CS267936B1 - živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze, psinke, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide vhodná predovšetkým na profylaxiu kožušinových zvierat a sposob jej pripravy - Google Patents

Description

CS 267936 B1 1

Vynález sa týká ž i ve j atenuovanej vakclny proti parvoviróze, psinke, infekčnejlaryngotracheitide a infekčnej hepatitide, a spí)sobu jej pripravy na buňkových kultu-rách.

Popři všeobecne známých pSvodcoch virusových ochoreni psov ako sú běsnota, psin-ka a infekčná hepatitida, spoíahlivo kontrolovaných efektivnymi atenuovanými vakcinamiexistuje celý rad virusov, ktoré sú pSvodcami častých ochoreni zaživacich a dýchacíchorgánov. K týmto v prvom řade patria: paravirus psov, p^vodca akútneho črevného ocho-renia postihujúceho prevážne mláóatá, virus infekčnej laryngotrachei tidy a virus para-influenzy 2 psov, ktoré samostatné, alebo v súčinnosti s bakteriálnym zárodkom 9orde-tella bronchiseptica vyvolávají! hromadné ochorenia dýchacích orgánov /Kennel cough syn-drome/. Appel v roku 1978 definoval patogenitu parvovirusu psov /CPV 2/ a označil hoako povodců epizoocie črevného ochorenia ktoré sa objavilo prvýkrát v roku 1978 v Spo-jených štátoch.

Ochorenie vyvolané týmto virusom sa klinicky prejavuje nechutenstvom, malátnostou,zvracanim a hnačkou, ktorá móže byt krvavá. Zvieratá majú horúčku a pri hematologickomvyšetřeni sa spravidla zistuje znižený počet leukocytov. Srdcová forma ochorenia posti-huje výhradně štěňata a je charakterizovaná rýchlym a vetmi krátkým priebehom a násled-né úhynom. Ochorenie sposobuje výrazné straty v chovoch psov, pričoa úhyn představuje20 až 40 Z z celkového počtu zvierat. Ochorenie postihuje všetky věkové kategorie zvie-rat, ale najraK šteňatá, pričom nástup je prudký a priebeh velmi rýchly.

Psi adenovirus serotypu 2 /CADV-2/, izolovaný a identifikovaný DITSCHFIELDOM, 1962je serologicky, antigénne, svojim trpizmom a klinickým prejavom ochorenia odlišný od virusu infekčnej hepatitidy psov /ICH/.

Ochorenie vyvolané týmito virusom má charakter infekčnej laryngotracheitidy, tra-cheobronchitidy, zápalu nosofaryngu a pluc, s klinickými prejavmi nádchy, spontánnehokašla zapříčiněného zúžením priechodnosti priedušiek, a ptúcnej hyperventilácie dopre-vádzanej zvačšenim bronchyálnych lymfatických uzlin. Patologicko anatomický obraz cha-rakterizuje infiltrácia submukózy lymfocytami, plazma tickými buňkami a neutrofilmi,proliferativne Intersticiálna pneumónia, nekrotizácia bronchov a bronchio l i tis. Přiinfekcii virusom CAOV-2 sa zaistujú vnútrojadrové inklúzie lokalizované v epite l i a lnychbuňkách nosovej a faryngeátnej sliznice

Specifická profylaxia uvedených virusových ochoreni, ktoré predstavujú v chovochpsov vážný zdravotný problém je založená na pasivnej imunizácii podáním hyperimúnnychsér alebo imúnnych sérových globulinov, ale najčastejšie sa využívá aktlvna imunizácia.Vo svete boli vyvinuté inaktivované a živé monovalentné a kombinované vakclny /CANDURR--P, MULTIMUNR 7, N0BIR VAC-SH, ENDURACELLR 7 - NSR, GALAXYR-VI - USA/ First Live cani-ne parvovirus vaccine, Vet.Rec. 17,1Í84, 114 No.11 p.255; Stettner, W. - Schutzimpfun-gen beim Hund, Wiener. TierSrztliche Honatsschrift, 72, 1985, Heft 5 S.178-182., Lang-zeituntersuchung zur ImmunogenitSt eines Kombinationipfstoffes ftir Hunde, Zygraich, N.,- Charlier,P. - Florent,G., - Gill, MM.A., - a spol Kleintierpraxis 30, 1985, 45-49.

Aj ke3 v zastúpeni jednotlivých virusových kmeňov vo vakcinach je značná roznoro-dost, všeobecne sa požaduje aby jedna vakcinačná dávka obsahovala minimálně 102'5 ažΙΟ^'θΤΚΧΟ^θ z každého virusu.

Vzhladom na všeobecný výskyt parvovirózy psov a narastajúci počet respiratórnychochoreni, pri vylúčeni účinku virusov psinkového komplexu u masožravých kožuiinovýchzvierat, postavili sme si za ciel získal, alebo izolovat odpovedajúci virusový kmen, sperspektivou použit ho na pripravu očkovacích látok. Jednotlivé izoláty virusov ifekč-nej la ryngotrachei ti dy a parvovirusu sme cestou chemických, šero logických a virologic-kých metod identifikovali, klonovali, potvrdili ich puritu a elektrónopticky znázorni- 2 CS 267936 B1 li. Po ukonCanl atenuéde jednotlivých vlrusov na rdznych druhoch buňkových kultúr aovarani leh naikodnostl na vnímavých zvieratich sae vyvinuli Ž1vú koablnnovanů vakcl-nu proti uvedený· 1nfakc1éa.

Predaatoa vynálezu je teda živá atanuované vakclna proti parvovlróze a obsahoakaeňa CPVA-BM 80782 CAPN V-290 v množstva 103 TKIDjg, psinka * obaahoa kaeňa CDV-F-BN10/83 CAPN V-289 v anožatve 103 ΤΚΙΟ^θ, InfakCnaj laryngotraeheltld· a Infekčnej hepa-titlde, ktori ta vyznaCuja týa, že obaahuje v 2 al kaeň parvovirusu psov, CPVA-BN 80/82CAPN V-290, v anožatve najaenej 103 TK1D$O, kaeň virusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPN V--289 v anožatve najaenej 103 TKI»S0 a kaeň virusu InfekCnej laryngotraehdt1dy CAOV-2H-5/85 MDCK40 CAPN V-320 v anožatve 102*5 TKIOjg Častíc virusu. Vakclna obsahuje lyofl-llzaCné aédlua anožatve 25 až 50 haotnostných percent, ktoré ta skladi zo sacharózy,fosforačnanového pufru, glutaaitu sodného alebo draselného, bovlnného albuminu alebo1ného zdroja blelkovln a želatiny, alebo daxtrénu. Výroba vakclny aa vyznaCuja týa, žekultlvity parvovlruau psov a vlruau palnky připravené znéaya apfiaoboa ta zaleiajú akultlvétoa vlruau InfekCnej laryngotrachdtldy CADV-2 H-5/85 HDCK40 získaným pomnože-ním na atabllnej Hn11 ROCK. Virus InfekCnej laryngotraehelt1dy aa na uvedenej stabll-nej Hnil anožl prl teploto 37 °C po dobu 3 až 6 dni, kedy aa vytvorla výrazné cytopa-tlcké zaeny a potoa aa virusový aaterlél zaleia a lyof1UzaCnýa aédloa a lyof1l1t1zuje.

Virus infekčnej laryngotrachei11 dy představuje virulentný kmen zahraničnej prove-niencie získaný vo formě lyofilizátu infekčných tkaninových tekutin v 5. pasáži na buň-kových kultúraeh. Atenuácia virusu, homogenita vlrusovej populácie a stabilita imuno-biologických vlastnosti sa dosiahla v 35. pasáži na b.l. MDCK. K prlprave vakdny bolpoužitý virus v 40. pasáži na uvedenom druhu tkaniva atenuovaný a definovaný na našompráčovi sku.

Virusové kmene parvovirusu psov CPVA-BN 80/82 CAPM V-290, psinky COV-F-BN 10/83CAPM V-289 a infekčnej laryngotrache1 tidy CADV-2 h-5/85 MDCK 40 CARM V-320, sú uloženév Československej zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstvav Brně, Hudcova 60.

Postup výroby vakclny:

Spdsob výroby vakdny je založený na tom, že uvedené vakcinačné kmeny, neškodněpre všetky věkové kategorie psov a masožravých kožušinových zvierat pri (ubovolnej ap-likácii, sa pomnožujů na definovaných buňkových substrátoch narastenýeh na skle, plas-tickej hmotě, kultivovaných stacionářnym sposobom alebo v otáčaných fCašiach /rolleroch/,připadne na mikronosičoch.

Spťisob infekcie buniek FE vakcinačným vlrusom parvovirózy psov: 6 · 1

Suspenzia buniek o hustotě 5 až 10.10 buniek . ml v rastovom médiu sa zmieša svakcinačným vlrusom pri multiplicite infekcie od 0,0001 do 0,001. Zmes virusu a bunieksa inkubuje pri 36 až 38 °C počas 30 až 60 mitůt. Potom sa zmes virusu a buniek narie-di v rastovom médiu, ktoré představuje minimálně esenciálně médium podta Eagla s pH 6,8 až 7,3 s prldavkoa pletich až daslatich haotnostných pareant bovlnného séra s vy-značenou kvalitou.

Rovnako je možné do bunkovej suspenzie v rastovom médiu přidat inokulum vakcinač-ného virusu o multiplicite infekcie 0,0001 až 0,001 a zmes virusu o buniek vyliat dokultivačnej nádoby.

Takto připravená suspenzia buniek za ůčelom pripravy vakdny sa kultivuje na skle,plastickej hmotě, štacionárnym spúsobom, alebo v otáčaných fíašiach /rolleroch/, pri- CS 267936 B1 padne na mikronosičoch, při 36 až 38 °C pečas 4 až 8 dni.

Možná je tiež infekcia prichytených buniek na kultivačom povrchu - po štvor ažšesthodinovej inkubácii buniek linie FE pri 36 až 38 °C. Do rastového média sa přidáinkulum vakcinačného virusu oni multiplicite infekcie 0,0001 až 0,001. Imkubácia pok-račuje pri 36 až 38 °C počas 4 až 8 dni. Množenie virusu je rovnako ako v bode A a Bsprevádzané výraznými cytopatickými změnami.

Sposob infekcie buniek kuracich embryonálnych fibroblastov KEB a buniek linie VĚROvirusom psinky.

Buňkové kultury KEB alebo VĚRO sa infikujú vakcinačným kmeňom virusu psinky primultiplicite infekcie najmenej 0,005. Infikujú sa 24 až 48 hod. buňky narastené na kul-tivačnom povrchu tak, že sa vymeni rastové médium za udržovacie, do ktorého je přidanéInfekčné inokulum. Udržovacie médium je pre jednotlivý druh buniek rovnakého zloženiaako rastové, ale neobsahuje sérum a má upravený obsah hydrouhli či tanu sodného na 0,1 až0,2 hmotnostných percent.

Alebo sa zmes virusu a buniek nechá inkubovat počas 60 až 120 min. pri 37 °C, po-tom sa suspenzia buniek nariedi v rastovom médiu tak, aby obsahovalo 4-8.106 buniek . _1 ml . buniek.

Rovnako je možné infekčné inokulum přidal do suspenzie buniek v rastovom médiu abez predchádzajůeej inkubácie naliat do kultivačnej nádoby. Za 24. až 48 hodin sa ras-tové médium vymeni, bez oplachu jednovrstvý buniek, za udržovacie a inkubácia pokraču-je za rovnakých podmienok. Po zisteni prvých cytopatických zmien /obvykle za 72 až 96hod./j~a médium vymieňa v 24 hodinových intervaloch, přidá doň lyofilizačné médium auchovává v zmrazenom stave až do pripravy kombinovanej vakciny před lyofi lizáciou, ale-bo sa kultivácia nechá prebiehat tak dlho, dokiat viac ako 50 percent jednovrstvý bu-niek je postihnutá virusšpecifickými změnami a virusová suspenzia sa zbiera len jedno-rázovo.

Sposob infekcie buniek MDCK vakcinačným virusom infekčnej laryngotracheitidy.

Buňkové kultury sa infikujú vakcinačným kmenom virusu infekčnej laryngotraeheiti-dy pri multiplicite infekcie 0,1 až 0,001. Infikujú sa 24 až 48 hodinové kultúry naras-tené na kultivačnom povrchu tak, že sa odstráni rastové médium a po 30 až 60 minútovejadsorbcii virusu na buňky pri 36 až 38 °C sa přidá udržovacie médium. Udržovacie médiumje rovnakého zloženia ako rastové, ale neobsahuje sérum. Inkubácia pokračuje pri 36 až38 °C počas 3 až 5 dni.

Rovnako je možné infekčné inokulum přidat do suspenzie buniek v rastovom médiu a bezpredchádzajůcej inkubácie naliat do kultivačnej nádoby. Za 24 až 48 hodin sa rastovémédium vymeni, bez oplachu jednovrstvý buniek, za udržovacie a inkubácia pokračuje zarovnakých podmienok počas 3 až 5 dni. Kultivácia sa v obidvoch pripadoch nechá prebie-hat tka dlho, dokial viac ako 80 percent jednovrstvý buniek je postihnutá virusšpeci-fickýme změnami. . Po ukončeni kultivácie sa infekčné tekutiny jednotlivých virusov zamiešajú s lyo-filizačným médiom v pomere 50 až 75 hmotnostných percent virusu k 50 až 25 hmotnostnýchpercent lyofilizačného média a uchovávajú pri -15 až -20 °C až do lyofilizácie, lyofi-lizačné médium je možné pri zachovaní rovnakých hmotnostných pomerov přidávat až tesne před koroplet 1záciou a lyofilizáeiou vakciny. Na pripravu lyof11izovanej vakciny sa po-4 -1 užijů infekčné tekutiny s obsahom minimálně 10 ΤΚΙΟ^θ. ml částic virusu CPVA-BN 80/82CAMP V-290, 104 TKID^q částic virusu CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 a 103 ΤΚΙ05θ částic vi-rusu CADV-2 H-S/85 MDCK 40 CAMP V-320, bakteriologicky sterilně. Takto připravené vi-rusově suspenzie zmiešané v pomere 0,5 dielu parvovirusu a 1 dielu virusu psinky a 1 4 CS 267936 B1 dietu virusu infekčnej laryngotracheitidy s Lyofiti začným médiom, ktoré obsahuje sacha-rózu, Ťosforečnanový pufor, glutamát sodný, alebo draselný, bovinný albumin alebo inýzdroj bielkovin, dextrán alebo želatinu /BOVARNICK, H.R. - MILLER, J.C. - SNYDER, J.C.,The influence of certain salts, aminoacidsm, sugars, and proteins on the stability ofrickettsiae. J. Baeteriol., 59, 1950: 509-522/ sa vo formo homogenizátu rozplňujú doampuliek alebo liekoviek, lyofllizujú, vzduchotěsně uzatvoria a uchovávajů pri chladničkovej teplete. Vakcina připravená podlá uvedeného postupu obsahuje najmenej 103 ΤΚΙΟ^θ n^-1·parvovirusu, 10^ ΤΚΙύ,-θ . ml~^ virusu psinky a 10^'® γκιο^θ. ml”^ virusu infekč-nej laryngotracheitidy, čo představuje Jednu 1mun1z*čnú dívku. Živ» atenuova vakcina proti parvoviróze, infekčnej laryngotracheit1de a infekčnej hepa-titide sa míže s výhodou používal na profylaxlu chorňb lišok a pescov, s klinickými prejavmi nádchy, výtoku z oči, laryngotracheitidy, tracheobronchltidy a paralýzy žádnýchkončatln doprevádzaných 30 až 50 percentným úhynom z celkového poítu zvlerat, ako tomubolo v rokov 1985 až 1987. Ž1vá atenuovaná vakcina, připravená podlá přihlášky vynále-zu zaistuje požadovanů ochranu proti všetkým aktuálnym virusovým infekciám pri uvede-ných kožušinových zvierat.

Za současného stavu poznatkov nemá úalšie rozširovanie spektra účinnosti očkovacej lát-ky opodstatnenie, pričom pridanie dalších antigénych komponent by výrazné zvýšilo pred-pokladanů cenu výrobku /vakclny/, a negativné ovplyvnilo ekonomicku vo velkochovech ko-žušinových zvlerat.

I

Uvedené příklady predmet vynálezu nijak neobmedzujú ani nevyčerpávajú: Přiklad 1

Suspenzia buniek FE, MDCK, VĚRO, připravené pomocou proteolytických fermentov asuspenzia kuřácích ambryonálnych buniek /KEB/, připravená pomocou proteolytických fer-mentov z 11 dňových kuřácích zárodkov v rastových médiách, ktoré obsahujú definovanémnožstvo aminokyselin a vitaminov s pridavkom 5 hmotnostných percent séra pri kultúrachKEB a VĚRO a 10 hmotnostných percent sér· určeného pre tkaninové kultúry pri kultúrachFE a MDCK sa kultlvujú na skle, štadonárnym spdsobom a v suspenzli. Přiklad 2

Spdsob infekcie buňkových kultúr vakcinačným virusem parvovlrusu psov:

Buňkové kultúry připravené a pěstované podlá bodu 1. sa infikujů vakcinačný viru-sem CPVA-BN 80/82 pri multiplicite infekcie najmenej 0,001 nasledovnýml sposobmi: 6 a. Suspenzia buniek Unie FE o hustotě 10.10 buniek . ml v rastovom médiu sazmieša s vakcinačným virusom pri multiplicite infekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sainkubuje pri 37 °C počas 30 minút. Potom sa zmes virusu a buniek nariedi v rastovommédiu, ktoré představuje minimálně esenčiálne médium podlá Eaglea s pH 7,2 a pridavkom10 hmotnostných percent bovinneho séra. 5 -1 b. Do suspenzie buniek liniek FE o hustotě 5x10 .ml v rastovom médiu sa přidáinokulum vakeinačného virusu o multiplicite infekcie 0,001, a infikovaná suspenzia saihned vyleje do kultivačnej nádoby. Takto připravená suspenzia buniek za účelom přípra-vy virusu do vakclny sa kultivuje v Rouxových fíašiach pri teplote 37 °C počas 6 dni. c. Infekcia prichytených buniek na kultivačnom povrchu po šesthodinovej kultiváciibuniek FE pri 37 °C sa do rastového média přidá inokulum vakeinačného virusu pri mul-tiplicite infekcie 0,001. Inkubácia pokračuje pri 37 °C počas 6 dni. Hnoženie virusu jerovnako ako v bode a/ a b/ sprevádzané výraznými cytopatickými změnami.

Vakcinačný virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kultúrach FE pěstova-ných podlá bodu 1 a infikovaných podlá bodu 2. Po vytvořeni rozsiahlych cytopatických CS 267936 81 5 zmien atenovných mikroskopicky sa kultivácia ukonči a do kultivačného média s pomnože-ným virusom sa přidá priamo do kultivačných nádob vhodné lyofilizačné médium v pomere50 hmotnostných percent virusovej suspenzie a 50 hmotnostných percent lyofizačného mé-dia. Zmes sa uchovává v kulticačných nádobách v zmrazenom stave. Přiklad 3

SpSsob infekcie buňkových kultúr vakcinačným virusom psinky:

Inokulum vakcinačného virusu, v ktorom je virus stabilizovaný pridavkom 10 hmot-nostných percent dimetyIsulfoxidu sa uchovává v zmrazenom stave pri -70 °c. Buňkovékultúry připravené a pěstované pódia bodu 1. sa infikujů vakcinačným virusom CDV-F-BN10/83 pri multiplicite infekcie najmenej 0,005 nasledovnými sposobmi: a. Infekcia narastenej jednovrstvý buniek KEB: z monovrstvy buniek sa po 24 hodi-novom raste odstáni rastové médium a buňková kultura sa infikuje inokulom přidaným doudržovacieho média, ktorým sa nahradí rastové médium. b. Suspenzia buniek VĚRO v rastovom médiu s hustotou asi 10? . ml buniek sa zmieša s inokulom vakcinačného virusu, a zmes inkubuje pri 37 °C počas 30 min. Po ukončenisa infikovaná suspenzia buniek nariedi v rastovom médiu tak, aby obsahovala 4.1o5.mlbuniek v 1 ml a kultivuje sa pri 37 °C 48 hod. t.j. až do vytvorenia úplnej jednovrst-vý buniek na kultivačnom povrchu. Potom následuje výměna rastového média za udržovacie. 5 -1 c. Do bunkovej suspenzie KEB v rastovom médi· s hustotou 4.10 . ml sa přidá ino-kulum vakcinačného virusu. Suspenzia sa i hne3 vleje do kulivačnej nádoby a inkubuje sapri 37 °C počas 24 hodin t.j. až do vytvorenia jednovrstvý buniek. Potom následuje vý-měna rastového média za udržovacie.

Vakcinačný virus sa produkuje v udržovacom médiu, ktoré je svojim základným zlo-ženim rovnaké ako rastové médium s tým rozdielom, že neobsahuje sérum a koncentráciahyrouhliči tanu sodného sa pohybuje do 0,30 hmotnostných percent. virus z buňkových kul-túr pěstovaných podlá bodu 1. sa infikovaných podlá bodu 3 sa ziskava nasledovnými spó-sobmi : a. Udržovacie médium sa ponechá bez výměny na kultúrach až do vytvorenia rozsiah-lych cytopatických zmien stanovených mikroskopicky. Do udržovacieho média s virusom sa přidá priamo do kultivačných nádob vhodná lyofilizačné médium v pomere 2 diety vi-rusové] suspenzie a Jeden dlel lyof1l1začného média. Zmes se dalej uchovává v kul-tlvačných nádobách v zmrazenom stave. b. Po objaveni sa prvých priznakov Specifických cytopatických zmien sa udržovaciemédium zleje a do kultivačných nádob naleje rovnaké množstva udržovacieho média. Postupsa opakuje v 24. hod. intervaloch až do vytvorenia rozsiahleho cytopatického efektu,kedy sa konečné ošetrenie vykoná podlá bodu a. Do virusovej suspenzie ziskanej pri opa-kovaných výměnách udržovacieho média sa bezprostredne po zliati přidá lyofilizačné mé-dium a dále j sa uchovává v zmrazenom stave. Přiklad 4

Sposob infekcie buňkových kultúr vakcinačným virusom infekčnej laryngotracheitidy:

Buňkové kultúry připravené a pěstované podlá bodu 1. sa infikujů vakcinačným viru-som CADV-2 H-5/85 MD CK40 pri multiplicite infekcie najmenej 0,01 nasledovnými sposob-mi: a. Infekcia narastenej jednovrstvý buniek FiDCK: Z monovrstvy buniek sa po 48 hodi-novom raste pri 37 °C odstráni rastové médium, ktoré představuje minimálně esenciálněmédium podlá Eaglea a buňková kultůra sa infikuje adsorbciou virusu na buňky po dobu60 minut pri 37 °C. Potom sa přidá udržovacie médium, ktoré je rovnakého zloženia ako 6 CS 267936 B1 rastové, ale neobsahuje sérum. 5 “ 1 b. Oo bunkovej suspenzle v rastovom médiu s hustotou 4.10 . ml sa přidá 1noku- lum vakeinačnéhi virusu. Suspenzla sa Ihned vleje do kultlvačnej nádoby a inkubuje sapri 37 °C počas 48 hodin t.j. až do vytvorenla jednovrstvý bunlek. Potom následuje vý-měna rastového média za udržovacle, a Inkubáda pokračuje pr1 37 °C počas 2 dni. Mne-ženie virusu je v obldvoch případech sprevádzané výraznými cytopatlckýml změnami bun-kovej jednovrstvý.

Vakdačnl virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kultúrach MOCk pěstovanýchpódia bodu 1. a Infikovaných pódia bodu 4. Po vytvořeni rozsiahlych cytopatických zmlensa kultlváda ukonči a do kultlvačného média s pomnoženým vlrusom sa přidá prlamo dokultlvačných nádob vhodné lyoflUzačné médium v pomere 2 dlely vlrusovej suspenzle ajeden dlel lyof1l1začného média. Zmes sa áalej uchovává v kultlvačných nádobách v zmra-ženo stave. Přiklad 5 Příprava komblnovanej vakdny:

Na přípravu lyof1l1zovanej vakclny sa použljú Infekčné tekutiny s obsahom minimál-ně 104 TKID50 . ml"1 častíc virusu CPVA-BN 80/82, 104 TKIDSO . ml“1 částic virusu COV--F-BN 10/83 a 103 TKIĎjq častíc virusu CAOV-2 H-5/85 M0CK40 bakteriologicky sterilné.Takto připravené virusové suspenzle sa zmlešajú v pomere 0,5 dielu parvovirusu a 1 dlelvirusu psinky a 1 dlel virusu Infekčnej laryngotrache1t1dy. Homogenizovaný virusový ma-teriál s požadovaným obsahom Infekčnýeh jednotlek sa adjustuje, lyoflllzuje, vzducho-těsně uzatvorl a uchovává pr1 chladnlčkovej teplete.

Vakcina připravená pódia uvedeného postupu obsahuje v jednej apllkačnej dávke najmenej10^ TKIDjq parvovirusu psov, 103 TKIOjq virusu psinky a 10^/5 τκίο^θ virusu Infekčnejlaryngotracheitldy. porovnanle účinnosti žívej atenuovanej vakdny proti parvovlróze, psinke, Infekč-nej laryngotracheit1de a Infekčnej hepatitlde vhodnej predovšetkým na profylaxlu kožu-šinových zvlerar s účinnostou monovalentnej vakdny proti Infekčnej laryngotracheltldea blvalentnej vakdny proti parvovlróze a psinke odskůšané na liškách zobrazuje obraz 1. Uvedené hodnoty zobrazené graficky vyjadruhů priemerné tltre hemaglutinačne-1nh1b1č-ných protilátek proti parvovirusu a virusu Infekčnej laryngotracheitldy a virus neutra-Uzačných protilátek /VN/ proti virusu psinky. Z předložených výsledkov je zřejmé, žepo očkovaní polyvafcentnou vakdnou bolí proti očakávaniu zistované hodnoty protilátekna rovnakej úrovni ako po apllkádi mono- resp. blvalentnej vakdny. Navodenie takej-to Imunitnej odpovede sa nepředpokládalo a nebole doposiai u masožravých kožušinovýchzvierat zistované. Z výsledkov uvedených v tabuike 1 vldiet, že vakdnované ani kontrolné zvieratánereagovali na infekciu terénnym kmeňom psieho parvovirusu zaznamenatetnou poruchoucelkového zdravotného stavu. Tieto nálezy podporujú aj údaje zistené McAdaraghom a kol.Experlmental infectlon of conventional dog* wlth canlne parvovlru*. Am^J.Vet.R·»., Vol.43, Ho.4, 1982, p. 693-696.

Po infekcii virulentným vlrusom psinky ostali zdravé všetky vakdnované zvieratá, kýmobidve kontrolné lišky uhynuli za charakteristických prlznakov pslnkového ochorenla.

Pri úplnej chránenosti vakdnovaných zvierat na Infekciu vlrusom Infekčnej laryngotra-cheitidy, reagovali dve z platich kontrol přechodným, ale zjavnýra ochorenlm hornýchdýchacích ciest. Rovnako ostali zdravé všetky vakdnované zvieratá Infikované vlrusominfekčnej hepatitldy, ktorý je póvodca encefalitidy lišok, čo je prejavom krlžovej chrá

Claims (4)

CS 267936 B1 7 nenostl zvierat očkovaných virusom infekčnej laryngotracheit1dy proti infekcii virusominfekčnej hepatitidy /u lišok encefalitidy/. Obidve nevakcinované kontroly reagovalina infekciu vývojom klinických priznakov charakteristických pre virusovú encefalitidulišok. ZVIERATÁ rNFEKCIA VÍRUSOH POČET ZVIERAT VÝSLEDKY Kliň. zdravé Kliň. choré Úhyn CPV 5 5 0 0 Vakcinova- CDV 5 5 0 0 né CADV-2 5 5 0 0 CADV-1 5 5 0 0 CPV 5 5 0 0 Kontroly CDV 2 0 0 2 CADV-2 5 3 2 0 CADV-1 2 0 2 0 Tab. č. 1 ? R E D Μ E T VYNÁLEZU

1. Živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze s obsahom kmeňa CPVA-BN 80/82 CAPH V-290v množstve 103 ΤΚΙΟ^θ, psinke s obsahom kmeňa CDV-F-BN 10/83 10/83 CAPH V-289 vranožstve 103 TKID^ θ, infekčnej laryngotracheitide a infekčnej hepatitide vyznačujú-ca sa tým, že obsahuje v 2 ml kmen parvovirusu psov CPVA-BN 80/82 CAPH V-290, v množstve najmenej 103 TKID,n, kmen virusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 v množ-3 ·*υ štve najmenej 10 ΤΚΙΟ,-θ a kmen virusu infekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85MDCK40 CAPH V-320 v množstve 10^z3 ΤΚΙΟ^θ částic virusu, a lyofilizačné médium.

2. Živá atenuovaná vakcina pódia bodu 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje lyofilizač-né médium v ranožstve 25 až 50 hmotnostných percent vztiahnuté na hmotnost celejvakciny.

3. Živá atenuovaná vakcina pódia bodu 1 až 3 vyznačujúca sa tým, že lyofilizačné mé-dium obsahuje sachrózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodný alebo draselný, bovin-ný albumin alebo iný zdroj bielkovin a želatinu alebo dextrán.

4. Sposob výroby vakciny pódia bodu 1 kultiváciou parvovirusu CPVA-BN 80/82 CAPM V--290 a virusu psinky č. CDV-F-BN 10/83 CAPH V-289 známým sposobom a vyznačujúci satým, že sa kultiváty parvovirusu a virusu psinky zmiešajú s kultivátora virusu in-fekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85 MDCK40 CAPH V-320 získaným pomnožením nestabilnej linii budiek HDCK po 30 až 60 minútovej infekcii 24 až 48 hodinovej mono-vrstvy v minimálnom esenciálnom médiu pódia Eaglea pri teplote 36 až 38 °C po dobu 3 až 6 dni, až do vytvorenia cytopatických zmien a potom sa virusový materiál zmie-ša s lyof1 lizačnýra médiom na obsah minimálně 10 ' ΤΚΙΟ^θ .ml , a táto zmes salyofilizuje. 8 CS 267936 B1 S. Splssob výroby ..«cíny podlá bodu 4 vyznaiujúcl sa tým, ie sa 1yof111 začné médiumpřidává k viruc.»· juspenziám bezprostředné po 1ch získaní a zmes sa uchovává aždo lyot111záci * - zmrazenom stave, alebo sa lyof111 zuje okamžité. 1 výkres