CZ294217B6

CZ294217B6 - Nová oxabispidinová sloučenina vhodná pro léčení srdeční arytmie

Info

Publication number: CZ294217B6
Application number: CZ2003923A
Authority: CZ
Inventors: Björsneámagnus; Cladingboeládavid; Ponténáfritiof; Strandlundágert
Original assignee: Astrazenecaáab
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2004-10-13
Also published as: US20090240051A1; IL154803A; EP1900741A8; MXPA03002679A; HUP0302288A2; WO2002028863A1; CA2421776A1; RU2003107668A; PL364047A1; EP1900741A1; AU2001292504B2; AU9250401A; KR100812920B1; BR0114366A; NO20031414D0; WO2002028863A8; ZA200301757B; NO20031413L; NO20031414L; AU2001292503A1

Abstract

Benzensulfonát @}{[@}@Ź@dimethyl@oxobutylB@oxa@Ź@diazabicyklo[@�]non@yl]propyl}aminoBbenzonitriluŹ který je vhodný pro použití při prevenci a léčbě srdečních arytmiíŹ zejména atriální arytmie a ventrikulární arytmieŕ

Description

Předmětný vynález se týká nové farmaceuticky užitečné sloučeniny, konkrétně sloučeniny, která je vhodná pro léčení srdečních arytmií.

Dosavadní stav techniky

Srdeční arytmie je možné definovat jako abnormality v rychlosti, pravidelnosti nebo místě původu srdečního impulzu nebo jako poruchy přenosu nervových impulzů skrz srdce, které způsobují abnormální aktivační sekvenci. Klinicky je možné srdeční arytmie klasifikovat podle předpokládaného místa původu (tzn. že je možné hovořit o supraventrikulámích, včetně atriálních a atrioventrikulámích, srdečních arytmiích a ventrikulámích srdečních arytmiích) a/nebo podle rychlosti (tzn. že je možné hovořit o bradyarytmiích (zpomalená činnost srdce) a tachyarytmiích (zrychlená činnost srdce).

Negativní výsledky klinických studií při léčení srdečních arytmií (viz například výsledky studie Cardiac Arrytmia Suppression Trial (CAST), uveřejněné v časopise New England Journal ofMedicine, 1989, 321, 406), „tradičními“ léčivy proti srdečním arytmiím, jejichž účinek je primárně založen na zpomalení rychlosti přenosu nervových impulzů (tato léčiva se označují také jako antiarytmika I. třídy), vedly ke vzniku poptávky po vývoji nových léčiv na bázi sloučenin, které selektivně zpožďují srdeční repolarizaci, čímž dochází k prodloužení WT intervalu. Antiarytmika ΠΙ. třídy je možné definovat jako léčiva, která prodlužují trvání transmembránového aktivačního potenciálu (kteiý může být vyvolán zablokováním výstupních K⁺ proudů nebo zvýšeným přívodem iontových proudů) a odolnost proti onemocnění, aniž by došlo k ovlivnění přenosu nervových impulzů skrz srdce.

Jednou z klíčových nevýhod doposud známých léčiv, jejichž účinek je založen na zpoždění repolarizace (antiarytmika III. třídy nebo jiná antiarytmika), je známý fakt, že vykazují unikátní formu proarytmogenního efektu známého jako torsades de pointes (obrácení bodů), které může mít v některých případech fatální následky. Z hlediska bezpečnosti je minimalizace výskytu tohoto jevu (jehož výskyt byl prokázán i po podání jiných než činnost srdce ovlivňujících léčiv, jako jsou fenothiaziny, tricyklická antidepresiva, antihistammy a antibiotika) klíčovým problémem, který je třeba vyřešit za účelem získání účinných antiarytmik.

Antiarytmika na bázi bispidinu (tj. na bázi 3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonanů), jsou mimo jiné známé ze zveřejněných mezinárodních přihlášek číslo WO 91/07405, WO 99/31100, WO 00/76997, WO 00/76998, WO 00/76999 a WO 00/77000, z evropských patentových přihlášek číslo EP 306 871, EP 308 843, EP 655 228 a z patentů Spojených států amerických číslo US 3 962 449, US 4 556 662, US 4 550 112, US 4 459 301 a US 5 468 858 a z článků v odborných časopisech, jako je mimo jiné publikace J Med. Chem., 1996, 39, 2559, Pharmacol., Res., 1991, 24, 149, Circulation, 1994, 90, 2032 a Anal. Sci., 1993, 9, 429. V žádném z těchto dokumentů však nejsou opsány ani navrženy oxabispidinové sloučeniny.

Některé oxabispidinové sloučeniny jsou jakožto chemické kuriozity popsané v publikaci Chem. Ber., 1963, 96, 2827. To, že by tyto sloučeniny mohly být použity při léčení srdeční arytmie však v této publikaci není ani zmíněno ani zavrženo.

Nyní bylo zcela neočekávatelně zjištěno, že některé sloučeniny na bázi oxabispidinů vykazují elektrofyziologický účinek, výhodně elektrofyziologický účinek ΙΠ. třídy, a proto je tedy možné předpokládat, že budou vhodné pro léčení srdeční arytmie.

-1 CZ 294217 B6

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je benzensulfonát 4-({3-[7-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7diazabicyko [3.3.1 ]non-3-yl] propyl} amino)benzonitrilu

Ve výhodném provedení se sloučenina A připravuje ve formě monohydrátu.

Způsob přípravy

Předmětem tohoto vynálezu je i způsob přípravy sloučenina A, který zahrnuje (a) reakci kyseliny benzensulfonové a 4-({3-[7-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazacyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitrilem (tj. se sloučeninou A ve formě volné báze), přičemž tato reakce probíhá například při teplotě blízké teplotě místnosti a v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla (jako je například izopropylacetát), nebo se tato reakce provádí přidáním vodného roztoku uvedené kyseliny k ethanolickému roztoku uvedené volné báze;

(b) reakci 3-(4-kyanoanilino)propylbenzensulfonátu

s 3,3-dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanonem

přičemž tato reakce probíhá při teplotě místnosti nebo při teplotě vyšší, než je teplota místnosti, jako je teplota v rozmezí od teploty místnosti do teploty varu použitého rozpouštědla (například při teplotě od 10 °C do 100 °C) v přítomnosti vhodného systému rozpouštědel (jako je například Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), N-methylpyrrolidinon nebo acetonitril), nebo, výhodně, v přítomnosti hydroxylového rozpouštědla, jako je nižší alkylalkohol (například alkohol obsahující od 1 do 4 atomů uhlíku, jako je ethanol) a/nebo v přítomnosti vody.

4-({3-[7-(3,3-Dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitril je možné připravit:

(i) reakcí sloučeniny obecného vzorce (I)

kde

L¹ představuje odstupující skupinu, jako je atom halogenu, alkansulfonátová skupina (např. mesylátová skupina), perfluoralkansulfonátová skupina nebo arensulfonátová skupina (např. 2- nebo 4-nitrobenzensulfonátová skupina nebo, výhodně, toluensulfonátová skupina), s 3,3-dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanonem, přičemž tato reakce probíhá například při zvýšené teplotě (jako je například teplota v rozmezí od 35 °C do teploty varu), případně v přítomnosti vhodné báze (jako je například triethylamin nebo uhličitan draselný) a v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla (jako je například acetonitril, dichlormethan, chloroform, dimethylsulfoxid, Ν,Ν-dimeethylformamid, nižší alkylalkohol (např. ethanol), izopropylacetát nebo směsi těchto rozpouštědel) a po této reakci následuje zpracování reakční směsi za účelem odstranění případných protiiontů, a to za odpovídajících reakčních podmínek; nebo (ii) reakcí 4-{[3-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)propyl]amino}benzonitrilu

Q

NC se sloučeninou obecného vzorce Π (II)

-3CZ 294217 B6 kde

L² představuje odstupující skupinu, jako je atom halogenu (zejména atom chloru), alkansulfonátová skupina, perfluoralkansulfonátová skupina, arensulfonátová skupina, imidazolová skupina nebo skupina R²³O- kde

R²³ představuje například alkylovou skupinu obsahující od 1 do 10 atomů uhlíku nebo arylovou skupinu, přičemž tyto skupiny mohou být případně substituované jednou nebo více nitroskupinami), přičemž tato reakce probíhá například při teplotě v rozmezí od teploty místnosti do teploty varu v přítomnosti vhodné báze (jako je například triethylamin, uhličitan draselný nebo hydrogenuhličitan, jako je hydrogenuhličitan sodný) a v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla (jako je například dichlormethan, chloroform, acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid, tetrahydfuran, toluen, voda, nižší alkylalkohol (např. ethanol) nebo směsi těchto rozpouštědel).

3,3-Dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanon může být připraven reakcí 9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1 jnonanu

nebo monochráněného (například jednou benzylovou skupinou) derivátu této sloučeniny se sloučeninou shora definovaného obecného vzorce II, a to například za podobných podmínek, které byly popsány výše v souvislosti s přípravou 4-({3-[7-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitrilu (postup ii), s následným (v případě potřeby) odchráněním vzniklého meziproduktu, jež probíhá za standardních podmínek.

4-{[3-(9-Oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)propyl]amino}benzonitril je možné připravit reakcí sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce (I) s 9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1Jnonanem nebo sjeho monochráněným (např. jednou terc.butoxykarbonylovou skupinou) derivátem, přičemž tato reakce probíhá například za podobných podmínek jako výše popsaná reakce (postup i), při níž vzniká 4-({3-[7-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitril a/nebo sloučenina A, a po uvedené reakci (v případě potřeby) následuje odchránění vzniklého meziproduktu, jež probíhá za standardních podmínek.

Příprava sloučenin obecných vzorců I a Π, 3-(4-kyanoanilino)propylbenzensulfonátu a 9-oxa3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonanu (a jeho chráněných derivátů) je popsána níže.

Sloučenina A a výše popsané meziprodukty je možné izolovat z reakčních směsí pomocí obvyklých metod. Sloučenina A může být dále přečištěna za použití běžných metod, jako je rekrystalizace. Skupina vhodných rozpouštědel pro provedení této rekiystalizace zahrnuje nižší alkylalkoholy (například alkoholy obsahující od 1 do 4 atomů uhlíku, jako je ethanol), vodu a jejich směsi. Výhodným rozpouštědlem pro provedení uvedené rekrystalizace pak je směs ethanol/voda.

Odborníkovi v dané oblasti techniky je zřejmé, že při shora popsaných postupech mohou nebo musí být funkční skupiny meziproduktových sloučenin chráněné vhodnými chránícími skupinami.

-4CZ 294217 B6

Mezi funkční skupiny, které je třeba takto chránit patří aminoskupina. Skupina vhodných chránících skupin pro ochránění aminoskupiny zahrnuje benzylovou skupinu, sulfonamidoskupinu (jako je například benzensulfonamidoskupina), terc.butoxykarbonylovou skupinu, 9-fluorenylmethoxykarbonylovou skupinu a benzyloxykarbonylovou skupinu.

Uvedené chránění a odchránění funkčních skupin se může provádět před nebo po kterémkoli shora popsaném reakčním stupni.

Chrániči skupiny je možné odštěpit postupy, které jsou odborníkovi v dané oblasti techniky dobře známé a které jsou opsány v dalším textu.

Úplný popis použití chránících skupin je uveden v publikaci „Protective Groups in Organic Chemistry“, ed. J. W. F. McOmie, Plenům Press (1973) a v publikaci „Protective Groups in Organic Synthesis“, 3. vydání, T.W. Greene a P. G. M. Wutz. Wiley-Interscience (1999).

Odborníkovi v dané oblasti techniky je zřejmé, že za účelem získání sloučeniny A alternativním postupem a v některých případech i snazším způsobme, je možné jednotlivé zde popsané reakční stupně provádět v jiném pořadí a/nebo jednotlivé chemické reakce je možné provádět v různých reakčních stupních celého procesu (tzn. že meziprodukty spojené s konkrétní shora popsanou reakcí mohou obsahovat další substituenty a/nebo mohou tyto meziprodukty podléhat po svém vzniku dalším chemickým transformacím). Volba konkrétního postupu závisí kromě jiného na takových faktorech, jako je povaha ostatních funkčních skupin přítomných v konkrétním substrátu, dostupnost klíčových meziproduktů a na tom, jakou je třeba zvolit strategii týkající se chránících skupin (pokud je tuto strategii třeba vůbec zvolit). Samozřejmě, že povaha použitých chemických reakcí ovlivní výběr reakčních činidel, která se používají v uvedených reakčních stupních, potřebu a typ použitých chránících skupin a sekvenci reakčních stupňů pro přípravu konkrétní sloučeniny.

Medicinální a farmaceutické použití

Sloučenina A je užitečná díky svým farmakologickým účinkům. Proto se tato sloučenina indikuje jako léčivo.

Dalším aspektem předmětného vynálezu tedy je sloučenina A, pro použití jako léčivo.

Konkrétně sloučenina A vykazuje srdeční elektrofyziologický účinek, jako je například účinek projevený v níže popsaných testech.

Z tohoto důvodu se předpokládá, že sloučenina A je vhodná jak pro prevenci, tak pro léčení srdečních arytmií, zejména pak pro prevenci a léčení atriální a ventrikulámí arytmie.

Sloučenina a se tedy indikuje při léčení nebo prevenci srdečních onemocnění, nebo při indikacích, souvisejících s onemocněním srdce, u kterých se předpokládá, že hlavní roli hrají srdeční arytmie, do jejichž skupiny spadá ischemická choroba srdeční, náhlý srdeční záchvat, infarkt myokardu, srdeční selhání, operace srdce a tromboembolické příhody.

Při léčení srdečních arytmií bylo zjištěno, že sloučenina A selektivně zpožďuje srdeční repolarizaci, čímž dochází k prodlužování QT intervalu, a zejména pak to, že sloučenina A vykazuje účinek antiarytmik ΙΠ. třídy. Avšak i když bylo zjištěno, že sloučenina A vykazuje účinek antiarytmik III. třídy, a to zejména při léčení srdečních arytmií, její mechanismus účinku(ů) není omezen jen na tuto třídu.

-5CZ 294217 B6

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob léčení srdeční arytmie, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny A osobě trpící nebo náchylné k tomuto chorobnému stavu.

Farmaceutické přípravky

Sloučenina A se obvykle podává orálně, subkutánně, intravenózně, intraarteriálně, transdermálně, intranasálně, inhalací nebo jakoukoli další parenterální cestou, a to ve formě farmaceutického přípravku zahrnující uvedenou aktivní složku a ve farmaceuticky přijatelné dávkové formě, ίο V závislosti na poruše a stavu pacienta, který má být léčen a rovněž podle způsobu podávání je možné sloučeniny A podávat v různých dávkách.

Skupina výhodných farmaceutických prostředků podle tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutické kompozice s modifikovaným uvolňováním, které zahrnují sloučeninu A a farmaceuticky přijatel15 ný nosič a/nebo další prostředky, přičemž právě tento nosič a uvedené prostředky (pokud jsou použity) způsobují modifikované uvolňování aktivní složky a tato farmaceutická kompozice je uzpůsobena pro orální podávání.

Skupina vhodných farmaceutických prostředků zahrnuje takové farmaceutické prostředky, ve 20 kterých je sloučenina A vpravena do polymemí matrice (například ve formě systému s modifikovaným uvolňováním na bázi želatinové matrice, který zahrnuje hydrofílní želírovací složku a aktivní složku).

Skupina vhodných hydrofilních želírovacích složek pro použití podle tohoto vynálezu zahrnuje 25 xanthan, hydroxypropylcelulózu, maltodextrin, skleroglukan, karboxypropylmethylen, polyethylenoxid, hydroxyethylcelulózu a hydroxypropylmethylcelulózu. Takovéto farmaceutické prostředky je možné připravit standardními technikami.

Sloučeninu A je rovněž možné kombinovat s jakýmikoli dalšími léčivy, která jsou vhodná pro 30 léčbu srdečních arytmií a/nebo jiných kardiovaskulárních chorob.

Dalším aspektem předmětného vynálezu tak je farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu A ve směsi s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou, ředidlem nebo nosičem.

Vhodná denní dávka sloučeniny A při terapeutické léčbě lidí se pohybuje při orálním podávání v rozmezí od přibližně 0,005 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti od 25,0 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti a v rozmezí od přibližně 0,005 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti do 10,0 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti při parenterálním podávání. Výhodná rozmezí denní dávky sloučeniny A při terapeutickém léčení lidí jsou od přibližně 0,005 miligramu/kilogram 40 tělesné hmotnosti do 10,0 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti při orálním podávání a od přibližně 0,005 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti do 5,0 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti při parenterálním podávání.

Obvyklá denní dávka sloučeniny A je v rozmezí od 10 miligramů do 2000 miligramů, jako je 45 například dávka 25 miligramů nebo dávka od 30 miligramů do 1200 miligramů, volné báze (tj.

bez zahrnutí hmotnosti připadající na přítomný protiiont), a to bez ohledu na počet farmaceutických kompozic (například tablet), který se podává v průběhu dne. Výhodná denní dávka sloučeniny A se pohybuje v rozmezí od 50 miligramů do 1000 miligramů, jako je dávka v rozmezí do 100 miligramů do 500 miligramů. Obvyklá dávka sloučeniny A připadající na jednotli50 vou farmaceutickou kompozici (například tabletu) je tak v rozmezí od 15 miligramů do

500 miligramů, jako je například dávka v rozmezí od 40 miligramů do 400 miligramů.

Výhodou sloučeniny A je, že je účinná proti srdečním arytmiím.

-6CZ 294217 B6

Výhodou sloučeniny a může rovněž být, že v porovnání s dosud známými sloučeninami pro použití v této oblasti techniky je účinnější, méně toxická, má širší rozsah účinku (včetně toho, že vykazuje jakoukoli kombinaci účinků antiarytmik I. třídy, Π. třídy, III. třídy a/nebo IV. třídy (zejména pak kombinaci účinků antiarytmik I. třídy a/nebo IV. třídy a antiarytmik III. třídy)), vykazuje delší dobu trvání účinku, produkuje méně vedlejších účinků (včetně nižšího výskytu proaiytmogenních efektů, jako je torsades de pointes), je snadněji absorbována nebo může mít další užitečné farmakologické vlastnosti.

Biologické testy

Test A

Primární elektrofyziologické účinky u anestezovaných morčat

Při tomto testu byla použita morčata o hmotnosti od 660 gramů do 1100 gramů. Zvířata byla odchycena jeden týden před začátkem testu a během této doby měla volný přístup k jídlu a vodě.

Anestézie byla vyvolána intraperitoneální injekcí pentobarbitalu (v dávce 40 až 50 miligramů/kilogram), do krční tepny zvířete byl zaveden katétr (pro zaznamenávání krevního tlaku a pro odběr krevních vzorků) a dále byl katétr zaveden do krční žíly (pro podávání infúze léčiva). Na končetiny zvířete byly umístěny jehlové elektrody, které sloužily pro měření EKG (lead II). Do rekta zvířete byl vložen termistor a tak, aby rektální teplota byla v rozmezí od 37,5 °C do 38,5 °C.

Zvířeti byla provedena tracheotomie a uvedené zvíře bylo pomocí malého zvířecího ventilátoru uměle ventilováno vzduchem nacházejícím se v místnosti, přičemž uvedený ventilátor byl nastaven tak, aby obsah plynů v krvi byl udržován na normální hladině odpovídající danému živočišnému druhu. Za účelem redukce autonomních vlivů byly zvířeti 15 minut před začátkem testu přeříznuty u krku oba X. hlavové nervy s následným podáváním propranololu (v dávce 0,5 miligramu/kilogram).

Levý ventrikulámí epikard byl vystaven levostranné thorakotomii a do volné stěny levé komory byla zavedena sací elektroda, která byla vytvořena speciálně pro účely tohoto testu a která sloužila pro záznam monofázového akčního potenciálu (MAP). Uvedená elektroda byla udržována ve své pozici tak dlouho, dokud bylo možné zaznamenávat přijatelný signál a teprve když nebylo možné tento signál zaznamenávat, tak byla přemístěna do nové pozice. Srdce zvířete bylo stimulováno připevněním bipolámí elektrody na levou srdeční předsíň. Stimulace (doba trvání 2 milisekundy, dvojnásobek prahové diastolické hodnoty) byla prováděna pomocí stimulátoru s konstantním proudem. V průběhu testu bylo srdce stimulováno během 1 minuty frekvencí, která byl těsně vyšší než je normální sinusový rytmus, a to každou 5. minutu.

Krevní tlak, MAP signál a lead II EKG byly zaznamenávány na inkoustovém zapisovači Mingograph (Siemens-Elema, Švédsko). Všechny signály byly snímány (při vzorkovací frekvenci 1000 hertzů) na PC, a to během posledních 10 sekund každé stimulační sekvence a během posledních 10 sekund následující minuty sinusového rytmu. Získané signály byly zpracovány pomocí počítačového programu vytvořeného speciálně pro účely tohoto testu, který slouží pro sběr a analýzu fyziologických signálů naměřených u pokusných zvířat (viz. publikace Axenborg a Hirsch, Comput. Methods Programs Bioche. 1993, 41, 55).

Testovací postup sestával z pořízení dvou bazálních záznamů během stimulace srdce a během sinusového rytmu, přičemž jednotlivé záznamy byly pořízeny v odstupu 5 minut. Po pořízení druhého bazálního, neboli kontrolního záznamu byla zvířeti infúzně podána první dávka testované sloučeniny o objemu 0,2 mililitry, a to prostřednictvím katétru zavedeného do krční žíly, přičemž uvedená dávka byla podána během 30 sekund. O tři minuty později byla zahájena stimulace srdce a byl pořízen nový záznam. Pět minut po první dávce byla zvířeti podána druhá

-7CZ 294217 B6 dávka testované sloučeniny. Takto bylo během každého testu podáno šest až deset po sobě jdoucích dávek.

Analýza získaných dat

Z Čísel proměnných naměřených při této analýze byly vybrány tři proměnné jakožto nejdůležitější paramenty pro porovnání a výběr aktivních sloučenin. Uvedenými třemi vybranými proměnnými bylo trvání MAP při 75procentní repolarizaci během stimulace srdce, doba trvání atrioventrikulámího (AV) přenosu nervového impulzu (která byla definována jako doba mezi atriálním pulzem a začátkem ventrikulámího MAP) během stimulace srdce a tepová frekvence (která je definována jako RR interval během sinusového rytmu). Za účelem posouzení hemodynamického stavu anestezovaného zvířete byl měřen systolický a diastolický krevní tlak. Dále byl záznam EKG sledován za účelem odhalení srdečních arytmií a/nebo morfologických změn.

Průběh uvedených dvou kontrolních záznamů byl považován za nulovou hodnotu a účinky zaznamenané po podání jednotlivých po sobě jdoucích dávek testovaných sloučenin byly vyjádřeny jakožto procentní změna této hodnoty. Sestrojením grafu závislosti těchto procentních změn na kumulativní dávce podané před každým záznamem bylo možné sestrojit křivky reakcí na podanou dávku testované sloučeniny. Tímto způsobem byly při každém exprimentu získány tři křivky reakcí na podanou dávku testované sloučeniny, přičemž jedna taková křivka byla získána pro trvání MAP, druhá křivka byla získána pro dobu trvání AV přenosu nervového impulzu a třetí křivka byla získána pro sinusovou frekvenci (RR interval). Byla vypočtena střední křivka pro všechny experimenty provedené s testovanou sloučeninou a z této střední křivky byly odvozeny hodnoty týkající se účinnosti uvedené sloučeniny. Všechny křivky reakcí na podanou dávku při těchto experimentech byly zkonstruovány lineárním pospojováním jednotlivých naměřených bodů. Kumulativní dávka vedoucí k prodloužení trvání MAP o 10 procent, vztaženo k základní hodnotě, byla použita jakožto index pro stanovení elektrofyziologického účinku testované sloučeniny (D₁₀).

TestB

Glukokortikoidem ošetřené myší fibroblasty jakožto model pro detekci blokátorů zpožděného usměrněného proudu K

Hodnota IC₅₀ pro blokádu draslíkového kanálu byly stanoveny pomocí screeningové metody na bázi mikrotitračního plata, a to na základě změn membránového potenciálu glukokortikoidem ošetřeným myším figroblastům. Uvedený membránový potenciál glukokortikoidem ošetřených myších fibroblastů byl měřen s použitím fluorescence bisoxonolového barviva DiBac₄₍₃₎, které je možné spolehlivě detekovat pomocí fluorescenčního laserového zobrazovacího čítače plat (FLIPR). Exprese zpožděného usměrněného draslíkového kanálu byla vyvolána u myších fibroblastů jejich vystavení působení glukokortikoidu, kterým byl dexamethason (v koncentraci 5 μΜ). Blokáda těchto kanálů depolarizovala uvedené fibroblasty, což vedlo ke zvýšené fluorescenci DiBac₄₍₃₎.

Myší ltk fibrolasty (L-buňky) byly pořízeny z americké sbírky buněčných kultur Američan Typeu Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA) a byly kultivovány v modifikovaném médiu Dulbeccos, do kterého bylo přidáno 5 objemových procent fetálního telecího séra, 500 jednotek/mililitr penicilinu, 500 mikrogramů/mililitr streptomycinu a 0,862 miligramu/mililitr L-alanin-L-glutaminu. Buňky byly každé 3 až 4 dny pasážovány s použitím trypsinu (0,5 miligramu/mililitr) fyziologického roztoku neobsahujícího vápník, který byl pufrován fosfátovým pufrem, Gibco BRL). Tři dyn před zahájením experimentů byla buněčná suspenze napipetována do černých plastických 96jímkových plat s čirým dnem (v koncentraci 25 000 buněk/jímku).

-8CZ 294217 B6

Pro měření membránového potenciálu byla použita fluorescenční sonda Dibac₄₍₃) (DiBac Molecular probes). DiBac₄(₃) maximálně absorbuje záření o vlnové délce 488 nanometrů a emituje záření o vlnové délce 513 nanometrů. DiBac4(₃) je bisoxonol a proto je při pH negativně nabitý. Díly tomuto negativnímu náboji je distribuce DiBac₄₍₃) podél membrány závislá na transmembránovém potenciálu: pokud se uvedené buňky depolarizují (tj. buněčný interiér se stane méně negativní oproti buněčnému exteriéru) dochází vlivem elektrostatických sil ke zvýšení koncentrace DiBac₄(₃) uvnitř buněk. Jakmile se ocitnou uvnitř buněk, mohou se molekuly DiBac₄(₃) vázat k lipidům a proteinům, což vede ke zvýšení intenzity fluorescenčního emisního záření. Depolarizace se proto projeví ve zvýšení fluorescence DiBac₄(₃). Změna fluorescence DiBac₄(₃) byla detekována přístrojem FLIPR.

Před provedením každého experimentu byly buňky čtyřikrát promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaným fosfátovým pufřem (PBS) za účelem odstranění kultivačního média. Poté byly buňky ošetřeny při teplotě 35 °C 5 μΜ DiBac₄(₃₎ (roztok ve 180 mikrolitrech PBS). Jakmile bylo dosaženo stabilní hodnoty fluorescence (obvykle po uplynutí 10 minut) bylo k buňkám přidáno 20 mikrolitrů testované sloučeniny, a to pomocí 96jímkového pipetovacího systému, který byl vnitřní součástí zařízení FLIPR. Následujících 10 minut bylo každých 20 sekund prováděno měření fluorescence. Díky vysoké citlivosti jak vodivosti zpožděného usměrněného draslíkového kanálu, tak fluorescence DiBac₄₍₃j k teplotě, probíhaly všechny experimenty při teplotě 35 °C. Roztok testované sloučeniny byl připraven v 96jímkovém platu v PBS obsahujícím 5 μΜ DiBac₄₍₃). Koncentrace připraveného roztoku testované sloučeniny byla 1 Okřát vyšší než koncentrace požadovaná při vlastním experimentu, protože při přidávání uvedeného roztoku testované sloučeniny během experimentu došlo kjeho dalšímu ředění v poměru 1:10. Jako pozitivní srovnání, tj. pro stanovení maximálního zvýšení intenzity fluorescence, byl použit dofetilid (v koncentraci 10 μΜ).

Sestavení křivek, jež byly použity pro stanovení uvedených hodnot IC₅₀, bylo provedeno pomocí programu Graphpad Prism (Graphpad Software lne., San Diego, CA, USA).

Test C

Metabolická stabilita testované sloučeniny

Byl sestaven in vitro screeningový test pro stanovení metabolické stability sloučeniny A.

Při tomto testu byla použita hepatická frakce S-9 pocházející z psa, člověka, králíka a krysy, obsahující jakožto kofaktor NADPH. Při tomto testu byly použity následující podmínky: S-9 (3 miligramy/mililitr), NADPH (0,83 mM), Tris-HCl (50 mM) o pH 7,4 a 10 μΜ testované sloučeniny.

Reakce byla zahájena přidáním testované sloučeniny a ukončena po 0, 1, 5, 15 a 30 minutách zvýšením pH vzorku na hodnotu vyšší než 10 (přidáním 1 mM NaOH). Po extrakci rozpouštědla byla proti vnitřnímu standardu pomocí kapalinové chromatografíe (LC) (s fluorescenční/UV detekcí) změřena koncentrace testované sloučeniny.

Bylo vypočteno zbývající množství testované sloučeniny, které bylo vyjádřeno jako procento z původního množství testované sloučeniny, po uplynutí 30 minut testu (a tím i hodnota ti/2) a tato hodnota byla použita jakožto měřítko metabolické stability.

-9CZ 294217 B6

Příklady provedení vynálezu

Předmětný vynález bude nyní dále ilustrován pomocí následujících příkladů, které slouží jen pro ilustraci a nijak neomezují jeho rozsah.

Obecné experimentální postupy

Hmotnostní spektra byla měřena na jednom z následujících přístrojů: pomocí přístroje Waters ZMD s jediným kvadrupólem a elektrosprejovou ionizací (S/N mc350); pomocí spektrometru Perkin-Elmer SciX API 150ex; pomocí přístroje VG Quatro II se třemi kvadrupóly; pomocí přístroje VG Platform II s jediným kvadrupólem; nebo pomocí hmotnostního spektrometru Micromass Platform LCZ s jediným kvadrupólem (poslední tři uvedené přístroje byly vybaveny pneumaticky podporovaným elektrosprejovým rozhraním (LC/MS)). Ή NMR a ¹³C NMR spektra byla měřena na spektrometrech Bruker ACP 300 a Varian 300, 400 a 500, přičemž pracovní frekvence při měření *H NMR spekter byla 300 megahertzů, 400 megahertzů, respektive 500 megahertzů, zatímco pracovní frekvence při měření ¹³C NMR spekter byla 75,5 megahertzů, 100,6 megahertzů, respektive 125,7 megahertzů. V alternativním případě byla ¹³C NMR spektra měřena na spektrometru Bruker ACE 200 při pracovní frekvenci 50,3 megahertzů.

V závislosti na snadnosti interpretaci daného spektra bylo nebo nebylo možné ve spektrech rozlišit jednotlivé rotamery. Pokud není uvedeno jinak, jsou hodnoty chemického posunu udávané v ppm, kdy jako vnitřní standard sloužilo použité rozpouštědlo.

Příklad 1 (i) 4-[(3-Hydroxypropyl)amino]benzonitril

Alternativa 1: Směs 12,0 gramů (99,1 milimol) 4-fluorbenzonitrilu a 59,6 gramu (793 milimol) 3-amino-l-propanolu byla 3 hodiny míchána v inertní atmosféře při teplotě 80 °C a poté k ní bylo přidáno 150 mililitrů vody. Směs byla ponechána zchladnout na teplotu místnosti a byla extrahována diethyletherem. Organická vrstva byla oddělena, vysušena nad bezvodým síranem sodným, přefiltrována a zahuštěna ve vakuu, čímž bylo získáno 17 gramů (97 procent) požadovaného produktu ve formě oleje, jenž stáním zkrystalizoval.

Alternativa 2: 24,6 gramu (0,203 mol) 4-fluorbenzonitrilu (Aldrich, čistota 99 procent) bylo přidáno ke 122,0 gramům (1,625 mol, 8 ekvivalentů) 3-amino-l-propanolu (Aldrich, čistota 99 procent) a vzniklá směs byla 5 hodin zahřívána v dusíkové atmosféře na teplotu 80 °C. Roztok byl ponechán zchladnout na teplotu 22 °C a bylo k němu přidáno 300 mililitrů vody. Vzniklý zakalený roztok byl dvakrát extrahován dichlormethanem (poprvé 300 mililitry, podruhé 200 mililitry) a spojené dichlormeethanové extrakty byly promyty 300 mililitry vody. Plynovou chromatografií (GC) organické vrstvy bylo zjištěno, že tato obsahuje aminopropanol v množství, které odpovídalo přibližně 1,0 procentu z celkové plochy píků.

Alternativa 3: Ke 30,29 gramu (247,7 milimol, 1,0 ekvivalent) 4-fluorbenzonitrilu bylo přidáno 150 mililitrů (148,8 gramu, 1981,5 milimol, 8,0 ekvivalentů) 3-amino-l-propanolu. Vzniklá směs byla míchána v dusíkové atmosféře při teplotě místnosti (tj. při teplotě 27 °C) až do úplného rozpuštění pevné látky. Roztok byl zahřát v olejové lázni na teplotu 77 °C, udržován při této teplotě po dobu 7 hodin a následně byl míchán 14 hodin při teplotě místnosti. Do reakční směsi bylo přidáno 365 mililitrů vody a výsledný zakalený roztok byl extrahován nejprve 365 mililitry a poté 245 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly promyty 365 mililitry vody. Dichlormethanový roztok produktu byl vysušen destilací: 200 mililitrů rozpouštědla bylo odstraněno a nahrazeno 200 mililitry čerstvého dichlormethanu. Z roztoku byl odstraněn další podíl rozpouštědla o objemu 250 mililitrů, takže celkový objem rozpouštědla činil 365 mililitrů.

-10CZ 294217 B6 (ii) 3-(4-Kyanoanilino)propyl-4-methylbenzensulfonát

Alternativa I: K roztoku 17,0 gramů (96,5 milimol) 4-[(3-hydroxypropyl)amino]benzonitrilu (ze stupně (i) (Alternativa 1)) ve 195 mililitrech acetonitrilu, ochlazenému na teplotu 0 °C, bylo přidáno 9,8 gramu (96,5 milimol) triethylaminu a 20,2 gramu (106 milimol) p-toluensulfonylchloridu. Reakční směs byla 90 minut míchána při teplotě 0 °C a následně zahuštěna ve vakuu. Ke zbytku bylo přidáno 200 mililitrů vody a získaný vodný roztok byl extrahován dichlormethanem (DCM). Organická fáze byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, přefiltrována a zahuštěna ve vakuu. Získaný zbytek byl přečištěn krystalizací z izopropylalkoholu, čímž bylo získáno 24,6 gramu (77 procent) požadovaného produktu.

Alternativa Π: Roztok surového 4-[(3-hydroxypropyl)amino]benzonitrilu (ze stupně (i) (Alternativa 2)) byl destilací zahuštěn na objem 300 mililitrů, bylo kněmu přidáno dalších 200 mililitrů dichlormethanu a získaný roztok byl znovu zahuštěn destilací na objem 300 mililitrů (metodou Karla Fischera bylo zjištěno, že roztok obsahoval 0,07 procenta vody). Poté bylo k roztoku postupně přidáno 20,55 gramu (0,203 mol) triethylaminu a 248 miligramů (2,0 milimol) 4-(N,N-dimethylamino)pyridinu a výsledný produkt byl ochlazen na teplotu 0 °C. Poté byl k roztoku během přibližně 30 minut přidán roztok 38,70 gramu (0,203 mol) tosylchloridu ve 150 mililitrech dichlormethanu, přičemž během přidávání tohoto roztoku byla reakční směs intenzivně míchána a chlazena tak, aby její teplota nepřekročila 5 °C. Směs byla 23 hodin míchána v dusíkové atmosféře při teplotě v rozmezí od 3 °C do 5 °C (po 5 hodinách došlo k vysrážení hydrochloridu triethylaminu). Po uplynutí 20 až 23 hodin bylo chromatografií na tenké vrstvě (TLC) zjištěno, že dochází jen k velmi malé, pokud vůbec k nějaké další přeměně zbývajícího kyanoalkoholu. K reakční směsi bylo přidáno 300 mililitrů vody a jednotlivé vrstvy byly 15 minut intenzivně promíchávány. Organický roztok byl zahuštěn destilací při teplotě od 35 °C do 40 °C na objem přibližně 60 až 70 mililitrů. K roztoku bylo během 5 minut přidáno 100 mililitrů izopropylalkoholu (V tomto stadiu došlo ještě před přidáním izopropylalkoholu k vysrážení určitého množství granulového produktu. Po přidání izopropylalkoholu došlo velmi rychle ke krystalizaci). Další destilací ve vakuu byly ze směsi odstraněny zbytky dichlormethanu (bylo odstraněno dalších přibližně 30 mililitrů a u získaného destilátu bylo plynulou chromatografií (GC) prokázáno, že neobsahuje dichlormethan). Suspenze obsahující krystaly byla během přibližně 1 hodiny ochlazena na teplotu 0 °C až 5 °C, přičemž byla pomalu míchána a následně udržována 1 hodinu při teplotě v rozmezí od 0 °C do 5 °C. Vzniklé krystaly byly odfiltrovány na středně husté fritě a kompaktní filtrační koláč byl opatrně promyt 80 mililitry izopropylalkoholu, jenž byl ochlazen na teplotu 0 °C. Filtrační koláč byl přes nos sušen ve vakuu a v proudu dusíku. Bylo získáno 52,6 gramu (78,4 procenta) produktu, jehož čistota podle vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) byla 99,64 procenta.

Elementární analýza, nalezeno (teorie): 61,60 (61,67) % C; 5, 41 (5,49) % H; 8,44 (8,47) % N; 9,71 (9,70) % S.

(iii) N,N-Bis(2-oxiranylmethyl)benzensulfonamid

K 250 gramům (1 ekvivalent) benzensulfonamidu bylo postupně přidáno 2,5 litru (10 objemových ekvivalentů) vody a 500 mililitrů (4 ekvivalenty) epichlorhydridu. Uvedená reakční činidla byla zahřáta na teplotu 40 °C. Ke směsi byl přidán roztok 130 gramů hydroxidu sodného v 275 mililitrech vody, a to takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi zůstala v rozmezí od 40 °C do 43 °C. Přidávání uvedeného roztoku hydroxidu sodného tedy trvalo přibližně 2 hodiny (za účelem udržení uvedené teploty musela být rychlost přidávání hydroxidu sodného na začátku přidávání roztoku nižší než na konci). Po přidání veškerého roztoku hydroxidu sodného byla reakční směs míchána 2 hodiny při teplotě 40 °C a následně byla ponechána míchat přes noc při teplotě místnosti. Přebytek epichlorhydrinu byl odstraněn vakuovou destilací (při tlaku přibližně 4 kilopascaly (tj. 40 milibarů) a teplotě směsi 30 °C) ve formě azeotropické směsi s vodou. Ke zbytku byl přidán 1 litr dichlormethanu a směs byl 15 minut intenzivně míchána. Jednotlivé fáze

-11 CZ 294217 B6 byly ponechány oddělit (což trvalo 10 minut, ačkoli zcela čiré fáze byly získány až poté, co byla směs ponechána stát přes noc.). Uvedené fáze byly odděleny a získaný dichlormethanový roztok byl použit v dalším reakčním stupni, jenž je popsán níže.

NMR (400 MHz, CDC1₃): δ 2,55 - 2,65 (2H, m), 2,79 (2H, t, J = 4,4), 3,10 - 3,22 (4H, m), 3,58 - 3,73 (2H, m), 7,50 - 7,56 (2H, m), 7,58 - 7,63 (1H, m), 7,83 - 7,87 (2H, m).

(iv) 5-Benzyl-3,7-dihydroxy-l-fenylsulfonyl-l,5-diazacyklooktan

2,5 litru (10 objemových ekvivalentů) methylovaného průmyslového lihu (IMS) bylo přidáno k dichlormethanovému roztoku z výše uvedeného stupně (iii). Roztok byl destilován až do okamžiku, kdy vnitřní teplota směsi dosáhla 70 °Č. Takto bylo oddestilováno přibližně 1250 mililitrů rozpouštědla. K destilačnímu zbytku bylo postupně přidáno dalších 2,5 litru (10 objemových ekvivalentů) methylovaného průmyslového lihu (IMS) a 120 mililitrů (0,7 ekvivalentu) benzylaminu, který byl přidán najednou, aniž by byla pozorována exotermní reakce, a vzniklá směs byla 6 hodin zahřívána na teplotu varu (přičemž od okamžiku, kdy byl ze směsi po 2 hodinách odebrán vzorek, nebylo pozorovány žádné další změny ve složení směsi). K reakční směsi bylo přidáno dalších 15 milimetrů benzylaminu a roztok byl zahříván další 2 hodiny. Ze směsi byl oddestilován methylovaný průmyslový líh (IMS) (přibližně 3,25 litru) a ke zbytku bylo přidáno 2,5 litru toluenu. Z roztoku byly oddestilovány další přibližně 2,4 litru rozpouštědla a ke zbytku byl přidán další 1 litr toluenu. Teplota, na kterou byla směs zahřívána, nyní činila 110 °C a při této teplotě bylo shromážděno dalších 250 mililitrů rozpouštědla. Teoreticky byl tímto postupem při teplotě 110 °C zanechán vzniklý produkt rozpouštěný v přibližně 2,4 litru toluenu. Tento roztok byl použit v dalším reakčním stupni.

Ή NMR (400 MHz, CDC1₃): δ 7,83 - 7,80 (4H, m ArH), 7,63 - 7,51 (6H, m ArH), 7,30 - 7,21 (10H, ArH), 3,89 - 3,80 (4H, m, CH(a) + CH(b)), 3,73 (2H, s, CH₂Ph(a)), 3,70 (2H, s, CH₂Ph(b)), 3,59 (2h, dd, CHHNSO₂Ar(a)), 3,54 (2H, dd, CHHSO₂Ar(b)), 3,40 (2h, dd, CHHNSO₂Ar(b)), 3,23 (2H, dd, CHHNSO₂Ar(a)), 3,09 - 2,97 (4H, m, CHHNBn(a) +

CHHNBn(b)), 2,83 (2H, dd, CHHNBn(b)), 2,71 (2H, dd, CHHNBn(a)).

(Údaje byly získány z přečištěného materiálu, který obsahoval směs trans-diolu (a) a cis-diolu (b) v poměru 1:1).

(v) 3-Benzyl-7-(fenylsulfonyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1 Jnonan

Toluenový roztok z výše uvedeného stupně (iv) byl ochlazen na teplotu 50 °C a bylo k němu přidáno 0,2 litru bezvodé kyseliny methansulfonové. Teplota směsi vzrostla z 50 °C na teplotu 64 °C. Po uplynutí 10 minut byl do reakční směsi přidán 1 litr kyseliny sulfonové a výsledná směs byla 5 hodin zahřívána na teplotu 110°C. Následně byl z reakční směsi oddestilován toluen, kterého bylo takto izolováno 1,23 litru (v této souvislosti je třeba poznamenat, že vnitřní teplota směsi by v kterémkoli stadiu reakce neměla překročit 110 °C, jinak dochází ke snížení výtěžku produktu). Poté byla směs ochlazena na teplotu 50 °C a s použitím vakua byl odstraněn zbývající toluen. Směs byla dále zahřívána na teplotu 110°C při tlaku 65 kilopascalů (tj. 650 milibarů), čímž bylo izolováno dalších 0,53 litru toluenu (avšak je výhodné, pokud je toluen možné odstranit při jakékoli nižší teplotě). Reakční směs byla ponechána zchladnout na teplotu 30 °C a bylo k ní přidáno 250 mililitrů deionizované vody, čímž došlo k zvýšení teploty reakční směsi z 30 °C na teplotu 45 °C. Ke směsi bylo přidáno během celkem 30 minut dalších 2,15 litru vody, a to takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřekročila 54 °C. Roztok byl ochlazen na teplotu 30 °C a následně k němu byly přidány 2 litry dichlormethanu. S použitím externího chlazení a za intenzivního míchání byla reakční směs zalkalizována přidáním 2 litrů lOmolámího vodného roztoku hydroxidu sodného, jenž byl přidáván takovou rychlostí, aby vnitřní teplota směsi nepřekročila 38 °C. Přidávání uvedeného objemu roztoku hydroxidu sodného tak trvalo 80 minut. Míchání směsi bylo zastaveno a během 3 minut došlo k oddělení jednotlivých fází. K získanému dichlormethanovému roztoku byly přidány 2 litry methylovaného

-12CZ 294217 B6 průmyslového lihu (IMS) a bylo započato s odestilováváním rozpouštědla. Takto bylo izolováno 2,44 litru rozpouštědla, přičemž destilace byla ukončena při dosažení teploty v destilační hlavě 70 °C. Tímto postupem byl vzniklý produkt zanechán rozpuštěný v 1,56 litru methylovaného průmyslového lihu (IMS). Tento roztok byl následně ponechán přes noc zchladnout na teplotu místnosti, přičemž byl zároveň pomalu míchán. Pevný produkt, k jehož vysrážení došlo, byl odfiltrován a promyt 0,5 litru methylovaného průmyslového lihu (IMS), čímž byl získán světlehnědý produkt, jehož množství po usušení ve vakuu při teplotě 50 °C činilo 50,8 gramu (8,9 procenta ze 3 reakčních stupňů). 20,0 gramů získaného produktu bylo při teplotě varu rozpuštěno ve 100 mililitrech acetonitrilu za vzniku světle žlutého roztoku. Po ochlazení na teplotu místnosti byly krystaly, které tímto postupem vznikly, izolovány filtrací a promyty 100 mililitry acetonitrilu. Produkt byl 1 hodinu sušen ve vakuu při teplotě 40 °C, čímž bylo získáno 17,5 gramu (87 procent) požadovaného produktu.

Ή NMR (400 MHz, CDC1₃): δ 7,18 - 7,23 (10H, m), 3,86 - 3,84 (2H, m), 3,67 (2H, d), 3,46 (2H, s), 2,91 (2H, d), 2,85 (2H, dd), 2,56 (2H, dd).

(vi) Dihydrochlorid 3-benzyl-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonanu

1,2 litru (3 objemové ekvivalenty) koncentrované kyseliny bromovodíkové byly přidány ke 400 gramům pevného 3-benzyl-7-(fenylsulfonyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonanu (viz. stupeň (v) výše), a vzniklá směs byla zahřívána v dusíkové atmosféře na teplotu varu. K rozpuštění pevné látky v kyselině došlo při teplotě 95 °C. Po 8hodinovém zahřívání reakční směsi bylo analýzou vysokoůčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) zjištěno, že došlo k úplné reakci. Obsah reakční nádoby byl ochlazen na teplotu místnosti. Ke směsi bylo přidáno 1,2 litru (3 objemové ekvivalenty) toluenu a výsledná směs byla 15 minut intenzivně míchána. Poté bylo míchání přerušeno a došlo k oddělení jednotlivých fází. Toluenová fáze byla spolu s malým množstvím materiálu na rozhraní obou vrstev dána stranou. Kyselá fáze byla vrácena do původní reakční nádoby a najednou k ní bylo přidáno 1,4 litru (3,5 objemového ekvivalentu) lOmolámího roztoku hydroxidu sodného. Vnitřní teplota směsi vzrostla ze 30 °C na 80 °C. Bylo změřeno pH směsi za účelem potvrzení, že jeho hodnota je vyšší než 14. Poté bylo ke směsi přidáno 1,6 litru (4 objemové ekvivalenty) toluenu, čímž došlo k ochlazení směsi z teploty 80 °C na teplotu 60 °C. Po 30minutovém intenzivním míchání byly od sebe odděleny jednotlivé fáze. Vodná vrstva byla spolu s malým množstvím materiálu na rozhraní obou vrstev dána stranou. Toluenová fáze byla vrácena zpět do původní reakční nádoby a byly k ní přidány 4 litry (10 objemových ekvivalentů) 2-propanolu. Teplota směsi byla nastavena na hodnotu mezi 40 °C a 45 °C. Ke směsi bylo během 45 minut přidáno 200 mililitrů koncentrované kyseliny chlorovodíkové, a to takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi zůstala v rozmezí od 40 °C do 45 °C. Došlo k vytvoření bílé sraženiny. Směs byla míchána 30 minut a následně ochlazena na teplotu 7 °C. Získaný produkt byl izolován filtrací, promyt 0,8 litru (2 objemové ekvivalenty) 2-propanolu, usušen odsátím a dále usušen ve vakuové sušárně při teplotě 40 °C. Bylo získáno 297 gramů (91 procent) požadovaného produktu.

Ή NMR (CD₃OD + 4 kapky D₂O): δ 2,70 (brd, 2H), 3,09 (d, 2h), 3,47 (brs, 4H), 3,60 (s, 2H), 4,12 (brs, 2H), 7,30 - 7,45 (m, 5H).

API MR: m/z = 219 [C₁₃Hi₈N₂O+H]⁺.

(vii) 3,3-Dimethyl-l-[9-oxa-7-(fenylmethyl)-3,7-diazabicyklo[3.3. l]non-3-yl]-2-butanon

Ke 114,2 gramu (4 ekvivalenty) hydrogenuhličitanu sodného bylo postupně přidáno 500 mililitrů (5 objemových ekvivalentů) vody a 45,8 mililitru (1 ekvivalent) 1-chlorpinakolonu. K této směsi byl pomalu (během 20 minut) přidán roztok 100,0 gramu dihydrochloridu 3-benzyl-9-oxa-3,7diazabicyklo[3.3.1]nonanu (viz stupeň (vi) výše) ve 300 mililitrech (3 objemové ekvivalenty) vody, takže uvolňování oxidu uhličitého bylo udrženo pod kontrolou. Reakční směs byla 4 hodi

-13CZ 294217 B6 ny zahřívána na teplotu 65 °C až 70 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti bylo ke směsi přidáno 400 mililitrů (4 ekvivalenty) dichlormethanu a po 15 minutách míchání byly odděleny jednotlivé fáze. Vodná fáze byla promyta 400 mililitry (4 objemové ekvivalenty) dichlormethanu a organické extrakty byly spojeny. Roztok byl destilován a bylo zněj odstraněno 550 mililitrů rozpouštědla. K získanému zbytku byl přidán 1 litr ethanolu a bylo pokračováno v uvedené destilaci, kterou bylo odstraněno dalších 600 mililitrů rozpouštědla. K získanému zbytku byl opět přidán 1 litr ethanolu a bylo pokračováno v destilaci, kterou bylo odstraněno dalších 500 mililitrů rozpouštědla (teplota v destilační hlavě nyní dosahovala 77 °C). Získaný roztok (který obsahoval teoreticky 1150 mililitrů ethanolu) byl použit přímo v dalším stupni.

^!H NMR (400 MHz, CDC1₃): δ 1,21 (9H, s), 2,01 - 2,59 (2H, m), 2,61 - 2,65 (2H, m), 2,87 - 2,98 (4H, m), 3,30 (2H, s), 3,52 (2H, s), 3,87 (2H, brs) 7,26 (2H, d, J= 7,6), 7,33 (1H, dd, J= 7,6, 7,6), 7,47 (2H, d, J= 7,6).

(viii) 3,3-Dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanon

K ethanolovému roztoku z výše uvedeného stupně (vii) bylo přidáno 44 gramů (0,4 hmotnostního ekvivalentu) palladia na uhlí (61 procent vlhkého katalyzátoru, Johnson Matthey Typ 440L). Vzniklá směs byla hydrogenována při tlaku 400 kilopascalů (tj. 4 bary). Reakce byla považována za skončenou po uplynutí 5 hodin. Katalyzátor byl odstraněn filtrací a promyt 200 mililitry ethanolu. Spojené ethanolové filtráty byly použity v níže popsaném stupni (ix). Testem roztoku bylo zjištěno, že obsahoval 61,8 gramu požadovaného produktu v ethanolu (teoreticky v 1,35 litru, naměřeno 1,65 litru). Část produktu byla izolována a přečištěna. Přečištěný produkt byl pak použit pro provedení analýz.

‘H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 1,17 (9H, s), 2,69 (2H, dt, J= 11,4, 2,4), 2,93 (2h, d, J= 10,8), 3,02 (2H, d, J= 13,8), 3,26 (2H, s), 3,32 (2H, dt, J= 14,1), 3,61 (2h, brs).

Uvedenou reakci je rovněž možné provést s použitím nižšího hmotnostního poměru katalyzátoru a benzylované výchozí sloučeniny. Tohoto snížení uvedeného poměru je možné dosáhnout několika různými způsoby, například použitím jiných katalyzátorů (jako je Pd/C s jiným obsahem kovu než u shora uvedeného katalyzátoru typu 440L, nebo jako je Rh/C) a/nebo zlepšením vlastností reakční směsi týkajících se přenosu hmoty (odborníkovi v dané oblasti techniky je zřejmé, že tohoto zlepšení je možné dosáhnout například provedením uvedené hydrogenace ve větším než výše popsaném měřítku). S použitím těchto technik je možné uvedený hmotnostní poměr katalyzátoru a výchozí sloučeniny snížit na hodnotu nižší než 4:10 (například na hodnotu v rozmezí od 4:10 do 1:20).

(ix) Sloučeniny A

56,6 gramu (1,5 ekvivalentu) uhličitanu draselného a 90,3 gramu (1 ekvivalent) 3-(4-kyanoanilino)propyl—4-methylbenzensulfonátu (viz. stupeň (ii)) bylo přidáno k roztoku 61,8 gramu (podle testu) 3,3-dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanonu v 1,65 litru ethanolu (viz stupeň (viii)). Směs byla 4 hodiny zahřívána na teplotu 80 °C. Testem bylo zjištěno, že po této době zůstalo v reakční směsi 8,3 gramu výchozí sloučeniny, a proto bylo do reakční směsi přidáno dalších 12,2 gramu 3-(4-kyanoanilino)propyl—4—methylbenzensulfonátu a výsledná směs byla zahřívána 4 hodiny na hodnotu 80 °C. Ze směsi bylo oddestilováno 1,35 litru rozpouštědla a poté k ní bylo přidáno 2,5 litru izopropylacetátu. Ze směsi bylo oddestilováno 2,51 litru rozpouštědla a opět kní bylo přidáno 2,5 litru izopropylacetátu. Další destilací bylo z reakční směsi oddestilováno 0,725 litru rozpouštědla. Vnitřní teplota směsi byla nyní 88 °C. Bylo odstraněno dalších 0,825 litru rozpouštědla, takže byl získán požadovaný produkt ve formě roztoku v izopropylalkoholu (teoreticky 2,04 litru). Po ochlazení na teplotu 34 °C bylo k roztoku přidáno 0,5 litru vody. Došlo ke vzniku černé suspenze, patrně palladia. Hodnota pH vodné fáze byla 11. Ke směsi bylo přidáno 0,31 litru lmolámího roztoku hydroxidu sodného, a to takovou rychlostí, aby teplota směsi nepřesáhla 25 °C, a výsledná směs byla 5 minut intenzivně míchána.

- 14CZ 294217 B6

Hodnota pH vodné fáze byla 12. Jednotlivé fáze byly od sebe odděleny a vodná fáze byla dána stranou. K organické fázi bylo přidáno dalších 0,5 litru vody a po oddělení byla vodná fáze dána stranou. Získaný esterový roztok byl přefiltrován za účelem odstranění suspendovaných částic a objem získaného filtrátu byl doplněn na 2 litry přesně. Tento roztok byl následně rozdělen na dvě části o objemu 1 litr.

(Pro zabránění přípravy výše uvedeného produktu s vysokým obsahem palladia bylo možné provést následující postup: 12,5 gramu (25 hmotnostních procent) pryskyřice Deloxan^R bylo přidáno k roztoku uvedené vodné báze o objemu 1 litr a získaná směs byla za intenzivního míchání 5 hodin zahřívána na teplotu varu. Poté byl roztok ochlazen na teplotu místnosti a míchán další 2 dny. Následně byl roztok filtrací zbaven uvedené pryskyřice).

Byl proveden test za účelem výpočtu množství kyseliny benzensulfonové potřebného pro vytvoření benzensulfonátové soli.

Roztok 20,04 gramu kyseliny benzensulfonové (1 ekvivalent za předpokladu, že uvedenou kyselinou byl její čistý monohydrát) ve 200 mililitrech izopropylacetátu byl během 5 minut přidán za intenzivního míchání k 1 litru roztoku uvedené vodné báze (pokud je to možné, je lépe přidávat uvedený roztok ještě pomaleji), čímž došlo ke vzniku žluté sraženiny. Teplota reakční směsi vzrostla z 18 °C na 22 °C. Po 10 minutách byla reakční směs ochlazena na teplotu 10 °C a produkt byl izolován filtrací. Získaný produkt byl promyt 250 mililitry izopropylacetátu, odsát na filtru do sucha a následně 2 dny sušen ve vakuu při teplotě 40 °C, čímž bylo získáno 59,0 gramů produktu (výtěžek 61 procent na dihydrochlorid 3-benzyl-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonanu).

(Surový benzensulfonát bylo možné alternativně připravit přidáním vodného roztoku kyseliny benzensulfonové o koncentraci 70 hmotnostních procent k ethanolovému roztoku volné báze).

Surový shora uvedený produkt byl izolován ve formě monohydrátu.

K 50,0 gramům tohoto surového produktu bylo přidáno 500 mililitrů ethanoíu a 250 mililitrů vody. Vzniklý roztok byl zahřát na teplotu 75 °C. K rozpuštění pevné látky došlo při teplotě 55 °C. Roztok byl 5 minut udržován při teplotě 75 °C a ochlazen během 1 hodiny na teplotu 5 °C. Srážení produktu začalo při teplotě 18 °C. Studený roztok byl přefiltrován a filtrační koláč byl promyt 150 mililitry směsi ethanol/voda (2:1), odsát na filtru do sucha a poté sušen ve vakuu při teplotě 40 °C, čímž bylo získáno 41,2 gramu (82 procent) čistého požadovaného produktu.

(Tuto rekrystalizací bylo v případě potřeby možné provést i s většími objemy rozpouštědel, jako například ve směsi ethanol/voda (2:1, 45 objemových ekvivalentů), kdy bylo zpětně izolováno 62 procent z výchozího množství produktu, nebo ve směsi ethanol/voda (6:1, 35 objemových ekvivalentů), kdy bylo zpětně izolováno 70 procent z výchozího množství produktu).

Podle stanovení rentgenovou difrakcí monokrystalu byl produkt po uvedené rekrystalizací izolován ve formě monohydrátu.

Příklad 2 (i) 3-(4-Kyanoanilino)propylbenzensulfonát

K roztoku 4-[(3-hydroxypropyl)amino]benznitrilu (získaného alternativou 3 ve stupni (i) příkladu 1), u kterého bylo předpokládáno, že obsahuje 43,65 gramu (247,7 milimol, 1 ekvivalent) uvedené sloučeniny v 360 mililitrech (celkový objem roztoku) dichlormethanu, bylo postupně vždy najednou přidáno 52 mililitrů (37,60 gramu, 371,55 milimol, 1,5 ekvivalentu) triethylaminu a 11,89 gramu (123,85 milimol, 0,5 ekvivalentu) hydrochloridu trimethylaminu.

-15CZ 294217 B6

Získaný žlutý roztok byl ochlazen na teplotu -20 °C (pomocí směsi aceton/suchý led nebo pomocí chladicí desky) a přikapávací nálevkou s obtokem pro vyrovnávání tlaku k němu byl přidán roztok 32 mililitrů (43,74 gramu, 247,7 milimol, 1,0 ekvivalent) benzensulfonylchloridu v 220 mililitrech dichlormethanu (5 objemových ekvivalentů vzhledem k uvedenému kyanoalkoholu). Uvedený roztok byl přidáván postupně tak, aby vnitřní teplota reakční směsi nepřekročila -14 °C, takže přidání veškerého roztoku trvalo 25 minut. Reakční směs byla 35 minut míchána při teplotě v rozmezí od -15 °C do -10 °C. Ke směsi bylo přidáno 365 mililitrů vody a teplota vzrostla na 10 °C. Roztok byl ochlazen zpět na teplotu 0 °C a 15 minut intenzivně míchán při této teplotě. Organická vrstva o objemu 570 mililitrů byla oddělena a destilací při atmosférickém tlaku z ní byl odstraněn dichlormethan (DCM) (celkem 450 mililitrů, teplota v reakční nádobě 40 °C až 42 °C, teplota vdestilační hlavě 38 °C až 39 °C). K destilačnímu zbytku bylo přidáno 250 mililitrů ethanolu a výsledný roztok byl ponechán zchladnout na teplotu nižší než 30 °C a následně připojen k vakuu. Další destilací (při tlaku 5,2 kilopaskalu (tj. 52 milibarů) a teplotě v reakční nádobě i v destilační hlavě 21 °C až 23 °C) bylo odstraněno 40 mililitrů rozpouštědla a produkt se postupně vyloučil v roztoku. V tomto okamžiku byla destilace zastavena a ke zbytku bylo přidáno dalších 50 mililitrů ethanolu. Směs byla zahřáta (ve vodní lázni o teplotě 50 °C) na teplotu 40 °C, čímž došlo k rozpuštění veškeré pevné látky a ke vzniklému roztoku bylo pomalu přikapávací nálevkou přidáno 90 mililitrů vody. Roztok byl přes noc (15 hodin) pomalu míchán při teplotě místnosti (20 °C), přičemž po uplynutí této doby došlo k vykrystalování části produktu. Směs byla ochlazena na teplotu -5 °C (pomocí lázně naplněné směsí led/methanol), míchána při této teplotě 20 minut a poté z ní byly filtrací izolovány světle žluté krystaly. Získaná pevná látka byla promyta směsí ethanol/voda (42 mililitrů ethanolu, 8 mililitrů vody), 30 minut sušena odsáváním na filtru a následně sušena 72 hodin ve vakuové sušárně při teplotě 40 °C do konstantní hmotnosti. Hmotnost takto získaného surového produktu byla 47,42 gramu (149,9 milimol, 60 procent). K 20,0 gramům (63,22 milimol, 1,0 ekvivalent) tohoto surového produktu bylo přidáno 160 mililitrů (8 objemových ekvivalentů) ethanolu. Vzniklá směs byla míchána v dusíkové atmosféře a zahřívána pomocí vodní lázně na teplotu 40 °C. Po dosažení této teploty došlo k rozpuštění veškeré pevné látky za vzniku čirého žlutého roztoku. K tomuto roztoku bylo během 10 minut přikapáno 60 mililitrů (3 objemové ekvivalenty) vody, přičemž vnitřní teplota roztoku byla udržována v rozmezí od 38 °C do 41 °C. Vodní lázeň byla odstraněna a roztok byl během 40 minut ponechán zchladnout na teplotu 25 °C, přičemž během této doby začal produkt krystalizovat. Směs byla ochlazena během 10 minut na teplotu -5 °C a udržována při této teplotě dalších 10 minut. Vyloučená světle žlutá pevná látka byla izolována filtrací, 10 minut sušena odsáváním a poté byla sušena 15 hodin ve vakuové sušárně při teplotě 40 °C do konstantní hmotnosti. Takto bylo získáno 18,51 gramu (58,51 milimol, 93 procent (z množství surového produktu)) požadovaného produktu.

(ii) Sloučenina A

K ethanolovému roztoku (o celkovém objemu 770 mililitrů, přibližně 20objemových ekvivalentů vzhledem k aminu) 3,3-dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanonu (který obsahoval 34,97 gramu uvedené sloučeniny (ověřeno testem), 154,4 milimol, 1,0 ekvivalent; viz stupeň (viii) příkladu 1) bylo najednou přidáno 49,05 gramu (154,52milimol, 1,0 ekvivalent) 3-(4-kyanoanilino)propylbenzensulfonátu (viz. stupeň (i) výše). Vzniklá směs byla 6 hodin míchána při teplotě 74 °C a poté 65 hodin při teplotě 20 °C (směs byla ve skutečnosti míchána při teplotě místnosti přes víkend, avšak odborníkovi v dané oblasti techniky je zřejmé, že reakce by proběhla úspěšně i bez takto dlouhého míchání směsi při teplotě místnosti). Z reakční směsi bylo odstraněno 370 mililitrů ethanolu a ke zbytku bylo přidáno 200 mililitrů vody, čímž byla získána směs ethanol/voda (2:1) o celkovém objemu 600 mililitrů. Po přidání vody klesla teplota v reakční nádobě z 80 °C na 61 °C. Roztok byl zpět ohřát na teplotu 70 °C a poté ponechán za neustálého pomalého míchání samovolně vychladnout přes noc (19 hodin) na teplotu místnosti. V tomto stadiu došlo k vyloučení pevné látky. Směs byla ochlazena na teplotu 0 °C, míchána 15 minut při této teplotě a následně zní byla filtrací izolována vyloučená pevná bílá látka. Tato pevná látka byla promyta 150 mililitry studené směsi ethanol/voda (2:1), 1,25 hodiny sušena odsáváním a následně sušena 20 hodin ve vakuové

-16CZ 294217 B6 sušárně při teplotě 40 °C. Hmotnost takto získaného surového produktu byla 57,91 gramu (103,3 milimol, 60 procent).

Vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) bylo zjištěno, že čistota tohoto surového produktu byla 98,47 procenta. Poté byl tento surový produkt rekrystalizován níže popsaným postupem, přičemž při uvedené rekrystalizací bylo zpět izolováno 84 procent z původního množství surového produkt a čistota získaného produktu byla 99,75 procenta.

Postup rekrystalizace:

K 56,2 gramu shora získaného surového produktu bylo přidáno 562 mililitrů ethanolu a 281 mililitrů vody. Roztok byl zahřát na teplotu 75 °C, přičemž k rozpuštění veškeré pevné látky došlo při teplotě 55 °C. Vzniklý roztok byl 5 minut zahříván na teplotu 75 °C a následně ochlazen během 1,5 hodiny na teplotu 5 °C. Srážení produktu začalo při teplotě 35 °C. Uvedený vychlazený roztok byl přefiltrován a izolovaná sraženina byla promyta 168 mililitry směsi ethanol/voda (2:1) Pevná látka byla odsáta na filtru do sucha a poté byla usušena ve vakuu při teplotě 40 °C, čímž bylo získáno 47,1 gramu (84 procent) čistého produktu. (Tento postup byl zopakován s použitím polovičního množství rozpouštědla, což vedlo ke zvýšení množství zpětně izolovaného produktu z 84 procent na 94 procent).

*H NMR (400 MHz, CDC1₃): δ 1,06 (9H, s), 2,2 - 2,3 (2H, m), 2,89 (2H, d), 3,11 (2H, dd), 3,27 (2H, t), 3,33 - 3,4 (4H, m), 3,70 (2H, s), 4,1 - 4,15 (4H, m), 6,36 (1H, t), 6,44 (2H, d), 7,25 - 7,3 (2H, m), 7,33 - 7,4 (3H, m), 7,8 - 7,9 (2H, m).

Sloučenina A byla testována ve shora popsaném testu A a bylo zjištěno, že vykazuje hodnotu Dio 6,7.

Ve výše uvedeném textu byly použity následující zkratky:

API ionizace při atmosférickém tlaku (v souvislosti s MS), br široký signál (v souvislosti s NMR), d dublet (v souvislosti s NMR),

DCM dichlormethan, dd dublet dubletů (v souvislosti s NMR),

DMF N,N-dimethylformamid,

HPLC vysokoůčinná kapalinová chromatografie,

IMS methylovaný průmyslový líh, m multiplet (v souvislosti s NMR),

MS hmotnostní spektroskopie,

NADPH nikotinamidadenindinukleatidfosfát, redukovaná forma,

Pd/C palladium na uhlí, q kvartet (v souvislosti s NMR), s singlet (v souvislosti s NMR), t triplet (v souvislosti s NMR),

THF tetrahydrofuran,

TLC chromatografie na tenké vrstvě.

Claims

1. Benzensulfonát4-({3-[7-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-<liazabicyklo[3.3.1]non3-yl]propyl} amino)benzonitrilu.

2. Monohydrát benzensulfonátu 4-( { 3—[ 7—(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabi-

1 o cyklo[3.3.1 ]non-3-yl]propyl} amino)benzonitrilu.

3. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 1 nebo 2 ve směsi s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou, ředidlem nebo nosičem.

15

4. Farmaceutický prostředek pro použití při prevenci nebo léčení srdeční arytmie, vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 1 nebo 2.

5. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako léčivo.

20

6. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2 pro použití při prevenci nebo léčení srdeční arytmie.

7. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 jakožto aktivní složky pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení srdeční arytmie.

25

8. Použití podle nároku 7, kdy uvedenou srdeční arytmií je atriální arytmie nebo ventrikulámí arytmie.

9. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) reakci kyseliny benzensulfonové s 4-{3-(7-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3. l]non-3-yl]propyl}amino)benzonitrilem;

nebo (b) reakci 3-(4-kyanoanilino)propylbenzensulfonátu s 3,3-dimethyl-l-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1 ]non-3-yl)-2-butanonem.