CZ295994B6

CZ295994B6 - L-Ribóza izomeráza a způsob její produkce a produkce ketózy a aldózy a jejich vzájemné konverze a mikroorganismus rodu Acinetobacter

Info

Publication number: CZ295994B6
Application number: CZ19971501A
Authority: CZ
Inventors: Ken Izumori; Keiji Tsusaki
Original assignee: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenky
Priority date: 1996-05-16
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2005-12-14
Also published as: EP0807682A2; JP4012596B2; US6037153A; KR100512062B1; DE69732875D1; EP0807682B1; US5846804A; CZ150197A3; EP0807682A3; TW482822B; US6294369B1; JPH10155480A; KR970074930A; DE69732875T2

Abstract

Je popsána L-ribóza izomeráza, způsob její produkce a mikroorganismus rodu Acinetobacter. Dále je popsán způsob produkce ketózy a aldózy, jakož i jejich vzájemné konverze a to vždy za použití L-ribóza izomerázy nebo uvedeného mikroorganismu.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká L-ribóza izomerázy, způsobu její produkce a způsobu produkce ketózy a aldózy, jakož i jejich vzájemné konverze a mikroorganismu rodu Acinetobacter.

Dosavadní stav techniky

V poslední době se rychle rozvíjí biochemický průmysl a po vzácných sacharidech, které dosud byly mimo zájem, je velká poptávka v oblasti chemie sacharidů. Vyžaduje se zavedení těchto vzácných sacharidů do výroby. I když takové vzácné sacharidy mohou být produkovány metodami organické chemie, jsou výrobní podmínky obecně kritické a výtěžky požadovaných produktů jsou relativně nízké. Proto nejsou metody organické chemie vyhovující pro výrobu v průmyslovém měřítku. Třebaže byly metody sacharidové konverze zdánlivě vhodné jako biochemické metody pro produkci vzácných sacharidů, nebyla podána žádná zpráva o izomeráze, která působí na L-ribózu nebo L-talózu jako vzácný sacharid a nebyla nalezena produkční metoda pro takové vzácné sacharidy.

Existuje silný požadavek na produkční metodu v průmyslovém měřítku pro vzácné sacharidy, jako je L-ribóza a D-talóza.

Pro dosažení předmětu přítomného vynálezu původci studovali L-ribóza izomerázu a intenzivně hledali mikroorganismy, které produkují takový enzym. Výsledkem je, že zjistili, že nově izolovaný mikroorganismus druhu Acinetobacter calcoaceticus LR7C kmen, izolovaný z půdy v Mikimachi, Kita-gun, Kagawa, Japonsko, produkuje L-ribóza izomerázu. Původci také zjistili, že Lribóza izomeráza usnadňuje produkci vzácných sacharidů, které působí na aldózy nebo ketózy jako substrát a uskutečňuje dále popsaný vynález.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je L-ribóza izomeráza, která izomeruje L-ribózu na L-ribulózu a naopak, a která je vyrobitelná z mikroorganismu rodu Acinetobacter.

Předmětem tohoto vynálezu je dále způsob produkce L-ribóza izomerázy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kultivaci v živném kultivačním médiu mikroorganismu rodu Acinetobacter za vzniku L-ribóza izomerázy a izolaci produkované L-ribóza izomerázy z kultury.

Předmětem tohoto vynálezu je také mikroorganismus rodu Acinetobacter, který produkuje Lribóza izomerázu.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž způsob produkce ketózy vybrané ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje uvedení do styku L-ribóza izomerázy nebo mikroorganismu popsaného výše s aldózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu za vzniku jedné z uvedených ketóz, která odpovídá uvedeným ketózám a izolaci produkované ketózy, jakož i způsob produkce aldózy vybrané ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje uvedení do styku L-ribóza izomerázy nebo mikroorganismu popsaného výše s ketózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psi

-1 CZ 295994 B6 kozu a L-sorbózu za vzniku jedné z uvedených aldóz, která odpovídá uvedeným ketózám, a izolaci produkované aldózy.

Předmětem tohoto vynálezu je též způsob konverze mezi aldózami a ketózami, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje uvedení do styku L-ribóza izomerázy buď s aldózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu pro izomeraci uvedené aldózy na její odpovídající ketózu vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu, nebo s ketózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu pro izomerizaci uvedené ketózy na její odpovídající aldózu vybranou ze souboru zahrnujícího Lribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje vliv teploty na enzymatickou aktivitu L-ribóza izomerázy získané z Acinetobacter calcoaceticus.

Obr. 2 představuje vliv pH na enzymatickou aktivitu L-ribóza izomerázy získané z Acinetobacter calcoaceticus.

Obr. 3 představuje tepelnou stabilitu L-ribóza izomerázy získané z Acinetobacter calcoaceticus.

Obr. 4 představuje pH stabilitu L-ribóza izomerázy získané z Acinetobacter calcoaceticus.

Obr. 5 je rentgenové difrakční zobrazení pro krystaly L-ribóza izomerázy s nejvyšší čistotou, získané podle předloženého vynálezu, stanovené práškovou rentgenovou difrakční analýzou za použití CuKa záření. Čísla na obrázku jsou čísla pro každý pík.

Dále se uvádí podrobný popis tohoto vynálezu.

Předložený vynález se týká L-ribóza izomerázy, způsobu její produkce (přípravy) a použití, zvláště se týká L-ribóza izomerázy, která konvertuje L-ribózu na L-ribulózu a více versa, jejich přípravy, mikroorganismů schopných produkovat L-ribóza izomerázu a způsobu produkce ketóz a aldóz za použití L-ribóza izomerázy.

Dále jsou uvedeny identifikační výsledky mikroorganismu rodu Acinetobacter, tj. Acinetobacter calcoaceticus LR7C kmen (FERM BP-5335).

Identifikační výsledky Acinetobacter calcoaceticus LR7C kmene:

A. Morfologie

Charakteristiky buněk při inkubaci při 27 °C v agarové živné půdě;

Obvykle existují ve formě jednotlivých tyčinek 1,0-1,5 x 1,5-2,5 pm;

Motilita: pozitivní (rotační nebo vinrační motilita);

Asporogenicita: pozitivní;

Flagellum: pozitivní;

Gram barvení: negativní;

-2CZ 295994 B6

B. Kultivační vlastnosti (1) Charakteristiky kolonie vytvořené při inkubaci při 27 °C na živné agarové plotně s půdou

Tvar: kruhovitá kolonie, mající průměr asi 0,1-1 mpo 2denní inkubaci;

Okraj: celý;

Projekce: hemisférický tvar;

ío Lesk: matný;

Povrch: hladký;

Barva: semitransparentní, světležlutá;

(2) Charakteristiky kolonie vytvořené při inkubaci při 27 °C na šikmém živném agaru s půdou

Růst: vyhovující;

Tvar: podobný vláknu;

(3) Charakteristiky kolonie vytvořené při inkubaci při 27 °C na šikmém agaru s trypton sójovou půdou

Růst: vyhovující;

Tvar: podobný vláknu; a (4) Nezkapalňuje želatinu při stab-kultivování při 27 °C v živné želatině s půdou,

C. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce dusičnanů: pozitivní;

(2) Akumulace poly-p-hydroxybutyrátu: negativní;

(3) Test s methylčervení: negativní;

(4) VP-test: negativní;

(5) Tvorba indolu: negativní;

(6) Tvorba sirovodíku: negativní;

(7) Hydrolýza škrobu: negativní;

(8) Využití kyseliny citrónové: pozitivní;

(9) Tvorba pigmentu: negativní;

(10) Oxidáza negativní;

(11) Kataláza pozitivní;

(12) Růstové podmínky: růst při teplotě v rozmezí 20 až 37 °C;

(13) Požadavky na kyslík: aerobní;

(14) Tvorba kyseliny z D-glukózy: pozitivní;

(15) Hemolýza: negativní;

-3CZ 295994 B6 (16) β-Xyloxidáza negativní;

(17) Využití zdroje uhlíku:

Využití kyseliny glutarové, kyseliny malonové, kyseliny fenylmléčné, kyseliny azelainové, kyseliny D-jablečné, ethanolu, 2,3-butandiolu, kyseliny akonitové, Dribózy, D-xylózy, L-arabinózy a D-glukózy;

(18) Využití zdroje dusíku

Využití L-fenylalaninu, L-histidinu, L-aspartové kyseliny, L-leucinu, L-tyrosinu, β-alaninu, L-argininu a L-omitinu, ale ne využití histaminu;

(19) DNasa: pozitivní;

(20) Tvorba 3-ketolaktózy: negativní; a (21) Mol% guaninu (G) plus cytosinu DNA: 42 %.

Na základě těchto mykologických vlastností byl mikroorganismus porovnán s těmito vlastnostmi známých mikroorganismů s odkazem na Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, deváté vydání (1994). Výsledkem je, že mikroorganismus byl identifikován jako nový mikroorganismus rodu Acinetobacter. Vynálezci identifikovali tento mikroorganismus jako jeden ze druhů Acinetobacter calcoaceticus na základě údajů, že neroste při 41 °C, negativní hemolýzy aželatinové hydrolýzy, pozitivní tvorby kyseliny z glukózy a podmínek využití zdrojů uhlíku adusíku.

Z těchto výsledků autoři vynálezu pojmenovali mikroorganismus jako „Acinetobacter calcoaceticus LR7C“ a uložili jej 14. prosince 1995 v National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki, Japonsko. Uložení mikroorganismu bylo akceptováno tentýž den a bude udržován institutem pod přírůstkovým číslem FERM BP5335.

Navíc k výše identifikovanému mikroorganismu mohou být jiné kmeny rodu Acinetobacter a jejich mutanty vhodně použity v předloženém vynálezu, pokud produkují L-ribóza izomerázu podle předloženého vynálezu. Výše uvedené mutanty mohou být získány fyzikálním zpracováním mikroorganismů rodu Acinetobacter s ultrafialovým zářením nebo gama-paprsky, chemickým zpracováním mikroorganismů s nitrózoguanidinem nebo úspěšnou kultivací mikroorganismů v živném kultivačním médiu, obsahujícím D-lyxózu za stabilní produkce předložené Lribóza izomerázy a za zvýšení výtěžku enzymu. V předloženém vynálezu může být použit jakýkoliv jiný mikroorganismus pokud tento produkuje předloženou L-ribóza izomerázu. Je možné produkovat L-ribóza izomerázu expresí izomerázy ve transformantech, do kterých je zaveden gen, kódující izomerázu. Je-li to nutné, mohou být použity techniky proteinového inženýrství pro zvýšení tepelné stability předložené L-ribóza izomerázy nebo pro rozšíření pH stability. Ve vynálezu může být použito jakékoliv živné kultivační médium jako je živné kultivační médium syntetického nebo přírodního původu, pokud výše uvedené mikroorganismy v něm mohou růst a produkovat předloženou L-ribóza izomerázu. Jako zdroje uhlíku mohou být ve vynálezu použity jedna nebo více složek, obsahujících uhlík, jako jsou aldózy, ketózy a cukrové alkoholy. Obvykle může být D-lyxóza výhodně použita jako zdroj uhlíku pro kultivační médium. Zdroje dusíku použité v předloženém vynálezu zahrnují anorganické dusík obsahující sloučeniny jako jsou amoniové soli a dusičnany a organické dusík obsahující sloučeniny jako je močovina, výluh z kukuřice, kasein, pepton, kvasničný extrakt a masový extrakt. Anorganické složky použité v předloženém vynálezu zahrnují vápenaté soli, hořečnaté soli, draselné soli, sodné soli a fosfáty. Mikroorganismy použité ve vynálezu mohou být kultivovány za aerobních podmínek při teplotě obvykle asi 10 až 40 °C, výhodně asi 20 až 35 °C a při pH asi 5 až 9, výhodně asi 6 až 8,5.

-4CZ 295994 B6

Po ukončení kultivace mikroorganismů se předložená L-ribóza izomeráza získá z kultury. Buňky mohou být použity jako takové jako enzymatické činidlo, protože enzymatická aktivita existuje intracelulárně. Intracelulámí enzym může být extrahován z buněk běžnou technikou a extrahovaný enzym může být použit netknutý jako surový enzym nebo použit po čištění běžnými metodami. Například extrakty homogenizovaných buněk mohou být čištěny dvěma nebo více technikami jako je frakcionace za použití polyethylenglykolu, iontovýměnnýchchromatografií a gelových filtračních chromatografií pro získání enzymových přípravků s elektroforeticky jediným proteinovým pruhem.

Aktivita předložené L-ribóza izomerázy se hodnotí následovně: Směs 0,05 ml pufru (pH 9,0) 0,5 M glycin-hydroxidu sodného, 0,05 ml 0,05 L-ribózy a vhodného objemu enzymového roztoku dostačujícího pro poskytnutí celkového objemu 0,5 1. Výsledný roztok se inkubuje při 30 °C pro enzymatickou reakci a kvantifikaci množství vytvořené L-ribózy cysten-karbazolovou metodou. Jedna jednotka aktivity předložené L-ribóza izomerázy je definována jako množství enzymu, které tvoří jeden pmol L-ribózy za minutu.

Navíc k L-ribóze působí předložená L-ribóza izomeráza na aldózy jako je L-lyxóza, D-talóza, D-mannóza, L-alóza a L-gulóza a izomerizuje je na jejich odpovídající ketózy.

Předložená L-ribóza izomeráza nutně nemusí být čištěna na nejvyšší možnou hodnotu. Například mikroorganismy, obsahující L-ribóza izomerázu a zpracované s toluenem, mohou být vhodně použity netknuté v reakcích sacharidového transferu v průmyslovém měřítku. Mikroorganismy s aktivitou předložené L-ribóza izomerázy a částečně čištěné preparáty izomerázy mohou být imobilizovány běžnými imobilizačními metodami jako jsou metody zachycení, adsorpce a kovalentní vazby. Imobilizovaný enzym může být opakovaně použit vsádkově nebo kontinuálně po balení do kolon.

Takto získané reakční směsi obvykle obsahují jak aldózy tak ketózy. Obecně mohou být směsi čištěny dvěma nebo více technikami filtrace za použití filtračních prostředků, filtrů a membránových filtrů, odstřeďováním pro odstranění nerozpustných složek, odbarvováním s aktivním uhlím a odsolením za použití ionexů v H- a OH-formě. Výsledné směsi mohou být zahuštěny za získání sirupovitých produktů nebo sušeny na práškovité pevné produkty. Je-li to nezbytné, mohou být použity stupně krystalizace na vyšší koncentrace: například frakcionace za použití kationtových měničů ve formě alkalického kovu a/nebo kovu alkalických zemin nebo aniontové měniče v bisulfitové formě a/nebo ve formě kyseliny borité a sloupcové chromatografie využívající silikagely, produkující vysoce čisté sacharidy. Jestliže získané sacharidy jsou krystalovatelné, mohou být libovolně zpracovány do krystalických produktů běžnými krystalizačními technikami. Například výše uvedené reakční směsi nebo sacharidové roztoky, buď zpracované s nebo bez vhodných čisticích metod, se smísí s jedním nebo více organickými rozpouštědly jako jsou obecné nižší alkylalkoholy, zahrnující methanol, ethanol, izopropylalkohol nebo se zahustí a/nebo nechají stát při relativně nízkých teplotách. Tyto metody mohou být kombinovány pro získání supemasycených roztoků výše uvedených sacharidů s následující kiystalizací roztoků a oddělením krystalů pro získání pevných produktů, obsahujících krystaly. Tyto sacharidové produkty mohou být použity jako chemická činidla a použity v potravinářském průmyslu jako sladidla a činidla zlepšující kvalitu a ve farmaceutickém a chemickém průmyslu jako materiály a meziprodukty.

Z těchto sacharidů D-ribóza, izomer L-ribózy, je podstatnou složkou pro DNA korelující hluboce s buněčným růstem. Proto L-ribóza nebo její deriváty mohou být použity jako činidlo inhibující replikaci pro nukleové kyseliny. Příklady takového inhibičního činidla zahrnují farmaceutika jako jsou antiseptika, antivirová činidla, anti-AIDS činidla a protinádorová činidla. Jak je popsáno výše, je L-ribóza snadno připravena z L-ribulózy za použití předložené L-ribóza izomerázy. L-ribulóza není omezena na svůj původ: například sacharid může být snadno připraven oxidačními reakcemi za použití mikroorganismů rodu Gluconobacter a Acetobacter, tj, druh; Gluconobacter frateurii a Acetobacter aceti. Následující pokusy podrobněji vysvětlují vynález.

-5CZ 295994 B6

Příklady provedení vynálezu

Pokus 1

Příprava L-ribóza izomerázy z Acinetobacter calcoaceticus LR7C

Kapalné živné médium, obsahující 0,4 % hmotn./obj. kvasničného extraktu, 0,5 % hmotn./obj. polypeptonu, 0,5 hmotn./obj. soli a vodu se upraví na pH 7,0. Dva litry média byly umístěny do 2,5-1 skleněného fermentoru, sterilizovány v autoklávu při 120 °C po 20 min, ochlazeny a inokulovány s očkovací kulturou Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335), která byla kultivována 4 dny v živném kultivačním mediu, obsahujícím D-lyxózu jako zdroj uhlíku, která pak byla kultivována při 0 °C po 14 hodin za podmínek provzdušňování-míchání. Kultivační médium bylo odstředěno za získání buněk ve výtěžku asi 15 g vlhkých buněk najeden litr kultivačního média. Vlhké buňky byly běžným způsobem rozrušeny s práškem hliníku, smíseny s 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5) k extraktu požadovaného enzymu a odstřeďovány pro získání 200-ml supernatantů jako roztoku surového enzymu, majícího celkovou enzymovou aktivitu 2870 jednotek a specifickou aktivitu 1,73 jednotek/mg proteinu.

Pokus 2

Čištění L-ribóza izomerázy

Pokus 2-1

Polyethylenglykolová frakcionace

Surový enzymový roztok z pokusu 1 byl zmrazen na ledu, smísen s 0,01 M chloridu manganatého a ponechán stát 30 min pak odstřeďován pro odstranění nerozpustných složek. K výslednému supernatantů byl přidán polyethylenglykolový prášek na konečnou koncentraci 15 hmotn./obj. % a rozpuštěn v něm za míchání s následujícím odstředěním směsi pro odstranění vytvořených nerozpustných látek. Výsledný supernatant byl smísen s polyethylenglykolem na konečnou koncentraci 25 hmotn./obj. % a tento v něm byl rozpuštěn za míchání a odstředěním byly shromážděny nerozpustné složky.

Pokus 2-2

Iontovýměnná chromatografie

Sedimenty z pokusu 2-1 byly rozpuštěny v 0,05 M Tris-HCl pufru (pH 7,5) a zbylé nerozpustné složky byly odstraněny odstředěním za získání 13-ml supernatantů, který byl pak nanesen na kolonu naplněnou „DEAE-TOYOPEARL^r 650M“, slabě alkalickým aniontoměničem dostupným od Tosoh Corporation, Tokyo, Japonsko, k absorbování požadovaného enzymu, s následující eluci enzymu z kolony s lineárním gradientem roztoku chloridu draselného, který se zvyšuje z 0 M na 0,5 M a byly shromážděny frakce s aktivitou L-ribóza izomerázy.

-6CZ 295994 B6

Pokus 2-3

Gelová filtrační chromatografie

Frakce s aktivitou L-ribóza izomerázy v pokusu 2-2 byly zahuštěny a koncentrát byl nanesen na kolonu naplněnou „SEPHADEX^R-em G-150“, perličkovitým dextranovým gelem dostupným od Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Švédsko, a eluován s 0,05 M Tris-HCl pufřem (pH 7,5) pro získání frakcí s aktivitou L-ribóza izomerázy. Tabulka 1 uvádí množství proteinu, enzymovou aktivitu, výtěžek enzymu a stupeň čištění enzymu v každém stupni čištění.

Tabulka 1

Stupeň čištění	protein (mg)	enzymová aktivita (jednotka)	výtěžek (%)	stupeň čištění
surový enzym	1660	2870	100	1,0
PEG frakce	450	2570	90	3,3
DEAE- TOYOPEARL^r	79,8	1180	41	8,6
SEPHADEX^r	32,9	796	28	14

Kontrola čistoty polyakrylamidovou gelovou diskovou elektroforézou pro finálně čištěný enzym, získaný jako eluát z gelové filtrace za použití „SEPHADEX^R-u G-150“ v tabulce 1, potvrzuje, že enzym byl vyčištěn až do jediného proteinového pruhu, což znamená, že enzym byl elektroforeticky vysoce vyčištěný enzym.

Pokus 3

Vlastnost L-ribóza izomerázy

Použitím čištěné L-ribóza izomerázy, získané způsobem podle pokusu 2, byly studovány fyzikálně-chemické vlastnosti.

Pokus 3-1

Působení

Jestliže se působí na L-ribózu nebo L-ribulózu v souladu s metodou pro hodnocení aktivity předložené L-ribóza izomerázy, vytváří čištěná L-ribóza izomeráza L-ribulózu z L-ribózy a více versa. Enzymatické reakce je reverzibilní rovnovážná reakce.

Pokus 3-2

Substrátová specifita

V souladu s metodou pro hodnocení aktivity předložené L-ribóza izomerázy, byla studována aktivita čištěné L-ribóza izomerázy pro aldózy jako substráty. Tabulka 2 ukazuje relativní aktivity enzymu pro aldózy, jestliže relativní aktivita enzymu pro L-ribózu byla hodnocena jako 100.

Tabulka 2

Substrát

L-ribóza D-lyxóza D-talóza D-mannóza L-allóza L-gulóza relativní aktivita (%)

100

Jak je zřejmé z výsledků v tabulce 2, L-ribóza izomeráza vykazuje nejvyšší aktivitu na L-ribóze. L-ribóza izomeráza působí na jiné aldózy jako je L-lyxóza, D-talóza, D-mannóza, L-allóza a L-gulóza. Tyto enzymatické reakce byly reverzibilní reakce a enzym také působí na L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu jako substráty, odpovídající výše uvedeným aldózám. Tabulka 3 uvádí data ketóz a aldóz získaných z výše uvedených substrátů, které byly potvrzeny iontovýměnnou chromatografíí, vysoce účinnou kapalinovou chromatografíí, chromatografíí na tenké vrstvě atd.

Tabulka 3

Materiál

L-ribóza D-lyxóza D-talóza D-mannóza L-allóza L-gulóza L-ribulóza D-xylulóza D-tagatóza D-fruktóza L-psikóza L-sorbóza produkt

L-ribulóza D-xylulóza D-tagatóza D-fruktóza L-psikóza L-sorbóza L-ribóza D-lyxóza D-talóza D-mannóza L-allóza L-gulóza

Jak je zřejmé z výsledků v tabulce 3 předložená L-ribóza izomeráza působí tak, že konvertuje aldózy na jejich odpovídající ketózy a více versa. Tyto enzymatické konverzní reakce se podílejí na běžném průběhu enzymatické reakce.

-8CZ 295994 B6

Chemický vzorec 1;

c t	H 0	C	H₂ 0 H
1 H 0 C	H ->	1 c	0
1	<-	1
H 0 C \|	H	H 0 C t	H
1 c	H₂ O H	1 c	Hz O H
ribosa		Ir	ribulosa

Enzymatická reakce předložené L-ribóza izomerázy je reverzibilní reakce. Obr. 4 představuje výsledky kvantitativního vztahu reverzibilních rovnovážných reakcí mezi aldózami a ketózami za podmínek použitých pro studování aktivity předložené L-ribóza izomerázy.

Tabulka 4

L-ribóza : L-ribulóza D-lyxóza: D-xylulóza D-talóza: D-tagatóza D-mannóza : D-fruktóza L-allóza: L-psikóza L-gulóza: L-sorbóza : 30

70:30 : 88 : 70

40:60 :75

Km, Michaelisova konstanta, předložené L-ribóza izomerázy k L-ribóze byla 44 M.

Pokus 3-3

Molekulová hmotnost (1) Asi 25 000-35 000 daltonů podle polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE);

(2) Asi 110 000-130 000 daltonů podle gelové filtrační metody;

Molekulová hmotnost podle gelové filtrace, asi 4krát vyšší než podle SDS-PAGE indikuje, že přítomná L-ribóza izomeráza existuje jako tetramer.

Pokus 3-4

Izoelektrický bod (pl)

Předložená L-ribóza izomeráza má pl asi 4,0 až 5,5 podle izoelektroforézy za použití agarózových ploten.

-9CZ 295994 B6

Pokus 3-5

Inhibice aktivity

Aktivita předložené L-ribóza izomerázy je slabě inhibována L-arabitolem a ribitolem.

Pokus 3-6

Optimum teploty

Optimum teploty předložené L-ribóza izomerázy bylo studováno metodou pro hodnocení aktivity předložené L-ribóza izomerázy. Jak je uvedeno na obr. 1 bylo optimum teploty asi 30 °C při inkubaci při pH 9,0 po 10 min.

Pokus 3-7

Optimum pH

Optimum pH předložené L-ribóza izomerázy bylo studováno v souladu s metodou hodnocení aktivity předložené L-ribóza izomerázy. Jak je uvedeno na obr. 2 optimum pH bylo asi 8 až 9 při inkubaci při 30 °C po 10 min. Obr. 2 ukazuje výsledky pokusu za použití citrátového pufru, Veronal pufru a pufru glycin-hydroxid sodný, které jsou odpovídajícím způsobem označeny symboly „O“, „·“ a „A“.

Pokus 3-8

Tepelná stabilita

Tepelná stabilita předložené L-ribóza izomerázy byla studována v souladu s metodou hodnocení aktivity předložené L-ribóza izomerázy. Jak je uvedeno na obr. 3 byla L-ribóza izomeráza stabilní až do teploty asi 30 °C při inkubaci při pH 9,0 po 10 min.

Pokus 3-9 pH stabilita pH stabilita předložené L-ribóza izomerázy byla studována v souladu s metodou hodnocení Lribóza izomerázy. Jak je uvedeno na obr. 4, izomeráza byla stabilní při pH asi 7 až 9 při inkubaci při 4 °C po 24 hodiny. Obr. 4 uvádí výsledky pokusu za použití citrátového pufru, fosfátového pufru, Tris-HCl pufru a pufru glycin-hydroxid sodný, které jsou odpovídajícím způsobem označeny,^“, „·“ „A“ a „A“.

Na základě těchto hodnot jsou optimum pH a pH stability předložené L-ribóza izomerázy v podstatě stejné, což znamená, že izomeráza má výhodu při použití při výrobě v průmyslovém měřítku.

-10CZ 295994 B6

Pokus 3-10

N-Terminální aminokyselinová sekvence

Čištěný enzymový přípravek získaný, metodou podle pokusu 2-3 byl dialyzován proti destilované vodě a asi 80 pg enzymu vzhledem k obsahu proteinu bylo použito jako vzorek pro analýzu Nterminální aminokyselinové sekvence. „PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A“, proteinový sekvenátor dostupný od Applied Biosystems lne., Foster City, USA, stanovuje aminokyselinovou sekvenci až do pátého aminokyselinového zbytku od N-konce, kterou je SEQ ID NO:1. Podrobnější analýza výše uvedeného vzorku odhaluje, že enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 jako N-terminální parciální aminokyselinovou sekvenci.

Následují preferované příklady podle předloženého vynálezu.

Příklad 1

Produkce ketóz z aldóz

Použitím čištěné L-ribóza izomerázy získané způsobem podle pokusu 2, byly produkovány ketózy z aldóz. L-Ribóza, D-lyxóza, D-talóza, D-mannóza, L-allóza a L-gulóza byly použity jako aldózy. Při udržování 10 ml 0,05 M aldózového roztoku na pH 9, bylo k aldózovému roztoku přidáno 50 jednotek čištěné L-ribóza izomerázy s následující inkubací při 30 °C po 10 hodin. Reakční směs byla zpracována s aktivním uhlím a podrobena deionizaci a frakcionaci sloupcovou chromatografií za použití katexu v Ca²⁺-formě. Výsledné frakce, obsahující požadovaný produkt byly zahuštěny ve vakuu za získání čištěného produktu. Analýza vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií a chromatografií na tenké vrstvě potvrzuje, že vztah mezi aldózami jako materiály a ketózami jako produkty byl v podstatě stejný jako v tabulce 3.

Příklad 2

Produkce aldóz z ketóz

Za použití čištěné L-ribóza izomerázy získané metodou podle pokusu 2 byly produkovány aldózy z ketóz. Jako ketony byly použity L-ribulóza, D-xylulóza, D-tagatóza, D-fruktóza, L-psikóza a L-sorbóza. Při udržování 10 ml 0,05 M ketózového roztoku na pH 9, bylo ke ketózovému roztoku přidáno 50 jednotek čištěné L-ribóza izomerázy s následující inkubací při 30 °C po 10 hodin. Reakční směs byla zpracována s aktivním uhlím a podrobena deionizaci a frakcionaci sloupcovou chromatografií za použití katexu v Na⁺-formě. Výsledné frakce, obsahující požadovaný produkt byly zahuštěny ve vakuu za získání čištěného produktu. Analýza vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií a chromatografií na tenké vrstvě potvrzuje, že vztah mezi ketózami jako materiály a aldózami jako produkty byl v podstatě stejný jako v tabulce 3.

Příklad 3

Produkce L-ribózy

V souladu s metodou podle příkladu 2 bylo 10 jednotek čištěné L-ribóza izomerázy přidáno do 25 ml 0,1 M L-ribulózy s následující inkubací při 30 °C po 15 hodin pro konverzi L-ribulózy na L-ribózu. Reakční směs byla běžným způsobem odbarvena aktivním uhlím, odsolena a čištěna ionexy v H- a CO₂-formě a frakcionována sloupcovou chromatografií za použití aniontoměniče v bisulfítové formě zahřátého na 40 °C za získání čištěné L-ribózy. Výtěžek čištěné L-ribózy k materiálu L-ribulóze byl asi 60 % vyjádřeno na suchých pevných látkách jako základu (dry

-11 CZ 295994 B6 solid basis - d.s.b.). Získaný produkt může být libovolně použit v potravinářských produktech, kosmetice, farmaceutikách a jejich materiálech jako jsou sladidla, činidlo, zlepšující kvalitu, humektant a činidlo, inhibující replikaci nukleových kyselin.

Příklad 4

Produkce D-talózy

V souladu s metodou podle příkladu 2 bylo 10 jednotek čištěné L-ribóza izomerázy přidáno do 50 ml 0,1 M D-tagatózy s následující inkubací při 30 °C po 20 hodin pro konverzi D-tagatózy na D-talózu. Reakční směs byla běžným způsobem odbarvena aktivním uhlím, odsolena a čištěna ionexy v H- a CO₂-formě a frakcionována sloupcovou chromatografíí za použití aniontoměniče v Ca²⁺- formě s následujícím zahuštěním frakcí, obsahujících požadovaný produkt pro získání D-talózového krystalu. Výtěžek získané D-talózy k materiálu D-tagatóze byl asi 10 % d.s.b.. Získaný produkt může být libovolně použit v potravinářských produktech, kosmetice, farmaceutikách a jejich materiálech jako jsou sladidla, činidlo, zlepšující kvalitu a humektant.

Příklad 5

Produkce L-ribózy z ribitolu

Stomililitrové podíly živného kultivačního média, obsahujícího 2 hmotn./obj. % trypton sójové půdy, jedno hmotn./obj. % glycerolu a deionizovanou vodu, byly distribuovány do deseti 500-ml třepacích nádob, s následujícím autoklávováním nádob při 120 °C po 20 min. Potom byly baňky ochlazeny a inokulovány s očkovací kulturou Gluconobacter frateurii (IFO 3254) za použití platinové smyčky, s následující inkubací při 30 °C po 2 dny za třepání. Po skončení kultivace byly buňky shromážděny odstředěním a asi 10 g vlhkých živých buněk bylo smíseno se 100 ml 0,05 M Tris-HCl pufru (pH 7,0), obsahujícího 5 hmotn./obj. % ribitolu. Směsný roztok v objemu 100 ml byl umístěn do 500-ml třepací nádoby a inkubován při 30 °C 20 hodin za třepání pro konverzi ribitolu na L-ribulózu. Potom byla kultura odstředěna pro odstranění buněk, a výsledný supernatant byl běžným způsobem odbarven s aktivním uhlím, odsolen s „DIAION SK1B (Hforma)“ a „DIAION WA30 (OH-forma)“, oba jsou kationtoměniče od Mitsubishi Chemical Corporation, Tokyo, Japonsko, a zahuštěn ve vakuu za získání transparentního sirupu s koncentrací asi 60 hmotn./obj. %. Sirup byl frakcionován sloupcovou chromatografíí za použití „DOWEX 50W-X4“, kationtoměniče v Ca²⁺-formě od The Doe Chemical Co., Midland, Michigan, USA, za získání frakcí s vysokým obsahem L-ribulózy, které pak byly zahuštěny na asi 70 hmotn./obj. % sirup. Vysoceúčinná kapalinově chromatografícká (HPLC) analýza za použitíkolony 8 x 300 mm plněné s „MCIGEL CK-08EC“, gel v Ca²⁺-formě dostupný od Mitsubishi Chemical Corporation, Tokyo, Japonsko, zjišťuje, že produkt obsahuje alespoň 97 hmotn./hmotn. % L-ribulózy, d.s.b. Výtěžek L-ribulózy k materiálu ribitolu byl asi 90 % d.s.b.

Za použití získané L-ribulózy byla připravena L-ribóza následovně: Podle metody z pokusu 1 bylo získáno asi 50 g vlhkých buněk odstředěním kultury mikroorganismů a zpracováno s toluenem. Výsledné buňky byly hněteny se 100 ml 2,5 hmotn./obj. % alginátů sodného. Suspenze, obsahující buňky byla nakapána do 0,1 M CaCl₂ roztoku, který byl míchán magnetickým míchadlem za tvorby gelů s průměrem asi 2 mm. Gely byly filtrovány za získám imobilizovaného enzymu s aktivitou L-ribóza izomerázy asi 5000 jednotek. L-Ribulózový sirup získaný výše uvedenou metodou byl zředěn vodou na asi 1,0 M roztok, který byl pak smísen s asi 50 jednotkami/g L-ribulózy imobilizovaného enzymu a následně ponechán reagovat při pH 8,5 a 10 °C 15 hodin pro konverzi L-ribulózy na L-ribózu. Imobilizovaný enzym byl odstraněn filtrací a filtrát byl podobně jako v příkladu 3 odbarven, odsolen a frakcionován sloupcovou chromatografíí za získání frakcí s vysokým obsahem L-ribózy při odstranění frakcí s vysokým obsahem L-ribulózy. Frakce s vysokým obsahem L-ribózy byly spojeny, zahuštěny, krystalizovány přídavkem očko

- 12CZ 295994 B6 vacího krystalu za míchání a separovány pro získání frakcí s vysokým obsahem L-ribózy za odstranění frakcí s vysokým obsahem L-ribulózy. Frakce s vysokým obsahem L-ribózy byly spojeny, zahuštěny, smíseny s očkovacím krystalem pro krystalizaci L-ribózy za míchání s následujícím dělením směsi za získání pevného produktu, obsahujícího L-ribózový krystal. HPLC analýza jak je popsána v příkladu 5 zjišťuje, že čistota produktu byla asi 98 hmotn./hmotn. % a výtěžek L-ribózového krystalu k materiálu L-ribulóze byl asi 20 %, d.s.b. Krystal může být libovolně použit v potravinářských produktech, kosmetice, farmaceutikách a jejich materiálech jako jsou sladidla, činidlo, zlepšující kvalitu, humektant a činidlo, inhibující replikaci nukleových kyselin. Znovu získaný imobilizovaný enzym může být opakovaně použit v předložené konverzní reakci. Navíc frakce s vysokým obsahem L-ribulózy, které byly frakcionovány a odstraněny z reakčních směsí, mohou být výhodně recyklovány jako materiál pro L-ribózu pro zvýšení výtěžku L-ribózového krystalu.

Příklad 6

Produkce L-ribózy z ribitolu

Stomililitrové podíly živného kultivačního média, obsahujícího 2 hmotn./obj. % trypton sójové půdy, jedno hmotn ,/obj. % glycerolu a vodu, byly distribuovány do dvou 500-1 třepacích nádob s následujícím autoklávováním nádob při 120 °C po 20 min. Potom byly nádoby ochlazeny a inokulovány výsevem Acetobacter aceti (IFO 3281) za použití platinové kličky s následující inkubací při 30 °C po 2 dny za třepání, za získání očkovací kultury. 16,8 1 živného kultivačního média, obsahujícího 1,1 hmotn./obj. % polypeptonu, 0,2 hmotn./obj. % „HINUTE SMP“, peptidového roztoku jedlých sójových bobů, dostupného od Fuji Oil Co., Ltd., Tokyo, Japonsko, 1,68 hmotn./obj. % dihydrogenuhličitanu draselného, jedno hmotn./obj. % glycerinu a vodu, bylo umístěno do 301itrového skleněného fermentoru, autoklávováno při 120 °C 20 minut, ochlazeno na 30 °C a pH upraveno na 7,2 přídavkem vodného roztoku hydroxidu sodného. Živné kultivační médium bylo inokulováno s jedním hmotn./obj. % výše uvedené očkovací kultury a inkubováno při 30 °C 22 hodin za podmínek provzdušňování-míchání, potom smíseno se 3,2 1 vodného roztoku ribitolu, obsahujícího 2 kg ribitolu, který byl autoklávován na 120 °C 20 min a míchán 27 hodin za podmínek provzdušňování-míchání pro konvertování ribitolu na L-ribulózu. Reakční směs byla membránově filtrována za získání filtrátu. HPLC analýza jak popsána v příkladu 5 zjišťuje, že filtrát obsahuje alespoň 97 hmotn./hmotn. % L-ribulózy, d.s.b.

Za použití získané L-ribulózy byla L-ribóza připravena následovně: Očka Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335) byla inokulována do a inkubována v živném kultivačním médiu, obsahujícím D-lyxózu jako zdroj uhlíku, při 30 °C po 4 dny za třepání. Část kultury byla pak inokulována do a inkubována v čerstvě připraveném stejném živném kultivačním médiu po 2 dny a tento kultivační stupeň byl 5krát opakován. Po ukončení těchto postupných kultur, byla část finální kultury inkubována na povrchu živných agarových ploten, obsahujících D-lyxózu jako zdroj uhlíku a kultivována za vzniku homogenních kolonií. Jedna z těchto kolonií jako očko byla inokulována do živného kultivačního média, obsahujícího 0,5 hmotn./obj. % kvasničného extraktu, 0,5 hmotn./obj. % polypeptonu, 0,5 hmotn./obj. % soli a vodu, které bylo autoklávováno při 120 °C po 20 min a kultivováno při 30 °C za třepání za získání očkovací kultury. Patnáct litrů čerstvě připraveného stejného živného kultivačního média jak bylo použito ve výše uvedené očkovací kultuře, bylo umístěno do 30-litrového skleněného fermentoru, autoklávováno při 120 °C 20 min, ochlazeno na 30 °C, inokulováno s jedním obj./obj. % očkovací kultury a kultivováno při 30 °C 20 hodin za podmínek provzdušňování-míchání. Potom byla kultura odstředěna pro získání vlhkých buněk a asi 50 g těchto buněk bylo zpracováno s toluenem, smíseno s 50 mM glycinového pufru (pH 9,0) v objemu jeden ml na g vlhkých buněk pro získání 110 ml enzymového roztoku, obsahujícího 128 jednotek/ml L-ribóza izomerázy. Výše uvedený filtrát, obsahující L-ribulózu získanou výše uvedenou metodou byl upraven na pH 9,0 přídavkem vodného roztoku hydroxidu sodného, smísen s chloridem manganatým pro získání konečné koncentrace

-13 CZ 295994 B6

0,5 mM, smísen s enzymovým roztokem s asi 5 jednotkami/g L-ribulózy a inkubován při 30 °C po 24 hodin pro převedení asi 70 % L-ribulózy na L-ribózu.

Takto získaná reakční směs byla filtrována ultrafiltrem, odsolena a zahuštěna ve vakuu za získání 1,77 kg asi 85 hmotn./hmotn. % sirupu. K sirupu byl přidán ethanol pro krystalizaci L-ribózy a krystal byl oddělen, promyt, sušen ve vakuu a práškován za získání asi 600 g vysoce čistého L-ribózového krystalu. HPLC analýza jak popsána v příkladu 5 potvrzuje, že čistota L-ribózového krystalu byla asi 99,9 hmotn./hmotn. % d.s.b. Výtěžek L-ribózového krystalu k materiálu ribitolu byl asi 30 %. „GEIGERFLEX RAD-IIB“, analyzátor difrakce rentgenových paprsků za použití CuKa paprsků dostupný od Rigaku Corporation, Tokyo, Japonsko, zjišťuje, že L-ribózový krystal měl difrakční úhly (20) 16,3°, 20,1°, 21,3°, 21,4° a 33,0°. L-Ribózový krystal může být libovolně použit v potravinářských produktech, kosmetice, farmaceutikách a jejich materiálech jako jsou sladidla, činidlo, zlepšující kvalitu, humektant a činidlo, inhibující replikaci nukleových kyselin.

Jak je z výše uvedeného zřejmé, předložená L-ribóza izomeráza působí na L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu tak, že je konvertuje nebo izomeruje na jejich odpovídající L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu. Enzymatická rekce je reverzibilní rovnovážná reakce. L-ribóza izomeráza tak může být použita v izomeračních konverzních reakcích mezi aldózami a ketózami. L-ribóza izomeráza by nemusela být ponechána působit na své substráty poté, co byla čištěna na relativně vysokou hladinu a surové přípravky L-ribóza izomerázy mohou být libovolně používány pro průmyslovou výrobu vzácných sacharidů. Předložený vynález umožňuje snadnou produkci vzácných sacharidů, které nebyly snadno dostupné a výrazně ovlivní oblast potravinářského, kosmetického, farmaceutického a chemického průmyslu. Proto má předložený vynález nezměrný průmyslový význam.

I když byl předložený vynález popsán pomocí preferovaných provedení vynálezu je třeba chápat, zeje možno s ním provádět různé variace, a pokud jsou kryty předloženými nároky, spadají takové modifikace do myšlenky a rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. L-Ribóza izomeráza, která izomeruje L-ribózu na L-ribulózu a naopak, a která je vyrobitelná z mikroorganismu rodu Acinetobacter.
2. L-ribóza izomeráza podle nároku 1, která je vyrobitelná z mikroorganismu vybraného ze souboru zahrnujícího Acinetobacter calcoaceticus LR7C FERM BP-5335 a jeho mutanty.
3. L-ribóza izomeráza podle nároku 1, mající tyto íyzikálně-chemické vlastnosti:

(1) molekulová hmotnost asi 25 000 až 35 000 podle elektroforézy na sodném sulfátovém polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a asi 110 000 až 130 000 podle metody gelové filtrace, (2) optimum teploty asi 30 °C při inkubaci při pH 9 po 10 min,

-14CZ 295994 B6 (3) optimum pH pH 8 až 9 při inkubaci při 30 °C po dobu 10 min, (4) tepelná stabilita stabilní až do teploty asi 30 °C při inkubaci při pH 9 po 10 min a (5) pH stabilita stabilní při pH 7 až 9 při inkubaci při 4 °C po dobu 24 hodin.
4. L-ribóza izomeráza podle nároku 1, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQID NO: 1,

SEQ ID NO: 1:

Thr Arg Thr Ser Ile.
5. Způsob produkce L-ribózaizomerázy podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci v živném kultivačním médiu mikroorganismu rodu Acinetobacter za vzniku L-ribóza izomerázy a izolaci produkované L-ribóza izomerázy z kultury.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus je mikroorganismus vybraný ze souboru zahrnujícího Acinetobacter calcoaceticus LR7C FERM BP-5335 a jeho mutanty.
7. Mikroorganismus rodu Acinetobacter, který produkuje L-ribózu izomerázu podle nároku 1.
8. Mikroorganismus rodu Acinetobacter podle nároku 7, který je zpracován s toluenem nebo imobilizován.
9. Mikroorganismus podle nároku 7 nebo 8, který je vybrán ze souboru zahrnujícího Acinetobacter calcoaceticus LR7C FERM BP-5335 a jeho mutanty.
10. Způsob produkce ketózy vybrané ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu, vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení do styku L-ribóza izomerázy podle nároku 1 nebo mikroorganismu podle nároku 7, 8 nebo 9 s aldózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu za vzniku jedné z uvedených ketóz, která odpovídá uvedeným ketózám a izolaci produkované ketózy.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že stupněm izolace jej edna nebo více technik vybraných ze souboru zahrnujícího filtraci, odstřeďování, odbarvování, odsolování, zahuštění, sušení, sloupcovou chromatografíi, krystalizaci a separaci.
12. Způsob podle nároku 11, vy zn ač u j í c í se tim , že sloupcová chromatografíe používá iontoměničovou pryskyřici.
13. Způsob produkce aldózy vybrané ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu, vyznačující se tí m , že zahrnuje uvedení do styku L-ribóza izomerázy podle nároku 1 nebo mikroorganismu podle nároku 7, 8 nebo 9 s ketózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu za vzniku jedné z uvedených aldóz, která odpovídá uvedeným ketózám, a izolaci produkované aldózy.

-15CZ 295994 B6
14. Způsob podle nároku 13, v y z n a č uj í c í se t í m , že stupněm izolace je jedna nebo více technik vybraných ze souboru zahrnujícího filtraci, odstřeďování, odbarvování, odsolování, zahuštění, sušení, sloupcovou chromatografii, krystalizaci a separaci.
15. Způsob podle nároku 14, vy zn a č u j í ci se t í m , že sloupcová chromatografie používá iontoměničovou pryskyřici.
16. Způsob konverze mezi aldózami a ketózami, vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení do styku L-ribóza izomerázy podle nároku 1 buď s aldózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu pro izomeraci uvedené aldózy na její odpovídající ketózu vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, Dtagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu, nebo s ketózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu pro izomerizaci uvedené ketózy na její odpovídající aldózu vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu.
17. Způsob produkce aldózy vybrané ze souboru zahrnujícího L-ribózu, D-lyxózu, D-talózu, D-mannózu, L-allózu a L-gulózu, vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení do styku (i) L-ribóza izomerázy podle nároku 1 nebo (ii) mikroorganismu rodu Acinetobacter schopného produkce L-ribóza izomerázy podle nároku 1, který je zpracován s toluenem nebo imobilizován, s ketózou vybranou ze souboru zahrnujícího L-ribulózu, D-xylulózu, D-tagatózu, D-fruktózu, L-psikózu a L-sorbózu za vzniku jedné z uvedených aldóz, která odpovídá uvedeným ketózám, krystalizaci produkované aldózy a izolaci krystalické aldózy.