CS253602B1 - Analytické činidlo pro stanovení substrátů oxidační kopulací - Google Patents

Abstract

Řešení se týká analytického činidla pro stanovení substrátů oxidační kopulací obsahujících pufr, kopulační složky a enzymy, které podle vynálezu obsahuje redukující látky v určitém· množství v poměru k roztoku kompletního analytického činidla. Oproti současně používaným činidlům uvedené činidlo potlačuje vliv pozitivně interferujících látek.

Description

Vynález se týká analytického Činidla pre stanovení substrátů oxidační kopulací potlačující vliv pozitivně interferujících látek a způsob jeho přípravy.

Analytické systémy založené na oxidační kopulaci jsou v současné době široce využívány pro stanovení látek, které se vliverm specificky působících enzymů oxidují kyslíkem za vzniku oxidačních produktů a peroxidu vodíku. Peroxid vodíku se využívá v další reakční sekvenci k oxidační kopulaci katalyzované nejčastěji enzymem peroxidasou a vzniklé zbarvení se měří fotometricky. Jako kopulační složky se obvykle používají 4-aminoantipyrin, s různými fenoly nebo 3-methyl-2~benzothiazolinon hydrazon s aromatickými aminy. Tímto postupem jsou například stanovovány glukosa, cholesterol, kyselina močová, triacylglyceroly a další látky» Oxidace glukosy je katalysována enzymem glukosar· xoxidasou, oxidace kyseliny močové enzymem urikasou, oxidace cholesterolu enzymem cholesteroloxidasou.

Zatímco prvá reakční sekvence využívající enzymů specificky katalysující oxidaci analytu, který je současně pro daný enzym substrátem, je specifická, je druhá reakční sekvence, při níž probíhá kopulace, reakcí nespecifickou. Může být totiž vyvolána jak peroxidem vodíku vznikajícím v prvé reakční sekvenci, tak i jinými peroxosloučeninami nebo dalšími látkami, které mohou samy působit oxidačně, nebo jako katalysátory kopulace přímo na vzdušný kyslík.

Průběh oxidační kopulace je výrazně rušen prakticky většinou redukujících látek, které snižují obsah peroxide vodíku vzniklého prvou reakční sekvencí, a tím negativně ovlivňují analýzu. Je známo, že tyto analysy jsou rušeny kyselinami askorbovou, gentisovou, močovou a dalšími redukujícími látkami pří_t 2S3 602 tomnými například v biologickém materiálu. Některá z redukovadel jsou dokonce schopná odbarvovat vzniklé barvivo.

Bylo zjištěno, že zejména některé chemikálie, jako jsou pufry a detergenty, které jsou používány v činidlech pro stanovení oxidační kppulací, obsahují látky vyvolávající kopulační reakce i bez přítomnosti stanoveného analytu. Tím nespecifickým způsobem narůstá absorbance reakční směsi, mění se současně citlivost stanovení, jeho přesnost a správnost a u metod využívajících kinetické způsoby měření se mění počáteční rychlost nekontrolovatelným způsobem.

Uvedené interference lze částečně potlačit například výběrem chemikálií bez interferujících látek, nebo chemikálie speciálně čistit. V obou případech narůstají prudce náklady na analysu. Někteří výrobci diagnostik volí ke korigování uvedených pozitivních interferencí projevujících se zvyšováním nespecifické absorbance samostného Činidla jiný postup. Například do reakčního systému pro stanovení glukosy přidávají předem stanovovaný analyt, v tomto případě glukosu, který zvyšuje počáteční absorbanci činidla na definovanou hodnotu, Čímž se zdánlivě potlačí nespecifický vliv rušivých látek. Toto řešení má ale několik nevýhod. Jednou z nich je vyšší počáteční hodnota absorbance kompletního činidla. Obecným požadavkem kladeným na analytické metody totiž je, aby hodnota slepého pokusu byla co nejnižší. Mimo to má vznik zbarveni v činidle nepříznivý vliv na jeho stabilitu. V prvém přiblížení lze říci, že čím intenzivnější je počáteční zbarvení činidla, tím méně je stálé. Z uvedeného rozboru dosavadních nedostatků analytických systémů založených na oxidační kopulaci plyne, že počáteční intenzivní zbarvení činidel nepříznivě ovliv» í nuje jejich vlastnosti i vlastnosti analytické metody.

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že tyto nežádoucí pozitivní interference projevující se intenzivním zbarvením, lze potlačit pomocí některých látek jinak obecně rušících při stanovení i s oxidační kopulací, pokud jsou k analytickému systému přidány specifickým způsobem a v úzce vymezeném koncentračním intervalu.

Předmětem vynálezu je složení analytického činidla pro stáno- 3 253 602 vení substrátů oxidační kopulací obsahující pufr, kopulační složky a enzymy, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje redukující látky, například kyselinu askorbovou, siřičitan, cystein nebo hydroxylamín v množství 1 až 500/umol/l, vztaženo na roztok kompletního analytického činidla.

Redukující látka se přidá k jednotlivým činidlům neb o složkám analytického systému nebo k jeho kombinacím před tím, než může dojít ke vzniku nežádoucího zbarvení, s výhodou před přidáním kopulačních složek a enzymů, a nechá se reagovat po dobu potřebnou k odstranění interferujících látek, s výhodou 4 až 48 hodin.

Složkami, které nejčastěji obsahují pozitivně interferující látky, jsou pufrovací substance, povrchově aktivní látky užívané jako smáčedla nebo i další látky, u nichž se zjistí, že vyvolávají pozitivní interferenci, itostředkem k potlačení pozitivních interferencí může být jedna látka nebo kombinace několika redukujících látek. K objasnění předmětu vynálezu jsou uvedeny následující příklady.

Příklad 1

Činidlo pro stanovení glukosy

K 1000 ml roztoku fosforečnanového pufru o koncentraci 0,05 až 0,5 mol/1 a pH 6 až 9 se přidá kyselina askorbová v množství 1/umolXX, roztok se promíchá a nechá se stát do druhého dne. Pak se v tomto roztoku postupně rozpustí fenol v množství 5 až 10 mmol/1, 4-aminoantipyrin v množství 1 až 5 mmol/1 a enzymy glukosaoxidasa v katalytické koncentraci 83 až 340yukat/1 a enzym peroxidasa v katalytické koncentraci 8 až 33/Ukat/l.

Příklad 2

Činidlo pro stanovení cholesterolu

Připraví se rozpuštěním pevné pufrovací směsi obsahující 0,37 molů hydrogenfosforečnanu diddaselnéh^, 0,35 molů dihydrogenfosforečnanu draselného, 2 g neionogenního tensidu a 500/umolů hydroxylaminu v asi 800 ml destilované vody. Přidá se 70 ml metha-

253 602 nolu a nechá se stát 48 hodin ve tmě. Pak se k roztoku přidá 8 až 24mmolů fenolu, 0,5 až 4 mmoly 4-aminoantipyrinu, 1 až 5yukat cholesteroloxidasy, 0,8 až 2/ukat peroxidasy a roztok se doplní voduu do 1000 ml.

Příklad 3

Činidlo pro stanovení kyseliny močové

V destilované vodě se rozpustí 0,061 molů hydrogenfosforečnanu didraselného, 0,39 molů dihydrogenfosforečnanu draselného a 8/umolů cysteinu. Doplní se vodou do 1000 ml. Roztok se nechá stát 24hodia.

Podobně se rozpustí ve vodě 10 g neionogenního teasidu, při dá ee 400^umolů hydrogensiřičitaau sodného, doplní se vodou do 1000 ml a nechá se stát 24 hodin.

Oba roztoky se smíchají a v jejich směsi se rozpustí 0,3 až 3 mmoly 4-aminoantipyrinu, 25 až 50/umolů ferrokyanidu draselného a 0,8 až 2 mkat enzymu urikasa a 15 až 25/ukat enzymu peroxidasa.

Claims (1)

1. Analytické činidlo pro stanovení substrátů oxidační kopulací obsahující pufr, kopulační složky a enzymy_fvyznačené tím, že obsahuje redukující látky, například kyselinu askorbovou, siřičitan, cystein nebo hydroxylamín v množství 1 až 500/umol/l vztaženo na roztok kompletního analytického činidla.