CS270021B1 - 2působ přípravy nízkomolekulárnlch látek obsahujících imunomodulační aktivity z buněčných lyzátů lidských a zvířecích tkání, vylučující přítomnost infekčních agens a jejich toxických produktů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká přípravy nízkomoleku- J ! lárních látek obsahujících imunomodulační j aktivitu z homogenátů orgánů, tkání a bu- j něčných suspensí lidského a zvířecího půvo- j du zaručujících^uchování plné biologické i hodnoty a zabraňujícím průnik virových, bakteriálních a dalších mikrobiálních agens a jejich toxických produktů z výchozího ma- ; terlálu do konečného produktu. Požadovaných i cílů se dosáhne výběrem vhodných lidských . i zvířecích dárců, kontroly výchozího mate- I riálu na nepřítomnost vybraných infekčních agens, zachováváním nízkých teplot v průběhu celého procesu zpracování, použitím * dodatečné ultrafiltracé získaného dialyzátu nebo ultrafiltrátu. Tento postup umožní i bezpečnou hromadnou výrobu vysoce účinných imunomodulačnlch preparátů použitelných ■ v lidské a veterinární medicíně k prevenci j nebo léčbě chorob, z nichž mnohé měly dosud I letální průběh a byly zapříčiněny různými ' ‘ poruchami imunity.

Description

Vynález se týl$á způsobu přípravy nízkomolekulárních látek obsahujících imunomodulační látky z buněčných lyzátů lidských a zvířecích tkání, vylučujících přítomnost infekčních agens a jejich toxických produktů. Způsob přípravy umožňuje zvýšení kvality maximálním zachováním biologicky aktivních, ale velmi labilních látek při vyloučení rizika přenosu Infekčních onemocnění o odstranění většiny nežádoucích látek.

v průběhu posledních 20 let se projevuje snaha využívat vysoce účinné biologicky aktivní látky živočišného původu mající imunomodulační vlastnosti, v léčbě těch chorob, jejichž terapie je doeud problematická a často neúspěšná (stavy imunodefiolsncs, nádorové choroby, imunopatologické stavy, Infekční choroby apod. - Pekárek J.i Pokroky v Imunolouli, Cd.i Ouranaký, Stofanovlč, etr. 155, 1979) Bardens E. 3.i 3. Allergy and Clln. Immunol., 75, 423, 1985| Drews 3. i Infection_tl? .SudoI. 2, 242, 1985).' Jedná se hlavně o látky získané z krve e různých orgánů a tkání, z lidí a zvířat, obsahujících imunologicky aktivní buňky. Vzhledem k možnosti vzniku anatylaktické nebo transplantační reakce je nutné použít k léčebným účelům pouze látky zbavené alogenních nebo dalších antlgenních struktur. Navíc je nutné odstranit z uvedených látek různá infekční egens živočišného původu, zejména virů, schopných vyvolat závažná lidská, popřípadě zvířecí onemocnění. Používané postupy (Horowitz st sl.i Transfusion, ££, 516, 523, 1985) jako např. jednorázové působení vyšěích teplot nebo opekovené, popřípadě dlouhodobé působení mírnějších teplot <60 °C), podobně jako půeobení některých chemikálií, se v tomto případě nedají využít, nebol všechny tyto postupy podatatně narušují žádanou biologickou aktivitu.

Nízkomolskulární látky, získaná např, z dialyzátu extraktu imunologicky aktivních tkání, obsahují řadu specifických i'nespecifických (ne antlgenech,závislých) faktorů a imunomodulačními vlastnostmi. Z nespecifických jsou to např. inosin, C vitamin, psptidy, štěpy nuklsinových'kyselin, látky působící jsko tymosin apod. (Fudenberg H. H.i Proceedings of ths Fifth Internationsl Symposium on Tranter Factor - Ed. Institute of Virology SAV, Bratislava 1987), Antigen «pacifické fíktory jsou trsnsfer faktor (Lawrence H. S. et al.t Trans, Assoc. Amer. Physicians ,22., 84, 1963) a indukční a supresorické faktory (Borkowski W. and Lswrenoe H. S.i 3. Immunol..123. 1741, 1979). Trsnsfer faktor podle současných znalostí js ribosilovaný peptld (Burger D. R. et el.i 3. Immunol., 122. 1091, 1979). Ode však o látky velmi labilní, která se inaktivují, nebo deetruují jak při nevhodném zpreoování, tek iekladování. Výhodou těchto nízkomolekulárníoh látek je, že jsou , samy o sobě nsantigenní, a jo proto možné jo opakovaně podávat, aniž by došlo k nežádoucím reakcím (anafylaxe), nebo k nerušení jejich biologické aktivity imunitním aparátem příjemce.

' Při dosavadním způsobu příprsvy (např. transfer faktoru) je preparát vyráběn jednorázovou dislýzou nebo ultra!Utrácí z materiálů z jednotlivých dárců, .a to v omezeném množství pro malý počet pacientů (.Lawrence H. S.i The Hervey Lectures Series, 68. 239, 1974| Arala-Chavez st al. i Immunological Engineering, Ed.t Jírech 3. W,, 35, 1978). Pro použití u velkého množství dárců, nebo v terapeutických klinických zkouškách je tento přístup příliš časově náročný o neposkytuje dostatečná množství produktu. Při průmyslové výrobě velkých množství preparátů je nutné použít materiálů získaných z několika set až tisíce dárců nebo z většího množství zvířat. Tím se pochopitelně zmnohonásobí prsvděpodobnost výskytu infekčních agens. e způsob přípravy se podstatně prodlouží a stává se náročnějším z hlediska možné degredeoe produktu, jednorázový proces dialýzy nemueí zaručit za všech okolností nepřítomnost infekčních egens'v dialyzátu, zejména viru hepatitidy a HIV u AIDS, nebol může dojít jak k potřísnění povrchu dialyzační membrány tkáňovým extraktem, tek nelze ani vyloučit makroskopicky nezjistitelné mikrotrhliny umožňující průnik infekčních virových zárodků. Totéž plstí o ultrafiltračníoh membránách.

Předmětem vynálezu je tedy způseb přípravy nízkomolekulárních látek obsehujících imunodulační aktivity z buněčných lyzátů lidských nebo zvířecích tkání vylučující přítomnost Infekčních egens a jejich toxických produktů, jehož podetsta spočívá v tom, že se lidský nebo zvířecí materiál obsahující imunokompetentní buňky, odebraný od vybraných dárců, okamžitě po odběru zpracuje a nejpozději 4 hodiny po odběru zmrazí na teplotu nižší

CS 270021 Bl než -18 °C, po rozmražení se při udržování teploty do 4 °C zhomogenizuje, podrobí dialýze nebo ultrafiltraci a takto získaný roztok se zahustí lyofilizací nebo ultrafiltrací a bezprostředně před vlastním rozpínáním konečného produktu se znovu ultrafiltruje přes membránu propouštějící látky o molekulové hmotnosti nižSí než 10 000 0 a následně sterilizuje filtrací. Ve výhodném provedení se homogenizace provádí metodou opakovaného zmrazování a rozmrazování nebo ultrazvukovou dezintegrací, případně kombinací obou technik a při zpracování se provádí centrifugace, sedimentace případně filtrace. Proces dialýzy se výhodně průběžně kontroluje spektrofotometricky.

Způsobů jako dosáhnout požadovaných cílů bylo popsáno již několik, ale každý způsob sám o sobě nestačí zaručit všechny potřebné podmínky najednou. Samotná příprava homogenátu tkání, nebo orgánů pomocí mechanických homogenizátorů na principu mixérů, mlýnků na maso, apod. nezajistí rozrušení buněčných stěn imunokompetentních buněk. Za účelem docílení maximálních výtěžků biologicky aktivních látek je nutné tuto homogenizaci doplnit způsoby zaručujícími nerušení buněčných stěn, jako je např. opakované střídání cyklů zmražování a tání, nebo rozrušení buněk pomocí ultrazvuku, popřípadě kombinací těchto dvou metodik, jak je to použité v postupu podle vynálezu.

Takto získaný hemogenát se podrobí přímo dialýze bez další úpravy. Při využití ultrafiltrace jako prvého stupně získávání nízkomolekulárních látek je nutné homogenát vyčeřit buá centrifugací, nebo stupňovitou filtrací (počínaje kalolisem a konče hrubší ultrafiltrací), přičemž pro získání maximálního výtěžku je nutné výchozí materiál v průběhu zpracování dořeňovat apyrogenní destilovanou vodou nebo jiným dialyzačním roztokem. Výtěžek nízkomolekulárních biologicky aktivních látek lze dále zvýšit průběžnou kontrolou obsahu nízkomolekulárních látek ve filtrátu nebo dialyzátu pomocí spektrofotometru při vlnové délce 260 nm a 280 nm; přičemž se proces dialýzy nebo ultrafiltrace ukončí tehdy, pokud již nedochází k dalšímu průniku nízkomolekulárních látek do filtrátu, nebo když jejich další přírůstek je minimální.

Nízkomolekulární biologicky aktivní látky získané dialýzou nebo ultrafiltrací je však nutné zakoncentrovat na přijatelný objem. Optimální metodou je lyofilizace s následným naředěným do požadovaného objemu, nebo použití ultrafiltrace přes membránu propouštějící látky o velikosti maximálně 1 000 0. Tohoto způsobu lze však použít pouze tam, kde se aplikují větší objemy konečného preparátu a kde není nutný tak vysoký stupeň koncentrace .

Biologicky aktivní látky s imunomodulačrií aktivitou se nalézají ve frakci dialyzátu nsbo ultrafiltrátu, která obsahuje polypeptidy a nízkomolekulární štěpy nukleinových kyselin. Tyto látky jsou velice choulostivé na vliv teploty, a proto vyžadují důsledné dodržování tepelného režimu během celého výrobního procesu. Základní podmínkou pro výrobní postup zaručující minimum ztrát aktivity těchto látek je zachování co nejnižších teplot v průběhu všech operací. V praxi to znamená, že výchozí materiály jako orgány, tkáně, buněčné suspenze je nutné okamžitě po odběru zpracovat tak, aby mohly být nejpozději 4 hodiny po odběru zmraženy tekutým dusíkem nebo suchým ledem nebo uloženy do mrazicích boxů při teplotě nižší než -18 °C. Rovněž doprava a další skladování těchto materiálů se musí dít za těchto kautel. Při dalším zpracování takto získaných materiálů homogenizací, sonikací, centrifugací, filtrací, ultrafiltrací a dialýzou apod. nesmí teplota překročit +4 °C. jedinou výjimku představuje procestání v průběhu opakovaného zmražování a rozmražování, kdy ss proces rozmražování provádí v lázni 37 °C teplé. Zachování tohoto teplotního režimu platí i pro finální produkt, který je nutno uchovávat buá při teplotách nižších než -20 °C nebo v lyofilizovaném stavu.

řři výrobě biologicky aktivních látek živočišného původu je kromě dodržení podmínek nutných pro zachování vysoké imunomodulační aktivity a docílení jejich maximálního zisku nutné zajistit i vyloučení přenosu infekčních agens, schopných vyvolat onemocnění u lidí nebo léčených zvířat. Základní podmínkou v xomto smyslu je cílený výběr vhodných, zdravých (tj. choroboplodných zárodků prostých) dárců, a to jak lidí, tak i zvířat. Další ne

C8 270021 Bl

J zbytnou podmínkou je cílená kontrole získaného materiálu na přítomnost vybraných závažných infekcí (např. viru hepstltidy B, přítomnost původce AIDS apod.). Vlastní výrobní postup musí bezpečně zajistit bud inaktivaoi, nebo nepřítomnost choroboplodných zárodků v konečném preparátu; Příprava imunomodulačníoh látek o molekulové hmotnosti nižší než 10 000 0 sama o sobě by mála zaručit nepřítomnost infekčních, zvláště virových částic. Zajištění této větší bezpečnosti ředí výrobní postup, spočívající v opakování ultrafiltrace a sterilní filtrace provedené těsná před konečným rozpínáním příslušného finálního produktu. Tento postup dokáže kromá bezpečného odstranění infekčních agens odstranit s konečnou platností 1 různé nežádoucí produkty těchto agens, jako jsou např. endotoxiny, bnktnrlelní pyrogeny nebo některé mikrobiální entigeny, a to tekové, které as mohly doetut do meziproduktu např. shora uvedenými mlkrotrhlincml v membráně) stejně jako ty, které mohly výjimečně kontaminovat materiál během zpracováni. Způsob výroby spočívá též ve smíšení materiálu z velkého množství déroů, což je výhodné zejména proto, že se jednak nuřodí nežádoucí aktivity (vyěší množství tlumlvého faktoru) evsntélně přítomné v některém materiálu z jednotlivého dárce, jednak se překryje nepřítomnost antigen specifických rektorů, která ee vyskytuje u některých dárců.Tekový preparát pak Obráží imunologickou kapacitu velké populační skupiny. Dé se tedy konstatovat, že těmito postupy se dále podstatně zvýěí kvalita konečného produktu. ,

Nízkomolekulární látky získané výěe uvedeným způsobem nevykazují žádné příznaky akutní ani chronické toxicity v pokusech na myčích a morčatech. Při léčebné aplikaci preparátu nebyly v průběhu schválené rozěířené klinické studie, nežádoucí reakce (Pekárek 3. et al.i Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 491, 1987).

Při sledování Imunomodulačních vlastností těchto látek se zjistilo, že umožňují zejména polyklonální aktivaci lymfocytů od pacientů s prokázanou poruchou funkce T lymfocytů (Pekárek 3. et al.t Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 185, 1987). V kultuře morčecích tymocytů vykazují komltogenní efekt tím, že stimulují blastiokou transformaci Indukovanou konkanavalinem A (Barnet K. et al.t Abstract of the VI^th International .Workshop on Transfer Factor, Beijing, str. 71, 1988). Tyto látky účinkují rovněž v testu znovuobnovy rozet a stimulují reakci ětěpu proti hostiteli u zvířat se záměrně poručenou imunitou (Barnet K. st al.t Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 178, 1987).

Při léčebné aplikaci normalizují sníženou hladinu I lymfocytů u pacientů s poruchou buněčné Imunity. Zkouška účinnosti předepsaná Státním ústavem pro kontrolu léčiv je založena právě na tomto principu. Výrazné imunomodulační vlastností nízkomolekulárních látek připravených výše uvedeným způsobem byly rovněž ověřeny v průběhu výěe uvedená rozšířené klinické studie, kde se prokázalo, že ve více než 80 h případů došlo k normalizaci porušené hladiny T lymfocytů a ve významném procentu 1 k normalizaci dalších imunologických ukazatelů, narušených v důsledku stavu poruch imunity. Výrazný byl rovněž léčebný efekt u celé řady klinických stavů zaviněných poruchami imunity (Pekárek 3. et al.i Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 491, 1987).

Hromadnou přípravou nízkomolekulárních látek s imunomodulační aktivitou ve formě dialyzátů homogenátů leukocytů se zabývají některá pracoviště v NOR, ČLR a na Kubě. Výrobní postupy využívají většinou klasického postupu podle Lawrence (viz výše) s větší či menší modifikací jednotlivých kroků, podobně jako se postupuje 1 jinde ve evětě. Konkrétně v NOR se leukocyty z periferní krve dárců získávají formou leukooytárního koncentrátu centrifugací. Příprava homogenátů, tj. rozrušení leukocytů se provádí několikanásobným zpražením a rozmražením. Takto získaný homogenát se vyčeří centrifugací a získaný supernatant se ultrafiltruje přes membránu propouštějící látky o molekulové hmotnosti menší než 10 000 0 (Sartorius filtr SM 12 Dá). Vlastní preparát určený pro klinickou aplikaci obsahuje v 1 dávce 5 mezinárodních jednotek (m. j.). Tento výrobní postup je uveden v práci Franke et al. (The Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 575, 1987). Při stanovení m, j. se v NOR podobně jako jinde ve světě vychází z počtu leukocytů obsažených ve výchozí surovině. Vlastní definice této jednotky zní, že je to množství biologicky

CS 270021 Bl o aktivních látek obsažených ve výchozích 1 x 10 leukocytech. Toto množství považované za 1 m. j. se v NOR podobně jako u nás získá obecně z odběrů 2 dárců (tj. 2 x 450 ml krve). Preparát používaný v NOR obsahuje podle tohoto propočtu v 1 terapeutické dávce 5 m. j. což 9 odpovídá výchozím 5 x 10 živých leukocytů.

Naproti tomu preparát Transfer faktor SEVAC, který je vyroben způsobem podle vynálezu, obsahuje v 1 terapeutické dávce pouze 0,2 m. j., tj. množství biologicky aktivních lá’ 8 tek obsažených ve výchozím množství 2 x 10 živých leukocytů. Přitom klinická účinnost obou preparátů, tj. preparátu vyrobeného v NOR metodikou v současné době ve světě běžnou, který obsahuje v 1 dávce 5 m. j., je srovnatelná s preparátem, který je vyroben způsobem podle vynálezu a obsahuje v 1 dávce pouze 0,2 m. j.

Při léčbě recidivujících uveitid činí základní terapeutická dávka preparátu NOR 30 m. j., při léčbě akutních forem dokonce 100 i více m. j. (Fricke H. 0. et al.: The Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 533, 1987). Naproti tomu Hána a spol. (Abstrakta Imunologického sjezdu v Plzni, 1988) uvádějí srovnatelný klinický úspěch s preparátem Transfer faktor SEVAC, podávaným ve schématu doporučovaném výrobcem (Příbalový leták: Transfer faktor SEVAC) v celkové dávce pouze 1,2 m. j. To ve skutečnosti znamená, že srovnatelného klinického účinku bylo dosaženo 25násobně nižšími dávkami (v m. j.) preparátu vyrobeného způsobem podle vynálezu než s preparátem vyrobeným ve světě běžně používaným způsobem.

Podobně i v dalších klinických případech se dosáhne požadovaného klinického účinku s preparátem Transfer faktor SEVAC, který je vyroben způsobem podle vynálezu, za použití jedné, maximálně 2 m. j., zatímco zahraniční preparáty vyráběné dosavadní technologií vyžadují podání 20 i více m. j. Tak Huo Baolai v ČLR užívá k léčbě chronické hepatitidy B 2 m. j. podaných 2 x týdně po dobu 3 měsíců, tj. celkem 46 m. j. Podobně další čínský autor Li Zailian při léčbě herpetické keratitidy užívá rovněž schématu používajícího 2 m. j. podávaných 2krát týdně. Celkem podává 10 injekcí, tj. 20 m. j. Podobných případů by se dalo citovat více.

Srovnáme-li výše uvedené výsledky klinické účinnosti preparátů, vyrobených dnes ve světě běžně užívaným klasickým způsobem podle Lawrence nebo jeho mírnou modifikací, s výsledky získanými preparátem vyrobeným způsobem podle vynálezu, zjistíme, že tento způsob umožní zachovat maximální biologickou aktivitu obsaženou ve výchozích živých leukocytech po celou dobu výrobního cyklu oproti klasickému, dnes běžně ve světě používanému způsobu. Tato minimálně 25násobně vyšší účinnost preparátů vyráběných způsobem podle vynálezu ve srovnání s klasickým výrobním postupem nevyplývá však ze součtu účinků jednotlivých kroků, ale ze souboru kroků, které pouze v kombinaci uvedené ve vynálezu dokáží jako celek vytvořit podmínky pro uchování maximální biologické aktivity z výchozího materiálu, a navíc zaručit jeho maximální bezpečnost a neškodnost. Navíc účinnost preparátu Transfer faktor·.SEVAC je ve většině případů kromě klinického efektu potvrzována i jeho vlivem na imunitní aparát pomocí imunologických testů schopných objektivně posoudit aktuální imunitní stav vyšetřované osoby. Tato průběžná imunologická kontrola prokazuje, že zlepšení nebo normalizace klinického stavu je provázeno zlepšením nebo normalizací sledovaných imunologických ukazatelů (Pekárek J. et al.: The Fifth International Symposium on Transfer Factor, str. 491, 1987).

Předností popsaného způsobu výroby biologicky aktivních látek živočišného původu je to, že umožňuje přípravu vysoce účinných imunomodulačních látek, použitelných v humánní i ve veterinární medicíně v léčbě nebo prevenci chorob, jejichž léčba je dosud problematická, nebo dokonce neúspěšná. Výše popsaný postup dále zaručuje uchování velice labilní biologické aktivity v průběhu celého výrobního cyklu a umožňuje maximální výtěžek účinných látek obsažených ve výchozím materiálu.

Výrobní postup je zaměřen k odstranění nebo vyloučení infekčních agens přítomných ve výchozím materiálu a schopných vyvolat onemocnění u příjemců (lidí nebo zvířat). Předností tohoto postupu je, že kromě odstranění infekčních agens odstraňuje i nežádoucí pro

CS 270021 Bl :

dukty patogenních i nepatogenních mikrobů, které se mohly dostat do produktu jak z výchozího nateriálu a použitých roztoků a ingrediencí, tak i v průběhu vlastního výrobního procesu.

Pcpsaný.způsob přípravy lze využít při výrobě specifických přenosových faktorů cílených inunoregulačních látek jako jsou faktory stimulující selektivně určité typy imunitního systému, a to jak pomocné T lymfocyty, tak lymfocyty tlumící imunitní odpověó, dále při přípravě nízkomolekulárních obecně imunostimulečních látek, některých nízkomolekulárních faktorů z lidských a zvířecích brzlíků, stejně jako při přípravě různých diferenciaCních faktorů a faktorů schopných ovlivnit žánětlivou reakci a hojení ran, a to jak v hunánní, tak i veterinární medicíně.

Příklad 1 .

Krev odebraná zdravým dárcům krve prověřeným podle pravidel transfúzní služby byla do 30 ninut odstředěna při 500 G po dobu 25 minut při teplotě *4 °C a vrstva na rozhraní plazmy a erytrocytární masy - leukocytární koncentrát - byl odsát a stanoven počet leukccytů. Takto získaný leukocytární koncentrát se zmrazil při teplotě -20 °C, takže od doby odběru krve do uložení leukocytárního koncentrátu do mrazicího boxu uplynulo 80 minut. Po 24 hodinách čekací lhůty nutné ke sledování zdravotního stavu dárce po odběru a laboratorním vyšetření vzorku leukocytárního koncentrátu na přítomnost viru hepatitidy 8 a HIV byly lahvičky NTS 100 ml převedeny do Ústavu sér a očkovacích látek v termoboxu na suchém ledu. Zde se lahvičky ponechaly při pokojové teplotě, až jejich obsah roztál. Ihned po roztáni se obsah 8 lahviček NTS 100 ml slil do velké NTS 500 ml láhve, v níž se provedla dezintegrace leukocytů pětinásobným zmražením v mrazicí lázni sestávající z linu denaturovaného 1 X hmotnostním benzinu ve směsi se suchým ledem. Teplota lázně se udržovala v rozmezí -50 °C až -65 °C. Rozmražení se provedlo umístěním lahve do vodní lázně vytemperované na *37 °C. Okamžitě po roztáni se obsah lahve opětně zmrazil. Po pětinásobném zmražení a rozmražení se láhev uložila do ledové lázně a její obsah se podrobil sonikaci při 20 kHz po dobu 3 minut na přístroji Soniprobe type 7530 A. Takto připravený homogenát se vpravil do dialyzační trubice o průměru 48 mm a dialyzoval proti pětinásobnému objemu sterilní apyrogenní destilované vody při teplotě *4 °C. Po 24 a 48 hodinách byly dlalyzáty odebrámy a vyměněny za novou destilovanou vodu. U každého z těchto tří dialyzátů byla stanovena absorbance při 260 a 280 nm. Vzniklý dialyzát se zahustil lyofllizscí, lyofllizát se rozpustil ve 48 ml vody pro injekce tak, že 1,6 ml vzniklého roztoku obsahovalo biologicky aktivní materiál z původních 200 miliónů leukocytů. Takto připravený roztok se znovu přefiltroval přes ultrafiltr UM 10 firmy AHICON, propouštějící látky o molekulové hmotnosti menší než 10 000 0, okamžitě se sterilizoval filtrací přes sterilizační filtr Millipore GSWP, rozplnil do ampulí po 1,6 ml, zmrazil při -28 °C a při této teplotě se uchovával. Konečný preparát se zkoušel fyzikálně-chemlcky, biologicky, na sterilitu a měl tyto parametry: roztok byl čirý, slabě nažloutlý, poměr abaorbancí “TJjbo ^by^ ^1,S5’ ^{Test na} sterilitu, neškodnost a biologickou účinnost vyhovoval. Uvedený preparát byl použit k léčbě 6 lidí, u kterých byl prokázán defekt buněčné imunity (snížená hladina E rozetujících buněk) a kteří trpěli opakovanými záněty dýchacích cest. Každému pacientovi byly podány 4 dávky preparátu (á 0,2 m. j.) subkutánně. Kontrolní imunologické vyšetření prokázalo vzestup snížené hladiny E rozetujících buněk u 5 ze 6 uvedených pacientů.

Příklad 2

Krev odebraná zdravým dárcům byla zpracována postupem uvedeným v příkladu 1 až do stadia izolace nízkomolekulárních látek z homogenátů. Homogenát získaný z 8 lahviček leukocytárních koncentrátů byl centrifugován v chlazené centrifúze janetzki při 2 500 G po dobu zj minut. Supernatant byl filtrován postupně přes Millipore filtr typu RAWP (1,2 um). HAiv'i' (3,45 un) a Amicon membránu UM 10 při teplotě *4 °C. Podíl zadržený na membráně UM 10 byl promyt čtyřnásobným množstvím vody pro injekce. Získaný ultrafiltrát byl zlyofilizován, rpzpuštšn ve 48 ml vody pro injekce, znovu přefiltrován přes ultrafiltr Amiccn UH 1C. LItraf11trát byl sterilizován filtrací přes Millipore membránu GSWP, rozplněi po 1,6 ml c: ampulí, zmražen při -28 °C a při této teplotě uchováván. Konečný preparát byl zkc.šen

CS 270021 Bl postupem uvedeným v příkladu 1 s následujícím výsledkem: roztok byl čirý, slabě nažloutlý, Ao zn · poměr absorbancí byl 2,02; test na sterilitu, neškodnost a biologickou účinnost vyhovoval. Uvedený preparát byl použit k léčbě 5 lidí s recidivujícími záněty dýchacích cest.

Každému pacientovi byly podány 4 dávky (á 0,2 m. j.) preparátu subkutánně. Kontrolní imunologické vyšetření prokázalo vzestup snížení hladiny E rozetujících buněk u cientů.

všech 5 paPříklad 3

Čtyři leukocytární koncentráty získané od vybraných dárců, u nichž byla pomocí kožního testu s kandidinem, obsaženým v diagnostické soupravě Imunoskintest SEVAC prokázána výrazná reaktivita proti kandidinu, byly zpracovány metodikou uvedenou v příkladu 1. Výsledným preparátem byl specifický protikandidový. přenosový faktor. Bylo ho připraveno 12 dávek. Čtyři dávky byly použity v protekčním testu na myších, kde 1 dávka (0,2 m. j.) dokázala ochránit vždy 5 myší před letální infekcí, vyvolanou podáním dávky 1 x 10^ živých zárodků Candida albicans. Osm dávek (á 0,2 m. j.) bylo použito ke zvládnutí pooperačního septického stavu, vyvolaného C. albicans u dvou pacientů.

Příklad 4

Ze 2 zdravých býčků a 2 jalovic se okamžitě po porážce odebraly lymfatické uzliny inguinální, mezenteriální a subskapulární. Pomocí pinzety a nůžek se uzliny zbavily tukové a vazivové tkáně, vložily do PE sáčků, zmrazily na suchém ledu a v tomto stavu se transportovaly do Ústavu sér a očkovacích látek. Zde se uzliny uchovávaly při teplotě -20 °C. Před dalším zpracováním se materiál ponechal při pokojové teplotě až do roztáni. Potom se při teplotě +4 °C uzliny rozkrájely pomocí nůžek, skalpelu a pinzety na malé kousky. Z tohoto materiálu byl odvážen podíl 500 gj který byl spolu s 1 000 ml sterilní apyrogenní destilované vody homogenizován v mixeru za chlazení. Tento homogenát byl rovněž za chlazení podroben ultrazvukové dezintegraci při 20 kHz po dobu 3 minut v podílech po 250 ml. Získaný homogenát byl odstředěn při 2 500 G po dobú 20 minut na chlazené centrifúze, isolovaný supernatant byl podroben postupné filtraci přes Millipore filtry typu RAWP a HAWP s následnou ultrafiltrací přes Amicon membránu UM 10. Po dvou hodinách se získaný retentát doplnil sterilní apyrogenní vodou do původního objemu a ultrafiltroval dále. Postup se opakoval pětkrát. Získaný ultrafiltrát se zahustil lyofilizací. Lyofilizát se rozpustil v 500 ml vody pro injekce, takže vznikl preparát, který obsahoval v objemu 5 ml biologickou g aktivitu obsaženou v původních 1 x 10. leukocytů. Takto získaný roztok byl znovu ultrafiltrován přes Amicon membránu UM 10 a po sterilizační filtraci přes Millipore membránu GSWP byl rozplněn po 5 ml do 10 ml ampulí. Po zkoušce sterility byl materiál předán Státnímu statku v Sokolově, kde jím bylo naočkováno 45 novorozených telat. První injekce byla podána 24 hodin po narození a druhá 21 dní později. Tato telata byla ustájena spolu s kontrolními telaty v počtu 50 kusů, kterým byl podán stejný objem fyziologického roztoku ve stejných intervalech jako transfer faktor u,pokusné skupiny. Po sedmiměsíčním sledování bylo prokázáno, že preparát připravený z hovězích uzlin dokázal ochránit telata před virovými a bakteriálními infekcemi, probíhajícími v tomto stádu. Z pokusné skupiny neuhynulo žádné tele, zatímco ze skupiny, které byl podán pouze fyziologický roztok uhynulo 5 telat. Navíc byla prokázána vysoká ochranná účinnost proti infekci vyvolané trychofyciemi. Zatímco ze skupiny chráněné uvedeným preparátem onemocněla pouze 3 telata, ze skupiny kontrolní onemocnělo 16 telat.

Příklad 5

Lymfatické uzliny a sleziny byly odebrány po porážce prasete 12 kg těžkého, infikovaného parazitem Ascaris suum a ihned zbaveny tuku a vazivové tkáně, zmraženy a odeslány v termoboxu na suchém ledu do Ústavu sér a očkovacích látek. 32,5 g tohoto materiálu bylo zpracováno po přidání 97,5 ml sterilní apyrogenní vody postupem uvedeným v předchozím příkladu. Finální preparát byl rozplněn do 16 ampulí a použit k ochraně prasat před infekcí parazity Ascaris suum. Ochranný účinek byl prokazován stanovením počtu larev v plicích nakažených zvířat. Pokus provedený na 11 prasatech prokázal ochranný účinek v 62 % případů oproti 100 % nakažených kontrolních prasat.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy nízkomolekulárních látek obsahujících imunomodulační aktivity z buněčných lyzátů lidských nebo zvířecích tkání vylučující přítomnost infekčních agens a jejich toxických produktů, vyznačující se tím, že se lidský nebo zvířecí materiál obsahující imunokompetentní buňky odebraný od vybraných dárců okamžitě po odběru zpracuje a nejpozději 4 hodiny po odběru zmrazí na teplotu nižší než -18 °C, po rozmražení se při udržování teploty do +4 °C zhomogenizuje, podrobí dialýze nebo ultrafiltraci a takto získaný roztok se zahustí lyofilizací nebo ultrafiltraci a bezprostředně před vlastním rozplněním konečného produktu se znovu ultrafiltruje přes membránu propouštějící látky o molekulové hmotnosti nižší než 10 000 0 a následně sterilizuje filtrací.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se homogenizace provádí metodou opakovaného zmražování a rozmražování, nebo ultrazvukovou dezintegrací, případně kombinací obou * technik. ·
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se při zpracování orgánů a tkání provádí centrifugace, sedimentace, popřípadě filtrace.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se proces dialýzy nebo ultrafiltrace průběžně kontroluje spektrofotometricky.