CS254011B1

CS254011B1 - Cell culture medium

Info

Publication number: CS254011B1
Application number: CS849006A
Authority: CS
Inventors: Augustin Hrbka
Original assignee: Augustin Hrbka
Priority date: 1984-11-26
Filing date: 1984-11-26
Publication date: 1987-12-17
Also published as: CS900684A1

Abstract

Riešenie sa týká použitia solubílneho extraktu z gluténu alebo aíeuronátu po rozštiepení bolamylázou a trypsínotn do médií pre buňkové kultury natniesto laktalbumínhydrolyzátu. V udržiavacích médíách sa dajú použiť na množenie virusu bez pridania séra, resp. fetálneho séra. Sú neantigénne.The solution concerns the use of a soluble extract from gluten or aleuronate after digestion with bolaamylase and trypsin in cell culture media instead of lactalbumin hydrolyzate. In maintenance media, they can be used to multiply the virus without the addition of serum, or fetal serum. They are non-antigenic.

Description

Vynález sa týká média pre buňkové kultúry s náhradou laktalbumínhydrolyzátu.The invention relates to a medium for cell cultures with a lactalbumin hydrolysate substitute.

Doteraz sa používá do médií pre kultváciu buňkových kultúr laktalbumínhydrolyzát (Lennette, Β. H., Schmidt N. J.: Diagnostic Procedures tor Viral and Rickettsial Diseases, Third odition, American Public Nealth Asociation, lne., 1790 Broadway, New York, N. Y. 10019, 1964, str. 91, 96, 97, 102, 103, 104, 105, 117, 119, 133). Laktalbumínhydrolyzát vyrába niekotko firiem. Tieto firmy sa nachádzajú v nesocialistických štátoch. Preto sa musí buď médiá alebo laktalbumínhydrolyzát do socialistických štátov dovázat. Z celej rady vyrábaných prípravkov laktalbumínhydrolyzátu sa hodia pre přípravu médií pre buňkové kultury len niektoré. Pri použití médií s laktalbumínhydrolyzátom alebo médií syntetických je nutné pri množení vírusov použiť do udržiavacích médií sérum. Ak sérum obsahuje inhibitory pre množenie daného virusu, je nutné použit fetálne sérum, ktoré je vefmi drahé. Ak ide o vakcíny pre humánně použitie, aby sa zabránilo alergizácii l'udí, je třeba použiť 1'udský albumin.Lactalbumin hydrolysate has been used in cell culture media (Lennette, Β. H., Schmidt N. J.: Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Diseases, Third edition, American Public Health Association, Inc., 1790 Broadway, New York, N. Y. 10019, 1964, pp. 91, 96, 97, 102, 103, 104, 105, 117, 119, 133). Lactalbumin hydrolysate is produced by several companies. These companies are located in non-socialist countries. Therefore, either the media or the lactalbumin hydrolysate must be imported into socialist countries. Of the entire range of lactalbumin hydrolysate preparations produced, only some are suitable for the preparation of cell culture media. When using media with lactalbumin hydrolysate or synthetic media, it is necessary to use serum in the maintenance media for virus propagation. If the serum contains inhibitors for the propagation of the given virus, it is necessary to use fetal serum, which is very expensive. In the case of vaccines for human use, in order to prevent human allergy, it is necessary to use human albumin.

Uvedené problémy s používáním laktalbumínhydrolyzátu do médií pre buňkové kultúry rieši médium pre buňkové kultúry vyznačujúce sa tým, že v médiu je laktalbumínhydrolyzát nahradený solubilným extraktom z gluténu alebo aleuronátu po rozštiepení bolamylázou a trypsínom. Jedná sa o vedíajšie produkty škrobárenského priemyslu ako rafinovaného kukuřičného gluténu a pšeničného lepku — aleuronátu. Z týchto surovin sa fermentatívnou cestou připraví solubílny extrakt, ktorý može byť použitý ako základná živná látka v mikrobiologických podach, ale rovnako sa hodí ako náhrada laktalbumínhydrolyzátu v podach pre buňkové kultúry. Je to prípravok vyrábaný v Československu, relativné lačný, vhodný pre přípravu rastových médií. Udržiavacie médiá pre množenie virusu je možné připravit bez séra. Ide o prípravok v ktorom sú bielkoviny rozložené, takže je neantigénny.The above problems with the use of lactalbumin hydrolysate in cell culture media are solved by a cell culture medium characterized by the fact that the lactalbumin hydrolysate in the medium is replaced by a soluble extract of gluten or aleurone after cleavage with amylase and trypsin. These are by-products of the starch industry such as refined corn gluten and wheat gluten — aleurone. A soluble extract is prepared from these raw materials by fermentation, which can be used as a basic nutrient in microbiological media, but is also suitable as a substitute for lactalbumin hydrolysate in cell culture media. It is a preparation produced in Czechoslovakia, relatively inexpensive, suitable for the preparation of growth media. Maintenance media for virus propagation can be prepared without serum. It is a preparation in which proteins are decomposed, so it is non-antigenic.

Sposob fermentácie gluténu resp. aleuronátu je nasledovný:The method of fermentation of gluten or aleurone is as follows:

kg gluténu sa vpraví do 300 1 vody, upraví sa pH na hodnotu 6,3-6,5, přidá sa 200 g bolamylázy a fermentuje sa pri teplote 60—65 °C 4 hod. Potom sa do reakčnej zmesi přidá 300 g trypsinu o aktivitě 10 000 až 15 000 mU/g a fermentuje sa 4 až 6 hod. pri pH 7,6 až 7,8 a teplote 40—45 °C. Potom sa upraví pH na 4,5 až 5,5 a reakčná zmes sa zahřeje do varu na dobu 15 minút. Nerozpustné podiely sa odfiltrujú a čirý roztok sa upraví na pH 7,0 až 7,5 a nechá sa sedimentovať pri teplote 50—95 °C. Supernatant sa zahustí na vákuovej odparke na 10 až 20 % sušiny a po prípadnom přefiltrovaní suší Sa na sprayovej sušiarni pri vstupnej teplote 150 až 170 °C, výstupnej teplote 80 až 90 °C za mierneho podtlaku. Získá sa tým svetložltý voluminózny prášok o nasledujúcich chemických parametroch: celkový dusík 9 až 12 %, aminodusík 2,2 až 3,6 %, množstvo solí 5 až 10 °/o, ktorý je dobré rozpustný vo vodě na číry až žltohnedý, světlý roztok.kg of gluten is introduced into 300 l of water, the pH is adjusted to 6.3-6.5, 200 g of bolaamylase is added and fermented at a temperature of 60-65 °C for 4 hours. Then 300 g of trypsin with an activity of 10,000 to 15,000 mU/g is added to the reaction mixture and fermented for 4 to 6 hours at a pH of 7.6 to 7.8 and a temperature of 40-45 °C. Then the pH is adjusted to 4.5 to 5.5 and the reaction mixture is heated to boiling for 15 minutes. Insoluble components are filtered off and the clear solution is adjusted to a pH of 7.0 to 7.5 and allowed to sediment at a temperature of 50-95 °C. The supernatant is concentrated in a vacuum evaporator to 10 to 20% dry matter and, after possible filtration, is dried in a spray dryer at an inlet temperature of 150 to 170 °C, an outlet temperature of 80 to 90 °C under slight vacuum. This gives a light yellow voluminous powder with the following chemical parameters: total nitrogen 9 to 12%, amino nitrogen 2.2 to 3.6%, salt content 5 to 10%, which is readily soluble in water to a clear to yellowish-brown, light solution.

Příklad 2Example 2

Ako v příklade 1 s tým rozdielom, že miesto gluténu sa použije 30 kg aleuronátu.As in Example 1, except that 30 kg of aleuroneate is used instead of gluten.

Získaný produkt má podobné vlastnosti ako The product obtained has similar properties to produkt připravený z gluténu. Laktalbumínhydrolyzátové nasledujúce zloženie: product prepared from gluten. Lactalbumin hydrolysate the following composition: médium n medium n íá yes chlorid sodný sodium chloride 6,8000 6.8000 g g chlorid draselný potassium chloride 0,4000 0.4000 g g kyslý fosforečnan sodný sodium hydrogen phosphate (NaH2PO4 . 2H₂O) ( _NaH2PO4.2H2O ) 0,1250 0.1250 g g chlorid vápenatý calcium chloride (C1C₂ . 2H2O) ( _C1C2.2H2O ) 0,2650 0.2650 g g síran horečnatý magnesium sulfate (MgSOd . 2 H2O) (MgSOd . 2 H2O) 0,2000 0.2000 g g laktalbumínhydrolyzát lactalbumin hydrolysate 2,2000 2,2000 g g glukóza glucose 1,000 1,000 g g fenolová červeň phenol red 0,0100 0.0100 g g ( + ) biotín ( + ) biotin 0,0020 0.0020 g g d-pantotenát vápenatý calcium d-pantothenate 0,0020 0.0020 g g riboflavín riboflavin 0,0002 0.0002 g g kyselina listová folic acid 0,0020 0.0020 g g cholínchlorid choline chloride 0,0020 0.0020 g g i-inozitol i-inositol 0,0036 0.0036 g g nikotínamid nicotinamide 0,0020 0.0020 g g pyridoxal HC1 pyridoxal HCl 0,0020 0.0020 g g tiamín HC1 thiamine HCl 0,0020 0.0020 g g redestilovaná voda redistilized water ad 2 000 ml up to 2,000 ml

Médium podfa předloženého vynálezu je rovnaké len laktalbumínhydrolyzát je nahradený gluténom alebo aleuronátom. Toto médium je možné použiť na kultiváciu různých druhov buniek či už ide o primokultúry alebo buňkové linie.The medium according to the present invention is the same except that the lactalbumin hydrolysate is replaced by gluten or aleuronate. This medium can be used for the cultivation of various types of cells, whether primary cultures or cell lines.

Claims

SUBSTANCE Medium of cell culture characterized in that lactalbumin lyarate lysate is replaced by soluble extract of the invention of gluten or aleuronate after cleavage by bolamylase and trypsin in the medium.