Opioidní peptid, farmaceutický prostředek s jeho obsahem a použití

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nového opioidního peptidu pro léčení bolestí, farmaceutického prostředku jej obsahujícího a použití takového peptidu.

Dosavadní stav techniky

Mnoho endogenních peptidů, pocházejících ze savců a obojživelníků, se váže ke specifickým opioidním receptorům a vyvolává analgetickou odezvu podobně jako klasické narkotické opiáty. Ve vyšších živočiších byla zjištěna koexistence mnoha různých typů opioidních receptoru. Například viz.W. Martin a kol., J.Pharmacol.Exp.Ther., 197, 517 (1975); a. J. Lord a kol., Nátuře (Londýn), 257, 485 (1977). Byly identifikovány tři různé typy opioidních receptorů. První, δ, vykazuje diferencující afinitu pro enkefalinu podobné peptidy. Druhý, μ, vykazuje zvýšenou selektivitu pro morfin a jiné polycyklické alkaloidy. Třetí, k, vykazuje stejnou afinitu pro jakoukoliv skupinu výše uvedených ligandů a preferenční afinitu pro dynorfin. Obecně se jeví μ-receptory být více zahrnuty v analgetických účincích, δ-receptory se jeví jako podílející se na vlivu na chování, i když δ a κ-receptory mohou také zprostředkovat analgesii.

Každý opioidní receptor, je-li kopulován s opiátem, působí specifickou biologickou odezvu unikátní k tomuto typu receptoru. Jestliže opiát aktivuje více než jeden receptor, je ovlivněna biologická odezva pro každý receptor a dochází tak k vedlejším účinkům. U méně specifického a selektivního opiátu může být větší možnost vyvolání zvýšených vedlejších účinků podáním opiátu.

Podle stavu techniky opioidní peptidy a jejich analogy buď nevykazují nebo vykazují v omezeném stupni specifičnost a selektivitu pro typ receptoru nebo receptorů, ke kterým se vážou. Primárním místem působení analgetických opioidů je centrální nervový systém (CNS). Běžná narkotická analgetika jsou normálně nehydrofobní a jsou tak zvláště vhodná pro prostup lipidovými membránami jako je hematoencefalická bariéra. Díky této fyzikální schopnosti mají analgetika sklon se vázat na opioidní receptory v centrálním nervovém systému v mozku. Nemusí se však nezbytně vázat na homogenní receptorový podtyp. Tato vazba působí, že se objevují z lékařského hlediska nežádoucí vedlejší účinky. Opiáty mohou působit nebezpečné a potenciálně fatální vedlejší účinky. Vedlejší účinky jako je respirační deprese, tolerance, fyzická závislost a syndrom náhlého vysazení jsou vyvolány nespecifickými interakcemi v receptorech centrálního nervového systému. Viz K. Budd, v Intemational Encyclopedia of Pharmacology and Therapeutics; N.E. Williams a H. Wilkinson, vyd., Pergammon: (Oxford), 112, str. 51 (1983). Proto u opioidních analgetik, působících v zásadě přes opioidní receptory v periferním nervovém systému se nepředpokládá, že budou vyvolávat podobné nežádoucí vedlejší účinky jako jsou vedlejší účinky spojené s opioidními analgetiky působícími na centrální nervový systém. Opioidní peptidy podle tohoto vynálezu podstatně ovlivňují periferní nervový systém a proto překonávají některé z nevýhod běžných opiátů podstatnou prevencí výskytu nežádoucích vedlejších účinků.

V současnosti jsou jednou z mála tříd činidel, o kterých je známo, že působí periferní analgetické účinky, nesteroidní protizánětlivá činidla, jako je kyselina acetylosalicylová, ibuprofen a ketorolak. Tato činidla neinteragují s opioidními receptory, ale je známo, že inhibují cyklooxygenasu a oslabují syntézu prostaglandinu. Tato slabá analgetika nemají centrálně zprostředkované vedlejší účinky, ale mohou způsobit jiné vedlejší účinky jako je ulcerace gastrointestinálního traktu. Předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí peptidů podobných opioidům, které působí periferně, ale v podstatě vylučují nežádoucí vedlejší účinky spojené s běžnými periferně působícími analgetiky.

- 1 CZ 288523 B6

V poslední době bylo ve stavu techniky uvedeno, že existuje významná periferní analgetická aktivita opiátových léčiv. Viz A. Barber a R. Gottschlich, Med.Res.Rev., 12, 525 (1992) aG. Stein, Anasth. Analg., 76, 182 (1993). Kvartémí soli známých centrálně působících opioidních alkaloidů byly použity jako farmakologické sondy pro rozlišení mezi periferními a centrálními analgetickými odpověďmi. Kvartémí soli potentních opiátů mají trvale pozitivní náboj a vykazují omezenou prostupnost hematoencefalickou bariérou: Viz T.W. Smith. a kol., Life Sci., 31, 1205 (1982); T.W. Smith a kol., Int. J. Tiss. Reac., 7,61 (1985); B.B. Lorenzetti a S.H. Ferreira, Braz. J. Med. Biol. Res., 15, (1982); D.R. Brown a L.I. Goldberg, Neuropharmacol., 24, 181 (1985); G. Bianchi a kol., Life Sci., 30, 1875 (1982); a J. Russel a kol., Eur.

J. Pharmacol., 78, 255 (1982). Byly připraveny vysoce polární analogy enkefalinu a demorfinu, které si zachovávají vysoce antinociceptivní aktivitu, ale vykazují omezený prostup do centrálního nervového systému. Viz R.L. Follenfant a kol., Br. J. Pharmacol., 93, 85 (1988); G.W. Hardy a kol., J.Med. Chem., 32, 1108 (1989). Naopak ve známém stavu techniky byly lipofilní opioidní peptidy považovány za snadněji prostupující hematoencefalickou bariérou. Je překvapující, že opioidní peptidy podle tohoto vynálezu jsou vysoce lipofilní, ale podstatně neprostupují hematoencefalickou bariérou.

Na rozdíl od běžných opiátů jsou opioidní peptidy hydrofobní. Jejich hydrofobicita má sklon zvyšovat rychlost jejich odstraňování z těla savce. Hydrofobicita zvyšuje schopnost těchto peptidů procházet epitheliálními bariérami. Nicméně bylo shledáno, že podání opioidních peptidů do savčího těla ovlivňuje centrální nervový systém. Proto bylo vyvinuto mnoho snah o zlepšení absorpčních vlastností těchto sloučenin. Vědci se pokoušeli snížit peptidovou penetraci do centrálního nervového systému zejména tehdy, jestliže by vystavení těla těmto chemikáliím mohlo vyvolat nežádoucí vedlejší účinky nebo dokonce mohlo být toxické.

Bylo uvažováno, že nepolární peptidy procházejí mnohem snadněji do centrálního nervového systému překonáním hematoencefalické bariéiy. Bylo publikováno, že TAPP (H-Tyr-D-AIaPhe-Phe-NH₂) vykazuje antinociceptivní vlastnosti jak periferně tak centrálně (P. Schiller a kol., Proceedings of 20th European Peptide Symposium, (1988)).

Výraz „specificita“ jak je použit v této přihlášce, označuje částečnou nebo úplnou vazbu opiátu nebo opioidního peptidu k jednomu opioidnímu receptorů spíše než k jinému opioidnímu receptorů. Specificita opioidního peptidu je indikována vazebnou inhibiční konstantou Kj. Výraz „selektivita“ označuje schopnost opiátu nebo opioidního peptidu si vybírat mezi několika opioidními receptory a vázat se pouze najeden určitý receptor. Selektivita opioidního peptidu pro receptor je dána poměrem vazebných konstant. Například poměr vazebných inhibičních konstant Κ^δ/Κ^μ je hodnota, která může být použita pro měření selektivity. Tento poměr představuje vztah afinit pro vazbu na μ a δ receptory. Vyšší hodnota tohoto poměru znamená větší preferenci ligandu k vazbě na μ receptor ve srovnání s δ receptorem. Běžný opioidní peptidový analog, H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(NMe)-Gly-ol (DAGO), je znám jako jeden z nejvíce selektivních opioidních peptidových analogů. Tyto peptidy vykazují Κ^δ/Κ^μ hodnotu 1050. Leu-enkefalin naopak vykazuje Κ^δ/Κί^μ hodnotu 0,2. Tato zlomková hodnota odráží zvýšenou afinitu k δ receptorů ve srovnání s receptorem μ.

Peptid musí mít určité předpoklady proto, aby byl farmakologicky použitelný. Za prvé by peptid měl být odolný k proteolytické degradaci. Za druhé by měl peptid vyvolávat zvýšenou biologickou odezvu. Za třetí musí peptid být bezpečný pro člověka. Za čtvrté by peptid měl být schopen být syntetizován ve velkých množstvích jak pro použití v klinických studiích jeho toxicity, tak také později pro komercionalizaci. V tomto případě jsou také menší lipidová rozpustnost a větší rozpustnost ve vodě žádoucí vlastností peptidů, které umožňují zabránit prostup hematoencefalickou bariérou a umožnit rychlé vyloučení jakéhokoliv podaného přebytku peptidu a jeho metabolitů. Dále by bylo žádoucí, aby peptid měl selektivní a specifickou receptorovou vazebnou aktivitu za účelem minimalizace potenciálních vedlejších účinků.

-2CZ 288523 B6

Existuje zde potřeba peptidů, které působí na specifický opioidní receptor, specificky μ receptor. Bylo by žádoucí nalézt peptidy s menší rozpustností v lipidech, než mají běžné opiáty proto, aby nemohla být prostoupena hematoencefalická bariéra. Dále by peptidy s vysokou polaritou měly normálně být rozpustnější ve vodném prostředí o fyziologickém pH, čímž by se usnadnilo jejich vylučování a vylučování jejich metabolitů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje nové sloučeniny, které jsou selektivní a specifické v podstatě pro jeden opioidní receptor. Předložený vynález poskytuje peptidy, které vykazují preferenční selektivitu a specificitu pro μ-opioidní receptor. Vynález také poskytuje peptidy, které primárně interagují s opioidními receptory na periferních nervových zakončeních a podstatně nepřekonávají hematoencefalickou bariéru. Předložený vynález tak snižuje nebezpečnost a počet vedlejších účinků ve srovnání s vedlejšími účinky spojenými s běžnými opiáty a opioidními peptidy, které byl dosud hlášeny.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mají obecný vzorec 1 ve kterém

X, Y a Z znamenají atom vodíku,

Ri je tyrosylový zbytek,

R₂ je vybrán ze skupiny zahrnující D-norvalin, D-serin, a D-arginin,

R₃ a R4 jsou fenylalanylové zbytky a

Q je amidová vazba.

Vynález také poskytuje farmaceuticky přijatelné prostředky obsahující tyto peptidy pro použití při ošetření bolesti.

Vynález také poskytuje použití těchto peptidů pro výrobu periferních analgetik pro léčení bolesti.

Tabulky a obrázky

Tabulka 1 uvádí in vivo a in vitro aktivitu hydrofobních tetrapeptidů příbuzných s dermorfinem.

Obr. 1 představuje časový průběh analgetického účinku morfínu (10 mg.kg'¹) (obr. 1) a příkladů testovaných sloučenin (obr. B: BCH2463; C: BCH2462; D: BCH2687).

Obr. 2 představuje křivky dávkové odezvy pro BCH2463 ve fenylchinonem indukované eseji svíjení se (u myší s.c.) ED₅o = 0,5 mg.kg'¹ 20 minut po podání.

-3CZ 288523 B6

Popis vynálezu

V popise a v nárocích byly použity následující obvyklé zkratky:

Arg - arginin

Phe - fenylalanin

GPI - ileum morčete

MVD - myší chámovod

Nva - norvalin

Ser - serin

Tyr - tyrosin

PBQ - fenyl-p-benzochinon

Tic - kyselina tetrahydroisochinolin-3-karboxylová

TAPP - H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH?

TSSP - H-Tyr-D-Ser-Phe-Phe-NH₂

Výraz „aminokyselina“ jak je zde použit, zahrnuje přirozeně se vyskytující aminokyseliny běžně používané odborníky v oboru chemické syntézy a peptidové chemie.

Výraz „ED₅₀“ jak je uveden v tabulce 1 pro PBQ esej svíjení seje definován jako dávka léčiva, která vyvolává 50% redukci v počtu „zkroucení“ pozorovaných ve srovnání s kontrolou. Výraz „ED₅o“ jak je zde použit v eseji na horké desce je definován jako dávka léčiva vyžadovaná pro zvýšení zpoždění odezvy 2-krát ve srovnání s kontrolou a byla stanovena „paralel-line probit“ analýzou.

Výraz „K“ je vazebná inhibiční konstanta. Výraz „K^/K/“ je hodnota, která může být použita pro měření selektivity. Tento poměr představuje vztah afinit opioidních peptidů pro vazbu na δ a μ receptory.

Výraz „zbytek“, je-li aplikován na aminokyselinu, znamená radikál odvozený od odpovídající aminokyseliny odstraněním hydroxylu karboxylové skupiny a vodíku z aminoskupiny.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mají obecný vzorec 1

X-Ri-RpRá-Q-Rí-N^ ⁽¹⁾ ve kterém

X, Y a Z znamenají atom vodíku,

Ri je tyrosylový zbytek,

R₂ je vybrán ze skupiny zahrnující D-norvalin, D-serin, a D-arginin,

R₃ a R4jsou fenylalanylové zbytky a

Q je amidová vazba.

-4CZ 288523 B6

Nejlepší v současnosti známý způsob provedení vynálezu zahrnuje použití sloučeniny H-Tyr-DArg-Phe-Phe-NH₂.

Byly připraveny 3 tetrapeptidy obecného vzorce 1 a hodnoceny jako ligandy opioidního receptoru a systémově působících analgetických činidel. Tyto sloučeniny jsou uvedeny v tabulce 1 spolu se svými vazebnými inhibičními konstantami a poměry receptorové selektivity.

Některé sloučeniny se strukturou podobnou sloučeninám podle tohoto vynálezu vykazují dobrou vazbu na receptor, ale slabý analgetický účinek v eseji svíjení se myši. Tato anomálie může být způsobena rychlou proteolýzou, rychlým clearence nebo oběma. Například když byl prototypový lipofílní dermorfinový peptid TAPP (BCH1174) vystaven kartáčovému lemu ledvinných membrán, bylo pozorováno, že rychle degraduje během 15 až 30 minut. Sloučeniny uvedené v tabulce 1 vykazují vyšší schopnost periferní analgezie než TAPP. Za použití těchto peptidů nebyl pozorován žádný centrální analgetický účinek ani v dávce 100 mg/kg v testu myš na horké desce.

Jak je uvedeno v tabulce 1, hodnoty ED₅₀ pro H-Tyr-D-Nva-Phe-Phe-NH? (BCH2462), HTyr-D-Ser-Phe-Phe-NH? (BCH2463) a H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH, (BCH2687) jsou 2,7, 0,5 a 0,5.

Výsledky ukazují, že sloučeniny BCH1174 (TAPP), BCH2462 a BCH2463 ještě podléhají proteolýze, ale mají delší poločas a proto jsou jako analgetická činidla účinnější. Na obr. 6 byly porovnány in vivo trvání analgetických účinků vyvolaných BCH1174 (TAPP) a BCH2463 (TSPP). Za použití 30 mg/kg s.c. BCH2463 a 20 mg/kg s.c. BCH1174 (TAPP) ukazuje obr. 3, že doba trvání analgetického účinku BCH1174 (TAPP) je delší, než doba trvání účinku BCH2463, což naznačuje slabé urychlení in vivo proteolýzy u BCH2463 ve srovnání s BCH1174 (TAPP).

Obr. 1A-D představují účinky morfinu, BCH2463 (TSPP), BCH2462 (TNPF) a BCH2687 u myši hodnocením reakce myši ve zkoušce na horké desce. Jak je uvedeno na obr. IA byla doba reakce myši ošetřené 10 mg/kg morfinu přibližně 17 sekund. Doba reakce u myši ošetřené 100 mg/kg BCH2453 (obr. IB) je asi 9 sekund ve srovnání s kontrolní hodnotou přibližně 7 sekund. Tyto výsledky indikují, že zatímco morfin inhibuje nociceptivní tepelný stimul, BCH2463 nikoli; ale BCH2463 je mocné analgetické činidlo, jak je zřejmé z inhibice chemicky vyvolaného svíjení se (obr. 2). Doba reakce myši ošetřené BCH2462 a s BCH2687 (obr. 1C, ID) je přibližně 8 sekund, což naznačuje podobné výsledky jako u BCH2463.

Byly studovány účinky inhibice proteolytického metabolismu BCH2463 inhibitorem DLthiorfanem a také metabolický rozpad BCH2463 zprostředkovaný kartáčovým lemem ledvinových membrán. Získané údaje indikují, že ledviny mohou být základním místem clearence a metabolismu pro sloučeninu BCH2463. Z obr. 2 je zřejmé, že endopeptidasový enzym EC2411, který je inhibován DL-thiorfanem je předběžným mediátorem BCH2463 proteolýzy extraktem ledvinového kartáčového lemu.

BCH2462 (TNPP) vykazuje letální účinky u myši při podání 1 až 5 mg.kg'¹ i.v. bolusové dávky léčiva. Naopak BCH2463(TSPP) překvapivě nevykazuje jakékoliv letální účinky až do 20 mg.kg'¹. Navíc byly peptidy bezpečné při subkutánním podání (s.c.) v dávkách větších než 100 mg.kg¹. Proto je žádoucím způsobem podání pro tyto sloučeniny podání subkutánní. BCH2463 není u myší letální ani v dávkách alespoň tak vysokých jako 20 mg.kg'¹.

Předložený vynález také poskytuje farmaceutické prostředky. Vhodné prostředky obsahují farmaceuticky účinné množství peptidu podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu.

Předložený vynález také poskytuje způsob ošetření bolesti u živočicha jako je savec včetně člověka. Způsob zahrnuje kroky podávání farmaceuticky účinného množství peptidu vzorce 1 pacientovi. Může být také použit farmaceutický prostředek popsaný výše.

-5CZ 288523 B6

Následující příklady jsou použity k lepšímu popisu vynálezu. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nejsou míněny tak, aby vynález jakýmkoliv způsobem omezily.

Příklady provedení vynálezu

Opioidní aktivita peptidů byla hodnocena in vitro za použití podélného svalového přípravku z ilea morčat (guinea pig ileum - GPI) a jejich antinociceptivní aktivita byla stanovena in vivo v PBQ vyvolaných modelech svíjení se (periferní aktivita) a u hlodavců v testu na horké desce (centrální aktivita). Antagonismus antinocicepce u opioidního antagonisty N-methylnalorfinu a porovnání aktivit ve svíjení a testu na horké desce ukazují, že analgetické účinky byly převážně zprostředkovány periferně. Periferní analgezie byla zjištěna jako vysoce potentní v testu svíjení ve spojení s nízkou potencí v testu na horké desce.

Svíjení myši indukované PBQ (fenyl-p-benzochinon) je hodnocením jak centrální tak periferní analgezie. Pro experimentální protokol viz Sigmund a kol., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 95, 729 (1957), který je zde zahrnut jako odkaz. Centrální analgezie byla stanovena inhibicí odezvy na horké desce u myši. Experimentální protokol viz G. Woolfe a A. Macdonald, J. Pharmacol. Exp. Ther., 80, 300 (1944), který je zde zahrnut jako odkaz. Eseje měřící opioidní receptorové vazební afinity pro μ a δ receptory jakož i GPI a MVD eseje byly provedeny podle experimentálního protokolu podle Schillera a kol., Biophys. Res. Commun., 85, 1322 (1975), zahrnutého zde jako odkaz.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu byly připraveny za použití syntézy v pevné fázi jak je uvedena dále a je obecně známá odborníkům v oboru.

Příklad 1

Syntéza opioidních peptidů v pevné fázi

Syntetické peptidy byly připraveny za použití Rink® pryskyřice, 4-(2‘,4‘-dimethoxyfenylFmoc-aminomethyl)-fenoxypiyskyřice (Novabiochem nebo Advanced Chemtech) a relevantního Αα-Fmoc-L-aminokyselinového zbytku každého peptidů, kteiý je syntetizován.

Všechny L- a D-aminokyseliny (Novabiochem nebo Advanced Chemtech) měly své alfaskupiny Fmoc-chráněné (9-fluorenylmethyloxykarbonyl) a následujícími chránícími skupinami postranního řetězce: terc.-butylether (tBu) pro serin, a 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc) pro arginin.

Dimethylformamid (Anachemia) byl čistoty „prostý dimethylaminu“ a byl zpracován s aktivovanými 4 A molekulovými síty. Piperidin (Advanced Chemtech) byl použit bez dalšího čištění. DCC (dicyklohexylkarbodiimid) a HOBt (hydroxybenzotriazol) byly získány od Fluka a Advanced Chemtech.

Syntéza peptidů v pevné fázi byla provedena manuálně na Rink® pryskyřici. Vsádka byla přibližně 0,6 mmol/g. Peptidová kondenzace byla provedena za použití: 1) kopulace: 2 ekvivalenty každého z Fmoc-aminokyseliny, HOBt a DCC v DMF po 1-4 hodiny při teplotě místnosti. 2) rekopulace: 1 ekvivalent každé Fmoc-aminokyseliny, HOBt a DCC. 3) acetylace: 20 % (objemových), (CH^CO^O/DCM po 1 hodinu při teplotě místnosti. 4) Ν-α-Fmoc deprotekce: 20 % (objemových) piperidin v DMF po 25 minut.

Odstranění chránících skupin postranního řetězce (tBu, Pmc) a odštěpení peptidů z pryskyřice bylo provedeno pomocí koktejlu obsahujícího TFA (objemově) 55/5/40 TFA/anisol/DCM po

-6CZ 288523 B6 minut při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku. Peptid byl vysrážen z diethyletheru, filtrován a sušen. Surový peptid byl čištěn a analyzován pomocí HPLC na koloně s reverzní fází s gradientem eluce využívajícím 0,06 % TFA/H2O a 0,06 % TFA/acetonitril.

Příklad 2

Esej s horkou deskou

Měření analgetické aktivity

Pro tento test byli použiti CD #1 samci myší o hmotnosti mezi 20 a 25 g. Myši byly zváženy, označeny a rozděleny do skupin po 10.

Myši byla obvykle podána subkutánní injekce sloučeniny (nebo standardu nebo média) v injekčním objemu odpovídajícím 0,1 ml/lOg p.c. (lOml/kg). Jestliže byl použit antagonista jako Naloxon nebo N-methyl-levallorphan, byl podáván intraperitoneálně 20 minut před podáním sloučeniny (nebo standardu nebo média). Injekční objem byl také 0,1 ml/10 g p.c. Dávka antagonisty byla 10 mg/kg.

Myši byly jednotlivě hodnoceny na reakční dobu na horké desce. Teplota horké desky (Sorel, model DS37) byla 55 °C. Myš byla pozorována na znaky nepohodlí jako je lízání nebo třepání tlapkami, pokusy o únik (vyskakování na desce) nebo třas. Reakční doba byla změřena když se objevil jeden z těchto znaků a byla zaznamenána v „sekundách“. Každá myš byla pozorována maximálně po 30 sekund tak, aby bylo zabráněno poškození tkáně tlapek. Myši byly pozorovány v různých časových intervalech po podání sloučeniny nebo média nebo standardu). Časové intervaly mohou být 30, 60 nebo 120 minut (nebo jiné).

V každé době odečtení byly násobeny průměrné reakční doby kontrolní skupiny 1,5. Reakční doba každé ošetřené myši byla porovnána s „průměrem kontroly x 1,5“. Jestliže reakční doba byla horší než u „kontrolní průměr x 1,5“ byla myš považována za nemající analgetický účinek. Jestliže reakční doba byla vynikající ke „kontrolní průměr x 1,5“ pak byla myš považována za mající analgetický účinek. Počet analgetických myší ve skupině stanovuje procenta analgeze sloučeniny pro tento odečet. Jestliže procenta analgeze byla horší než 30 %, byla sloučenina považována za negativní.

Příklad 3

Esej svíjení

Měření zkroucení (svíjení)

Test byl proveden na CD#1 samcích myši o hmotnosti mezi 18 a 22 g. Myši byly zváženy a označeny. Pak byly injektovány intraperitoneálním způsobem, s 0,3 ml/2 g hmotnostních s roztokem fenylchinonu 0,02%. Zkroucení, která se objevují během 15 minutové periody po injekci, byla spočtena. Fenylchinon byl injektován v časových intervalech 5,20 nebo 60 minut po podání sloučeniny (nebo média nebo standardu) subkutánním způsobem. Byl injektován v časových intervalech 60 minut po podání sloučeniny (nebo média nebo standardu) orálním způsobem.

0,02% fenylchinonový (2-fenyl-l,4-benzochinon (Sigma)) roztok byl připraven následujícím způsobem. 20 mg fenylchinonu bylo rozpuštěno v 5 ml ethanolu 90% (Sigma, činidlo, alkohol). Rozpuštěný fenylchinon byl pomalu přidán k 95 ml destilované vody kontinuálně třepané a předehřáté (nevařené). Fenylchinonový roztok byl po celou dobu chráněn před světlem a nový

-7CZ 288523 B6 roztok byl připravován pro test každý den. Doporučuje se počkat 2 hodiny před použitím fenylchinonového roztoku.

Test může být prováděn na 5 myších současně. Každá skupina obvykle obsahuje 10 myší. Je-li použit antagonista jako naloxon, podává se 20 minut před sloučeninou (nebo médiem nebo standardem) intraperitoneálním způsobem.

Tabulka 1

BCH č.	Sekvence	Κ,μ	K+ZK8	GPI (IC50) (nM)	EDso(PBQ) mg/kg (20 min)	mg/kg
2462	H-Tyr-D-Nva-Phe-Phe-NH2				2,7	>100
2463	H-Tyr-D-Ser-Phe-Phe-NH2	2,2		13	0,5	>100
2687	H-Tyr-D—Arg-Phe-Phe-NH?	0,88	2480	8,71	0,5	>100

PATENTOVÉ NÁROKY