Tento vynález ee týká oblasti technologie rekombinantni ONA, tj. způsobů používaných ve zmíněné technologii rekombinantni ONA a produktů získaných těmito způsoby.

Tento vynález ee zvláště týká způsobu přípravy replikovatelného expresního vektoru, který obsahuje ONA sekvence zahrnující sekvenci kódující zralý lidský leukocytárni interferon s částečnou aminokyselinovou sekvenci Cye-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Glu-Ile-Met-Arg-Ser, se 165 až 166 aminokyselinami a s aminokyselinou Asp, Glu nebo Val v poloze 114 nebo, jestliže na N-konec prvé aminokyseliny shora uvedeného interferonů je napojen methionin, ee 166 až 167 aminokyselinami a s aminokyselinou Asp, Glu nebo Val v poloze 115, vyznačující se tím, že se zkonstruuje první ONA sekvence kódující shora uvedený zralý interferon a odštěpitelně napojenou shora uvedenou schopnou uskutečňovat bateriálni expresi shora uvedeného interferonů.

Lidský leukocytárni interferon (LelF) byl poprvé objeven a připraven ve formě velmi surových sraženin Isaacsem a Lindenmannem (Proč. R. Soc. B 147. 258 až 2B7 (1957) a USA patent 3 699 222). Od té doby pokračuje snaha o vyčištěni a charakterizaci tohoto materiálu. Toto úsilí vadlo k přípravě relativně homogenních leukocytárnlch interferonů získaných z normálních nebo leukemických donorekých leukocytů (NSR patentový zveřejňovaci spis č. 2 947 134). Tyto interferony tvoří skupinu bílkovin, o kterých je známo, že mají schopnost udělovat svým cílovým buňkám reai8tanci vůči virům.

Interferon může dále působit inhibičně na prolifereci buněk a modulovat imunitní odpověď. Tyto vlastnosti interferonů inspirovaly jejich klinické použití jako terapeutických prostředků pro léčeni virových infekci a maligních onemocněni.

Leukocytárni interferony byly vyčištěny až v podstatě do homogenního stavu /viz Rubinstein a spolupracovnici, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 640-644 (1979); Zeon a spolupracovníci, tamtéž, 76, 5601-5605 (1969)/, a jejich uváděné molekulární hmotnosti sa pohybuji v rozmezí od asi 17500 do asi 21000. Specifická aktivita těchto preparátů ja pozoruhodně vysoká, 2 x 10 až 1 x 10 jednotek na mg bílkoviny, ale výtěžky metod používajících buněčných kultur jeou odrazujícím způsobem nízké. Přeeto pokroky v pracovních technikách pro stanovováni bilkovinových sekvenci dovolily určení částečných sladů aminokyselin v těchto interferonech /viz Zeon a spolupracovnici. Science 207, 527 (1980); Levý a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77; 5102-5104 (1980)/. Objasněni glykosylace různých leukocytárních interferonů není ještě v současné době úplné, ale již nyní je zřejmé, že rozdíly v gylkosylacl mezi jednotlivými členy skupiny nevysvětluji samy o sobě spektrum pozorovaných molekulových hmotnosti. Leukocytárni interferony se mimo to zjevně liči ve složení a pořadí aminokyselin, a shodnost aminokyselin jest v některých případech nižši než 80 %.

Zatím co isolace interferonů z donorských leukocytů zajistila materiál postačující k částečné charakterizaci a k omezených klinickým studiím 8 homogenním leukocytárním interferonem, je tento zdroj zcela nedostatečným pro získáváni interferonů v množstvích potřebných pro jeho klinické zkoušení v širokém rozsahu a pro jeho rozsáhlé použiti k profylaktickým a/nebo terapeutickým účelům. Současné klinické výzkumy používající intarfanony získané z lidských leukocytů k testováni jejich antineoplastického a antivirového účinku se vskutku principiálně omezily jen na surové preparáty (o čistotě menší než 1%) a dlouhé doby potřebné pro výrobu dostatečných množství epolu e nereálnou výškou cen kriticky zdržely výzkum na široké frontě.

Nástup technologie rekombinaca ONA umožnil kontrolovanou mikrobiální produkci enormní řady užitečných polypeptidů, V současné době jsou již k dispozici bakterie modifikované touto technologií umožňující výrobu takových polypeptidických produktů jako jsou eomatostatin, A a B řetězce lidského insulinu a lidský růstový hormon /viz Itakura se spolupracovníky, Science 198, 1056-1063 (1977); Goaddal ae spolupracovníky. Nátuře 281, 544-548 (1979)/, Nověji bylo technologii rekombinace ONA použito k bakteriální produkci proinaulinu a thymoeinu alfa 1, a řada autorů referuje, ža nalezli DNA kódováni pro lidský leukocy rs, •q

Ř

CS 273 182 B2 tárni interferon a že vzniklé bílkoviny měly účinnost leukoeytárního interferonu (Nagata a spolupracovnici, Nátuře 284, 316-320 (1980); Mantei a spolupracovnici, Gene 10,

1-10 (1980); Tanlguchi a spolupracovnici. Nátuře 285, 647-549 (1980)/,

Výkonným útvarem při technologii rekombinace ONA je plasmid, chromosomO proetó smyčka dvouvláknové ONA nalezená v bakteriích a v jiných mikrobech, často v mnohonásobných kopiích v Jedné bakteriální buňce. V informaci zakódované v plasmidické DNA Jest včleněna informace potřebná k reprodukci plasmidů do dceřinných buněk (tzv. replikon) a obvykle Jedna nebo více selekčních charakteristik, jako je v ořipadě bakterii rezistence vůči antibiotikům, která dovoluje, že klony hostitelské buňky obsahující plasmid, který Je předmětem naěeho zájmu mohou být rozpoznány, vybrány a přednostně pěstovány v selektivním růstovém prostředí. Užitečnost bakteriálních plasmidů spočívá vs skutečnosti, že Js lze specificky štěpit jednou nebo druhou reetrikčni endonukleásou neboli restrikčním enzymem, přičemž každé z těchto endonukieáz rozpoznává na plasmidické DNA odlišné místo štěpeni. Po rozštěpeni lze do plasmidů vpravit cizorodé (hetarologni) gsny nebo fragmenty genů bu3 přímým připojením v místě rozštěpeni nsbo připojeni na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpeni. Rekombinace DNA se provádí vně buněk, ale vzniklý rekomblnováný plasmid lzs zavést do bakteriálních buněk postupem známým jako transformace a kultivaci získaného transformantu lze připravit velká množstvi rskom binovaného plasmidů obsahujícího heterologni gsn. Kromě toho, podle toho kam se gen vhod ně zavede vzhledem k částem plasmidů; které řídi transkripci (přepis) a translaci (překlad) zakódovaných ONA informaci, lze získaný exprese schopný nosič použit k aktuální produkci polypeptidické sekvence, pro kterou js vestavěný gen kódován; tento postup ss v popisu vynálezu označuje jako exprese.

Exprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která js rozpoznávána a na kterou ss připojuje RNA-polymsraza. V některých případech, jako v případu tryptofanového (trp) promotoru, kterého se s výhodou používá při praktickém prováděni způsobu podle tohoto vynálezu, jsou oblasti promotoru překryty oblastmi operátoru a vytváří es kombinovaný promotor-operátor. Operátory jeou sekvence DNA; které Jsou rozpoznávány tak zvanými reprssorovýml bílkovinami, které slouží k regulováni frekvence iniciace transkripce u specifického promotoru. Polymeróza ee pohybuje podél řetězce DNA, transkribuje informace obsažené v kódovacím· vláknu DNA a jeho 5* konce na 3'konec informační kyseliny ribonukleové (m-RNA) a tyto informace se ihned překládají do polypeptidické sekvence, která má takové pořadí aminokyselin; pro které js příslušná DNA kódována. Každá aminokyselina je zakódovaná jediným tripletem nukleotidů, neboli kodonem,’ pro který je v popisu vynálezu používán termín strukturální gen a který označuje tu část DNA, ve které je zakódované aminokyselinová sekvence exprimovaného paptldického produktu. Poté, co sa RNA polymeróza naváže na promotor, transkribujenejprve nukleotidy kódováním riboaomovóho vazebného místa, pak dojde k iniciaci translace neboli k signálu start (obyčejně kodonem ATG, který se ve vzniklé m-RNA stane AUG) a poté k translaci nuklsotidických kodonů uvnitř samotného strukturálního genu. Na konci strukturálního genu ss tranekribuji tak zvané stop-kodony a polymsráza může poté vytvářet další sekvenci m-RNA která vzhledem k přítomnosti stop-signálu zůstává nepřeložena ribosomy. Ribosomy se naváži na vazebné místo připravené na m-RNA, v bakteriích obvykle poté, co se m-RNA vytvoří, a samy produkuji zakódované polypeptidy, počínaje start signálem translace a konče shora zmíněným etop signálem. Žádaný produkt se tvoři jen tehdy, když jsou sekvence kódu jící vazebné místo ribosomů umístěny správně vzhledem k AUG iniciačnímu kodonu a když všechny zbývající kodony následuji zá iniciačním kodonem ve správné fázi. Vzniklý produkt lze získat lysou hostitelské buňky a jeho oddělením od ostatních bakteriálních bílkovin vhodnou čistící metodou.

Autoři vynálezu si uvědomili, že aplikace technologie rekombinace DNA (to je vložení interferonovych genů do mikrobiálních exprimačnlch nosičů a jejich exprese pod kontrolou regulačních prvků mikrobiálního genu) by byla nejefektivnšjší cestou k zajištěni

CS 273 182 B2 ,Α s

Bi •v velkých množství leukocytárniho interferonu, kterého by se přes to, že by nebyl glykosylován, jak je tomu v připadá produktu z lidských leukocytú, dalo klinicky používat při léčení širokého okruhu virových a neoplastických onemocněni.

Podle vynálezu ee první leukocytárni gen dá připravit následujícím sledem operací:

1) Za použiti parciálních aminokyselinových sekvencí lidského leukocytárniho intarferonu vyčištěných do homogenního stavu se zkonstruuji soubory zkušebních vzorků synthetických ONA, jejichž kodony v celku představují všechny možné nukleotidická kombinace schopné zakódovat zmíněné parciální aminokyselinové sekvence.

2) Připraví se banky bakteriálních kolonii obsahující komplementární ONA (cDNA) z indukované mRNA. Oinó indukované mRNA, radioaktivně značená, se hybridizují do plasmidické cDNA z táto banky. Hybridizujici mRNA se eluuje a testuje se jejich schopnost translace na interferon pomocí oocytárního testu. Plasmidické DNA z kolonii, u kterých bylo zjištěno, že při tomto způsobu indukují interferonovou aktivitu, ae dále testuji na jejich schopnost hybridizace do zkušebních vzorků připravených způsobem popsaným výše ad 1).

3) Souběžně 8 postupem popsaným výše v části 2) se cDNA odvozená z indukované mRNA v plasmidech použije k vytvořeni nezávislé banky transformovaných kolonii. Zkušebních vzorků z částí 1) se použije k započetí aynthssy radioaktivně značených Jednovláknových cONA, kterých se použije jako hybriďizačních zkušebních vzorků. Synthetické zkušební vzorky se hybridizují e indukovanou mRNA jakožto šablonou a prodlouží se reversní transkripci za vzniku indukované, radioaktivně značená cDNA, Klony z banky kolonii, které se hybridizují do radioaktivně značené cDNA získané shora uvsdenýnfpostupem, sa dále zkouši aby sa potvrdila přítomnost celá délky inteřferonového kódujícího genu. Sako zkušebních vzorků pro interferonový gen o plné délce lze jako takového použit kteréhokoliv domnělého genového fragmentu s částečnou délkou řetězce, získaného ve shora uvedených oddílech

1) a 2).

4) Interferonový gen o plné délce, získaný shora uvedeným postupem, se za použiti syntetické DNA uzpůsobí tak, aby ee odstranila jakákoliv vedoucí sekvence, která by mohla zabránit mikrobiální expresi zralého polypeptidu a aby se mu zajistilo vhodné umístění v nosiči schopném exprese vzhledem k iniciačním signálům pro start a kribosomovému vazebnému mletu mikrobiálního promotoru. Expresi získaný interferon se vyčisti do stupně dovolujícího potvrzeni jeho charakteru a stanoveni jeho aktivity.

5) Interferonový genový fragment připravený shora popsaným způsobem ee použije jako takový ke zkoušeni, ceetou hybridizace, pro přípravu jiných částečně hooologických leukocytárnich druhů interferonu.

Shora popsanou aplikací mstod technologie rekombinace ONA bylo dosaženo mikrobiální produkce, a to ve vysokých výtěžcích a vysoké čistotě, skupiny homologických leukocytárnich interferonů (neglykolyeovaných) ve formě zralých polypeptidů, nedoprovázených v podstatě odpovídající preeekvencí nebo jakoukoliv její částí. Tyto inteřferony se dají přímo exprimovat, izolovat a čistit do stupně čistoty vhodného pro jejich použiti při léčeni virových a maligních onemocněni u živočichů a u lidi. Mikrobiální expresí zatím ziakané produkty této skupiny prokázaly účinnost při testováni in vitro, a v prvních zkouškách toho druhu rovněž při testováni in vivo, přičemž posléze uvedené testováni zahrnovalo i první zralý leukocytárni interferon vyprodukovaný mikrobiálním způsobem.

Výraz zralý leukocytárni interferon používaný v popisu tohoto vynálezu značí mikrobiálně (například bakteriálně) vyprodukovanou interferonovou molekulu, prostou glykosylových skupin. Zralý leukocytárni interferon jest při způsobu podle vynálezu bezprostředně exprimován počínaje iniciačním signálem pro tlanslacl (ATG) ještě před prvním aminokyselinovým kodonem přirozeného produktu. Zralý polypeptid tak může obsahovat jako první aminokyselinu va své sekvenci methionin (pro který kóduje ATG) bez podstatné

CS 273 182 B2 změny evého charakteru. Na druhé straně může mikrobiální hostitel zpracovat produkt translace tak, žs js vynechán počáteční methionin. Zralý leukocytární interferon může být exprimován společně s konjugovanou bílkovinou jiné povahy než je běžná vedouci bílkovina, přičemž zmíněný konjugát se dá specificky rozštěpit v intra- nebo extracelulárnim prostředí (viz britský patent čislo 2 007 676 A), Posléze může být zralý interferon produkován v konjugaci 8 mikrobiálním signálním peptidsm, který transportuje konjugát do buněčné stěny, kde se signální peptid odštěpí a vyloučí se zralý polypeptid. Pojem exprese zralého leukocytárního interferonu značí bakteriální nebo jinou mikrobiální produkci interferonové molekuly neobsahující glykosylovó skupiny ani aminokyselinové preeekvence, které se bezprostředně zúčastňuji mRNA translace lidského leukocytárniho interferonového genomu. _x

Specifické leukocytární interferonové bílkoviny uváděné v tomto vynálezu jsou definovány pomoci stanoveného DNA genu (viz obrázky čislo 3 a 8) a podle dedukované aminokyselinové sekvence (viz obrázky 4 a 9)· Rozumí se, že u těchto specifických interferonů, i když Je lze vskutku všechny zahrnout do skupiny leukocytámich interferonových bílkovin, existuji přirozené alelické variace,' které se vyskytuji od případu k případu· Tyto variace lze demonstrovat rozdílem (nebo rozdíly) v celkové aminokyselinové sekvenci, nebo vynecháním, substitucí, vložením, inversi nebo přidáním aminokyseliny (nebo aminokyselin) vs zmíněné sekvenci. U každé leukocytární interferonové bílkoviny uvedené v tomto vynálezu, označených symboly LelF A až LelF □ , jsou zmíněné alelické variace zahrnuty do rozsahu uvedených označení nebo terminů definujících tyto interferony.

Výhodný způsob podle vynálezu jest bliže objasněn v následujícím podrobném popisu a na přiložených obrázcích 1 až 9.

Na obrázku 1 jsou znázorněny dvě aminokyselinové sekvence, které jsou společné všem druhům interferonů isolovaným z lidských leukocytů a vyčištěných do homogenního stavu, označených T-l až T-13. Všechny možné mRNA sekvence kódující tyto peptidy jsou znázorněny jako odpovídající DNA sekvence. Plemena A,’ T, G, C a U označuji nukleotidy obsahující base adenin, thymin, guanin, cytosin a uráčil. Písmeno N označuje kterýkoliv z uvedených nukleotidů A,’ G, C a U. P₀lynukleotidy jsou zobrazeny tak, aby se četly ze směru 5'(zleva) do 3'(doprava), a tam, kde je znázorněna dvouvláknová (d.v.) DNA, se naopak pročítá od spodu nebo od nekódujícího vlákna.

Na obrázku 2 je uveden autoradiogram znázorňujíc! hybridizaci potenciálních LelF 32 plasmidů se synthetickými deoxyoligenukleotidy značenými P.

Na obrázku 3 jeou znázorněny nukleotidická sekvence (kódující vlákna) osmi genových fragmentů, které byly izolovány jako možní kandidáti pro použiti k expresi leukocytérnich interferonů, a které jsou označeny písmeny A až “H. Iniciační ATG kodony translace a tarminačni triplety každého LelF jsou podtrženy; Stop kodony neboli terminačni triplety jsou následovány nepřekládanými oblastmi v poloze 3'· Včleněný gan o plné délce pro LelF A má vynechaný jeden kodon, který byl nalezen u ostatních nakreslených genů,’ jak je znázorněno ve třetí A lince obrázku 3. V poloze 5' nepřekládané oblasti předcházejí vedoucím sekvencím. Ve fragmentu E schůzí po izolaci celá prasakvence vedouci bílkoviny, ale je zahrnut celý gen pro předpokládaný zralý LelF E. Ve fragmentu G schází po izolaci celá kódující sekvence.

Na obrázku 4 jest znázorněno srovnáni osmi LelF bilkovinových sekvenci určených nukleotidickými sekvencemi. Pro aminokyseliny jsou používány Jednopismenkové zkratky, doporučené IUPAC-IUB komisi pro biochemickou nomenklaturu: A alanin; C « cystein:

a kyselina asparagová; E kyselina glutamová; F fenylalanin; G a glycin: H a histidinj I a isoleuain; K lysin; L leucin; M ; methionin; N a asparagin; P a prolin;

Q a glutamin; R a arginin; S a serin; T » threonin: V a valin; W a tryptofan; a Y = » tyro9in. Čísla označuji umístěni aminokyselin (S ee vztahuje na signální paptid).

CS 273 182 B2

Pomlčka na místě 44 u sekvence 165 aminokyselin interferonu LelF A jest zavedena pro vyrovnání zmíněné LelF A sekvence se sekvenci 166 aminokyselin jiných LelF, Sekvence LelF e byla stanovena za zanedbáni axtranuklaotidu (poloha 187 na obrázku 3) v jeho kódující oblasti. Hvězdičky označují terminačni kodony, které jsou ve fázi. Aminokyseliny společné všem LelF (s výjimkou pseudogenu LelF E) jsou rovněž zřejmé. Podtržené zbytky jsou aminokyseliny, které jsou rovněž přítomné v lidském fibroblastovém interferonu.

Na obrázku 5 jsou zobrazeny mapy rsstrikčnich endonukleáz osmi typů (A až H) cDNA klonovaných intarferony LelF. Hybridizované plasmidy byly zkonstruovány za použití metody dC:dG koncových zbytků /Goeddel D.V. a spolupracovníci,' Nátuře 287, 411-416 (1980)/. Při této metodě se vyříznou vložky cDNA za použiti rastrikčni endonukleázy Pstl. Cáry na konci každé cDNA vložky představuji přilehlé horapolymerické dC:dG koncové zbytky. Na obrázku js rovněž označeno umístěni PvuII,’ EcoRI a BglII štěpných mist. Stínované oblasti obrázku značí kódující sekvence zralých LelF; ěrafované oblasti označuji sekvence kódující signální peptid; volné oblasti znázorňuji 3^Z a 5^Z nekódující sekvence.

Na obrázku 6 je schematicky zobrazena konstrukce genu kódujícího přímou mikrobiální synthesu zralého LelF A. Osou vyznačena místa štěpeni a vzniklé zbytky (Pst I”, atd.). Zkratka b.p. označuje pár basi.

Na obrázku 7 ja schematicky znázorněna rastrikčni mapa dvou genových fragmentů používaných k expresi zralého leukocytárniho interferonu LelF B. Vyznačené kodonové sekvence jsou kódující koncová vlákna získaná digesci restrikčnim enzymem Sau3a v uvedených dvou případech.

Na obrázcích B a 9 jsou uvedeny DNA a aminokyselinové sekvence (pokud se týká příslušných jednoplsmenkových zkratek aminokyselin viz shora uvedený popis k obrázku 4) pěti LelF bílkovin/ včetně typu lad. Hvězdička na obrázku 9 označuje terminačni kodon příslušné DNA sekvence a rozdělovači čárka znáči deleci nebo mezeru v sekvenci.

A, Použité mikroorganismy

Způsob podle vynálezu zahrnuje používáni dvou mikroorganismů: bakterie E. coli x x 1776, jak ja popsáno v USA patentu čislo 4 190 495,' a bakterie E. coli K-12 kmen 294 (zakončeni A, thi”, hsr”, hsmjp; jak je popsáno v britském patentu ČÍ9I0 2 055 382 A. Každý z těchto mikroorganismů ja uložen v Americké sbírce typových kultur (ATCC) pod označením ATCC čislo 31537 a 31446. Všechny práca 8 rekombinovanými DNA byly prováděny v souhlase se závaznými směrnicemi Národního zdravotnického úřadu (NIH) v USA.

Způsob podle vynálezu ve svém nejvýhodnějšim provedeni jest popsán za použiti mikroorganismů E. coli, včetně nejen kmenů E. coli x 1776 a E. -coli K-12 kmene 294, uvedených výše, ale i jiných známých kmenů E. coli, jako E. coli B, nebo jiných mikrobiálních kmenů, z nichž četné jsou uloženy a dostupné ve známých sbírkových ústavech, jako v Americké sbírce typových kultur;'viz též NSR patentový zveřejňovací spis 2 644 432. Mezi zmíněnými ijinými mikroorganismy jsou zahrnuty například kmeny Bacilli, jako například Bacillus subsilis, a jiné snterobaktariální mikroorganismy, mezi kterými lze uvést například kmeny Salmonella typhimurium a Serrata marcescans, které využívají plasmidů a jsou schopné replikace a exprese heterologních genových sekvenci v nich obsažených.

□ako hostitelského organismu pro přípravu interfaronových bílkovin expresi genů pro ně kódovaných,' za kontroly kvasinkového promotoru, lze rovněž používat s výhodou kvasinek, jako Sacharomyces carevisiae.

B. Zdroj a čištěni leukocytárni intarferonové mRNA (LelF mRNA)

LelF mRNA lze získávat z lidských leukocytů, obvykla z 'leukocytů nemocných s chronickou myeloidní leukémií; tyto leukocyty lze indukovat k produkci interferonu virem Sendaiské nebo Newcastleské nemoci, jak ja popsáno například v NSR patentovém zveřejCS 273 182 82 novacím spisu číslo 2 947 134. Zvláště výhodným zdrojem, používaným rovněž v této práci, jeet linie buněk označená KG-1, získaná od nemocných s akutní myeloidni leukémii. Tato linie buněk, popsaná H.P. Koefflerem a D.W. Goldem v časopisu Science 200, 1153 (1978), ochotně roste v kultivačním mediu obsahujícím RPMI (Rosewsll Park Memoriál Institute) 1640 plus 10 % FCS (fetálni talsci sérum) inaktivované zahřátim, 25 mM pufru HEPES (N-2-hy.droxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina) a 50 ^ug/ml gentamicinu, a subkultivuje se na Jedno až tři rozděleni dvakrát za týden. Buňky z předcházejícího kultivačního prostřed! se zmrazí s 10 % OMSO (dimethylsulfoxidu). Buňky KG-1 jsou uloženy v Americké sbírce typových kultur pod označením ATCC číslo CRL 8031.

Buňky KG-1 se indukuji k produkci leukocytárni interferonové mRNA virem Sendaiské nebo Newcastleské nemoci způsobem popsaným Rubinsteinsm a spolupracovníky /viz časopis Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 650-644 (1979)/. Buňky se izoluji za 5 hodin po indukci a RNA se preparuje postupem /viz Chirgwin sa spolupracovníky, Blochemistry 18, 5294-5299 (1979)/. Stejným způsobem se izoluje RNA z neindukovaných buněk. Za použiti chromatografie na oligodeoxythymidin (dT) - celulose a ultracentrifugacs ss sacharosovým gradientem se zláká 12S frakce poly(A) mRNA, jak popisuji Grsen a spolupracovnici (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 /1976/) a Okinura a spolupracovníci /Arch. Biochsm. Biophys 188, 98-104 (1978)/. Takto získaná mRNA má interferonovou aktivitu 8000 až 10000 jednotek na mikrogram při oocytovém stanoveni za užiti žáby Xanopus Laevls /viz Cavalieri a spolupracovnici, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, 3287-3291 (1977)/.

C. Připrava bank kolonii obsahujících LsIF cONA sskvsncs

Za použiti 5 /tig mRNA 9s standardními postupy připrav! dvouvláknová cDNA /viz Wicksns a spolupracovnici, 3. Biol. Chsm. 253, 2483-2495 (1978) o Gosddsl a 9poluprčcovníci, Naturs 281, 544-548 (1979)/, Získaná cDNA sa frakcionuja podle velikosti elektroferesou na 6%nim polyakrylamidovém gelu (PAGE), a elektroelucí se izoluje 230 ng materiálu majícího velikost v rozmez! od 500 do 1500 b.p. U části této cDNA (100 ng) ss na konec naváži zbytky deoxycytidinu (dC) způsobem popsaným Changem a spolupracovníky v časopisu Nátuře 275, 617-624 (1978), produkt se aneluje se 470 ng plasmidů pBR322, na jehož Pst I rsstrikční misto jsou navázány zbytky dssoxyguanidinu (dG) /viz Bolivar a spolupracovníci, Gana 2, 95-113 (1977)/ a takto modifikovaného plasmidů sa použije k transformaci mikroorganismu E. coli x 1776, Získá sa asi 130 transformantů rezistentních vůči tetrycyklinu a citlivých na ampicllin, na jeden ng cONA.

V druhém podobném pokusu se získá přibližně 1000 transformantů E. coli K-12 kmene 294, rezistentních vůči tetracyklinu a citlivých na ampicilin, na jeden ng cDNA, V tomto případě se frakcionaci cDNA podle velikosti molekul a elektroelucí získá materiál o velikosti v roztnszi od 600 do 1300 b.p., který se použije k navázáni koncových dC.

0. Připrava synthetických oligonukleotidů a jejich použiti

Znalost aminokyselinových sekvencí různých tryptických fragmentů lidského leukocytárniho interferonů dovoluje navrhnout eynthetické deeoxyoligonukleotidy komplementární k různým oblastem LelF mRNA, Byly zvoleny dva tryptické peptidy T 1 a T 13, poněvadž mají aminokyselinovou sekvenci vyžadující synthesu pouze 12, popřípadě 4 undekamerů, aby sa vysvětlily všechny možné kódující sekvence (viz obrázek 1). Synthstisuji se čtyři soubory zkušebních vzorků deoxyoligonukleotidů pro každou sekvenci, z nichž každý obsahuje buň tři (T-1A, 8, C, D) nebo jeden (T-13A, B, C, D) oligonukleotid. Uvedené komplementární. deoxyoligonukleotidy o délce 11 basi se synthatiauji chemicky za použiti fosfortrieaterové metody /viz Crea a spolupracovnici, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75, 5765-5769 (1978)/, V T-13 sérii se připraví čtyři jednotlivá vzorky, v sérii T-l dvanáct vzorků ve čtyřech skupinách po třech vzorcích, jak Je uvedeno na obrázku 1.

Čtyři individuální zkušební vzorky v T-13 sérii a dvanáct T-l zkušabnich vzorků

CS 273 182 B2 připravených va čtyřech skupinách po třech primerech v každé aa použiji k informační synthese radioaktivně značené jednovléknové cDNA za účelem použiti k hybridizačním zkouškám. Oako vzorové mRNA se použije bu3 12S' RNA z KG-1 buněk indukovaných Sendaiským virem (8000 jednotek IF aktivity na jeden ^ug) nebo celkové poly(A) mRNA z neindukovaných leukocytů (aktivita menši než 10 jednotek na ^ug). Z uvedených primérů se připravi cDNA značená ³²P za použiti známých reakčnich podminek /viz Noyes a spolupracovnici, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 1770-1974 (1779)/. Reakce se provedou v 60 mikrolitrových pufrech o složeni 20 mM Trie-HCl (hydrochlorid tris-hydroxymathylmethanu) o pH 8,3, 20 mM chloridu draselného, 9 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 30 mM íb -merkaptoethanolu· Pro reakce se použije vždy Jedenoho ^ug každého primeru (tj. celkem 12 _yug pro primery T-l serie a celkem 4 _yug pro T-13 serie), 2 /Ug indukované 12S frakce mRNA (nebo 10 ^ug neindukované póly (A) mRNA), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP,

200 y.uCi (/1 ³²P) dCTP (dodavatel Amersham, 2000-3000 Ci/mraol) a 60 jednotek revereni transkriptásy (dodavatel Bethesda Research Laboratories). Žádaný produkt se odděli od neinkorporovaného značkovacího materiálu gelovou filtraci na sloupci 10 ml Sephadexu ^R G-50 a produkt sa zahřívá 30 minut na 70 °C s 0,3 N roztokem hydroxidu sodného, aby se rozložila RNA, a pak se směs zneutralizuje kyselinou chlorovodíkovou. Hydridizace se provedou způsobem popsaným Kafatosem a spolupracovníky v časopisu Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 (1979).

5. Identifikace klonů pLl až pL30

K přípravě 1 /Ug plasmidické DNA z každého z 500 individuálních transformantů

E. coli K-12 kmene 294 (viz oddíl C) ss použije rychlého způsobu izolace plasmidu popsaného Birnboimem a spolupracovníky v časopisu Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979). Každý získaný vzorek DNA se denaturuje a pak aplikuje trojmo na nitrocalulosový filtr podle postupu popsaného Kafatosem a spoluprůcovniky (viz výše).

Tři shora uvedené soubory nitrocslulosových filtrů obsahujicí 500 plasmidických vzorků se hybridizuji

a) s indukovanou cDNA obsahující T-l soubor primarůj

b) s indukovanou cDNA obsahující T-13 příměry, a

c) s neindukovanou cDNA připravenou ze použiti obou souborů primerů.

Klony se považují za pozitivní, když hybridizuji silněji na jednom nebo obou vzorcích indukované cONA než na celkovém neindukovaném vzorku. Z výchozích 500 vzorků plasmidů bylo vybráno třicet pozitivních klonů (pLl až pL30) k další analyse.

F. Identifikace klonů pL31 až pL39. Izolace plasmidu číslo 104 obsahujícího LelF genový fragment

Transformanty mikroorganismů E. coli x 1776 se podrobí užšímu výběru metodou koloniové hybridizace podle Grunsteina a Hognesse /viz Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975)/ za použití P značené indukované mRNA jako zkušebního vzorku /viz Lillenhaug a spolupracovníci, Biochemistry 15, 1858-1865 (1976)/. Neznačená mRNA z neindukovaných buněk ee emieí 8e zkušebním vzorkem v poměru 200:1, aby doělo ke kompetici s neindukovanou mRNA přítomnou v preparátu značeném ³²P. Hybridizace značené mRNA nastává přednostně s koloniemi obsahujícími indukované sekvence. Získají se tři druhy transformantů:

1) 2 až 3 % kolonií hybridizovaných na ³²P-mRNA velmi silně;

2) 10 % kolonii hybridizovaných signifikantně méně než ve skupině 1), a

3) zbytek, který nedává detegovatelný hybridizační signál.

Positivní kolonie (skupiny 1 a 2) se testuji na přítomnost sekvenci specifických pro interferon pomoci zkoušky, která spočívá v hybridizaci inteřferonové mRNA specificky na plasmidickou DNA. Nejprve se 60 silně positivních kolonii (ze skupiny 1) kultiCS 273 182 B2 ?· •r vuje individuálně ve 100 ml živného prostředí M9, doplněného tetracyklihem (20 ^ug/ml), kyselinou diaminopimslovou (100 /ug/m ), thymidinsm (20 /ug/ml) a d-biotinam (1 /ug/ml). Živná půda M9 obsahuje v 1 litru hydrogenfosforsčnan sodný (6 g), dihydrogenfoeforečnan draselný (3 g), chlorid sodný (0,5 g) a chlorid amonný (1 g)i po vystsrilisovóni v autoklávu se přidá 1 ml sterilního 1M roztoku síranu hořečnatého (bezvodého) a 10 ml sterilního 0,01 M roztoku bezvodého chloridu vápenatého. Kultury ss spoji po deseti a zs šesti uvedených spojených skupin ss izoluje plasmidické DNA způsobem popsaným Clswellem a spolupracovníky v časopisu Biochemistry 9, 4428-4440 (1970). Deset yug plasmidické DNA z každé skupiny ss rozštěpí enzymem HindlII, směs ss dsnaturujs a kovalsntně naváže na DBM-papir (diazobenzyloxymethylovaný filtrační· papír). Deden /ug přečištěné mRNA z indukovaných buněk se hybridizuje s rozštěpenou DNA vázanou na OBM-papiru. Nezhybridiaovanó mRNA se odstraní promytím, specificky hybridizovaná mRNA ss sluujs β testuje pomoci oocytů Xsnopus lasvis. V tomto testu bylo všech šest skupin negativních. Z 59 slabě positivních kolonii (skupina 2) bylo vytvořeno pět ekupin po 10 koloniích a jedna skupina z 9 kolonii, a z těchto skupin' byly shora uvedeným způsobem připraveny plasmidy, které byly zhodnoceny Jako bylo uvedeno výše. Z šesti testovaných skupin hybridizovalá jedna (K 10) na interferonovou mRNA a vykazovala v každé době testováni hladiny signifikantně vyšší nsž byly základní hladiny. Za účelem identifikováni specifického intsrferonového cONA klonu se z 9 kolonií skupiny K 10 připraví plasmidické DNA a testuji se individuálně. Dva ze zmíněných plasmidů (číslo 101 a číslo 104) vázaly interferonovou mRNA signifikantně nad základní hladiny, Z plasmidů číslo 104 byl izolován unikátní 32

Bgl II restrikční fragment obsahující 260 b.p., označen radioaktivním P způsobem popsaným Taylorem a spolupracovníky v časopisu Biochim. Biophys, Acta 442, 324-330 (1975) a použit jako zkušební vzorek k nezávislému výběrovému hodnoceni na 400 transformantech E. coli 294 za použiti skriningové metody na koloniích in sítu /viz Grunstein a Hogness, Proč. Nati. Sci. ZSA 72, 3961-3965 (1975)/. Bylo identifikováno devět kolonií (pL31 až pL39), které hybridizovaly v tomto testu do rozdílného stupně.

Shora uvedený značený fragment o 260 b.p. byl déle použit v nezávislém skríningu na 4000 transformantech E. coli 294 stejným způsobem. Bylo identifikováno 50 kolonii, které v tomto testu hybridizovaly se zkušebním vzorkem do rozdílných stupňů. Dedna z nich obsahovala LelF G fragment, jedna LelF H fragment a jedna obsahovala fragment označený jako LelF Hl, zřejmou alelickou variantu interferonu LelF H. Hybridní plasmidy, kte ré byly uvedeným způsobem získány, byly označeny jako pLelF H, atd.

G. Izolace a stanoveni sekvence prvého LsIF gsnu a plné délce řetězce

Ze^všech 39 potenciálních LelF cONA klonů se připraví plasmidické DNA, které se znovu podrobí dalšímu výběru se stejným zkušebním vzorkem DNA obsahujícím 260 b.p., za použiti hybridizačniho postupu popsaného Kafatosem a spolupracovníky (viz výše). Tři plasmidy (pL 4, pL 31, pL 34) dávaly při tomto skríningu velmi silné hybridizačni signály, čtyři (pL 13, pL 30, pL 32, pL 36) hybridizovaly mírně a tři (pL 6, pL 8,,pL 14) hybridizovaly se zkušebním vzorkem slabě.

Shora uvedených 39 potenciálních LelF cDNA rekombinovaných plasmidů bylo rovněž podrobeno výběrovému testováni za použiti syntetických undekamerů značených radioaktivním

P (skupiny individuálních T-1 primerů nebo individuální T-13 priméry) přímo jako hybridizačnich zkušebních vzorků. Hybridizačni podmínky byly zvoleny tak, aby mohlo dojit k dokonalému párováni baeí pro detegovatelné hybridizačni signály /viz Wallace a spolupracovnici. Nucleic Acids Ree. 6, 3543-3557 (1979)/. Tak byly z 39 klonů připraveny etan dardnim lysátovým postupem (viz Clswsll a spolu., shora uvedená citace) plasmidické DNA, které byly čištěny sloupcovou chromatografií na agarose značky Biorad Agarose A-50. Vzor ky (3 /Ug) každého preparátu byly linearizovóny působením restrikčního enzymu Eco Rl, de naturovány alkálií a naneseny na 2 separátní nitrocelulosové filtry v dávce 1,5 ^ug na Jednu nanášku (dle Kafatose a spolupracovníků,· citaci viz výše). Individuální synthetic9

CS 273 182 B2 kó deoxyoligonukleotidické primery a skupiny spojených primářů byly fosforylovány pomoci (4^³²P)-ATP následujícím způsobem: 50 pmol oligonuklaotidu a 100 pmol značeného (γ³²Ρ)-ΑΤΡ (dodavatel New England Nuclaar, aktivita 2500 Ci/mmol) bylo vneseno do 30 mikrolitrů pufru složeného z 50 mM Tris-HCl, 10 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 15 mM /3-merkaptoethanolu. Ke směsi byly přidány 2 jednotky polynukleotidické kinasy T 4 a po 30 minutách zahříváni na 37 °C byly vzniklé ³²P značené primery čištěny chromatografii na sloupcích z 10 ml Sephadexu ® G-50. Poté byly provedeny hybridizace za použiti 10⁵ cpm primeru T-13C nabo 3 χ 10⁶ cpm spojených primarů T-10. Hybridizacs byly prováděny při 15 °C po dobu 14 hodin v prostředí 6 x SSC (1 x SSC 0,15 M chlorid sodný a 0,015 M citrát sodný, pH 7,2) a 10 x Dsnhardtova roztoku (0,2 % hovězí sarumalbumin, 0,2 % polyvinylpyrolidon. O,'2 % Ficoll), způsobem popsaným Wallacem a spolupracovníky (citaci viz výše)· Filtry byly promývány po dobu 5 minut (3krát) při O °C v 6 x SSC, vysušeny a ex32 ponovány na film citlivý na X-paprsky. Výsledky získané a P značenými spojenými,primery T-13C a s primářem T-1C j3ou uvedeny na obrázku 2.

Bylo nalezeno, že dochází k signifikantní hybridizaci plasmidické DNA z klonu 104 se skupinou spojených primérů T-1C a s primerem T-130; ais nedochází k detegovatelné hybridizaci s jinými undskamery· Oak js znázorněno na obrázku 2, četné z uvedených 39 potenciálních LsIF plasmidů (pL 2; 4, 13, 17,’ 20, 30, 31, 34) rovněž hybridizuji s oběma těmito zkušebními vzorky. Avšak restrikční andonuklsázovou analysou bylo zjištěno, že pouze jadan z těchto plasmidů, plasmid pL 31, obsahuje rovněž interní Bglll fragment o 260 b.p. Digescí pL 31 restrikčním enzymem PstX bylo zjištěno, že velikost této cDNA vložky je přibližně 1000 b.p.

U posléze uvedené úplné Pstl vložky plasmidu pL31 byla analysovéna nukleotidická sekvence jednak Mexamovou-Gilbertovou chemickou metodou /viz časopis Msthods Enzymol.

65, 499-560 (1980)/ a jednak postupem stanovujícím zakončeni didaoxydového řetězce /viz Sm th, Msthods Enzymol. 65, 560-580 (1980)/ po subklonovátíí Sau 3a fragmentů do M13 vektoru. Sekvence DNA jest znázorněna na obrázku 3 pod označením A, Příslušná translačni pročitaci konstrukce zmíněná DNA se dá předpovědět z informaci, které jsou k dispozici o sekvenci aminokyselin interferonové bílkoviny, ze známého rozmezí molekulárních hmotnosti LelF a z relativního výskytu etop-tripletů ve třech možných pročítgcích konstrukcích, a poznaná nukleotidická sekvence dovoluje naopak předpovídat aminokyselinovou sekvenci celého LelF, včetně presekvence neboli signálního peptidu. První ATG iniciační kodon translace byl nalezen vs vzdálenosti 60 nukleotidů od 5^zkoncs sekvence, a jest následován o 188 kodonů později TGA terminačnim tripletem; pak je 342 nepřekládaných nukleotidů na 3^Z. konci,' následovaných póly (A) sekvenci. Domnělý eignálni peptid (pravděpodobně zahrnutý do sekrece zralého LelF z leukocytů) má délku 23 aminokyselin. Zralý LelF tvořený 165 aminokyselinami má vypočítanou molekulovou hmotnost 19390. Autoři vynálezu označili LelF zakódovaný do plasmidu Pl 31 jako LelF A, Z údajů o sekvencí (viz A“ na obrázku 4) js zřejmé, žs tryptickó psptidy TI a T13 intsrfsronu LelF B odpovídají aminokyselinám 145-149; popřípadě 57 až 61, interferonů LelF A. Skutečné DNA kódující sekvence nalezené v těchto dvou oblastech odpovídají sekvencím reprezentovanýmepojanými primery T 1-C a prxmarem T 13-C (viz obrázek 8).

H. Přímá exprese zralého leukocytárniho interferonů A (LelF A)

I. Obecně

Následující způsob exprese interferonů LelF A přímo ve formě zralého interfaronového polypeptidů je variantou postupu použitého dřivs pro přípravu lidského růstového hormonu /Goeddsl a spolupracovnici, Nátuře 281, 544-548 (1979)/ do té míry, že zahrnuje kombinováni syntetické (N-terminálni) a komplementární DNA, □ak je znázorněno na obrázku 6, místo štěpeni restrikční endonuklsázou Sau3a jest výhodně umístěno mezi kodony 1 a 3 interferonů LelF A. Byly určeny dva syntetické deoxyCS 273 182 82 oligonukleotidy, které inkorporuji ATS iniciační kodon pro translaci, obnovuji kodon pro aminokyselinu 1 (cystein) a vytváří záchytný (lepivý“) EcoRI konec. Tyto oligomery byly navázány na fragment o 34 b.p. mezi Sau3a - Avall mlety plasmidů pL31. Získaný produkt o 45 b.p. byl navázán na dalši DNA fragmenty a tak byl zkonstruován eyntheticko-přirozený gen o 865 b.p., který kóduje interferon LelF A a který je navázán EcoRI a Pstl restrikčnimi místy. Tento gen byl včleněn do plasmidů pBR 322 mszi jeho EcoRI a Pstl rsstrikčni mista za vzniku- plasmidů pLsIF AI.

2. Zkonstruováni tryptofanovóho kontrolního prvku (obsahujícího E. coli trp promotor a operátor, a trp hlavni ribosomové vazebná mleto, ale kterému schází ATG sekvence pro iniciaci translace)

Plasmid pGMI nsss tryptofánový (trp) opsron bakterii E. coli, majici deleci Lsl413 /viz Miozzari a spolupracovnici, Bacteriology 133, 1457-1466 (1978)/ a proto sxprimuJs fúzovanou bílkovinu obsahující prvních 6 aminokyselin vedoucí trp sekvence a přibližně poslední třetinu trp E polypeptidů (v dalším označovaný jako LE ), a rovněž sxprimujs trp D polypsptid jako celek, vše pod kontrolou tryptofánového promotorového-operátového systému. Plasmid (20 ^ug) se digsruje restrikčnim enzymem PvuII, který rozštěpí plasmid na pšti místech. Genové fragmenty se pak zkombinuji s EcoRI spojovacími Články (sestávajícími z vlastního komplementárního oligonuklsotidu o sekvenci pCATGAATTCATG), které obsahuji EcoRI rsstrikčni mleto potřebné pro pozdější klonováni do plasmidů obsahujícího EcoRI místo. Na fragmenty DNA (20 yug) získané z pGMI se působí 10 jednotkami DNA ligásy T₄ v přítomnosti 200 pmol 5*-fosforylovaného syntetického oligonuklsotidu pCATGAATTCATG a v prostředí 20 mikrolitrů T₄ DNA ligásového pufru (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP 10 mM bszvodého chloridu hořečnatého, 5 mM dithiothreitolu) při 4 °C přes noc. Roztok ss pak zahřívá 10 minut na 70 °C, aby sa spojováni zastavilo. Spojovací články se rozštěpí digescí endonuklsázou EcoRI, vzniklé fragmenty, nyní s EcoRI konci, ss oddělí za použiti PAGE slsktroforssy (5%ní gsl) a tři největší fragmenty ss isolují, po předchozím obarveni ethidiumbromidem a detekci v ultrafialovém světle, vyříznutím příslušné části gslové vrstvy obsahující žádaný fragment. Každý z uvedených gslových fragmentů ss umísti spolu s 300 mlkrolitry 0,1 x TBE pufru (TBE pufr obsahuje 10,8 g Tris-bass, 5,5 g kyseliny boritó a 0,09 g dvojsodnó soli kyseliny ethylsndiamintstraoctové (NagEDTA) v litru vody) do dialysačniho vaku a podrobí slaktroforsse při 100 V po dobu jedné hodiny v 0,1 x TBE pufru. Vodný roztok z dialysačniho vaku sa vyjme, extrahuje fenolem, extrahuje chloroformem, upraví na 0,2 M roztok chloridem sodným a ONA se ziská, po vysráženl sthanolsm, vs vodném prostředí. Získaný gsn s EcoRI záchytnými kenci, obsahující trp promotor-operátor, ss identifikuje dále popsaným způsobem, který spočítá vs vpraveni fragmentů do plasmidů citlivého na tetraoyklin, který se po zmíněném začleněni fragmentu stane rezistentním vůči tetracyklinu.

Plasmid pBRHI /viz Rodrigusz a spolupracovnici, Nuclsic Acids Res. 6, 3267-3287 (1979)/ sxprimujs ampicilinovou rezistenci a obsahuje gsn pro tetracyklinovou rezistenci, ale poněvadž nsni spojen s promotorem, posléze uvedenou rezistenci nsexprimuje. Plasmid Js proto citlivý vůči tetracyklinu. Vpravením promotorového-opsrátorového systému do EcoRI místa štěpeni plasmidů es plasmid stane'rezistentním vůči tetracyklinu.

Za tim účelem se plasmid pBRHI digeruje reetrikčni endonuklsázou EcoRI, enzym se odstraní fenolovou extrakci a následující chloroformovou extrakci a po vysráženl sthanolsm se DNA ziská vs vodném prostředí. Získané molekula DNA ee pomoci T₄ DNA ligásy, v oddělených reakčnich směsish, váže shora popsaným způsobem s každým zs tři ONA fragmentů získaných shora uvedeným postupem. Vzniklé DNA, obsažená v rsakčni směsi, se použije k transformaci příslušných bakterii E. coli K-12, kmene 294, za použiti standardních pracovních technik /viz Ksrshfisld a spolupracovnici, Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 71, 3455-3459 (1974)/. Bakterie ss pak umísti na LB (Luria-Bsrtani) agarové desky obsahující 20 ^ug/mol ampicilinu a 5 yug/ml tetracyklinu.. Kolonie bakterii rezistentních na tetraoyklin se vyberou, izoluje se plasmidické DNA a přítomnost žádaného frag11

CS 273 182 B2 mentu ee potvrdí restrikčni enzymatickou analysou* Získaný plasmid byl označen jako pBRHtrp.

Digescí virového genomu hepatitidy B enzymy EcoRI a BamHI se obvyklým způsobem získé produkt, který se začlení do EcoRI a BamHI restrikčních mlet plasmidu pGH6 /viz Goeddel a spolupracovnici, Nátuře 281, 544 (1979)/ za vzniku plasmidu pHS32. Získaný plasmid pHS32 ss rozštěpí enzymem Xbal, směs se extrahuje fenolem, pak ee extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem. Na získaný rozštěpený plasmid ss pak působí 1 mikrolitrera E. coli DNA polymsrázy I, Klenowovým fragmentem (Boehringer-Mannheim) v prostředí 30 mikrolitrů polymerázového pufru (tj. 50 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4, 7 mM bezvodého chloridu hořečnatóho a 1 mM /3-merkaptoethanolu), obsahující 0,1 mM dTTP a 0,1 mM dCTP, po dobu 30 minut při O °C a pak 2 hodiny při 37 °C. Při této rsakci se doplní dva zs 4 nukleotidů komplementárních k 5' vyčnívajícímu konci Xbal štěpícího místa :

5' CTAGA- 5' CTAGA -3' T—— 3' TCT Inkorpuji se dva nukleotidy, dC a dT,' a vznikne konec se dvěma 5' vyčnívajícími nukleotidy. Tento lineární zbytek plasmidu pHS32 (izolovaný po extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vysráženi e'thanolem ve vodném prostředí) ee rozštěpí restrikčním enzymem EcoRI. Velký plasmidický fragment se odděli od menšího EcoRI - Xbal fragmentu PAGE elektroforésou a'izoluje se elektroeluci. Tento ONA-fragment plasmidu pHS32 (0,2 ^ug) se naváže, za podmínek podobných těm, které byly popsány výše, na EcoRI - Taql fragment tryptofánového operonu (0,01 ^ug) získaného z pBRHtrp.

Při tomto shora popsaném postupu navazováni fragmentu z plasmidu pHS32 na EcoRI - Taql fragment se Taql vyčnívající konec naváže na Xbal zbývající vyčnívající konec, i když jeho base nejsou kompletně spárovány podle Watsona a Grickova principu:

-T CTAGA - __TCTAGA+

-AGC TCT- -AGCTCT-Část takto získané reakční směsi ligantů se transformuje do buněk bakterii E. coli 294, pak ss na buňky působí teplem a přeočkují se na LB agarové desky obsahující ampicilin. Selekci se získá 24 kolonii rezistentních vůči ampicilinu, která se kultivuji dále na 3 ml LB půdy (Lakria-Bertani) a plasmid ae izoluje, Seet z těchto plaamidů má Xbal štěpné místo regenerované pomocí bakteriemi E. coli katelysovaného přepárováni a replikace DNA:

-TCTAGA- -TCTAGA-AGCTCT—= -AGATCTBylo rovněž nalezeno, že ee tyto plasmidy štěpí jak restrikčním enzymem EcoRI, tak enzymem Hpal, a žs poskytuji očekávané štěpné fragmenty. Oeden z těchto plasmidů, oznsčený pTrpl4, byl použit pro expresi hstsrolognich polypeptidů, jak js popsáno dále.

Plasmid pHGH 107 /viz Goeddel a spolupracovnici, Nátuře 281, 544 (1979)/ obsahuje gen pro lidský růstový hormon, složený z 23 aminokyselinových kodonů produkovaných ze syntetických DNA fragmentů, a ze 163 aminokyselinových kodonů získaných z komplementární DNA vytvořené cestou reversní transkripce informační RNA pro lidský růstový hormon. Tento gen, i když mu schází kodony “pre -sekvence lidského růstového hormonu, obsahuje ATG kodon pro iniciaci translace. Gen se izoluje z 10 ^ug plasmidu pHGH postupem zahrnujícím nejprve působeni restrikčního enzymu EcoRI a poté připojení dTTP a dATP na získaný fragment působením Klenowova fragmentu E. coli ONA polymerazy I, jak bylo popsáno výěe. Vzniklý plasmid se izoluje extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vyeráCS 273 182 B2 žením ethanolem, .a poté se rozštěpí enzymem BamHI.

Vzniklý fragment obsahující gen pro lidský růstový hormon (HGH) se izoluje PAGE elektroforesou a následující elektroelucí. Výsledný fragment DNA obsahuje rovněž prvních 350 nukleotidů strukturálního genu pro rezietenci vůči tetracyklinu, ale chybí mu tetracyklinový promotorový-operátorový systém, takže, když ee v následujícím postupu tento fragment začlení do plasmidu, který je schopný exprese, lze plasmidy obsahující tuto vložku určit podle obnoveni tetracyklinové rezistence· Protože EcoRI zakončeni fragmentu je doplněno postupem za použití Klenowovy polymerázy I, má zmíněný fragment jeden tupý a jeden lepivý“ konec, což mu zajiětuje správnou orientaci, když je pozdě ji včleněn do plasmidu schopného exprese·

V dalším se připraví exprese schopný plasmid pTrp 14 tak, aby mohl přijmout shora uvedeným způsobem získaný fragment obsahující HGH gen. Plasmid pTrp 14 se za tim účelem digeruje restrikčním enzymem Xbal a a vzniklé lepivé konce fragmentu se doplní postupem s Klenowovou polymerázou I za použiti trifosfátů dATP, dTTP, dGTP a dCTP. Po extrakci získané směsi fenolem, extrakci chloroformem a vysráženi ethanolem se na ziska nou DNA působí enzymem BamHI a vzniklý velký fragment plasmidu se izoluje PAGE elektroforesou a elektroelucí. Uvedený fragment odvozený od pTrp 14 má jeden tupý a jeden lepivý konec, které mu zajištuji správnou orientaci při rekombinaci s výše popsaným fragmentem obsahujícím HGH gsn.

Fragment obsahující HGH gsn a posléze uvedený fragment pTrp 14 AXba - BamHI se zkombinuji a navzájem naváži za podmínek podobných těm, které byly popsány výše. Doplněné Xbal a EcoRI konce se naváži spolu s tupými vazebnými konci za obnoveni obou XBal a EcoRI štěpných míst:

doplněný Xbal konec doplněný EcoRI konec iniciace HGH genu

-TCTAG

AATTCTATG—TCTAGAATTCTATG-s*

-AGATC

TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC

Xbal EcoRI

Touto konstrukci se rovněž obnoví rezistence genu vůči tetracyklinu. Oelikož plasmid pHGH 107 exprimuje tetracyklinovou rezistencí z promotoru ležícího proti proudu od HGH genu (lac promotor), umožňuje tato výsledná konstrukce plasmidu, označeného jako pHGH 207, expresi genu pro tetracyklinovou rezistenci za kontroly tryptofánového promotoru-operátoru. Směs produktů ligace se transformuje do bakterií E. coli 294 a po kultivaci na LB agarových deskách s půdou obsahující 5 ^ug/ml tetracyklinu se vyberou rezistentní kolonie.

Plasmid pHGH se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a PAGE elektroforesou a následu jíci elektroelucí se izoluje fragment o 300 b.p. obsahujíc! trp promotor, operátor a vazebné místo pro tryptofénový hlavni ribosom, kterému však acházi ATG sekvence pro iniciaci translace. Tento DNA fragment sa zaklonuje do EcoRI štěpného mista plasmidu pLelF A, Exprese schopné plasmidy obsahující shora uvedený modifikovaný trp regulon (trp operon bakterie E. coli, ze kterého je vynechaná útlumová sekvence, aby se kontrolovatelně zvýšily hladiny exprese) lze kultivovat do stadia předem stanovených hladin na živné půdy obsahující přídatný tryptofan v množství dostatečném k potlačení promotorového-operátorového systému, pak se tryptofan odstraní, dojde k derepresi systému a nastane exprese žádaného produktu.

Uvedený postup je podrobněji popsán níže a znázorněn na obrázku 6. Plasmid pL 31 (250 /ug) se digeruje restrikčním enzymem Pstl a gelovou elektrofořežou na 6%nim póly13

CS 273 182 B2 akrylamidovém gelu sa izoluje vložený fragment o 1OOO b.p. Elektroeluci se z gelu získá asi 40 ^ug žádaného vloženého fragmentu, který se za účelem dalšího zpracováni enzymatickou digesci rozdělí na 3 alikvotní podíly:

a) Asi 16 /Ug vzorek tohoto fragmentu se částečně digeruje 40 jednotkami endonukleázy BglII po dobu 45 minut při 37 °C a reakčni směs se čisti PAGE elektroforesou na 6%nim gelu, získají sa asi 2 ^ug žádaného fragmentu o 670 b.p.

b) Druhý vzorek (8 ^ug) Pst fragmentu o 1000 b.p. se štěpí endonukleázami Avall a BglII; gelovou chromatografii (PAGE) se získá jeden ^ug uvedeného fragmentu o 150 b.p.

c) Na 16 y-ug vloženého fragmentu o 1000 b.p. ee působí enzymy Sau3a a Avall; po izolaci elektroforesou na 10%nim polyakrylamidovém gelu se získá asi 0,25 ^ug (10 pmol)) fragmentu o 34 b.p.

Fosfortriesterovou metodou se synthetisuji dva dále uvedené deoxyoligonukleotidy,

5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) a 5'-dGATCACACATG (fragment 2). Fragment 2 se fosforyluje ,39 následujícím způsobem: 200 mikrolitrů (asi 40 pmol) (y P)-ATP (dodavatel Amereham, aktivita 5000 Ci/mol) sa vysuší a znovu nasuspenduje ve 30 mikrolitrech pufru složeného z 60 mM Tris-HCl (pH δ), 10 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 15 mM/S-merkaptoethanolu, a obsahujícího 100 pmol zmíněného DNA fragmentu a 2 jednotky T4 polynukleotidkinázy. Směs ss zahřívá 15 minut na 37 °C,' pak se přidá 1 mikrolitr 10 mM roztoku ATP, reakce ee nechá probíhat dalších 15 minut při uvedené teplotě a pak se provede inaktivace zahříváním směsi po dobu 15 minut na 70 °C. K reakčni směsi se přidá 100 pmol 5'-OH fragmentu 1 a 10 pmol Sau3a - Avall fragmentu o 34 b.p. a provede se vzájemné navázání fragmentů v 50 mikrolitrech prostředí složeného z 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM bezvodého chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu, 0,5 mM ATP, v přítomnosti 10 jednotek T4 DNA ligázy, při 4 °C po dobu 5 hodin. Směs ss rozdělí PAGE elektroforesou na 6%nim gelu a elektroeluci se zisků produkt o 45 b.p. Asi 30 ng (1 pmol) posléze zmíněného produktu o 45 b.p. se zkombinuje s 0,5 ^ug (5 pmol) Avall - BglII fragmentu o 150 b.p. a 1 yAig (2 pmol) BglII - Pstl fragmentu o 670 b.p. Vzájemné navázání ee provede působením 20 jednotek T4 DNA ligasy při 20 °C po dobu 16 hodin. Ligasa se Inaktivuje zahříváním na 65 °C po dobu 10 minut a směs ss za účelem odstraněni polymerů genu digeruje enzymy EcoRl a Pstl. Po přečištěni směsi elektroforesou na 6% PAGE ea získá asi 20 ng (0,04 pmol) produktu o 855 b.p. Polovina (10 ng) tohoto produktu se naváže do plasmidu pBR 322 (0/3 /Ug) mezi jeho EcoRl a Pstl štěpná místa. Po transformaci tohoto plasmidu do bakterii E. coli 234 se získá 70 transformantů rezistentních vůči tetracyklinu a citlivých na ampieilin. Plasmidická DNA izolovaná z 18 z těchto transformantů sa digeruje enzymy EcoRl a Pstl. 2 těchto 18 plasmidů obsahovalo 16 EcoRl - Pstl fragment o délce 865 b.p. Oeden ^ug jednoho z těchto fragmentů, pLelF Al, se digeruje enzymem EcoRl a naváže na shora popsaným způsobem připravený EcoRl fragment o 300 b.p. (0,1 /ug), obsahující trp promotor a trp vazsbné místo hlavního ribosomu E, coli, Transformanty obsahující trp promotor se identifikují za použití P-trp zkušebního vzorku ve spojeni se skríningovou metodou pro kolonie bakterií podle Gruneteina-Hognesse. Asymetricky umístěné Xbal štěpné místo v trp gragmentu dovoluje stanovení rekombinantů, ve kterých trp promotor je orientovaný va směru na LalF A gen.

I, In vitro a in vivo účinnost interferonu LelF A

Pro stanoveni interferonové účinnosti sa připrav! extrakty následujícím způsobem:

Kultury o objemu 1 ml se pěstuji na živné půdě L obsahující 5 /ug/ml tetracyklinu do hodnoty absorbance při 550 nm (A_g50) asi 1,0/ pak ss kultura zředí do 25 ml M9 živné půdy obsahující 5 /Ug/ml tetracyklinu. Když A_ggQ dosáhne 1,0, odeberou sa 10 ml vzorky, které se odstředí, a získané buňky se suspenduji v 1 ml roztoku obsahujícím 15 % sacharosy, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) as50 mM EOTA (kyseliny ethylandiamintetraoctové). K suspensi se přidé Jeden mg lysozymu a po 5 minutách stáni při O °C se buňky rozruší ultrazvukem. Vzorky se centrifuguji 10 minut (15000 otáček za minutu) a v supernatantu se

5*“^

CS 273 182 B2 stanoví intarferonové účinnost srovnáním se standardy interferonu LelF pomocí testu inhibica cytopatické účinnosti (CPE). Ke stanoveni počtu molekul interferonu (IF) na jednu buňku se používá LelF o specifické aktivitě 4 χ 10⁸ jednotek/mg.

□ak je zřejmé z tabulky 1, klon pLsIF A trp 25, vs kterém je trp promotor začleněn v žádané orientaci, dává v tomto testu vysoké hladiny aktivity (va výši 2,5 x 10° jednotek v litru). Oak vyplývá z tabulky 2, interferon produkovaný bakteriemi E. coli K-k2 kmene 294/pLeIF A trp 25 se chová jako autentický lidský interferon LelF; je stálý vůči kyselému prostřed! o pH 2 a jeho účinnost je neutralizována králičími protilátkami lidských leukocytárnich interferonů. Uvedený interferon má zdánlivou molekulovou hmotnost asi 20000.

Účinnost interferonu in vivo vyžaduje přítomnost makrofágů a přirozených umrtvujících (NK) buněk, přičemž se zdá, že způsob jeho účinnosti in vivo spočívá ve stimulaci těchto buněk. 3e proto možné, že interferon produkovaný bakteriemi E. coli 294/pLeXF A 25, i když má antivirovou účinnost v testech na buněčných kulturách, by nemusel být účinný u infikovaných, živočichů. Kromě toho, in vivo antivirová účinnost bakteriálně produkovaného, neglykosylovanóho interferonu LelF A by mohla být rozdílná' od glykosylovaného LelF pocházejícího z lidských leukocytů. Proto biologická účinnost bakteriálně syntatisovaného interferonu LelF A (o čistotě 2 %) byla srovnávána s účinnosti interferonu z lidských kůži pokrytých leukocyty (LelF, čistota 8 %) u virové infekce letálni encefalomyokarditidy (EMC) hranostajů (viz tabulka 3).

Tabulka 1. Intarferonové účinnost extraktů z E. coli

E. coli K-12	buněčná	IF účinnost	počat LelF
kmen 294	hustota	jsdnotky/ml	molekul
transformovaný	(počet buněk	kultury	na buňku
plasmidem	na ml)
pLalF A trp 25	3,5 χ 108	36 000	9 000
pLelF A trp 25	1,8 χ 109	250 000	12 000

Tabulka 2. Srovnáni	účinnosti extraktů	z bakterii	E. coli 294/pLaIF A 25
ss standardním interfsronam	LelF x
Extrakt		Interferonová účinnost (jednotky/ml)
bez úpravy	při pH 2	v přítomnosti králičích anti-lidských leukocytárnich protilátek
extrakt z E. coli 294/pLeIF A trp 25		500	500	10
LelF standard		500	500	10
x/f Extrakt z bakterií	E. coli 294/pLeIF A trp 25 o	intarferonové	aktivitě 250 000 jed-

notak na ml, popsaný v tabulce 1, byl zředěn 500krát minimální základní živnou půdou na specifickou aktivitu 500 jednotek/ml.

Standard leukocytárniho interferonu (z Wadleyova ústavu), předem otitrovaný vůči NIH leukocytárnlmu interferonovému standardu, byl rovněž zředěn na konečnou koncentraci 500 U/ml. Alikvotnl podíly o objemu 1 ml byly upraveny kyselinou chlorovodíkovou o kon—

CS 273 182 B2 centraci IN na pH 2, vzorky inkubovány 52 hodin při 4 °C, zneutralizovány přidáním roztoku hydroxidu draselného a stanovena IF aktivita pomoci standardního testu CPE inhibice. Siné alikvotní podíly o objemu 25 mikrolitrů ze vzorků o koncentraci 500 jednotek/ml (nijak neošetřené) byly inkubovány s 25 mikrolitry králičí protilátky lidského leukocytárního interferonu při 37 °C po dobu 60 minut, vzorky byly 5 minut centrifugovány při 12000 násobku g a supernatant testován.

Tabulka 3. Antivirová účinnost různých LelF preparátů vůči EMG virové infekci hranostajů

Ošetření interferonem	Přežiti	Oednotky tvořeni sérových destiček/ml
den 2 den 3	den 4
Kontrola			A		e
(bakteriální	0/3	10)	3x10^		10)
bílkoviny)		0	3 0	104	1200()3,4x10^
		0 J	0		v
Bakteriální	3/3	• 0	0		0
LelF A		0	0		0
		0	0		0
Standardní LelF	3/3	0	0		0
		0	0		0
		0	0		0

K testování byli použiti samci hranostajů o průměrné hmotnosti 713 g, kteří neměli před infikováním protilátky vůči EMC viru. Zvířata byla infikována intramuskulárně dávkou 100 x LDgQ EMC viru (zjištěno u myši). V kontrolní skupině uhynuli hranostajové za 134, 158 a 164 hodin po infikováni. Ošetřeni zvířat interferonem v dávce 10® jednotek bylo prováděno intravenosní cestou v intervalech -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 a 240 hodin, vztaženo na dobu, kdy bylo provedeno infikování. Použitý bakteriální leukocytární interferon byla frakce ze sloupcové chromatografie lysátu bakterií E. coli 294/pLeIF A 25 o specifické aktivitě 7,4 x 10® jednotak/mg bílkoviny. Oako kontrolních bakteriálních bílkovin bylo použito bílkovin z ekvivalentní frakce sloupcové chromatografie lysátu bakterii E. coli 294 pBR 322 o dvojnásobné koncentraci celkových bílkovin. Oako standardního leukocytárního interferonu bylo použito interferonu indukovanég ho chromatograficky do specifické aktivity 32 x 10 jedhotek na mg bílkoviny.

Hranostajové v kontrolní skupině vykazovali postupující lethargii, ztrátu rovnováhy, ochablost a ochrnutí zadních končetin a zalévání oči začínající asi 8 hodin před smrti. Interferonem ošetřeni hranostajové nevykazovali žádnou z těchto abnormalit; zůstávali po celý čas aktivní a nevyvinula se u nich virémie. Oeden hranostaj z kontrolní skupiny, u kterého ee nevyvinula virémie během 4 dnů, uhynul nejpozději z neléčených zvířat (za 164 hodin po infikováni), ale vykázal vysoké titry viru v srdci a v mozku post mortem. U hranostajů ošetřených interferonem se nevytvořily protilátky proti EMC viru, jak bylo stanoveno za 14 a za 21 dnů po infikováni. Tyto výsledky ukazují, že aritivirálni účinnost LelF preparátů u infikovaných zvířat lze přisoudit pouze interferonu, poněvadž kontaminující bílkoviny v bakteriálních preparátech a v preparátech z lidských leukocytů jsou zcela rozličné. Tyto výsledky dále naznačuji, že glykosylace není pro in vivo antivirovou účinnost interferonu LelF A potřebná.

CS 273 182 B2

0. Izolace dalších cDNA pro ostatní leukocytárni interferony

Z plně charakterizovaného plasmidů obsahujícího interferonovou LelF A cDNA se vyřízne DNA enzymem Pstl, izoluje pomoci elekfroforézya označí radioaktivním P. Získaná radioaktivně značená DNA se použije jako zkušební vzorek k výběrovému tříděni dalších transformantů bakterii E. coli 294, získaných stojným postupem jak bylo popsáno v části C, pomoci metody skriningu kolonii in šitu podle Grunsteina a Hognesse (viz výše). Izoluji se kolonie, které hybridlzuji v rozličných množstvích ss zkušebním vzorkem. štěpením těchto kolonii a deseti hybridizujicích kolonii popsaných v části G pomoci enzymu Pstl byla izolována plaemidickó DNA, která byla charakterizována třemi rozdílnými metodami. Zmíněná Pstl fragmenty byly nejprve charakterizovány na základě vzorků získaných digesci restrikčniml sndonukleázami, enzymy Bgl II, Pvu II a Eco RI. Tato analysa umožnila charakterizovat nejméně osm rozličných typů (LsIF A, LsIF B, LsIF C, LelF D, LeiF E, LeiF F, LelF G a LeiF H), znázorněných na obrázku 5, na kterém je přibližně uvedeno umístěni různých restrikčnlch míst ve vztahu k současné znalosti o presskvenci a kódující sekvenci LelF A. Deden z těchto fragmentů, LelF D, je pravděpodobně identický 9 DNA fragmentem popsaným Nagatou a spolupracovníky v časopisu Nátuře 284, 316-320 (1980).

Za druhé byly některé ze zmíněných DNA testovány pomocí hybridizačnich selekčních testů popsaných Clevelandsm a spolupracovníky v časopisu Cell 20, 95-105 (1980), na základě schopnosti selektivně odstraňovat LalF mRNA z KG-1 buněčné RNA obsahujíc! poly-A řetězce. V tomto tastu byly LelF A, B, C,a F positivní. Za třetí, posledně zmíněné Pst fragmenty byly včleněny do express schopného plasmidů, zmíněným plasmidem byly transformovány bakterie E. coli 294 a fragmenty byly exprimovány. Všechny produkty zminěné exprese, o kterých se předpokládalo, že to jsou pre-interferony, byly positivní v CPE testu na interferonovou aktivitu, ačkoliv v případě LelF F fragmentu byla nalezena jen okrajová účinnost. Kromě uvedeného charakterizováni byla u všech popsaných LelF typů stanovena sekvence.

K, Přímá exprese druhého zralého leukocytárniho interferonů (LelF B)

Bylo zjištěno, že sekvence prvních čtrnácti nukleotidů izolovaného fragmentu obsahujícího gen pro zralý interferon LelF B je stejná u typů A i B. Z plasmidů pLelF A 25 byl proto izolován fragment nesoucí trp promotor-opsrátor, ribosomové vazebné místo a iniciační signál pro LsIF A (»B) gen, a tento fragment byl zkombinován se zbývající části B-sskvencs za vzniku exprese schopného plasmidů. Mapy vyčnivajicich restrikčnlch mist Pst fragmentu plasmidů pL4 (plasmid obaahujici interferonový LelF 8 gen zakončený Pst zbytky, znázorněný na obrázku 5), a plasmidů pLelF A25 jsou uvedeny na obrázcích 7a a 7b.

Aby sa zs sekvence znázorněné na obrázku 7a získal Sau3a až Pstl fragment obsahující přibližně 950 b.p., js třeba provést několik operací vzhledem k tomu, že je přítomno jedno nebo vice intervenujících Sau 3a restrikčnlch míst, to jest:

1. Po provedeném štěpeni se izoluji následující fragmenty:

a) fragment od Sau3a štěpícího mleta po EcoRI misto obsahující 110 b.p,;

b) fragment od EcoRI mista k Xba místu obsahujici 132 b.p,;

c) fragment qd Xba mista k Pst místu obsahujici vica než 700 b.p.

2. Fragmenty la) a lb) se vzájemně naváži a koncové skupiny Sau 3a a Xba sa odříznou působením enzymů Xba a BhlII, aby se zabránilo samopolymeraci způsobené těmito terminály (relevantní Sau3a misto js uvnitř BglII místa; enzymem BglII se štěpi, aby se odříznul Sau 3a záchytný konec). Izoluje se fragment obsahující 242 b.p.

3. Produkty získané postupy 2) a lc) gg navzájem naváži a za účelem zabráněni samovolné polymerisace se koncové skupiny odříznou působením enzymů Pstl a BglII. Izoluje se fragment od Sau3a až k P9tl mlatu obsahujici asi 950 b.p., znázorněný na obrázku 7a. Tento

CS 273 182 82 fragment obsahuje tu část LelF B genu, která není společná β LelF A.

4. Z plasmidu pLelF A25 ss izoluje fragment obsahující přibližně 300 b.p. (od HindlXI k Sau3a), obsahující trp promotor-operátor, ribosomové vazebné místo, ATG startovací signál a cysteinový kodon pro LelF A.

5. Z plasmidu pBR 322 se izoluje fragment od Pěti k H nd XII obsahující přibližně 3600 b.p.j tento fragment obsahuje replikon a zakódovanou tetracyklinovou, ale nikoliv ampici línovou rezistenci.

6. Fragmenty získané ve stupních 3, 4 a 5 se navzájem trojitě naváži a získaný plasmid ss transformuje do bakterií E. coli K-12 kmene 294.

Provede se minimální vyhledávači třídění transformantů /postupem podle Birnboima a spolupracovníků, Nucleic Acids. Res. 7, 1513-1523 (1979)/ a vzorky plasmídů se digeruji endonukleásou EcoRI. Digesci se získají tři fragmenty, které byly identifikovány Ja· ko 1) fragment obsahující EcoRI-EcoRI trp promotor; 2) vnitřní EcoRI až EcoRI fragment plasmidu pL4, a 3) fragment plasmidu pL4 obsahující iniciační signál pro translaci bílkoviny až EcoRI.

Bakteriální extrakty z klonů připravených shora uvedeným způsobem vykázaly v CPE testů typickou hodnotu asi 10 x 10® jednotek interferonové aktivity na litr při Α₅₅θ » = 1. Deden reprezentační klon připravený tímto postupem byl označen jako E. coli 294/pLeIF B trp 7.

L. Přímá exprese dalších zralých leukocytárních interfaronů (LelF C, D, F, Η, I a □)

Stejně jako v případě LelF A lze sestrojit i dalěi genové fragmenty o plné délce, obsahující jiné typy interferonů LsIF, a lze je umístit do exprimačnich nosičů určených pro jejich expresi. Pomoci úplného stanoveni sekvence obvyklými způsoby se zjisti, které restrikční místo leží dostatečně blízko prvého aminokyselinového kodonu zralého interferonového typu, aby umožnilo aplikovat postup popsaný ve shora uvedené části H pro expresi zralého interferonu LelF A, to je eliminaci presekvence restrikčním odříznutím a nahraženi kodonů pro N-terminálni aminokyseliny ztracených eliminaci presekvence navázáním synthetického DNA fragmentu. Selže-li tento způsob, lze použit následujícího postupu, který, ve stručnosti, spočívá vs štěpeni fragmentu obsahujícího preeekvenci přesně před bodem, ve kterém začíná kodon pro první aminokyselinu zralého polypeptidu. Postupuje se tak, že se

1. Dvouvláknová DNA převede v oblasti obklopující tento bod na jednovléknovou DNA;

2. Na jednovléknovou oblast vytvořenou podle bodu 1) se hybridizuje komplementární délka priméru jednovláknové DNA, přičemž 5' konec priméru leží na opačná straně nukleotidu soussdiciho se zamýšleným štěpícím místem:

3. Ta část druhého vlákna odstraněná ve stupni 1), která leží v 3^Z směru od příměru, ss obnoví reakci s DNA polymerázou v přítomnosti trifosfátů deoxynukleotidů obsahujících adsnin, thymin, guanin a cytosin;

4. Zbývající délka jednovláknové DNA, která vyčnívá nad zamýšlené místo štěpení, se odstraní digescí.

Poté lze navázat na 3 konec kódujícího vlákna jako jeho zakončeni krátký řetězec synthetické DNA s iniciačním signálem ATG pro translaci, například tak, že se pomoci lepivých konců naváže na sestrojený gen pro zralý interferon, a takto získaný gen se včlení do plasmidu schopného exprese a uvede pod kontrolu promotoru a jeho přidruženého ribosomového vazebného místa.

Podobným způsobem, jaký byl popsán výše v části K, se příslušně pro přímou bakteriální expresi uspořádají genové fragmenty kódující interferony LelF C a LelF D. Strategie exprese pro tyto dalši leukocytárni interferony zahrnuje v každém případě použiti

CS 273 182 B2 fragmentu přibližně o 300 b.p. (HindlII až Sau3a), obsahujícího trp promotor-operátor, ribosomové vazebné místo, ATG iniciační signál a cysteinový kodon interferonu LelF A z plasmidů pLelF A25. S tímto fragmentem ee zkombinuji genové fragmenty z dalších interferonových genů kódující jejich příslušné aminokyselinové sekvence mimo počátečního cysteinu, který je společný všem. Každý takto vzniklý plasmid se použije k transformaci bakterii E. coli K-12 kmene 294. K sestrojeni příslušných genů se použije následujících ligaci.

Interferon LelF C

Z plasmidů pLelF C se izoluji následující fragmenty:

a) fragment od Sau 3a k Sau 96 o 35 b.p.j

b) fragment od Sau 96 k Pstl o vice nsž 900 b.p.

Z plasmidů pLelF A-25 se izoluje postupem popsaným výše v částí K 4)

c) fragment HindlII až Sau 3a o 300 b.p.;

Z plasmidů pBR 322 se izoluje způsobem popsaným výše v Části K 5)

d) fragment Pstl až HindlII o přibližně 3500 b.p.

Sestrojeni genu

1) Naváží se fragmenty a) a c), produkt se ětěpi enzymy Bgl II a Hind III a izoluje se fragment asi o 335 b.p,

2) Provede se trojitá ligace fragmentů 1) + b) + d) a resultujicím plasmidem se transformuji bakterie E. coli.

Typický klon získaný tímto způsobem byl označen jako E. coli K-12 kmen 294/pLeIF C trp 35.

Interferon LelF O

Z plasmidů pLelF 0 se izoluje následující fragmenty:

a) fragment Sau 3a až Ava II o 35 b.p.;

b) fragment od Ava II k Bgl II o 150 b.p.j

c) .fragment.od BglII k Pstl o přibližně 700 b.p.

Z plasmidů pLsIF A25 se izoluje

d) fragment od HindlII až po Sau3a o 300 b.p.

Z plasmidů pBR 322 se izoluje

e) fragment od HindlII k Pstl o přibližně 3600 b.p.

Sestrojeni genu

1) Naváží se fragmenty a) + b), produkt se vyřízne enzymem BglII a po přečištěni se získá produkt o 185 b.p. (1).

2) Provede ee navázáni fragmentů 1) + d), vyřízne se enzymy HindlII a BglII a vyčisti se produkt o přibližně 500 b.p. (2),

3) Provede se navázáni fragmentů 2) + c) + a) a získaným plasmidem se transformují bakterie E. coli.

Typický klon připravený tímto způsobem byl označen jako E. coli K-12 kmen 294/pLeIF D trp 11.

Interferon LelF F

Fragment obsahující LsIF F lze pro přímou expresi sestrojit tak, že se k rekonstrukci s výhodou použije aminokyselinové sekvence 1 až 13 interferonu LelF B, která je úplně shodná s obdobnou sekvenci interferonu LelF F. Z plasmidů pHGH 207, popsaného výše, se postupem za použiti rastrikčnich enzymů Pst I a Xba I digescí a následující izolaci při19

CS 273 182 B2 praví fragment asi o 1050 b.p. (a), obsahující trp promotor a majici žádanou konfiguraci na svých koncích. Druhý fragment (b) se izoluje jako větší fragment ze směsi získaná digescí plasmidů pHKY 10 endonukleásami Pstl a BglII. Fragment a) obsahuje přibližně polovinu genu kódujícího ampicilinovou rezistenci; fragment b) obsahuje zbytek tohoto genu a celý gen pro tetracyklinovou rezistenci, kromě připojeného promotoru. Fragmenty a) a b) se naváží pomocí T4 ligasy a produkt se štěpí enzymy Xbal a BglII, aby se odstranily produkty dimerisace. Vznikne fragment c), obsahující trp promotor-operátor a geny pro tetracyklinovou a ampicilinovou rezistenci.

Digescí plasmidů pLsIF F enzymy Avall a BglII se ziská fragment d) mající přibližně 580 b.p. a obsahující kodony pro aminokyseliny 14 až 166 interferonu LelF F.

□igeesci plasmidů pLelF B enzymy Xbal a Avall se ziská fragment e) o 49 b.p., který kóduje aminokyseliny 1 až 13 interferonu LelF F.

Provede se trojitá ligace fragmentů c), d) a e) v přítomnosti T4 ligasy. Kohasivni konce příslušných fragmentů jsou takové, žs ss fragmenty správně uzavřou do kruhu za vzniku kompozitního plasmidů, který nsss gen pro tetracyklinovou rezistenci pod kontrolou trp promotoru-operátoru, spolu s gsnsm pro zralý interferon LelF F. Bakteria transformované tímto plasmidem lze proto vybrat na základě zmíněné rezistence při jejich kultivaci na agarových deskách obsahujících tetraoyklin. Typický klon připravený tímto způsobem byl označen jako E. coli K-12 kmen 294/pLeIF F trp 1.

Interferon LelF H

Úplný LelF H gen pro expresi zralého leukoeytárního interferonu LelF H lze zkonstruovat následujícím způsobem:

1) Plasmid pLsIF H se podrob! digesci enzymy Haell a Rsal a izoluje se fragment o 816 b.p. rozkládající se od signálu pro peptidickou aminokyselinu 10 až do 3' nekódují cí oblasti.

2) Fragment se dsnaturuje a podrobí se reparační synthese pomoci Klenowova fragmentu DNA polymerasy I /viz Klenow a spolupracovníci. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 65, 168 (1970)/, za použiti synthetického deoxyribooligonukleotidu δ'-dATG TGT AAT CTG TCT jako priméru.

3) Vzniklý produkt ee štěpí enzymem Sau3a a izoluje se fragment o 452 b.p. reprezentující aminokyseliny interferonu 1 až 150.

4) Plasmid pLelF H se digsruje enzymy Sau3a a Pstl a izoluje ee vzniklý fragment o 500 b.p.; ziská se gen kódující aminokyseliny od 150 až do konce kódující sekvence.

5) Fragmenty izolované ve stupních 3) a 4) se navzájem naváží za vzniku fragmentu

166 met cys . aep stop

ATG TGT ... -- .... GAT TGA_..._Pst I

Sau3a zakódovajicifio 166 aminokyselin interferonu LelF H.

6) Plasmid pLelF A trp 25 se digeruje restrikčnim enzymem Xbal, zakonči záchytnými konci s DNA polymerásou I a produkt se digeruje endonukleásou Pstl. Vzniklý velký fragment ss izoluje a provede se ligace s produktem získaným ve stupni 5). Získá ss exprese schopný plasmid, který může po transformaci do E. coli K-12 kmene 294 nsbo do jiné hostující bakterie exprimovat zralý interferon LelF H.

Interferon LelF I

Rekombinant lidského gsnomu fáze A Charonu 4A, sestrojený Lawnsm a spolupracovníky /viz časopis Cell 15, 1157 (1978)/ byl podroben skríningu na leukocytární interferonové

CS 273 182 B2 geny pomoci postupů popsaných Lawnem a spolupracovníky (viz výše) a Maniatieem a spolupracovníky /viz časopis Cell 15, 687 (1978)/. Radioaktivní LelF zkušební vzorek, získaný z cONA klonu interferonu LelF A byl použit k tříděni přibližně 500 000 pisků, z nicha bylo vybráno šest LelF genomových klonů. Po opakovaném tříděni a přečištěni plaků byl vybrán jeden z uvedených klonů, HLelF 2, pro další anelysováni.

Za použití shora popsané metody lze s výhodou použít jiných zkušebních vzorků k izolováni dalších leukooytárníoh interferonových bílkovin podle tohoto vynálezu.

Sestrojeni genu pro interferon LelF X:

1) EcoRI fragment klonu λ HLelF 2 o 2000 b.p. se subklonuje do plasmidu pBR 325 v jeho EcoRI restrikčním místě. Ziekaný plasmid obsahujicí LelF I se štěpí enzymem EcoRI a izoluje se fragment o 2000 b.p. Na tento EcoRI fragment o 2000 b.p. se naváže deoxy.oligonukleotid dAATTCTGCAG (konvertor EcoRI—Pstl), vzniklý produkt se rozštěpí enzymem Pstl a ziská se fragment o 2000 b.p. obsahující petl konce. Tento fragment se rozštěpí enzymem Sau 96 a izoluje se fragment o 1100 b.p., který mé jeden Pstl a jeden Sau 96 konec.

2) Plasmid pLelF C trp 35 se digeruje enzymy Pstl a Xbal a izoluje se větší fragment.

3) Malý Xbal - Pstl fragment z plasmidu pLelF C trp 35 se digeruje enzymy Xbal a Sau96 a izoluje se Xbal - Sau 96 fragment o 40 b.p.

4) Provede se ligace fragmentů izolovaných ve stupních 1); 2) a 3) a tak se vytvoří exprese schopný plasmid pLelF I trp 1.

Interferon LelF O

Postup k sestrojeni plasmidu schopného exprese LelF 3:

1) Plasmid pLelF 3 obsahuje HindlII fragment o 3,8 kilobaeich lidské genomové ONA. který zahrnuje LelF O genovou sekvenci. Z tohoto plasmidu se izoluje Oděl - Rsal fragment o 760 b.p.

2) Plasmid pLsIF trp 7 se rozštěpí enzymy HindlII a Ddel a izoluje ee HindlII - Ddel fragment o 340 b.p,

3) Plasmid pBR 322 se rozštěpí enzymem Pstl, fragmenty se zakončí lepivými konci inkubaci 8 DNA polymsrasou I (Klenowův fragment) a provede se digesce enzymem HindlII. Izoluje se velký fragment přibližně ,o 3600 b.p.

4) Provede se ligace fragmentů izolovaných ve stupních 1), 2) a 3) a tak se sestrojí expre se schopný plasmid- pLelF O trp 1.

M. čištěni

Obsah leukocytárního interferonu v bakteriálnich extraktech lze zvýšit postupným čištěnim:

1. Polyethyleniminovým 3ráženim, při kterém většina buněčných bílkovin, včetně interferonu, zůstává v supernatantu.

2. Amoniumsulfátovou frakcionaci, při které interferon vypadává z 55%niho nasyceného roztoku siřenu amonného.

3. Suspendováním amoniumsulfátových pelet v pufru složeném z 0,06 M fosforečnanu draselného a 10 mM Tris-HCl, pH 7;2; a dialysou proti 25 mM Tris-HCl, pH 7,9 (interferonová aktivita zůstává v roztoku).

4. Chromatografii shora uvedeným způsobem získaného supernatantu, při pH upraveném na 8,5, na sloupci OEAE celulosy (lineární gradientová eluce s O až 0,2 M roztokem chloridu sodného ve 25 mM Tris-HCl, pH 8,5).

5. Adsorpci na agarose (značky Cibachrome Blue Agarose) nebo na hydroxyapatltu a eluci

CS 273 182 B2

1,5 M roztokem chloridu draselného, popřípadě 0,2 M roztokem fosforečnanu.

O

6. Molekulárním tříděním na koloně Saphadaxu G-75.

7. Kataxovou chromatografii na CM-celulose ve 25 mM roztoku octanu amonného při pH 5,0, eluce amoniumacetátovým gradientem (až na 0,2 M roztok octanu amonného}·

Shora uvedenými čisticími postupy ss získá materiál o čistotě vyšěi než 95 %.

Surový materiál lzs rovněž čistit chromatografickým tříděním podle velikosti molekuly, vysokotlakou kapalinovou chromatografii s ravarani fází (RP-8) nebo afinitni chromatografii na imobilisovaných antiinterfaronových protilátkách.

Alternativně lze materiál získaný va shora uvedeném stupni 4 nanést na slouec obsahujíc! monoklonálni protilátku, připravený způsobem popsaným Milstainam v časopisu Scientific American 243, 66 (1980), a interferon eluovat směsi 0,2 M kyseliny octové,

0,1% roztoku Tritonu a 0,15 M roztoku chloridu sodného.

Při alternativním výhodném provedení lze leukocytárni interferon vyprodukovaný shora popsaným způsobem čistit pomocí následujících čisticích operaci:

1. Zmražené buněčné pelety obsahující exprimovaný lsukocytárni interferon ae rozbiji buď manuálně nabo ve vhodném drticím zářizaní. částečně rozmražená buňky as suspendují va 4 objemech pufru A, obsahujícího 0,1 M roztok Tris-baae upravený na pH 7,5 až 8,0 10% (m/V) roztok sacharosy, 0,2 M roztok chloridu sodného, 5 mM roztok EDTA, 0,1 mM roztok PMSF a 10 až 100 mM roztok bezvodého chloridu hořečnatého. Suspenze se udržuje na teplotě asi 4 °C.

Suspenze se pak nechá projit homogenisátorem při asi 41,4 MPa a pak znovu při tlaku menším naž 6,9 MPa. Efluant z homoganisátoru z obou pasáží sa jimá za chlazeni ledovou lázni.

2. K homoganátu se pomalu přidává polyethylenimin až do koncentrace asi 0,35 % a směs sa ponechá stát asi 30 minut. Pevné podíly se oddělí odstředěním nebo filtraci. Tento stupeň se provádí za stálého kontrolováni teploty nebo dostatečně rychle, tak aby teplota suparnatantu (nebo filtrátu) byla stéle nižší než 10 °C. Supernatant (filtrát) se zkoncentruje ultrafiltraci přibližně na 1/10 původního objemu. Drobné částečky nebo zákal v zadrženém zahuštěném roztoku lza odatranit filtraci přes vhodný filtr, jako například přes mikroporesni membránu.

3. Vyčeřený roztok se nanese přímo na sloupec obsahující monoklonálni protilátku, při rychlosti toku 5 až 8 cm/hod. (nap/íklad 25 až 40 ml/hod. na sloupci o průměru 2/6 cm). Po naneseni roztoku se sloupec .promyje přibližně desetinásobkem objemu sloupce roztoku mM Tris-HCl o pH 7,5 až 8,5, obsahujícího 0/5 M roztok chloridu sodného a roztok povrchově aktivní látky, jako 0;2 roztok Tritonu X-100 nebo ekvivalentní látky. Po promytí se sloupec vypláchne desetinásobkem objemu sloupce roztoku obsahujícího 0,15 M chlorid sodný a povrchově aktivní činidlo jako Triton X-100 (0,1% roztok) nebo jeho ekvivalent. Pak se sloupec eluuje 0,2 M roztokem kyseliny octové obsahujícím povrchově aktivní látku jako Triton X-100 (0,1% roztok) nebo jeho ekvivalent. Bilkovinovó frakce ze sloupce β monoklonálni protilátkou (stanovená pomoci UV abeorbanca nebo jinou vhodnou analytickou metodou) se shromáždí a pH sa upraví IN roztokem hydroxidu sodného nebo 1,0 M roztokem Tris-base na hodnotu přibližně 4,5.

4. Spojené intarferonové frakce se nanesou na sloupec katexu, jako na sloupec celulosy CM 52 (značky Whatman) nebo její ekvivalent, která byla předtím ekvilibrována vhodným pufrem, jako 50 mM roztokem octanu amonného o pH 4,5. Po naneseni interferonu se sloupec promývá pufrem použitým k ekvilibraci tak dlouho, až UV abeorbanca afluantu dosáhne takové hladiny, že ee ze sloupce sluuje trochu žádané bílkoviny. Sloupec se pak eluuje roztokem 25 mM octanu sodného obsahujícího 0,12 M chloridu sodného nebo jinou kombinaci, která optimalizuje získáni interferonu a poskytne po lyofilizaci produkt mající vyhovující vlastnosti jako vzhled a rozpustnost.

CS 273 132 B2

Monoklonálni protilátky používané při výhodném prováděni čištěni podle vynálezu popsaném výěe lze připravit postupy popsanými Staohalinem a spolupracovníky v časopisu Proč, Nati. Acad. Sci. USA 78, 1848-1852 (1981), Monoklonálni protilátky připravené z ascitické tekutiny ee vyčistí a kovalentně naváži na Affigel-10 způsobem popsaným níže:

Každá z pěti myších samic druhu Balb/c se naočkuje 5 až 10 x 10 hybridomnich buněk ze střední růstové fáze kmene. Asi 5 χ 10³ životaschopných buněk získaných z myši produkční kapaliny se inokuluje intraperitoneálně další skupině deseti nebo více myší. Od každé myši z posléze uvedené skupiny se opakovaně (2x až 4x) odebírá ascitická kapalina. Mohou být provedeny až tři přenosy buněk a následující odebrání ascitické kapaliny z Jedné skupiny myši na druhou. Ascitická kapalina odebraná myším při každém přenosu buněk se shromažďuje.

Z ascitické kapaliny se odstraní' buňky a jejich zbytky odstředěním při nízkých otáčkách (500 až lOOOnásobek g) po dobu 15 minut. Pak se pokračuje v odstřeďováni při 18 000 otáčkách za minutu po dobu 90 minut.'Suparnatant sa zmrazí a uloží při teplotě -20 °C.

Po zmrazení se odstraní další fibrin a Jemný vyloučený materiál odstřeďovánim při 35 000 otáčkách za minutu po dobu 90 minut. Všechny šarže ascitické kapaliny z každého transferu se testuji na specifickou protilátkovou aktivitu stanovením protilátkovó vazby v pevné fázi /viz Stachelin a spolupracovnici, citace uvedená výše/ a vyhovující podíly se spo ují.

Koncentrace bílkoviny ve spojených roztocích ae stanoví aproximačně na základě toho, že 1 mg bílkoviny vykazuje při 280 nm abrosbanci 1,2 v kyvetě o tlouštce 1,0 cm. Ascitické kapaliny s vysokými hladinami protilátky obsahuji 30 až 35 mg bílkoviny v jednom ml.

Toto množství je ekvivalentní 4 až 7 mg specifické protilátky/ml. Ascitická kapalina o této koncentraci ss ředí PBS roztokem (roztok 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7,3 a 0,15 M chloridu sodného) na koncentraci 10 až 12 mg bílkoviny v ml.

Ke každým 100 ml takto zředěného roztoku se při O °C, za intenzivního mícháni, pomalu přidá 90 ml při teplotě místnosti nasyceného roztoku síranu amonného. Suspenze ss chladí ledem po dobu 40 až 60 minut a pak se odetřeďuje 15 minut při teplotě 4 °C při 10 000 otáčkách za minutu. Suparnatant se oddekantuje a odcentrifugovapá látka se dobře vysuší. Pelety bílkoviny se rozpusti v roztoku obsahujícím 0,02 M Trie-HCl (pH 7,9) a 0,04 M chlorid sodný (pufr I). Roztok bílkoviny ss dialysuje 16 až 18 hodin při teplotě místnosti proti 100 objemům zmíněného pufru I s minimálně jednou výměnou pufru. Dialysovaný roztok ee za účelem odstraněni nerozpustného materiálu odstřsďujs 10 minut při 15 000 otáčkách za minutu. Podle stanoveni absorpce při 280 mm ss získá 30 až 35 % původního množství celkové bílkoviny přítomné v ascitické kapalině.

Roztok obsahující 30 až 40 mg bílkoviny na ml se poté nanese na sloupec DEAE-celulosy, ekvilibrovanó předem pufrem I, Na každý gram nanesené bílkoviny se použije vrstva sloupce o objemu alespoň 100 ml. Protilátka se ze sloupce vymývá gradientovou eluci roztokem chloridu sodného obsahujícím 0,02 M Tris-HCl o pH 7,9, s lineárním gradientem od 0,04 M do 0,5 M chloridu sodného. Spojené frakce bílkoviny sluované roztokem o koncentraci mezi 0,06 až 0,1 M chloridu sodného ss zkoncentruji tím způsobem, žs ss bílkovina vysráži stejným objemem roztoku síranu amonného nasyceného při teplotě místnosti a produkt se odcentrifuguje. Získané pelety bílkoviny se rozpusti v roztoku obsahujícím 0,2 M hydrogsnuhličitan sodný (pH asi 8,0 ) a 0,3 M chlorid sodný (pufr XX) a roztok se dialysuje při teplotě místnosti proti stejnému pufru, který se třikrát vymění, Oialysovaný roztok se za účelem odstraněni malého množství nerozpustného materiálu odetřeďuje 15 minut při 20 000 násobku g, a koncentrace bílkoviny se upraví pufrem II na hodnotu 20 až 25 mg/ml. Uvedeného roztoku protilátky se použije k přípravě imunoadsorbantu následujícím způsobem.

Affigel-10 (dodavatel BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornie) se promyje na sin23

CS 273 182 B2 trovaném skleněném filtru třikrát ledem ochlazeným isopropanolem a pak třikrát ledovou destilovanou vodou. Kaša gelu (asi 50%ni v ledové vodě) se přenese do trubic z plastické hmoty a provede sa sedimentace adsorbentu krátkým odstředěnímj supernatant se odsaje.

Do trubice naplněné gelem se přidá stejný objem (vzhledem ke gelu)přečištěného roztoku protilátky a trubice se nechá za účelem promíchání obsahu otáčet kolem kolmé osy 5 hodin při 4 °C. Po skončení reakce se gel odstředí a promyje dvakrát pufrem III (roztok 0,1 M hydrogenuhličitanu sodného a 0,15 M chloridu sodného), aby se odstranila nezkopulovaná protilátka. Stanoveni bílkovin ve spojených promývacich roztocích ukázalo, že vice než 90 % protilátky se navázalo na gel.

Aby se zablokovala nezreagoovaná místa, smísí se takto upravený gel se stejným objemem 0,1 M roztoku hydrochloridu ethanolamínu (pH 8) a trubice se nechá znovu za účelem promíchání obsahu rotovat 60 minut při teplotě místnosti. Kaše gslu se promyje až do odstranění reaktantů roztokem PBS a přechovává ee v roztoku PBS v přítomnosti 0,02 % (m/V) azidu sodného při teplotě 4 °C.

N. Parsnterálni podávání interferonů

Interfsrony LelF lze podávat parenterálnš osobám potřebujícím antitumorové nebo antivirové léčeni a těm, u kterých se projevují imunosupresivní stavy. Dávkováni a počet dávek jsou paralelní s těmi, které se běžně používají při klinickém zkoušeni interferonů θ získaných z lidských zdrojů, například asi (1 až 10) x 10 . jednotek denně, a v případě materiálů o vyšší čistotě než 1 %, účelně až do této čistoty, například 5 χ 10⁷ jednotek denně.

□ako jeden příklad vhodné aplikační formy pro v podstatě homogenní bakteriální interferon LelF lze uvést přípravu parenterálni formy: 3 mg LsIF o specifické aktivitě naQ přiklad 2 x 10 jednotek/mg se rozpusti ve 25 ml 5N roztoku lidského serumalbuminu, roztok se zfiltruje přes bakteriologický filtr a zfiltrovaný roztok se asepticky rozdělí do 100 kusů injekčních ampulek, které pak' obsahuji po 6 x 10 jednotek čistého interferonu vhodného pro parenterálni podáváni. Ampulky se před použitím výhodně přechovávají v chladu (při -20 °C).

Sloučeniny podle předloženého vynálezu lze formulovat známými metodami do formy farmaceuticky vhodných přípravků, přičemž' účinný polypeptid se používá ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosným vshikulsm. Vhodná vshikula a jejich formulování jsou popsány například v příručce Remington's Pharmaceutical Sciences E.V, Martinem, na kterou zde odkazujeme. Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují účinné množství interferonové bílkoviny spolu s vhodným množstvím vshikula umožňujícího účinné podáváni preparátu hostiteli. 3eden z přednostních způsobů podáváni js parentsrálni podáváni.