Sada primerů, diagnostický set, způsob detekce mutace V600E v genu BRAF a jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového způsobu detekce pro diagnostiku mutace V600E v genu BRAF pomocí metody LAMP a specifických sekvencí rozeznávající pouze mutovanou variantu genu. Mutace V600E je diagnostický biomarker stanovovaný u vybraných onkologických diagnóz k určení účinné léčby.

Dosavadní stav techniky

Za vznikem nádorových onemocnění často stojí bodové mutace v původních protoonkogenech. Příkladem takové onkogenní mutace je i záměna bazí tyminu za adenin na pozici 1799 v protoonkogenu BRAF, mající za následek změnu smyslu kodonu 600 z valinu (V) na kyselinu glutamovou (E), zapisovanou zkráceně jako BRAF V600E. Funkční důsledek této mutace spočívá v trvalé aktivaci onkoproteinu B-raf, která je nezávislá na vnějších signálech, a následné aktivaci signální dráhy MEK/ERK stimulující proliferaci a migraci buněk. Mutace V600E je přítomna až u 50 % případů maligního melanomu a 45 % papilárních nádorů štítné žlázy, v menší míře pak u kolorektálního karcinomu (10 %) nebo nemalobuněčného karcinomu plic (3 %) (Corcoran RB. New therapeutic strategies for BRAF mutant colorectal cancers. J Gastrointest Oncol. 2015;6(6):650-659; Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer. 2005;12(2):245-262). U všech jmenovaných nádorů byl prokázán negativní prognostický význam, přičemž pacienti nesoucí tuto mutaci vykazují výrazně horší odpověď na léčbu ve srovnání s pacienty bez mutace. Tyto poznatky přispěly v posledních letech ke zvýšení úspěšnosti cílené léčby díky novým inhibitorům mutovaného B-raf proteinu, a to zejména u melanomu.

Standardní metody detekce mutace V600E v genu BRAF zahrnují zejména sekvenování nové generace nebo digitální PCR, které jsou ovšem z hlediska instrumentace i chemie nákladné a zároveň časově náročné. Izotermální amplifikační techniky představují levnější i rychlejší variantu analýzy DNA, a to i v případě bodových mutací. Jedná se o techniky s konstantní teplotou během amplifikace cílové DNA, a tudíž nevyžadující PCR cyklery. Navíc dosahují srovnatelné citlivosti jako PCR, ale jsou obvykle odolnější vůči případným inhibitorům PCR reakce. Nejznámější z nich je zřejmě LAMP, neboli loop-mediated isothermal amplification, (Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63), využívající 4 až 6 primerů. Při nasedání primerů dochází k tvorbě smyček (loop), specifických struktur ve tvaru činky (dumbell) a amplikonů o různých délkách v průběhu jedné reakce, takže při vizualizaci na agarózovém gelu se místo klasického jednoho proužku objevuje žebříček složený z různě dlouhých LAMP produktů. Nejčastěji se metoda LAMP používá k detekci patogenů v nejrůznějších vzorcích (potraviny, půda, klinické vzorky aj.). Možnost rozpoznání bodové mutace (single nucleotide polymorphism, SNP) při nasedání primerů, kde v závislosti na přítomnosti mutace dochází, nebo nedochází k amplifikaci, je ovšem mnohem náročnější proces a dosud nebyl příliš úspěšný. Navíc v rámci studií, kde byla použita metoda LAMP pro detekci bodových mutací, byly často využity dodatečné sondy, nebo restrikční analýzy pro zvýšení selektivity stanovení. Ve stavu techniky chybí snadná a rychlá metoda detekce bodové mutace V600E genu BRAF, která by byla zároveň robustní vůči případným inhibitorům PCR reakce.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je založený na amplifikaci V600E mutované formy genu BRAF pomocí metody LAMP (obr. 1), využívající specifické primery pro mutaci V600E (sada primerů

- 1 CZ 2023 - 403 A3 s označením BRAF V600E). Pomocí předkládané metody je možné rychle, jednoduše a s vysokou citlivostí a specificitou detekovat přítomnost V600E mutace genu BRAF. V rámci analýzy nedochází k amplifikaci nemutované, tzv. wild-type (wt) formy BRAF genu, u které je výsledek negativní (obr. 1B). Předkládáme i druhou sadu primerů s označením ACTB, která amplifikuje gen ACTB a tato souběžná reakce slouží jako kontrola amplifikace potvrzující přítomnost a integritu genomové DNA ve vzorku. Reakce s primery ACTB je tedy kontrolní, jelikož negativní výsledek reakce se sadou primerů BRAF V600E by mohl být rovněž způsoben nedostatečným množstvím DNA, případně její degradací, obzvlášť u vzorků získaných např. ze séra. Vyvinutý způsob detekce mutované formy genu BRAF pomocí metody LAMP s využitím níže popsané sady primerů umožňuje kvalitativní zjištění přítomnosti mutace ve vzorku a tedy i aktivace onkoproteinu B-raf, to vše bez nutnosti použití dodatečných sond nebo restrikční analýzy, což dosavadní způsoby detekce nedovolovaly. Předkládaný vynález navíc nevyžaduje drahé laboratorní vybavení typu PCR cykleru nebo Real-Time PCR cykleru, ale stačí pouze termoblok nebo inkubátor s teplotním rozsahem do cca 70 °C. Minimální množství literatury popisující LAMP metodu pro analýzu SNP svědčí o náročnosti designu vhodných primerů, a ve stavu techniky neexistuje možnost stanovit BRAF V600E mutaci pomocí LAMP metody jenom s využitím jedinečné sady primerů. Současné metody detekce mutací pomocí variant metody PCR (ddPCR, ARMS-PCR, qPCR, aj.) vyžadují vícekrokové protokoly, delší čas reakce, případně dodatečné fluorescenční sondy, což zvyšuje celkovou časovou i materiální náročnost stanovení. Předkládaný vynález nabízí jednoduchou a rychlou možnost sledování progrese onkologických onemocnění - predikce rezistence na BRAF inhibitory (např. encorafenib, vemurafenib).

Předmětem předkládaného vynálezu je sada primerů pro detekci mutace BRAF V600E v lidské DNA, obsahující čtyři primery pro amplifikaci DNA, které mají následující sekvence:

Název	Sekvence 5' - 3'
BRAF V600E_F3 (SEQ ID NO: 1)	CTGATAGGAAAATGAGATCTACTG
BRAF V600E_B3 (SEQ ID NO: 2)	GGCCAAAAATTTAATCAGTGG
BRAF V600E_FIP (SEQ ID NO: 3)	TCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTCCTTTACTTACTA CACCTC
BRAF V600E_BIP (SEQ ID NO: 4)	AGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCAAAATAGCCTCAATTCTT ACCAT

Výše uvedená sada primerů je určená pro amplifikaci DNA pocházející z biologických vzorků (Homo sapiens), například ze vzorků FFPE (formalin-flxed, parafin-embedded) bloků odebraných pacientům s kolorektálním karcinomem, maligním melanomem nebo papilárním nádorem štítné žlázy.

Ve výhodném provedení obsahuje sada primerů dále dva následující přídavné primery pro amplifikaci DNA, které mají následující sekvence:

Název	Sekvence 5' - 3'
BRAF V600E_LF (SEQ ID NO: 5)	TCTTCATGAAGAAATATATCT
BRAF V600E_LB (SEQ ID NO: 6)	CATCAGTTTGAACAGTTGT

Přítomnost přídavných primerů zvyšuje efektivitu metody LAMP a zkracuje čas detekce.

Výše popsaná sada primerů je určená k amplifikaci úseku genu BRAF (B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase). Primery podle předkládaného vynálezu se specificky vážou na cílovou

- 2 CZ 2023 - 403 A3

DNA, sekvence sloužící jako templát má velikost 210 bp. Výsledný produkt LAMP amplifikace je složen z různě dlouhých fragmentů a je stanovitelný horizontální elektroforézou v agarózovém gelu, kde má tvar žebříčku. Příslušný úsek genu s polohou úseků (tučně), na které nasedají primery BRAF V600E_F3, BRAF V600E_B3, BRAF V600E_FIP, BRAF V600E_BIP, BRAF V600E_LF a BRAF V600E_LB, má sekvenci:

CATTGTTTTAGACATACTTATTGACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTACTATGTTTTAA AGAATATTATATTACAGAATTATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATG CTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTAC AGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCAT TTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTG AGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTATAGTATTTTCATAG TTCCCAGTATTCACAAAAATCAGTGTTCTTATTTTTTATGTAAATAGATTTTTTAAC (SEQ ID NO: 7)

GAG - mutovaná varianta (V600E), na adenin “A“ hybridizuje 5'-konec BRAF V600E_FIP i 5'-konec BRAF V600E_BIP.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále sada primerů pro detekci genu ACTB v lidské DNA, obsahující primery pro amplifikaci DNA, které mají následující sekvence:

Název	Sekvence 5'- 3'
ACTB_F3 (SEQ ID NO: 8)	GGGCTTCTTGTCCTTTCCTT
ACTB _B3 (SEQ ID NO: 9)	TCAGCAGCACGGGGT
ACTB _LF (SEQ ID NO: 10)	GCCCACATAGGAATCCTTCT
ACTB _LB (SEQ ID NO: 11)	ACTGGGACGACATGGAGAAAATCT
ACTB _FIP (SEQ ID NO: 12)	CCTCTCTTGCTCTGGGCCTCGTGTGATGGTGGGCATGGGT
ACTB _BIP (SEQ ID NO: 13)	CATCGAGCACGGCATCGTCACCACACGCAGCTCATTGT

Výše uvedená sada primerů je určená pro amplifikaci DNA pocházející ze stejných biologických vzorků (Homo sapiens) jako sada primerů pro detekci mutace BRAF V600E. Cílem použití sady primerů pro detekci ACTB je kontrola, že pro LAMP amplifikaci bylo použito dostatečné množství genomové DNA a reakce proběhla.

Výše popsaná sada primerů je určená k amplifikaci úseku genu ACTB (actin beta). Sekvence sloužící jako templát má velikost 218 bp. Výsledný produkt LAMP amplifikace je složen z různě dlouhých fragmentů a je stanovitelný horizontální elektroforézou v agarózovém gelu, kde má tvar žebříčku. Příslušný úsek genu s polohou úseků, na které nasedají primery ACTB_F3, ACTB_B3, ACTB_FIP, ACTB_BIP, ACTB_LF a ACTB_LB, má sekvenci:

GGCACCAGGTAGGGGAGCTGGCTGGGTGGGGCAGCCCCGGGAGCGGGCGGGAGGC AAGGGCGCTTTCTCTGCACAGGAGCCTCCCGGTTTCCGGGGTGGGGGCTGCGCCCGT GCTCAGGGCTTCTTGTCCTTTCCTTCCCAGGGCGTGATGGTGGGCATGGGTCAG AAGGATTCCTATGTGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCATCCTCACCCTG AAGTACCCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAAATC TGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCGTGC

- 3 CZ 2023 - 403 A3

TGCTGACCGAGGCCCCCCTGAACCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGGTG AGTGGCC (SEQ ID NO: 14)

Všechny výše popsané primery lze připravit standardními metodami oligonukleotidové syntézy.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále diagnostický set pro detekci biomarkeru BRAF mutace V600E, který lze využít při detekci aktivace onkoproteinu B-raf a s ní spojených rizik rozvinutí některých onkologických onemocnění, například kolorektálního karcinomu, maligního melanomu nebo papilárního nádoru štítné žlázy, pomocí LAMP amplifikace. Uvedený diagnostický set obsahuje:

- obě výše popsané sady primerů pro detekci mutace BRAF V600E a pro detekci genu ACTB,

- reakční směs pro LAMP amplifikaci, obsahující nukleosidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP, dTTP a DNA polymerázu, popřípadě dále hořečnatou sůl (například MgCL nebo MgSO4) pro vytvoření termostabilního komplexu s nukleosidtrifosfáty, který je rozpoznán DNA polymerázou. DNA polymerázou je Bst polymeráza (Bacillus stearothermophilus), nebo její varianty (2.0, 3.0, Turbo, aj.).

Diagnostický set může dále obsahovat pufr (například tris-borát-EDTA (TBE) pufr) a/nebo deionizovanou vodu.

Reakční směsi pro LAMP amplifikaci jsou komerčně dostupné a odborník v oboru by věděl, kde potřebnou reakční směs získat a jak ji použít pro LAMP amplifikaci.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob detekce mutace V600E v genu BRAF ve vzorku DNA metodou izotermální LAMP amplifikace, obsahující následující kroky:

1) izolace DNA ze vzorku; a

2) provedení amplifikace DNA metodou LAMP s použitím sady primerů pro detekci mutace BRAF V600E definované výše.

Izolaci DNA ze vzorku lze provést běžně dostupnými metodami, které jsou odborníkovi v oboru známé, například frakční separací, extrakcí pomocí kolonkové sady, apod.

Ve výhodném provedení se dále provede krok 3) amplifikace DNA metodou LAMP s použitím výše definované sady primerů pro detekci ACTB, přičemž koncentrace DNA ve vzorku v kroku 2) je stejná jako koncentrace DNA ve vzorku v kroku 3).

Ve výhodném provedení uvedený způsob detekce mutace V600E v genu BRAF ve vzorku DNA metodou izotermální LAMP amplifikace obsahuje následující kroky:

(i) izolace DNA ze vzorku;

(ii) poskytnutí směsi pro detekci BRAF metodou LAMP amplifikace, obsahující:

vzorek DNA, sadu primerů pro detekci mutace BRAF V600E definovanou výše, reakční směs pro LAMP amplifikaci, deionizovanou vodu;

(iii) poskytnutí kontrolní směsi pro detekci ACTB metodou LAMP amplifikace, obsahující: vzorek DNA, sadu primerů pro detekci genu ACTB definovanou výše, reakční směs pro LAMP amplifikaci, deionizovanou vodu, přičemž koncentrace vzorku DNA a primerů ve směsi je stejná jako koncentrace vzorku DNA a primerů ve směsi z kroku (ii);

- 4 CZ 2023 - 403 A3 (iv) LAMP amplifikace směsí z kroku (i) a (ii);

(v) gelová elektroforéza amplifikovaných směsí z kroku (iv);

(vi) vyhodnocení přítomnosti mutace V600E v genu BRAF ve vzorku DNA.

Ad i): Vzorek DNA, určený k analýze, je například vzorkem tkáně, séra nebo krve subjektu. V některých případech může být vhodné připravit vzorek DNA pomocí různých metod extrakce, které izolují a čistí DNA od okolních složek vzorku. Tyto čisticí metody jsou odborníkovi v oboru známé.

Ad ii) a iii): Poskytnutím směsi pro detekci BRAF metodou LAMP amplifikace se rozumí poskytnutí sady primerů BRAF V600E_F3, BRAF V600E_B3, BRAF V600E_FIP a BRAF V600E_BIP, popřípadě dále obsahující primery BRAF V600E_LF a BRAF V600E_LB, definované výše. Primery lze připravit standardními metodami oligonukleotidové syntézy. Součástí směsi v kroku (ii) je dále vzorek DNA, určený k analýze.

Reakční směs pro LAMP amplifikaci je komerčně dostupná a typicky obsahuje nukleosidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP, dTTP a DNA polymerázu.

Je důležité mít dostatečné množství cílové DNA v reakční směsi, aby bylo možné úspěšně amplifikovat cílovou sekvenci. Pokud je vzorek DNA nedostatečný, mohou se objevit falešně negativní výsledky. Tomu zabrání použití kontrolní směsi z kroku (ii), kde se použijí stejné koncentrace všech složek, pouze sada primerů je rozdílná - použije se sada primerů pro detekci genu ACTB, definovaná výše. Při použití sady primerů pro detekci genu ACTB by, při použití dostatečného množství DNA, měla být amplifikace viditelná bez ohledu na přítomnost/nepřítomnost mutace BRAF V600E. Uvedená směs tedy slouží jako kontrola, že koncentrace DNA ve studovaném vzorku je dostatečná pro průběh LAMP reakce.

Ve výhodném provedení je množství genomové DNA ve studovaném vzorku pro LAMP analýzu v rozmezí od jednotek nanogramů do jednotek mikrogramů, výhodněji je koncentrace DNA ve vzorku pro LAMP analýzu v rozmezí od 5 ng/pl do 100 ng/pl. V jednom provedení je koncentrace DNA ve vzorku pro LAMP analýzu 10 ng/pl.

Každý primer (FIP, BIP, F3, B3, popřípadě LF a LB) by měl být přítomen v reakční směsi v koncentraci obvykle v rozmezí od 0,1 do 2 pM. Přesná koncentrace primerů se může lišit podle optimalizace. V jednom provedení je koncentrace primerů ve vzorku pro LAMP analýzu následující: 1,6 μM FIP; 1,6 μM BIP, 0,4 μM LF; 0,4 μM LB; 0,2 μM F3; 0,2 μM B3.

Optimální koncentrace deoxyribonukleosidtrifosfátů (dNTP) jsou obvykle v rozmezí od 0,4 do 2,4 mM pro každý dNTP. Celková koncentrace dNTP by měla být dostatečně vysoká pro podporu amplifikace DNA, ale zároveň ne nadbytečně vysoká, aby se zabránilo nepříznivým vedlejším reakcím. V jednom provedení je koncentrace dNTP ve vzorku pro LAMP analýzu v rozmezí od 1,2 do 1,6 mM.

DNA polymerázou je s výhodou Bst polymeráza, výhodněji je její koncentrace ve vzorku pro LAMP analýzu v rozmezí od 0,30 do 0,34 U/pL.

Ad (iv): LAMP amplifikace směsí z kroku (ii) a (iii) se s výhodou provede při teplotě v rozmezí od 60 do 65 °C, po dobu alespoň 30 min. Jako kontrolu lze použít vzorek bez DNA, například pouze deionizovanou vodu.

Ad (v): Detekce výsledků amplifikovaných směsí a případně kontrolního vzorku se provede gelovou elektroforézou. V jednom provedení se v tomto kroku amplifikovaná reakční směs smíchá s nanášecím pufrem (nanášecí pufr je roztok obsahující barvivo a glycerol a popřípadě

- 5 CZ 2023 - 403 A3 další přídavné látky jako sacharózu apod.), vzorky se nanesou na agarózový gel s přídavkem barviva pro nukleové kyseliny a podrobí elektroforéze. Při elektroforéze dojde k separaci amplifikované směsi na základě velikosti/hmotnosti amplikonů. Porovnáním se standardem se následně vyhodnotí, zda k reakci došlo či nikoliv na základě přítomnosti/nepřítomnosti specifického LAMP produktu.

Ad (vi): Vyhodnocení přítomnosti mutace V600E v genu BRAF ve vzorku DNA se provede následujícím způsobem: Nejprve se vyhodnotí, zda byla koncentrace DNA ve vzorku dostatečná. To se zjistí elektroforézou amplifikované směsi z kroku (iii), obsahující primery pro detekci genu ACTB. Pokud uvedená směs obsahuje při porovnání se standardem specifický LAMP produkt, byla koncentrace DNA ve vzorku dostatečná a následuje vyhodnocení elektroforézy amplifikované směsi z kroku (ii), obsahující primery pro detekci mutace BRAF V600E. Pokud tato směs obsahuje při porovnání se standardem specifický LAMP produkt, znamená to, že studovaný vzorek DNA obsahoval genovou mutaci BRAF V600E.

V případě, že amplifikovaná směs z kroku (iii), obsahující primery pro detekci genu ACTB, neobsahuje při porovnání se standardem specifický LAMP produkt, byla koncentrace DNA ve vzorku nedostatečná a je potřeba detekci mutace V600E v genu BRAF ve vzorku DNA metodou izotermální LAMP amplifikace zopakovat s koncentrovanějším vzorkem DNA (je možné zvýšit množství vzorku použitého v reakci, nebo prodloužit reakční čas).

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití sady primerů pro detekci mutace BRAF V600E, obsahující:

Název	Sekvence 5' - 3'
BRAF V600E F3	CTGATAGGAAAATGAGATCTACTG
(SEQ ID NO: 1)
BRAF 600E_B3 (SEQ ID NO: 2)	GGCCAAAAATTTAATCAGTGG
BRAF V600E_FIP (SEQ ID NO: 3)	TCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTCCTTTACTTACTA CACCTC
BRAF V600E_BIP (SEQ ID NO: 4)	AGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCAAAATAGCCTCAATTCTT ACCAT

a popřípadě dále obsahující

Název	Sekvence 5' - 3'
BRAF V600E_LF (SEQ ID NO: 5)	TCTTCATGAAGAAATATATCT
BRAF V600E_LB (SEQ ID NO: 6)	CATCAGTTTGAACAGTTGT

a/nebo diagnostického setu definovaného výše pro detekci mutace BRAF V600E ve vzorku DNA, s výhodou metodou LAMP.

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Schéma SNP specifické LAMP reakce. Pro průběh reakce jsou esenciální 4 primery: F3, B3, FIP, BIP. Přídavné primery LF a LB zvyšují efektivitu LAMP reakce a zkracují čas

- 6 CZ 2023 - 403 A3 detekce. Kjejich nasedání dochází až ve druhém kroku amplifikace (nezobrazeno). Oligonukleotid na 5' konci primerů FIP a BIP zajišťuje rozeznání mutace a specificitu její amplifikace. V přítomnosti nemutovaného (wt) templátu nedochází ke správnému nasednutí primerů a amplifikace neprobíhá.

Obrázek 2: Výsledky kvalitativního stanovení vizualizované na gelu.

A: V LAMP reakci byla použita sada primerů specifických pro V600E mutaci v genu BRAF.

B: V LAMP reakci byla použita sada primerů specifických pro gen ACTB.

Obrázek 3: Výsledky kvalitativního stanovení ve dvou časových intervalech 30 a 60 minut vizualizované na gelu.

A: V LAMP reakci byla použita sada primerů specifických pro V600E mutaci v genu BRAF (SEQ ID NO: 1 až 4).

B: V LAMP reakci byla použita výhodnější sada primerů specifických pro V600E mutaci v genu BRAF (SEQ ID NO: 1 až 6).

Obrázek 4: Výsledky kvalitativního stanovení vizualizované na gelu.

A: V LAMP reakci byla použita sada primerů specifických pro V600E mutaci v genu BRAF.

B: V LAMP reakci byla použita sada primerů specifických pro gen ACTB.

Obrázek 5: Cílová sekvence (SEQ ID NO: 7) Homo sapiens B-Raf proto-onkogenu (BRAF) na chromozomu 7 s vyznačenými oblastmi pro nasedání primerů.

Obrázek 6: Cílová sekvence (SEQ ID NO: 14) Homo sapiens aktinu beta (ACTB) na chromozomu 7 s vyznačenými oblastmi pro nasedání primerů.

Příklady uskutečnění vynálezu

Materiál a instrumentace potřebné k stanovení mutace V600E v genu BRAF a přítomnosti genu ACTB pomocí sady podle předkládaného vynálezu:

Materiál • deionizovaná voda • pipetovací špičky s filtrem • mikrozkumavky (0,2 ml) nebo 96-/384-jamková deska • reakční směs pro LAMP amplifikaci ve variantě 2x Master Mix (obsahuje nukleosidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP, dTTP [každý 2,8 mM], MgSO4 [16 mM] a Bst polymerázu [0,64 U/pl]);

• agaróza • 0,5x TBE pufr, pH 8 • GelRed barvivo nukleových kyselin pro vizualizaci pod UV světlem • 6x nanášecí pufr na gel (PCR vkládací pufr)

Instrumentace a příslušenství • termoblok nebo termomixér • horizontální elektroforetická aparatura • kamerový systém pro vizualizaci gelu s UV zářičem

- 7 CZ 2023 - 403 A3

Příklad 1: Způsob kvalitativního stanovení přítomnosti mutace V600E genu BRAF

Amplifikace DNA pomocí isotermální amplifikační techniky LAMP byla provedena následovně:

Směs níže uvedených komponent byla amplifikována při teplotě 62 °C po dobu 30 min (bez nutnosti denaturace nebo deaktivace).

Komponenta	Množství	Původní koncentrace	Finální koncentrace
2x LAMP Master Mix složen z: dNTP mix Mg^ Bst polymeráza Reakční pufr	5 μΐ	2χ 2,8 mM 16 mM 0,64 U/μΙ 2χ koncentrovaný	lx 1,4 mM 8 mM 0,32 U/μΙ 1 x koncentrovaný
mix primerů pro detekci BRAF nebo ACTB genu (v závislosti na sekvenci)	0,4 μΐ	40 μΜ FIP; 40 μΜ ΒΙΡ	1,6 μΜ FIP; 1,6 μΜΒΙΡ
0,4 μΐ	10 μΜ LF; 10 μΜ LB	0,4 μΜ LF; 0,4 μΜ LB
0,4 μΐ	5 μΜΕ3; 5 μΜΒ3	0,2 μΜ F3; 0,2 μΜΒ3
deionizovaná voda	2,8 μΐ
DNA vzorek	1 μΐ	100 ng/μΐ	10 ng/μΐ

celkový objem 10 μΐ

Po ukončení inkubace byla reakční směs smíchána s 6x nanášecím pufrem a vzorky byly pipetovány na 1,5% agarózový gel s přídavkem barviva na nukleové kyseliny a vloženy do horizontální elektroforetické aparatury naplněné TBE pufrem, kde došlo k separaci směsi na základě velikosti/hmotnosti amplikonů. Po ukončení separace byl gel vyfocen, a bylo prokázáno, zda k reakci došlo či nikoliv na základě přítomnosti specifického LAMP produktu. Jako pozitivní kontrola byl použit vzorek DNA z buněčné linie s mutací V600E (A375), jako negativní kontrola byl použit vzorek bez DNA (blank). Jako interní kontrola kvality vzorku byl aktin (ACTB).

Výsledky

Pro reakci bylo použito 6 nádorových buněčných linií (A375, HT29, Caco2, SW620, LAPC4 a PÁNCI) se známým mutačním statutem genu BRAF. Kontrolní vzorek neobsahoval DNA, ale pouze vodu (blank). Těchto sedm vzorků bylo testováno metodou LAMP za přítomnosti sady primem BRAF V600E, obsahující výše definované primery BRAF V600E F3, BRAF V600EB3, BRAF V600E_FIP, BRAF V600E_BIP, BRAF V600E LF a BRAF V600E LB (obr. 2A) a sady primem ACTB, obsahující výše definované primery ACTB F3, ACTB B3, ACTBFIP, ACTBBIP, ACTB LF a ACTB LB (obr. 2B). Při použití sady primem BRAF V600E došlo k amplifikaci pouze u buněčných linií A375 a HT29, které nesou mutaci BRAF V600E. U ostatních linií k amplifikaci nedošlo, neboť nesou pouze nemutovanou varianto genu (wt). Při použití sady ACTB byla amplifikace pozorována u všech vzorků kromě blanku, což dokazuje, že bylo v reakci přítomno dostatečné množství genomové DNA a reakce proběhla. Výsledky experimentu jsou uvedené v tabulce 1.

Tabulka 1: Buněčné linie se známým statutem genu BRAF. Linie HT29 je heterozygotaí, tj. nese jak mutovanou varianto V600E, tak i varianto nemutovanou (wt, wild-type).

-8CZ 2023 - 403 A3

Buněčná linie	BRAF statut	Výsledek reakce
A375	V600E/V600E	Pozitivní
HT29	V600E/wt	Pozitivní
Caco2	wt/wt	Negativní
SW620	wt/wt	Negativní
LAPC4	wt/wt	Negativní
PANC1	wt/wt	Negativní

Jak je z výsledků patrné, vyhodnocení pomocí gelové elektroforézy není kvantitativní, neboť např. signály vzorků A375 i HT29 vykazují na gelu stejnou intenzitu, avšak linie A375 nese mutaci v obou kopiích genu, kdežto linie HT29 nese jednu wt a jednu mutovanou variantu genu. Avšak z klinického hlediska je i přítomnost jedné mutované alely (častější případ) klíčovým faktorem pro výběr vhodné léčby.

V následujícím experimentu bylo použito 10 vzorků DNA izolovaných z FFPE bloků pacientů s kolorektálním karcinomem, které byly sekvenovány s cílem zjistit přítomnost mutace BRAF V600E. U vzorků MUT1 až MUT5 byla zjištěna přítomnost mutace V600E v 22 až 29 % sekvenovaného množství DNA, u vzorků WT1 až WT5 nebyla mutace BRAF V600E detekována (ND). Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.

Tabulka 2: DNA izolovaná z FFPE bloků pacientů s kolorektálním karcinomem. Přítomnost mutace V600E u vzorku MUT1 až MUT5 zjištěna při sekvenování je vyjádřena v procentuálním zastoupení DNA. U vzorků WT1 až WT5 nebyla při sekvenování mutace detekována (ND).

Pacient	BRAF V600E	Výsledek reakce
MUT1	22 %	Pozitivní
MUT2	23 %	Pozitivní
MUT3	24 %	Pozitivní
MUT4	29 %	Pozitivní
MUT5	26 %	Pozitivní
WT1	ND	Negativní
WT2	ND	Negativní
WT3	ND	Negativní
WT4	ND	Negativní
WT5	ND	Negativní

Těchto deset vzorků bylo testováno primery pro BRAF V600E, obsahující výše definované primery BRAF V600E_F3, BRAF V600E_B3, BRAF V600E_FIP, BRAF V600E_BIP, BRAF V600E_LF a BRAF V600E_LB (obr. 4A) a sady primerů ACTB, obsahující výše definované primery ACTB_F3, ACTB_B3, ACTB_FIP, ACTB_BIP, ACTB_LF a ACTB_LB (obr. 4B). Stejně tak jako u testování buněčných linií o známém BRAF statutu, u vzorků testovaných primery pro BRAF V600E pouze vzorky, u kterých byla detekována mutace při sekvenování, mají na gelu viditelný vzor LAMP produktů. Při tomto testu byly zahrnuty i vzorky bez přídavku templátu (blank), nemutovaná kontrola (SW620, wt/wt) a mutovaná kontrola (A375, V600E/V600E). Slabší signály u vzorků WT1 až WT5 bez viditelného specifického vzoru produktů odpovídají především přítomné RNA a dalším kontaminacím, která se do vzorku dostaly při izolaci tkáně z FFPE bloků (u buněčných linií není viditelná). U vzorků testovaných primery pro ACTB byla amplifikace pozorována u všech vzorků kromě blanku, což dokazuje, že bylo v reakci přítomno dostatečné množství genomové DNA a reakce proběhla.