá individua exprimují různé HLA molekuly, které se liší od těch nalezených v jiných individuích. To vysvětluje obtížnost nalezení HLA sourodých orgánových donorů u transplantací. Význam genetické variace HLA molekul v imunologii je odražen v její roli jako imunoresponzivních genů. Díky jejich kapacitě vázat peptidy, přítomnost nebo absence některých HLA molekul určuje kapacitu individua odpovídat na specifické peptidové epitopy. Ve svém důsledku HLA molekuly určují rezistenci nebo citlivost vůči nemoci.
T buňky mohou inhibovat vznik a růst rakovinného onemocnění několika mechanismy. Cytotoxické buňky, jak HLA molekuly I třídy rozeznávající CD8+ tak HLA molekuly II třídy rozeznávající CD4+, mohou přímo usmrtit nádorovou buňku prezentující vhodný nádorový antigen. Obvykle jsou potřebné CD4+ pomocné T buňky pro cytotoxickou odpověď CD8+ T buněk, ale pokud je peptidový antigen prezentován vhodnou antigen předkládající buňkou (APC), cytotoxické CD8+ buňky mohou být aktivovány přímo, to ústí v rychlou, silnou účinnější odpověď.
Zatímco peptidy, které jsou prezentovány HLA molekulami II třídy, mají proměnlivou délku (12 až 25 aminokyselin), peptidy představované HLA molekulami I třídy musí mít obvykle devět aminokyselinových zbytků, aby byly kompatibilní s vazebným žlábkem HLA molekul I třídy. Delší peptid se-nemusí navázat, pokud nemůže být zpracován APC nebo cílovou buňkou, jako je rakovinná buňka, před interakcí se žlábkem HLA molekul I třídy. Byl zaznamenán pouze omezený počet odchylek od tohoto požadavku devíti aminokyselin a v těchto případech byla délka předkládaného peptídu buď osm nebo deset aminokyselinových zbytků.
Shrnutí týkající způsobu vazby peptidů na MHC molekuly může být nalezeno v práci Hans-Georg Rammensee, Thomas Friede a Stefan Stevanovic, (1995, Immunogenetics, 41, 178-228) a v práci Barinaga (1992, Science 257, 880-881). Male a kol. (1987, Advanced Immunology, J. B. Lippincott Company, Philadelphia) nabízí více ucelenější vysvětlení technického pozadí vynálezu.
V našem vynálezu International Application PCT/N092/00032 (publikováno jako WO92/14756) jsme popsali syntetické peptidy a fragmenty onkogenních proteinů, které mají bodovou mutaci nebo translokaci ve srovnání sjejich proto-onkogeny nebo proteiny genů nádorových supresorů. Tyto peptidy odpovídají, kompletně překrývají nebojsou fragmenty zpracovaných onkogenních proteinových fragmentů nebo genových fragmentů nádorových supresorů, které jsou prezentovány rakovinnými buňkami nebo jinými antigen předkládajícími buňkami, a jsou přítomny ve formě komplexu HLA-peptidy alespoň jednou alelou v každém individuu. U těchto peptidů bylo také ukázáno, že indukují specifickou T buněčnou odpověď vůči aktuálnímu onkogennímu proteinovému fragmentu produkovanému po zpracování buňkou a představovanému HLA moleku-2CZ 303215 B6 lám. Zvláště jsme popsali peptidy odvozené od p21-ras proteinu, který obsahoval bodové mutace v určitých aminokyselinových pozicích, zvláště v pozicích 12, 13 a 61. Bylo ukázáno, že tyto peptidy jsou účinné při regulaci růstu rakovinných buněk in vitro. Navíc bylo ukázáno, že peptidy vyvolávají CD4+ T buněčnou imunitní odpověď vůči rakovinným buňkám, které obsahují mutovaný p21-ras onkogenní protein, pri podávání takových peptidů ve vakcínách nebo při postupu terapie rakoviny. Později jsme také ukázali, že tyto peptidy také vyvolávají CD8+ T buněčnou odpověď vůči rakovinným buňkám které obsahují mutovaný p21-ras onkogenní protein, pri podávání takových peptidů zmíněném výše (viz Μ. K. Gjertsen a kol., Int. J cancer, 1997, kap. 72, s. 784).
io
Nicméně peptidy popsané výše mohou být použity pouze u omezeného množství rakovinných onemocnění, jmenovitě u těch onemocnění, kde byl nalezen onkogen s bodovou mutací nebo translokací v proto-onkogenu nebo genu nádorového supresoru. Je zde proto silná potřeba protirakovinné léčby nebo vakcíny, která by mohla být účinná vůči širšímu okruhu rakovinných onemocnění.
Obecně jsou nádory velice heterogenní s ohledem na odchylky nalezené v nádorových buňkách. To vyvolává myšlenku, že jak potenciální terapeutický účinek tak preventivní účinek rakovinných vakcín vzroste s počtem cílů, vůči kterým je vakcína schopna vyvolat T buněčnou imunitní odpověď. Vakcína s více cíly by také snižovala riziko tvorby nových nádorů léčbou vznikajících variant primárního nádoru.
Pro svoji předpokládanou roli v prevenci buněčného stárnutí byl v poslední době středem zájmu enzym telomeráza. Telomeráza je RNA-dependentní DNA polymeráza, která syntetizuje telomemí DNA repetice podle RNA templátu, který tvoří podjednotku telomerázového holoenzymu. DNA repetice syntetizované tímto enzymem jsou zainkorporovány do telomer, což jsou specializované struktury DNA-protein, které se vyskytují na koncích lineárních DNA molekul, které tvoří každý chromozóm. Telomeráza byla poprvé identifikována u ciliate Tetrahymena (Greider and Blackbum, 1985, Cell 43, 405-413). Sekvence katalytické podjednotky lidské telomerázy byla nedávno identifikována v práci Meyerson a kol. (1990, Cell 1197, 785-795) a v práci Nakamura a kol. (1997, Science 277, 955-959), byly pojmenovány gen hEST2 a hTRT respektive. Navíc byly identifikovány tři další proteiny, které jsou spojené s telomerázovou aktivitou: p80 a p95 u Tetrahymena (Collins et al, 1995, Cell 81, 677-686) aTPl/TLPl, což jsou savčí homology proteinu p80 u Tetrahymena (Harrington a kol., 1997, Science, 275, 973-977;
Nakayama a kol., 1997, Cell 88, 875-884).
Telomeráza není obvykle exprimována ve většině normálních buněk v organismu. Většina buněk somatického původu u člověka nevykazuje detegovatelnou telomerázovou aktivitu, telomerázová aktivita je za to delegována u zárodečných buněk a některých kategorií kmenových buněk, které jsou ve fázi aktivního buněčného dělení (Harley et al., 1994, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 59, 307-315; Kim a kol., 1994, Science 266, 2011-2015; Broccolia kol., 1995, PNAS USA 92, 9082-9086; Counter a kol., 1995, Blood 85, 2315-2320; Hiyama a kol., 1995, J. Immunol. 155, 3711-3715). Telomery u většiny typů lidských somatických buněk se zkracují se vzrůstajícím věkem organismu, což je v souladu s nepřítomností telomerázové aktivity u těchto buněk.
Kultivované lidské buňky také vykazují zkracování telomer. Zkracování telomer také pokračuje u kultivovaných lidských buněk, které byly transformovány, dokud telomery nedosáhnou kritické délky. V tomto okamžiku, který se nazývá kritický bod, je pozorována významná kariotická nestabilita a buněčná smrt.
Nesmrtelné buňky, které získaly schopnost růst v kultuře neomezenou dobu, se v populaci v kritickém bodě objevují s malou frekvencí. Tyto nesmrtelné buňky vykazují vysoké hladiny telomerázové aktivity a stabilní telomery. Telomerázová aktivita je také snadno detekovatelná ve velké většině lidských nádorových vzorků analyzovaných za čerstva (Kim a kol., 1994, Science 266, 2011-2015), včetně karcinomů ovarií (Counter et al., 1994, PNAS USA 91, 2900-2904).
Výstižné revue na toto téma je práce Shay and Bachetti (1997, Eur, J. Cancer 33, 787-791).
Aktivace telomerázy tak může překročit bariéru kontinuálního buněčného dělení vymezenou délkou telomer. Buňky, které překonají normální mechanismus stárnutí toho mohou docílit stabilizaci délky telomer, pravděpodobně díky aktivitě telomerázy.
U virů prokázaných při vzniku lidských rakovinných onemocnění, například Epstain Barr virus (EBV, u B buněčných malignit a karcinomů nosohltanu) a lidský Papilloma virus (HPV 16 a 18, u karcinomů cervixu), je dlouho známá schopnost učinit lidské buňky nesmrtelnými. Nedávno bylo demonstrováno, že indukce telomerázové aktivity je klíčový prvek v tomto procesu. (Klingelhutz et al., 1996, Nátuře, 380, 79-82).
Telomeráza je proto potenciální cíl rakovinové terapie. Byly tak nabídnuty inhibitory telomeráz jako nová třída protirakovinových léků (shrnuto v pracích Sharma a kok, 1997, Ann Oncol 8(11), 1063-1074; Axelrod, 1996, Nátuře Med 2(2), 158-159; Huminiecki, 1996, Acta Biochim PoL, 43(3), 531-538). Předpokládá se, že identifikace lidské katalytické podjednotky telomerázy, může zajistit biochemickou reagencii pro identifikaci takových léků (Meyerson et al., 1990, Cell 1197, 785-795). Telomerázy jsou také předpokládané jako markéry pro diagnózu prognózy rakoviny (Soria and Rixe, 1997, Bull Cancer 84(10), 963-970; Dahse et al., 1997, Clin Chem 43(5), 708-714).
Podstata vynálezu
Nicméně pokud je známo, nikdo ještě v minulosti neuvažoval, že telomerázy mohou sloužit jako užitečný cíl pro terapii zprostředkovanou T buňkami nebo, že telomerázové peptidy nebo pro25 teiny mohou být použity při léčbě nebo prevenci rakoviny.
V souladu s druhým aspektem vynálezu je zde zamýšleno použití nukleové kyseliny ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny, a to nukleové kyseliny, kteráje schopná kódovat telomerázový protein nebo peptidy jak je popsáno v prvním aspektu vynálezu.
V souladu se třetím aspektem vynálezu předkládáme farmaceutickou kompozici obsahující alespoň jeden telomerázový protein nebo peptid nebo nukleovou kyselinu jak je popsáno v prvním nebo druhém aspektu vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo,
V souladu se čtvrtým aspektem vynálezu předkládáme způsob přípravy farmaceutické kompozice, kteráje popsána ve třetím aspektu vynálezu, způsob zahrnující smísení alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu nebo nukleové kyseliny jak je uvedeno v druhém aspektu vynálezu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
Dále je zde v souladu s pátým aspektem vynálezu uvedena farmaceutická kompozice obsahující kombinaci alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle prvního aspektu vynálezu a alespoň jednoho peptidu schopného indukovat T buněčnou imunitní odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému proteinu nebo peptidu nádorového supresoru, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
Také v souladu se šestým aspektem vynálezu předkládáme způsob zahrnující smísení alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle prvního aspektu vynálezu s alespoň jedním peptidem schopným indukovat T buněčnou imunitní odpověď1 vůči onkogennímu nebo mutovanému proteinu nebo peptidu nádorového supresoru a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla.
V souladu se sedmým aspektem vynálezu předkládáme použití telomerázových proteinů nebo peptidů, nebo nukleové kyseliny schopné kódovat telomerázový protein nebo peptid při přípravě léků pro léčbu a prevenci rakoviny.
-4CZ 303215 B6
V osmém aspektu vynálezu je předkládán způsob přípravy T-lymfocytů schopných rozpoznat a zničit nádorovou buňku u savců, který zahrnuje odebrání vzorku T-lymfocytů ze savce a kultivace T-lymfocytů v přítomnosti telomerázových proteinů nebo peptidů v množství dostatečném pro přípravu T-lymfocytů specifických vůči telomerázovému proteinu nebo peptidů.
Vynález je podrobněji popsán pouze způsobem příkladů s odkazem na doprovodné obrázky, ve kterých:
Obr. 1 ukazuje sekvence aminokyselin konzervovaných motivů u lidské katalytické podjednotky io telomerázy, která byla identifikována v práci Meyerson a kol. (1997, Cell 90, 785-795) a v práci
Nakamura a kol. (1997 Science 277, 955-959). Jsou ukázány motivy T, 1, 2, 3 (A podle Nakamury), 4 (B' podle Nakamury) 5 (C podle Nakamury), 6 (D podle Nakamury) a E. peptidy mohou být syntetizovány s odpovídajícími sekvencemi nebo se sekvencemi zahrnujícími jakýkoliv z regionů označený závorkami. Označení A2, Al, A3 a B7 označuje peptidy, které jsou pravděpodobně přítomny v molekulách HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3 a HLA-B7.
Je předložen telomerázový protein nebo peptid pro použití ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny. Ve výhodném provedení způsob podle vynálezu obsahuje generaci T buněčné odpovědi vůči telomeráze. Způsob může zahrnovat podávání savcům, s výhodou člověku, který trpí nebo pravděpodobně trpí rakovinou, terapeuticky účinné množství telomerázového proteinu nebo peptidů tak, zeje indukována T buněčná imunitní odpověď vůči telomeráze u savců.
T buňky specifické vůči telomeráze mohou být použity k zasažení buněk, které exprimuj í telomerázu. Jelikož většina buněk v organismu neexprimuje telomerázu, budou pak neovlivněny. Nic25 méně nádorové buňky, které exprimují telomerázu budou napadeny a zničeny. Jelikož telomerázová aktivita byla detekována u většiny karcinomů je předpoklad, že tento materiál a způsoby najdou široké použití.
Rakovinná onemocnění, která jsou vhodná pro léčbu zahrnují (výčet není kompletní) rakovinu prsu, prostaty, pankreatu, karcinom kolorekta, plic, maligní melanom, leukémie, lymfomy, rakovinu ovarií, cervixu a karcinomy žlučového traktu.
Zde použitý termín telomeráza znamená ribonukleoproteinový enzym, který vykazuje telomery prodlužující aktivitu. Telomerázový protein, jak je zde použit, znamená jakoukoliv proteinovou komponentu telomerázy, včetně jakékoli podjednotky, která má katalytickou aktivitu.
S výhodou je telomerázový protein savčí telomerázový protein a výhodněji lidský telomerázový protein. Lidský telomerázový protein je s výhodou katalytická podjednotka telomerázy identifikovaná jako hTRT v práci Nakamura a kol. (1997, Science 277, 955-959) a hEST2 v práci
Meyerson a kol. (1990, Cell 1197, 785-795), jejíchž cDNA sekvence jsou uloženy v GenBank pod čísly AF015950 a AFO18167.
Termín telomerázový peptid, jak je použit zde, znamená peptid, který má sekvenci aminokyselin odpovídající sekvenci přítomné v sekvenci telomerázového proteinu. Telomerázové peptidy mají s výhodou 8 až 25 aminokyselin. Výhodněji telomerázové peptidy obsahují mezi 9 a 25 aminokyselinami. Například telomerázové peptidy obsahují 9, 12, 13, 16 nebo 21 aminokyselin.
Telomerázové proteiny nebo peptidy jsou vybrány tak, že jsou schopné generování T buněčné odpovědi přímo vůči telomerázovému proteinu (nebo vůči telomerázovému proteinu, od kterého so je telomerázový peptid odvozen). Ve výhodných provedeních T buněčná indukovaná odpověď je cytotoxická T buněčná odpověď. Cytotoxická T buněčná odpověď může být zprostředkována
CD4+ T buňkami nebo může být zprostředkována CD8+ T buňkami. V jakémkoliv případě musí být peptid schopný vytvořit a být prezentován jako komplex s MHC proteiny I nebo II třídy na povrchu nádorové buňky nebo antigen prezentující buňky po předchozím procesu zpracování antigenů, pokud je to nezbytné.
- 5 CZ 303215 B6
Telomerázový peptid může obsahovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků z aminokyselinového motivu nezbytného pro biologickou funkci telomerázového proteinu; jinými slovy se může překrývat alespoň částečně s takovým aminokyselinovým motivem. Příklady takových aminokyselinových motivů jsou motivy 1 až 6 v rámci sekvence lidské telomerázové katalytické podjednotky hEST2, jak byla identifikována v práci Meyerson a kol. (1990, Cell 1197, 785-795), jinými slovy to jsou motivy:
LLRSFFYVTE
SRLRFIPK,
LRPIVNMDYWG,
PELYFVKVDVTGAYDTI,
KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCY,
LLLRLVDDFLLVT a GCWNLRKTW nebo jakýkoliv z motivů T, 1,2, A, B', C, D nebo E, které byly identifikovány v práci Nakamura a kol. (1997, Science 277, 955-959) v hTRT sekvenci, jmenovitě motivy:
WLMSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLK,
EVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDG,
LRP1VNMDYWGARTFRREKRAERLTSRV,
PPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKP,
KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGI,
LLRLVDDFLLVTPHLTH,
AKTFLRTLVRGVPEYGCWNLRKTW a HGLFPWCGLLL.
Vhodné peptidy, které mohou být využity ve způsobech a kompozicích zde popsaných, jsou uvedeny v tabulce 1 stejně jako v přiloženém listu sekvencí.
Další vhodné peptidy odvozené z jakéhokoliv úseku v telomerázové sekvenci, které mohou být využity ve způsobech a kompozicích zde popsaných, jsou uvedeny v tabulce 2.
Jsou zahrnuty také proteiny a peptidy, které obsahují aminokyselinové sekvence odpovídající aminokyselinovým sekvencím přítomným v aminokyselinových sekvencích savčích homologů s telomerázou druhu Tetrahymena asociovaných proteinů p80 a p95. Například p80 homology TP1 a TLP1 (Harrington a kol., 1997, Science, 275, 973-977; Nakayama a kol., 1997, Cell 88, 875-884).
Větší peptidové fragmenty nesoucí malé množství aminokyselinových substitucí nejen na N-terminálním konci, ale i na C-terminálním konci jsou zahrnuty také, jak se předpokládá, tyto peptidy mohou zvyšovat množství T buněčných klonů, které mají vhodnou specifitu.
Zde popsané peptidy jsou zvláště vhodné pro použití do vakcíny schopné bezpečně zvýšit nejen CD4+, ale také CD8+ T buněčnou odpověď:
a) peptidy jsou synteticky produkovány a tak nemohou obsahovat transformované rakovinné geny nebo další místa nebo materiály, které by mohly mít škodlivý vliv,
-6CZ 303215 B6
b) peptidy samotné mohou být použity pro indukci buněčné imunitní odpovědi
c) peptidy mohou být cílem pro zvláště T buněčný typ imunitní odpovědi bez vedlejších účinků dalších neočekávaných odpovědí.
Telomerázové peptidy nebo proteiny zde popsané mohou být podávány v množství v rozsahu jednoho mikrogramu (1 pg) až jednoho gramu (1 g) průměrnému lidskému pacientu, který je vakcinován. Je výhodné, pokud jsou použity menší dávky v rozmezí jednoho mikrogramu (1 pg) io až jednoho miligramu (1 mg) na každou dávku.
Ve výhodném provedení je telomerázový peptid nebo protein pacientovi dodáván ve formě farmaceutické kompozice. Telomerázový protein nebo peptid může být podáván jako směs proteinů nebo směs proteinů a peptidů nebo jako směs peptidů. Farmaceutická kompozice může is navíc obsahovat obvyklá aditiva, rozpouštědla, stabilizátory nebo podobné látky známé v oblasti.
Farmaceutická kompozice může obsahovat jeden nebo více telomerázových proteinů nebo peptidů. Proteiny nebo peptidy obsažené ve směsi mohou být jakékoliv z následujících:
a) směs peptidů, které mají různé sekvence, například, odpovídají různým částem sekvence telomerázového proteinu:
b) směs peptidů, které mají překrývající se sekvence, ale schopné se vázat k různým HLA alelám;
c) směs obou předcházejících směsí (a) a (b);
d) směs některých směsí (a);
e) směs některých směsí (b);
f) směs některých směsí (a) a některých směsí (b);
V každém případě může být také použita směs proteinů a peptidů odpovídajících různým telomerázovým proteinům, například telomerázová katalytická podjednotka a homology
Tetrahymena p80 nebo p95.
Jinak mohou být telomerázové peptidy ve směsi vzájemně kovalentně spojeny za vzniku větších polypeptidů nebo dokonce cyklických polypeptidů. Farmaceutická kompozice může být tvořena smísením telomerázového proteinu(ů) nebo peptidu(ů) s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
Farmaceutické kompozice mohou také zahrnovat alespoň jeden peptid, který je schopný indukovat T buněčnou imunitní odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému proteinu nebo peptidu nádorového supresoru. Jinak telomerázové proteiny nebo peptidy mohou být podávány jak simultánně tak v libovolném pořadí těchto peptidů. Příklady onkogenních proteinů jsou p21-ras proteiny H-ras a N-ras, abl, gip, gsp, ret a trk. Výhodně jej onkogenní protein nebo peptid p21-ras protein nebo peptid, například p21-rav peptidy popsané v našem vynálezu International Application PCT/N092/00032 (publikační číslo WO92/14756). Proteiny nádorového supresoru zahrnují p53 a Rb (retinoblastom). Takové farmaceutické kompozice mohou být vytvořeny smísením telomerázového proteinu(ů) nebo peptidu(ů) s mutovaným nebo onkogennim proteinem nebo peptidem nádorového supresoru, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo rozpouštědlem.
Termín mutantní v použití zde znamená přirozenou sekvenci, která obsahuje jednu nebo více s následujících změn: bodová mutace (tranzice nebo transverze), delece, inzerce, duplikace translokace nebo inverze. Výraz farmaceutická kompozice neznamená pouze kompozici použitelnou pro léčbu pacienta s rakovinou, ale znamená také kompozici použitelnou ve spojení s prevencí, jako například kompozice vakcín.
-7CZ 303215 B6
Telomerázové peptidy nebo proteiny jsou podávány lidskému individuu, které potřebuje tento druh léčby nebo prevence. Podávání může být provedeno jednou nebo vícekrát jak je vhodné pro nastolení a/nebo udržení požadované T buněčné imunitní odpovědi. Peptidy mohou být podávány společně, jak dohromady tak odděleně, se sloučeninami jako jsou cytokiny a/nebo růstové faktory, například interleukin-2 (IL-2), interleukin-12 (IL-12), růstový faktor GM-CSF nebo podobné v závislosti na síle imunitní odpovědi jak je v oblasti známé. Telomerázové proteiny nebo peptidy mohou být použity jako vakcína nebo terapeutická kompozice buď samotné nebo v kombinaci s dalšími materiály. Například peptid nebo peptidy mohou být dodávané ve formě lipopeptidového konjugátu, o kterém je známo, že indukuje vysoce afinitní cytotoxickou T buněčnou odpověď (Dereš, 1989, Nátuře 342).
Peptidy nebo proteiny uvedené výše jako možné složky farmaceutických kompozic mohou být ve formě nukleových kyselin kódujících zejména peptid nebo protein. Tak se mohou farmaceutické kompozice skládat z peptidu a/nebo proteinu samotného nebo v kombinaci s nukleovou kyselinou, nebo mohou být složeny ze směsí nukleových kyselin.
Telomerázové peptidy nebo proteiny mohou být podávány individuu ve formě DNA vakcín. DNA kódující telomerázový peptid nebo protein může být ve formě klonované plazmidové DNA nebo syntetického oligonukleotidu. DNA může být podávány společně s cytokiny jako je IL-2 a/nebo další společně stimulující molekuly. Cytokiny a/nebo společně stimulující stimulační molekuly mohou být samy podávány ve formě plazmidu nebo oligonukleotidové DNA.
Bylo ukázáno, že odpověď na DNA vakcíny je vyšší v přítomnosti i mu nosti mu lačn ích DNA sekvencí (ISS). Ty mohou mít podobu hexamemích motivů obsahujících metyíovaný CpG podle vzorce: 5'-purin-purin-CG-pyrimidin-pyrimidin-3'. Naše DNA vakcíny mohou obsahovat tyto nebo jiné imunostimulační sekvence (ISS) v DNA kódující telomerázový peptid nebo protein, v DNA kódující cytokiny nebo další společně stimulující molekuly nebo v obou typech DNA. Shrnutí výhod DNA vakcinace je v práci Tighe a kol. (1998, Immunology Today, 19(2), 89-97).
Je popsán způsob léčby pacienta postiženého rakovinou, způsob zahrnující navození T buněčné imunitní odpovědi během stimulace in vitro nebo ex vivo pomocí telomerázového proteinu nebo peptidu. Telomerázový protein nebo peptid může být také použit ve způsobu vakcinace pacienta za účelem získání rezistence vůči rakovině. Vhodné metody pro vakcinaci zahrnují navození T buněčné imunitní odpovědi během stimulace in vitro nebo ex vivo pomocí telomerázového proteinu nebo peptidu. Také popisujeme způsob léčby nebo prevence rakoviny, který zahrnuje podávání savci trpícímu nebo pravděpodobně trpícímu rakovinou terapeuticky účinné množství telomerázového proteinu nebo peptidu tak, že se u savce indukuje T buněčná imunitní odpověď vůči telomeráze.
Peptidy zde popsané mohou být produkovány konvenčními metodami například různými metodami peptidové syntézy známými v oblasti. Také to mohou být fragmenty telomerázových proteinů vznikající štěpením, například použitím bromkyanu a následné purifikaci. Může být použito také enzymatické štěpení. Telomerázové proteiny nebo peptidy mohou být také ve formě rekombinantně exprimovaných proteinů nebo peptidů.
Nukleové kyseliny kódující telomerázové peptidy mohou být vytvořeny syntézou oligonukleotidů. Ta může být provedena jakoukoliv z různých metod dostupných v oblasti. Nukleové kyseliny kódující telomerázové proteiny mohou být klonovány z genomové nebo cDNA knihovny za použití konvenčního skreeningu knihovny. Nukleotidová sonda (proba) může odpovídat jakékoli Části sekvence známého telomerázového genu. Nukleová kyselina může být také získána pomocí PCR (Polymerase Chain Reaction). Nukleová kyselina je s výhodou DNA a může být případně v klonována do vektoru. Subklony mohou být připraveny použitím vhodných restrikčních enzymů. Klonovaná nebo subklonovaná DNA může být namnožena ve vhodném hostiteli, například bakteriálního původu. Hostitel může být také eukaryotický organismus, jako jsou kvasinky nebo
-8CZ 303215 B6 bakulovirus. Telomerázový protein nebo peptid může být získán expresí ve vhodném hostiteli. V tomto případě je DNA vklonována do expresního vektoru. Je dostupné množství komerčních expresních kitů. Metody jsou popsány v knize Maniatis a kol. (1991, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press) a knize Harlow and Lané (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press), které mohou být použity k těmto účelům.
Příklady provedení vynálezu io
Peptidy byly syntetizovány pomocí peptidové syntézy na pevné fázi v kontinuálním toku. Byly použity aminokyseliny N-a-Fmoc s vhodnou ochranou vedlejších řetězců. Fmoc aminokyseliny byly aktivovány pro vytvoření vazby vytvořením pentafluorfeny(esterů nebo použitím bud1 TBTU nebo diisopropylkarbodiimidové aktivace před reakcí. Pro selektivní odstranění Fmoc po každé vazbě byl použit 20% piperidin v DMF. Odštěpení řetězce od pryskyřice a odstranění skupin chránících vedlejší řetězce bylo provedeno pomocí 95% TFA s vhodnými čistícími látkami. Peptidy byly purifíkovány a analyzovány pomocí vysokotlaké chromatografie (HPLC) na reverzní fázi. Peptidy byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie s elektrospreyem (Finnigan mat SSQ710).
Aby byla vakcína vůěi rakovině a způsob specifické rakovinné terapie založený na T buněčné imunitní odpovědi účinný, musely být splněny tři podmínky:
a) peptid má alespoň délku 8 aminokyselin, je to fragment telomerázového proteinu a
b) peptid je schopný indukovat buď ve své plné délce, nebo po zpracování buňkami předkládajícími antigen T buněčnou imunitní odpověď.
Následující experimentální metody mohou být použity ke zjištění, jestli jsou tyto tři podmínky u daného peptidu splněny. Zaprvé by mělo být určeno, jestli daný peptid zvyšuje T buněčnou imunitní odpověď in vitro. Je také potřeba zjistit, zda syntetický peptid odpovídá neboje schopen po zpracování vytvořit peptidový fragment, který odpovídá peptidovému fragmentu, který se vyskytuje v rakovinných buňkách obsahujících telomerázu nebo v buňkách předkládaných antigen, které zpracovaly přirozeně se vyskytující telomerázu. Měla by být také stanovena specificita T buněk indukovaných in vivo pomocí vakcinace telomerázovými peptidy.
Je nezbytné stanovit, jestli nádorové buněčné linie exprimující telomerázu mohou být zabity T buněčnými klony získanými z periferní krve karcinomatických pacientů po vakcinaci telomerázovým peptidem. T buněčné klony jsou získány klonováním T buněčných blastů (T-cell blasts) přítomných mezi mononukleámí mi buňkami periferní krve (PBMC) odebranými karcinomatickému pacientu po vakcinaci telomerázovým peptidem. Protokol vakcinace peptidem zahrnuje několik in vivo injekcí peptidů zavedených intrakutánně společně s GM-CSF nebo jiným běžně používaným adjuvans. Klonování T buněk je provedeno vysetím odpovídajících T buněčných blastů v množství 5 blastů najednu maku v Terasakiho destičkách. V každé jamce bylo obsaženo 2x104 autologních ozářených (30 Gy) PBMC buněk jako zdrojových buněk. Buňky byly inkubovány s kandidátním telomerázovým peptidem v koncentraci 25 mM a s 5 U/ml rekombi45 nantního interleukinu-2 (rIL-2) (Amersham, Aylesbury, UK) v celkovém objemu 20 ml. Po devíti dnech byly T buněčné klony přeneseny na 96-jamkové destičky sjamkami s plochým dnem (Costar, Cambridge, MA) společně s 1 mg/ml fytohemaglutinin (PHA, Wellcome, Dartford, UK), 5 U/ml rlL-2 a salogenními ozářenými (30 Gy) PBMC buňkami (2 x 105) na jamku jako zdrojovými buňkami. Rostoucí klony byly dále expandovány do 24-jamkových destiček společně sPHA / rIL-2 a s 1 x 106 alogenních ozářených (30 Gy) PBMC buněk jak zdrojových buněk a testovány na peptidovou specificitu po 4 až 7 dnech.
T buněčné klony byly selektovány pro další charakterizaci. Fenotyp buněčného povrchu T buněčného klonu je určen zjištěním, jestli je T buněčný klon CD4+ nebo CD8+. T buněčný “’9CZ 303215 B6 klon je inkubován s autologními nádorovými buňkami vystavenými různým poměrům efektorová buňka ku cílová buňka za účelem stanovení jestli proběhla lyže nádorových buněk. Lyže naznačuje, že T buňky vykazují reaktivitu přímo vůči antigenů odvozenému z nádoru, například telomerázovému proteinu.
Za účelem ověření, jestli rozpoznávaný antigen je asociován s telomerázovým proteinem, a identifikace HLA molekula I a 11 třídy, které předkládají předpokládaný telomerázový peptid T buněčnému klonu, byly jako cílové buňky v cytotoxických testech použity různé nádorové buněčné linie exprimující telomerázový peptid a zároveň nesoucí jednu nebo více HLA molekul ίο 1 nebo II třídy pacienta. Cílové buňky byly značeny 51 Cr nebo 3H-thymidinem (9,25 x 104 Bq/ml) přes noc, jednou promyty a vysety v množství 5000 buněk na jamku v 96~jamkových destičkách.
T buňky byly přidány v různých poměrech efektorová buňka ku cílová buňka a destičky byly inkubovány po dobu 4 hodiny při teplotě 37 °C a sklizeny, poté vyhodnoceny na kapalinovém scintilačním čítači (Packard Topcount). Jako cílové buňky mohou být použity například buňky buněčné linie karcinomu močového měchýře T24 (12Vaf, HLA-ΑΙζ B35+), melanomové buněčné linie FMEX (!2Val\ HLA-A2\ B35+) a buněčné linie karcinomu střeva SW 480 (12Val\ HLA-A2*, B8 ) nebo jakékoliv další nádorová buněčné linie pozitivní na telomerázu. Jako kontroly mohou být použity vhodné buněčné linie, které neexprimují telomerázový protein, ty nebudou lyžovány. Lyže zvláště buněčných linií naznačuje, že T buněčný testovaný klon rozpoznává endogenně zpracovaný telomerázový epitop v kontextu HLA molekul 1 nebo II podtypu exprimovaný danou buněčnou linií.
Vymezení T buněčných klonů s HLA molekulami I nebo II třídy může být dosaženo experimenty s blokováním. Mohou být použity monoklonální protilátky vůči HLA antigenům I třídy, napri25 klad pankreatická monoklonální protilátka vůči HLA antigenům I třídy W6/32 nebo vůči antigenům II třídy, například monoklonální protilátky vůči HLA antigenům II třídy DR, DQ a DO (B8/11, SPV-L3 a B7/21). Aktivita T buněčného klonu vůči autologním nádorovým buněčným liniím je vyhodnocena pomocí monoklonálních protilátek vůči HLA molekulám I a II třídy v konečné koncentraci 10 mg/ml. Stanovení jsou provedena podle postupu uvedeného výše ve třech paralelních stanoveních v 96-jamkových destičkách a cílové buňky jsou preinkubovány 30 minut při teplotě 37 °C před přidáním T buněk.
Přesná specifícita T buněčného klonu může být stanovena pomocí experimentů s pulsem peptidů. Z důvodu identifikace telomerázového peptidů, který je aktuálně rozpoznáván T buněčným klonem, byl testován panel nonamemích peptidů. Autologní fibroblasty značené 51 Cr nebo 3H-thymidinem a promyté slabou kyselinou byly vysety v množství 2500 buněk na jamku v 96-jamkové destičce a vystaveny pulzu peptidů o koncentraci 1 mM společně s b2-mikroglobulinem (2,5 mg/ml) v inkubátoru s teplotou 37 °C a 5% CO2 před tím, než byly přidány T buňky. Stanovení byla prováděna ve třech paralelních provedeních v 96-jamkových destičkách a inkubace probíhala 4 hodiny s poměrem efektorová buňka ku cílová buňka 5:1. Kontroly mohou zahrnovat T buněčné klony kultivované samostatně, s APC v nepřítomnosti peptidů nebo s irelevantním s melanomem asociovaným peptidem, MART-l/Melan-A peptidem.
Ke stanovení přesné specificity T buněčných klonů může být použit také alternativní protokol.
V tomto alternativním protokolu jsou jako antigen předkládající buňky využity buňky linie T2 Tapú deficientn. Tato buněčná linie exprimuje pouze malé množství HLA-A2 antigenů, ale zvýšené hladiny HLA antigenů I třídy na buněčném povrchu mohou být indukovány přídavkem b2-mikroglobulinu. 3H značené cílové buňky jsou inkubovány s různými testovanými a kontrolními peptidy v koncentraci 1 mM společně s b2-mikroglobulinem (2,5 mg/ml) po dobu jedné hodiny pri 37 °C. Po pulzu peptidů před tím, než se přidají T buňky, jsou cílové buňky intenzívně promyty a vysety v množství 2500 buněk na jamku v 96-jamkové destičce. Destičky jsou před sklizením inkubovány 4 hodiny pri 37 °C v atmosféře 5% CO2. Kontroly obsahují T buněčné klony kultivované samostatně nebo s cílovými buňkami v nepřítomnosti peptidů. Stanovení byla prováděna ve třech paralelních provedeních v 96-jamkových destičkách s poměrem efektorová buňka ku cílová buňka 20:1.
-10CZ 303215 B6
Citlivost T buněčných klonů vůči zvláštním peptidům označeným výše může být také stanovena pomocí experimentů dávka-odpověď. Jako cílové buňky mohou být použity fibroblasty senzitivované peptidy. Cílové buňky jsou vystaveny pulzu daného peptidu, jak je popsáno výše pro stanovení přesné specificity stou výjimkou, že peptidy jsou před přídavkem T buněk přidány v různých koncentracích. Kontroly mohou zahrnovat cílové buňky samotné a cílové buňky vystavené pulzu irelevantního s melanomem asociovaného peptidu Melan-A/MART-l.
io Popis obrázků
Obr. 1
Obr. 1 popisuje indukci cytotoxických T-lymfocytů (CTL's) reaktivních vůči telomeráze (hTERT) u transgenních myší HLA-A2 (A2/Kb) imunizovaných telomerázovými peptidy se sekvenčním číslem 9 a 10. Jako kontrola byl použit standardní peptid chřipky (58-66) tvořící komplex s HLA-A2. Myším ve třech skupinách po pěti byly dvakrát týdně dávány subkutánní injekce, které obsahovaly 107 ozářených syngenních buněk sleziny, které byly předtím vystaveny pulzu peptidů (100 μg/ml). Týden po druhé injekci byly myši usmrceny a byly vypreparovány jejich sleziny. Buňky sleziny byly zpracovány standardními postupy a buňky z imunizovaných zvířat byly restimulovány in vitro po dobu 5 dní společnou kultivací s ozářenými autologními buňkami sleziny vystavenými pulzu peptidů (10 pg/ml), které sloužily jako antigen předkládající buňky, před tím, než byly testovány na cytotoxicitu vůči cílovým buňkám exprimujícím hTERT (Jurkat), které byly transfekovány HLA-A2 (A2/Kb), testu s uvolňováním 5lCr.
Sloupce vlevo na obrázku 1 ukazují zabiti HLA-A2 transfekovaných Jurkat buněk vystavených pulzu kontrolního peptidu (chřipka 58 až 66) T buňkami, které byly získány po imunizaci myší peptidem se sekvencí číslo 9, v různých poměrech efektorová buňka ku cílová buňka. U všech poměrů efektorová buňka ku cílová buňka byla pozorována specifická cytotoxicita vyšší než pozadí. Sloupce ve středu ukazují podobná data s T buňkami, které byly získány po imunizaci myší peptidem se sekvencí číslo 10. Významné zabíjení buněk Jurkat bylo pozorováno pouze tehdy, pokud jako efektorové buňky byly vybrány buňky sleziny od myší, které byly vystaveny pulzu telomerázového peptidu na rozdíl od toho, pokud jako efektorové buňky byly vybrány buňky sleziny od myší vystavených pulzu chřipkového peptidu. Zabití buněk Jurkat pouze na úrovni pozadí bylo pozorováno, když byly cílové buňky vystaveny pulzu irelevantního peptidu (peptid melanokortikoidního receptorů 1, MC1R244), jak je vidět ze sloupců v pravé části obr. 1. Tyto výsledky ukazují, že peptidy se sekvenčním číslem 9 a 10 jsou imunogenní in vitro a imunizace může vyvolat imunitní odpověď u teplokrevných živočichů, které vykazují běžné lidské MHC molekuly HLA-A2. Tato zjištění také naznačují, že peptidy s číslem sekvence 9 a 10 mohou být použity jako vakcína vůči rakovině u lidí nesoucích HLA-A2 nebo jiné HLA molekuly I. třídy schopné vázat tyto peptidy. Navíc tyto výsledky ukazují, že hTETR exprimované leukemickou T buněčnou linií Jurkat mohou být zpracovány proteolytickým aparátem buněčné linie za vzniku peptidových fragmentů, které jsou identické nebo podobné peptidům s číslem sekvence 9 a 10. Tato pozorování společně pak naznačují, že imunitní odpověď získaná po vakcinaci karcinomatických pacientů nebo pacientů s rizikem vzniku rakoviny těmito peptidy může ústit v účinné zabití nádorových buněk exprimujících hTERT podjednotku telomerázy.
Obr. 1 znázorňuje cytotoxicitu efektorových buněk získaných z myší imunizovaných jak naznačeno na obrázku vůči HLA-A2 transfektovaným buňkám Jurkat. Cílové buňky byly označeny 5,Cr (0,1 pCi/100 μΐ buněčné suspenze) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, dvakrát promyty a vystaveny pulzu peptidu (1 pg/ml) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C před promytím. Dva tisíce označených, cílových buněk vystavených pulzu peptidu bylo vyseto na jamku v 96jamkové mikrotitrační destičce s v-tvarem dna jamky, a do jamky byly přidány efektorové buňky (2,5 x 104 až 2 x 105). Kultura byla inkubována 4 hodiny při 37 °C, poté byl odebrán supematant a ten testován v gama čítači.
- 11 CZ 303215 B6
Výsledky v obr. I jsou vyjádřeny jako specifická cytotoxicita vypočítaná podle následujícího vztahu:
(cpm experimentálně uvolněné - cpm spontánně uvolněné)/ (cpm celkové - cpm spontánně uvolněné) x 100
Obr. 2
Obr. 2 ukazuje výsledky in vitro stimulace periferních krevních T buněk od pacienta (TT) s karcinomem střeva peptidy odvozenými od telomerázy (hTERT) s čísly sekvencí 2,3,4 a 7. Kultivace in vitro byla provedena následujícím způsobem: Tři sady 105 mononukleámích buněk bylo inkubováno 6 dnů v médiu X-VIVO 10 doplněném 15% lidským sérem inaktivovaným teplem ve vlhkém inkubátoru s 5% COi. Peptidy byly přítomny ve všech kulturách v konečné koncentraci 30 pg/ml média. Kultury bez peptidů sloužily jako kontrola. Proliferativní odpověď vyšší než pozadí byla pozorována u T-buněk pokud byly stimulovány peptidem se sekvencí číslo 4. Tyto výsledky ukazují, že krev karcinomatického pacienta obsahuje cirkulující T buňky specifické pro peptidy odvozené od telomerázy (hTERT). Tyto výsledky ukazují, že enzymatická podjednotka telomerázy (hTERT) je u muže imunogenní a může spontánně zvýšit specifickou T-buněčnou odpověď vůči telomeráze, pokud je nadměrně exprimována nádorem rostoucím v pacientovi. Navíc, jedna část specifické odpovědi u tohoto pacienta je zaměřena přímo proti peptídu s číslem sekvence 4, která je zde uvedena. Tento nález naznačuje, že peptid SEQ ID NO 4 může být také použit jako vakcína vůči rakovině u člověka. Obr. 2 znázorňuje výsledky konvenčního T buněčného proliferativního testu, kde periferní krevní mononukleárové buňky (105) byly kultivovány s peptidy, jak je ukázáno, 7 dní ve třech sadách před sklizením. K měření proliferativní kapacity kultur byl přidán před sklizením ke kultuře přes noc 3H-thymidin (3,7x104 Bq/jamku). Hodnoty jsou udány jako průměr četností za minutu (cpm) tří paralelních sad.
Obr. 3a4
Obr. 3 a 4 ukazují reaktivitu lymfocytů infiltrovaných do nádoru (TILs) získaných od pacienta s pokročilým karcinomem pankreatu. T buňky byly získány z biopsie nádoru a byly úspěšně kultivovány in vitro za vzniku T buněčné linie. T buněčná line byla CD3+, CD4+ a CD8a proliferovala specificky v odpovědi na přítomnost telomerázových peptidů. Výsledky v obr. 3 ukazují T buňky, které rozpoznávají peptidy se sekvencí číslo 2 a 3, ve srovnání s kontrolami, které obsahovaly samotné médium. Výsledky v obr. 3 ukazují T buňky, které rozpoznávají peptid se sekvencí číslo 2. TILs buňky byly expandovány společnou kultivací s rekombinantním interleukinem 2 (rIL~2) a testovány po 14 pomocí standardního proliferačního testu s použitými peptidy se sekvencemi číslo 2, 3, 4 a 7.
-12CZ 303215 B6
Tabulka 1
FLHWLMSVYWELLRSFFYVTE
EARPALLTSRLRFIPK
DGLRPIVNMDYWGAR
GVPEYGCWNLRKWNF
LMSVYWEL
ELLRSFFYV
YWELLRSF
WELLRSFF
SVYWELLR
VELLRSFFY
YVTETTFQK
RLFFYRKSV
SIGIRQHLK
RPALLTSRL
ALLTSRLRF
LLTSRLRFI
RPIVNMDYV
LRPIVNMDY
YWGARTFR
WGARTFRR
GARTFRREK
ARTFRREKP
PPELYFVKV
ELYFVKVDV
FVKVDVTGA
IPQDRLTEV
DRLTEVIAS
RLTEVIASI
IPQGSILSTL [LSTLLCSL
LLRLVDDFL
RLVDDFLLV
VPEYGCWN
VPEYGCWNL
TLVRGVPEY
FLRTLVRGV
GVPEYGCW
WNLRKTW
GLFPWCGLL
-Ϊ3CZ 303215 B6
Tabulka 2
YAETKHFLY
1SDTASLCY
DTDRRRLVQ
AQDPPPELY
LTDLQPYMR
QSDYSSYAR
ILAKFLHWL
ELLRSFFYV
LLARCALFV
WLCHQAFLL
RLVDDFLLV
RLFFYRKSV
LQLPFHQQV
RLGPQGWRL
SLQELTWKM
NVLAFGFAL
VLLKTHCPL
FLLVTPHLT
TLTDLQPYM
RLTEVIAS1
FLDLQVNSL
SLNEASSGL
ILSTLLCSL
LLGASVLGL
VLAFGFALL
LQPYMRQFV
LMSVYWEL
RLPQRYWQM
RQHSSPWQV
YLPNTVTDA
NMRRKLFGV
RLTSRVKAL
LLQAYRFHA
LLDTRTLEV
YMRQFVAHL
LLTSRLRF1
CLVCVPWDA
LLSSLRPSL
FMCHHAVRI
LQVNSLQTV
LVAQCLVCV
CLKELVARV
FLRNTKKFI
ALPSDFKTI
VLVHLLARC
VQSDYSSYA
SVWSKLQSI
KLPGTTLTA
QLSRKLPGT
ELYFVKVDV
GLLLDTRTL
WMPGTPRRL
SLTGARRLV
W1EQSSSL
LPSEAVQWL
QAYRFHACV
GLFDVFLRF
KLFGVLRLK
RLREE1LAK
- 14CZ 303215 B6
Tabulka 2 (pokračováni)
TLVRGVPEY
GLPAPGARR
GLFPWCGLL
KLTRHRVTY
VLPLATFVR
ELVARVLQR
DPRRLVQLL
FVRACLRRL
SVREAGVPL
AGRNMRRKL
LARCALFVL
RPAEEATSL
LPSDFKT1L
LPSEAVQWL
LPGTTLTAL
RPSFLLSSL
LPNTVTDAL
RPALLTSRL
RCRAVRSLL
MPRAPRCRA
GIRRDGLLL
VLRLKCHSL
YMRQFVAHL
SLRTAQTQL
QMRPLFLEL
LLRLVDDFL
FVQMPAHGL
HASGPRRRL
WIEQSSSL
RVISDTASL
CVPAAEHRL
RVKALFSVL
NVLAFGFAL
LVARVLQRL
FAGIRRDGL
HAQCPYGVL
RAQDPPPEL
AYRFHACVL
HAKLSLQEL
GAKGAAGPL
TASLCYSJL
APRCRAVRS
GARRLVET1
AQCPYGVLL
HAKTFLRTL
EATSLEGAL
KAKNAGMSL
AQTQLSRKL
AGIRRDGLL
VLRLKCHSL
ILKAKNAGM
DPRRLVQLL
GAKGAAGPL
FAGIRRDGL
GARRRGGSA
HAKTFLRTL
HAKLSLQEL
- 15'-'
Tabulka 2 (pokračováni)
LARCALFVL
EHRLREEIL
NMRRKLFGV
CAREKPQGS
LTRHRVTYV
RRFLRNTKK
RRDGLLLRL
RREKRAERL
RRLVETIFL
LRFMCHHAV
RRYAWQKA
KRAERLTSR
RRKLFGVLR
RRRGGSASR
RRLPRLPQR
RRLGPQGWR
LRGSGAWGL
HREARPALL
VRRYAWQK
ARTS1RASL
HRVTYVPLL
LRSHYREVL
MRPLFLELL
HRAWRTFVL
MRRKLFGVL
LRLVDDFLL
LRRVGDDVL
YRKSVWSKL
QRLCERGAK
FRALVAQCL
SRKLPGTTL
LRRLVPPGL
RRSPGVGCV
RRVGDDVLV
VRGCAWLRR
VRSLLRSHY
ARTFRREKR
SRSLPLPKR
IRASLTFNR
LREEILAKF
IRRDGLLLR
GRGDPAAFR
LRPIVNMDY
ARRLVETIF
ARPALLTSR
LRPSLTGAR
LRLKCHSLF
FRREKRAER
ARGGPPEAF
CRAVRSLLR
GRTRGPSDR
RRRLGCERA
LRELSEAEV
ARCALFVLV
RPAEEATSL
DPRRLVQLL
RPSFLLSSL
LPSEAVQWL
- 16CZ 303215 B6
Tabulka 2 (pokračování)
RPALLTSRL
LPSDFKTIL
RPPPAAPSF
LPRLPQRYW
LPNTVTDAL
LPGTTLTAL
LAKFLHWLM
KAKNAGMSL
GSRHNERRF
KALFSVLNY
SPLRDAW1
RAQDPPPEL
MPAHGLFPW
AEVRQHREA
REAGVPLGL
EEATSLEGA
LEAAANPAL
QETSPLRDA
REVLPLATF
KEQLRPSFL
REKPQGSVA
LEVQSDYSS
REARPALLT
EEDTDPRRL
REEILAKFL
CERGAKNVL
DDVLVHLLA
GDMENKLFA
YERARRPGL
Seznam sekvencí
Obecné pro všechny sekvence.
Typ sekvence: Peptid Sekvenční jednotka: Aminokyselina Topologie: Lineární io
SEQ ID NO: 1
DÉLKA SEKVENCE: 22 aminokyselin FLHWLMSVYVVELLRS F F Y V T E 1 5 10 15 20
SEQ ID NO: 2
DÉLKA SEKVENCE: 16 aminokyselin EARPALLTSRLRFIPK 15 10 15
- 17CZ 303215 B6
SEQ ID NO: 3
DÉLKA SEKVENCE: 16 aminokyselin OGLRPIVNMDYVVGAR 15 10 15
SEQ ID NO: 4
DÉLKA SEKVENCE: 18 aminokyselin GVPEYGCVVNLRKTVVNF 15 10 15
SEQ ID NO: 5 io
DÉLKA SEKVENCE: 23 aminokyselin
KFLHWLMSVYVVELLRS F 15 10 15
SEQ ID NO: 6
DÉLKA SEKVENCE: 17 aminokyselin
KFLHWLMSVYVVELLRS
10 15
SEQ ID NO: 7
DÉLKA SEKVENCE: 18 aminokyselin
LMSVYVVELLRS FFYVTE 15 10 15
SEQ ID NO: 9
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin ILAKFLHWL
1 5
SEQ ID NO: 10
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin ELLRSFFYV 1 5
F Y V Τ E
- 18 CZ 303215 B6
SEQ ID NO: 11
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin
LMSVYVVEL 1 5 5 SEQ ID NO: 12
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin
TSRLRFIPK 1 5
SEQ ID NO: 13 10
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin
LTSRLRFIP 1 5
SEQ IDNO: 14
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin LLTSRLRFI 1 5
SEQ ID NO: 15
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin
ALLTSRLRF 1 5
SEQ ID NO: 16
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin PALLTSRLR 1 5
SEQ ID NO: 17
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin
RPALLTSRL 1 5
SEQ ID NO: 18
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin ARPALLTSR
5
SEQ ID NO: 19
DÉLKA SEKVENCE: 9 aminokyselin EARPALLTS
Claims (15)
Hide Dependent
translated from
Claims (15)
Hide Dependent
translated from
- io PATENTOVÉ NÁROKY1. Telomerázový peptid, kteiý obsahuje mezi 9 a 25 aminokyselinami, kde telomerázový peptid obsahuje sekvenci ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19, nebo fragment ze15 SEQ IDNO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19, v délce alespoň 8 aminokyselin, přičemž fragment je schopný indukovat T buněčnou odpověď.
- 2. Telomerázový peptid podle nároku 1 obsahující sekvenci ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19.
- 3. Telomerázový peptid podle nároku 2 pro použití při léčení nebo proíýlaxi rakoviny, přičemž telomerázový peptid je schopný generovat T buněčnou odpověď přímo vůči proteinu telomerázy.
- 4. Telomerázový peptid podle nároku 3 pro použití k léčbě savce, prodělávajícímu nebo 25 pravděpodobně prodělávajícímu rakovinu, kterému se podá terapeuticky účinné množství telomerázového peptidu, takže je v savci indukována T buněčná odpověď vůči telomeráze.
- 5. Telomerázový peptid podle nároku 3 nebo 4 pro použití, jak je zde uvedeno, ve kterém je indukovanou T buněčnou odpovědí cytotoxická T buněčná odpověď.
- 6. Nukleová kyselina schopná kódovat telomerázový peptid podle nároku 1 nebo 2.
- 7. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden telomerázový peptid podle nároku 1 nebo 2, nebo alespoň jednu nukleovou kyselinu podle35 nároku 6, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
- 8. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci alespoň jednoho telomerázového peptidu podle nároku 1 nebo 2 a alespoň jednoho peptidu schopného indukovat T buněčnou odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému proteinu nebo peptidu40 nádorového supresoru, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.-20CZ 303215 B6
- 9. Farmaceutická kompozice podle 7 nebo 8 pro použití při léčení nebo profylaxi kterékoliv z následujících rakovin: karcinom prsu, karcinom prostaty, karcinom pankreatu, kolorektální karcinom, karcinom plic, maligní melanom, leukémie, lymfomy, karcinom ovarií, karcinom5 děložního čípku a karcinom žlučových cest.
- 10. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 7, vyznačující se tím, že se smísí alespoň jeden telomerázový peptid podle nároku 1 nebo 2, nebo alespoň jedna nukleová kyselina podle nároku 6, s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.io
- 11. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že se smísí alespoň jeden telomerázový peptid podle nároku 1 nebo 2 s alespoň jedním peptidem schopným indukovat T buněčnou odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému proteinu nebo peptidu nádorového supresoru, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
- 12. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že onkogenní protein nebo peptid je mutovaný p21-ras protein nebo peptid.
- 13. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím,20 že onkogenní protein nebo peptid je mutovaný p21-ras protein nebo peptid.
- 14. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že protein nebo peptid nádorového supresoru je retinoblastom nebo p53 protein nebo peptid.25 15. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že protein nebo peptid nádorového supresoru je retinoblastom nebo p53 protein nebo peptid.16. Použití peptidu pro výrobu léčiva k léčbě nebo profylaxi rakoviny, přičemž peptid obsahuje kteroukoliv sekvenci ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19, přičemž léčba nebo profylaxe30 zahrnuje generování T buněčné odpovědi vůěi peptidu obsahujícímu kteroukoliv sekvenci ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19, podle pořadí, nebojeho fragmentu v délce alespoň 8 aminokyselin, připravitelného po zpracování buňky prezentující antigen.17. Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva k léčbě nebo profylaxi rakoviny, přičemž35 nukleová kyselina je schopná kódovat peptid obsahující kteroukoliv sekvenci ze SEQ ID NO: 2,3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19, přičemž léčba nebo profylaxe zahrnuje generování T buněčné odpovědi vůči peptidu obsahujícímu kteroukoliv sekvenci ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19, podle pořadí, nebojeho fragmentu o délce alespoň 8 aminokyselin, připravitelného po zpracování buňky prezentující antigen.18. Použití podle nároku 16 nebo 17, ve kterém léčba nebo profylaxe zahrnuje podání savci podání savci, prodělávajícímu nebo pravděpodobně prodělávajícímu rakovinu, terapeuticky nebo profylakticky účinné množství peptidu, takže je v savci indukována T buněčná odpověď vůči telomeráze.19. Použití podle kteréhokoliv z nároků 16 až 17, ve kterém je indukovanou T buněčnou odpovědí cytotoxická T buněčná odpověď.20. Použití podle kteréhokoliv z nároků 16 až 19, ve kterém je léčivem farmaceutická kompozi50 ce obsahující peptid nebo nukleovou kyselinu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 16 nebo 18 až 20, ve kterém léčivo obsahuje peptid sestávající z kterékoliv sekvence ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10, 12 až 19 a alespoň jednoho55 peptidu schopného indukovat T buněčnou odpověď přímo vůči onkogennímu nebo mutovanému- 21 - cz 303215 B6 proteinu nebo peptidů nádorového supresoru, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.22. Použití podle nároku 21, ve kterém onkogenní protein nebo peptid je mutovaný p21-ras pros tein nebo peptid, nebo protein nebo peptid nádorového supresoru je retinoblastom nebo p53 protein nebo peptid.23. Použití podle kteréhokoliv z nároků podle 16 až 22, ve kterém je rakovina vybrána z karcinomu prsu, karcinomu prostaty, karcinomu, pankreatu, kolorektálního karcinomu, karcinom plic, io maligního melanomu, leukémií, lymfomů, karcinomu ovarií, karcinomu děložního čípku a karcinomu žlučových cest.24. Způsob přípravy T-lymfocytů schopných rozpoznat a zničit nádorové buňky u savců, vyznačující se tím, že se odebere vzorek T-lymfocytů od savce a kultivuje se
- 15 v přítomnosti peptídu v množství dostatečném k přípravě T-lymfocytů specifických vůči telomeráze, kde peptid sestává z kterékoliv sekvence ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10, 12 až 19 a kde Tlymfocyty specifické vůči telomeráze generují odpověď vůči peptidů sestávajícímu z kterékoliv sekvence ze SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 10 nebo 12 až 19 nebo jeho fragmentu o délce alespoň 8 aminokyselin, pri prav ite 1 ného po zpracování buňky prezentující antigen.25. T-lymfocyt specifický vůči telomeráze připravený způsobem podle nároku 24.