CS231174B2

CS231174B2 - Method of elimininating of disturbung effect of askorbic acid in tested system in proving oxidative-reducing reaction and diagnostic means to perform the method

Info

Publication number: CS231174B2
Application number: CS812271A
Authority: CS
Inventors: Laszlo Koever; Walter Rittersdorf; Wolfgang Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1980-03-29
Filing date: 1981-03-27
Publication date: 1984-10-15
Also published as: JPS56151358A; HK82686A; AU6864981A; EP0037056A1; ZA812059B; CA1155737A; DE3012368A1; US4957872A; SG38686G; DE3160405D1; JPH024861B2; AU538332B2; DD157834A5; CS227181A2; DE3012368C2; EP0037056B1; ATE3726T1; MY8600707A; US4743559A

Description

Vynález se týká způsobu odstranění rušivého vlivu kyseliny askorbové v testovaném systému při důkazu oxidačně redukčních reakcí a diagnostického prostředku pro důkaz redox-reakcí, který к vyloučení poruch způsobovaných kyselinou askorbovou obsahuje jodičnany.

V klinické a farmaceutické chemii, biochemii a potravinářské chemii, mají oxidačně redukční systémy pro metody stanovení substrátů a enzymů značný význam. Pro takovéto metody stanovení existují nejrůznějSÍ fotometrické postupy. Největší význam však mají v tomto oboru takzvaná rychlodiagnostika. Jsou to činidla, jejichž všechny složky jsou naneseny na savý nosič nebo jsou ve formě filmu ve vysušeném stavu. Tyto prostředky se uvádějí do styku se zkoumanými tekutinami a vzniklé zabarvení se může pozorovat fotorné tričky nebo pomocí reflexního fotometru.

Zkoumané materiály výše zmiňovaného okruhu chemické analytiky, jako je například krev, moč, potraviny, léčivé přípravky a podobně, se mnohdy vyznačují větším nebo menším obsahem redukčních činidel, z nichž nejčastější je kyselina askorbová. Je jasné» že oxidačně redukční reakce mohou být vlivem silných redukčních činidel, jako je kyselina askorbová, citelně rušeny.

Je známé, že při důkazu glukózy pomocí rychlodiagnostik, který je založen na bázi reakce glokosooxidáza-peroxidázareoxindikátoru (GOD-POD-redox-indikátor), jsou vlivem přítomnosti kyseliny askorbové vyvolávány chybné negativní výsledky. Peroxid vodíku, vznikající z glukózy vlivem glukosooxidázy (GOD), způsobuje totiž s peroxidázou (POD) na kyselinu askorbovou namísto na indikátor za oxidace a stanovení se tak znemožňuje.

Dále je známé, že rychlodiagnostika sloužící к důkazu krve v moči reaguje ze přítomnosti kyseliny askorbové rovněž chybně negativně. Pravděpodobně zde redukuje kyselina askorbová barvivo, vytvořené oxidací katalyzovanou hemoglobinem.

Jako příklad chybně pozitivních výsledků vlivem kyseliny askorbové je možno uvést stanovení redukovaných forem nikotinamiddinukleotidfosfátu (NADH nebo NADPH) pomocí redukce tetrazoliových solí na barevné formazany. Kyselina askorbová zde působí ve stejném smyslu a zvyšuje měrný signál.

Vzhledem к obzvláštnímu významu a okruhu poruch vlivem kyseliny askorbové, nechyběly tedy pokusy tuto látku ze zkoumaných kapalin odstranit, popřípadě objevit bezporuchový způsob a odpovídající prostředek.

Dosud známé jsou následující postupy:

- oxidace jodovým roztokem a odstranění přebytečného jodu tiosíranem;

- oxidace kysličníkem manganičitým a odfiltrování nespotřebovaného oxidačního Činidla ;

- oxidace alkalickým peroxidem vodíku;

- zpracování roztoku vzorku aniontoměničem.

Všechny tyto způsoby vyžadují zdlouhavé zpracování roztoku vzorku. Za další je obzvláště u rychlodiagnostik integrované řešení problému velmi nákladné. Jsou také známé testovací papírky, u nichž moč nejprve musí chromátografovát přes zónu s iontoměniČem aniontů (DAS č. 15 98 008), aby potom při dalším průběhu na jednotlivých zónách mohla bez nežádoucího rušení reagovat. Testy s lontoměničovými zónami jsou pro glukózu a galaktózu na trhu běžně dustupné. Vyznačují se komplikovanou stavbou a vlivem značné doby chromátografování se doba analýzy ve srovnání s dobou analýzy dosavadních rychlotestů podstatně zvýší.

Další možrnst odstranění kyseliny askorbové z tekutin, popřípadě odrušení diagnostických prostředků, spočívá v přídavku eskorboxidázy do optických testů a rychlodiagnootik (DAS č. 26 25 334).

Ačkoliv je tento způsob použitelný obzvláště při malých koncentracích kyseliny askorbové, nemůže se tento problém považovat za zcela vyřešený a sice z následujících důvodů:

askorbátoxidáza reaguje pouze s kyselinou askorbovou samotnou, ne však s jejími meesboUty, jako je glukuronid a síran, jakož i s jiiými redukční mi činidly;

oxidace kyseliny askorbové askorbátoxidázou probíhá relatvvně pommlu, takže se u testovaných tekutin, které obsahuj více než 100 mm/dl kyseliny askorbové, musí používat nehospodárně vysoká mncoství askorbátoxidázy, aby se v rozumné míře mohl zaručit neovlivněný výsledek stanovení;

v určitých případech se enzym askorbátoxidáza vlivem agresivních reagencií relativně rychle rozkládá. Z tohoto důvodu se musí například OumeetLhУdropeoxid, používaný v testu krve v mooi, zapouzdřovat do mikrookppsí. (viz například patent US č. 4 129 417).

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že je možno vypracovat způsob a diagnostický prostředek, obzvváště ^^^diagnos^um, které neruší přítomnost kyseliny askorbové a jejích mettaboitů, i když jsou příoonrny v pommrně velikých mnoožsvích, když se ke známým recepturám nebo ke zkoumanému systému přidá dodátečně jodičnan. Jako na překvapivou skutečnost je třeba pohhížet na to, že jodičnan sice dostatečně rychle oxiduje kyselinu sako^nou, ne však substráty důležité v klinické chemii, dále mnohé indikátory oxidačně redukční, používané v analytice a jejich barevné reakční produkty, jakož i běžné pomocné látky. Tak nejsou jodičnanem napadány za běžných podmínek anylýzy (ph 5 až 9) a za běžných časů analýzy následují látky:

- substráty: uhlohydráty (například glukóza, galaktóza a podobně), glycerol (z t^gl-y^^dů), kyselina močová, redukované fonny nikoti.namidciinukleotidu a oi0ltinamidddnoSOielidfosfáts a podobně;

- substrátoxidázy: glsOÓzoxidáza, galaOtózllxidáza, cholesttrlllxidáza, glyceroloxidáza, . urikáza a podobně;

- indikátory: deriváty benzidinu (například o-tolidin, 3,3 ',5,5 '-tetaaittyiOtnzidio), heterocyklické aziny (kyselina aziol-0is-0tozo-tiazlloosslflOlvá), formazany jako redukční produkty tetrazoHových solí a podobně;

- peroxidázy: peroxidáza křenu, hemoglobin (krev);

- pomocné látky: erylsemikarbazidy, které jsou popsány jako stabilizátory oxidačních indikátorů (viz DOS č. 27 16 060).

že tato vlastnost jodičnanu je překvapivá, a že nemůže být odvozena pouze z oxidačního potenciálu, ukazuje srovnání s jirými halogenovými sloučeninami. Jejich standardní potenciály jsou podle Cottona a Wilkinsona (Anorganische Chemie, Weenheim 1970, 2. vydání, str. 532) následnici:

- jodičnan + 0,26V

- jodistan + 0,39V

- jod + 0,54V

- bromičnan + 0,61V

- chlorečnan + 0,63V

Zatímco jodiatan a volný jod oxidují vadle kyseliny askorbové většinu indikátorů, především deriváty benzidinu, nejsou bromičnan a chlorečnan a to, vzhledem ke svému vysokému oxidačnímu potenciálu, oxidovat kyselinu askorbovou, Jsou tedy к uvažovanému účelu zcela nepoužitelné. Také u jodičnanů bylo dosud předpokládáno, Že kyselinu askorbovou může oxidovat pouze v roztoku okyseleném kyselinou octovou (R. Indovina, D. Elia, Bull. Soc. Ital. Biol. sperm. 00, 390 až 393 (1945), C. A. £0, 6110 (1946)).

Podstata způsobu odstranění rušivého vlivu kyseliny askorbové v testovaném systému při důkazu oxidačně redukčních reakcí spočívá v tom, že se do testovaného systému přidává rozpustný jodičnan v množství, které odpovídá dvou až dvacetinásobnému molárnímu přebytku, vztaženo na i nejvyšší množství kyseliny askorbové, přítomné v testovaném systému, přičemž hodnota pH testovaného systému je v rozmezí 5 až 9.

Podstata diagnostického prostředku pro odstranění rušivého vlivu kyseliny askorbové při důkazu oxidačně-redukčních reakcí spočívá v tom, že obsahuje 0,5 ež 2 g rozpustného jodičnenu na 100 ml testovaného systému a pufr s hodnotou pH v rozmezí 5 až 9.

Rychlodiegnostika, která nejsou prakticky rušena přítomností kyseliny askorbové, obsahují tedy o sobě známý prostředek, к němuž je přidán jodičnan. Takové prostředky jsou například:

- testovací papírky pro důkaz krve v moči s organickými hydroperoxidy a o-tolidinem - viz např. DOS č. 22 35 152, DOS č. 26 40 211 a DOS č. 12 42 905. a tetrametylbenzidinnapříklad DOS č. 24 60 903 a DOS č. 27 16 060;

- testovací papírky к důkazu glukózy v moči s glukosooxidázou, peroxidázou a o-tolidinem, například DOS č. 24 15 257, DAS č. 11 21 847 a pat. spis OE č. 19 88 96, 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin, například DOS č. 24 60 903, substituované aminokarbazoly, například DOS

č. 22 05 733 e DOS č. 23 3B 932 a heterocyklické aziny, například DOS č. 16 48 840;

- testovací papírky к důkazu galaktózy v moči s' galaktozóoxidázou, peroxidázou a o-tolidinem, například patentní spis US Č. 3 362 886;

- testovací papírky různých substrátů se specifickými oxidázami, peroxidázou a o-tolidinem pat. spis US č. 3 099 605;

- testovací filmy ke stanovení glukózy v krvi s glukózooxidázou, peroxidázou, o-tolidinem, například DOS č. 15 9B 153 a 3,3 *,5,5'-tetrametylbenzidinem, například DOS

č. 24 60 903;

- testovací papírky ke stanovení NADH nebo substrátů tvořících NADH, popřípadě enzymů s tetrazoliovými solemi a diaphorázou, například DOS č. 24 52 283.

Vzhledem к tomu, že většinB výše uvedených testů se provádí ve vodných roztocích, používají se výhodně jodičnany rozpustné ve vodě. V úvahu přicházejí prakticky všechny ve vodě rozpustné soli kyseliny jodičné s anorganickými a organickými kationty, pokud tyto samy neruší analytický postup. Především jsou to soli alkalických kovů, které jsou pohodlně dostupné a zčásti běžné na trhu, dále soli kovů alkalických zemin a soli amonné a soli jednoduchých aminů, jako je například piperidin nebo piperazin.

Pouze ve výjimečných případech jsou potřebné určité modifikace běžných receptur:

při průmyslové výrobě testovacích papírků jsou občas potřebné relativně dlouhé doby impregnace. V průběhu této dlouhé doby může za určitých okolností dojít v impregnačním roztoku již к částečné oxidaci indikátoru. Toto nastává například v případě substituovaných aminokarba2olů podle DOS č. 22 05 733. V tomto případě Je účelné provést určité prostorové rozdělení reakčních složek tak, že se nejdříve testovací papír impregnuje vSemi ostatními reagenciemi a teprve potom odpovVdajícím jodičnanem z organického rozpouštědla, které ostatní součásti testovací směsi nerozpooští. Jodičnany rozpustné v organických rozpouštědlech jsou například jodičnan amorný, jakož i soli kyseliny jodičné s aminy s delším řetězcem.

V případech,, kdy vlivem poožití jodičnanu nastávají problémy se stabilitou testovací srněss, mohou se pouUít β sobě známá opatření pro· zlepšení stability, jako je po sobě následuUící impregnace z různých rozpouutědel, popřípadě za přídavku vhodných oddělovacích činidel, jako jsou například polymery.

P^uuiltí jodičnanu v rychlodiagnostikách je účelné pouze v následnících hranicích pH:

Při pH pod asi 4,5 vzniká při redukci jodičnanu kyselinou askorbovou převážně volný jod, který jak již bylo řečeno, oxiduje mnoho různých indikátorů. Kromě toho má jodičnan v kyselém prostředí oxidační potenciál +1· ,20 V (Cotton-Wilkinson, viz výše) a není tedy s většinou indikátorů a jiných so^Š^é^s^^í přípravků vhodný.

Při hodnotě pH nad 7 ež 8 je oxidace kyseliny askorbové jodičnanem podstatně těžší, takže k účinnému zamezení poruchám jsou zapotřebí nesrovnatelně větší mnoožtví jodi-čnanu, což vede k těžkostem při zpracování a popřípadě k problémům s trvanlivostí.

Jodičnany se pouužvaaí účelně ve dvojnásobném až dvacetinnáobbném molárním přebytku, vztaženo na m^oživ! kyseliny askorbové, příocmné ve zkoumané kapalině. Protože oxidace kyselily askorbové musí prakticky proběhnout před vlastní důkazovou reakcí, je třeba pro rychle pro^b^J^h^azúcí důkazové reakce větší přebytek jodičnanu než při reakcích probíhajících pommleji. Vzhledem k tomu, že jak již bylo výše uvedeno, oxidace kyseliny askorbové se při vyšších hodnotách pH zpommanUe, musí se také v těchto případech pouužt větší přebytek jodičnanu. Správné ééo0žtví jodičnanu se v každém případě dá zjistit jednoduchou sér^zií pokusů.

¾ryehoOSagnostiks podle předloženého vynálezu mají proti známým rušivě neovlivňovaným, popřípadě málo ovlivňovaným rychlodiagnostikám následující výhody:

Jejich pouUžtí odpovídá úplně pouužtí již dlouhou dobu známých a běžných rychlsSiagoostik.

Jejich výroba je jednoduchá a odpovídá zcela běžným výrobním metodám.

Ve srovnání s rychlsSijgnostiiy, která obsahují asisrbátoxiSSzu, vykazuj zčásti vyšší stupeň odrušení, především jsou ale poddtatně levici vyrobbteeoS.

PooUití jodičnanu samého není omezeno pouze na inkorporaci do rychlsSijgnostik. Jodičnan se m^že například přidávat přímo do zkoumaného roztoku a roztok takto zbavený rušivých látek se může dále podrobbt zkoumání známými způsoby, například fotometricky nebo pomocí běžných rychlotestů. Je třeba ovšem vzít v úvahu, že v takovémto roztoku potom není možno provádět testy, jejichž subbtráty nebo ^agencie mohou s jodičnanem reagovat.

Při zkoumání moči vícenásobnými testy jsou to například testy ne dusitany a žlučová barviva jako ursb:ilinsgeo a bilirubin. Tyto látky se jodičnanem v kyselém prostředí testovacího papírku ještě před svým důkazem oxiduUí. Kromě toho se oxiduj na silně barevné sloučeniny aromatické aminy, používané při běžných testech na dusitany.

Skutečnoot, zda je určitý test rušen přídavkem jodičnanu, se dá jednoduše zjistit tak, že se srovná standard s přídavkem jodičnanu a bez něho.

V určitých případech, například při analytických postupech, které pracují při pH v rozmeeí·5 až 6, kde se kyselina askorbová jodičnanem velmi rychle oxiduje, může být výhodné, přidávat jodičnan do reagenčního přípravku nebo do jeho čímž se průběh analýzy podstatně íjednoduUěí. V jirých případech, například- při analýze séra, může se jodičnan přidávat do silně kyselého prostředku pro odstranění bílkovin, čímž se získá testovaný roztok, zbavený ruěivých účinků. Přídavkem pufru nebo pufrovaného systému činidel se může potom testovaný roztok uprevi^t na pH vhodné pro důkazní reakce, například na pH v rozmezí 7 ež 9.

Diagnootická činidla jsou výhodně rychlotesty, u nichž jsou systémy reagenčních činidel impregnovány na savém, v tesoovaném systému nerozpustném nosiči nebo jsou inkooporovány do v tesoovaném systému botnavého filmu, který je upevněn popřípadě na pevném nosiči, například na folii z umělé hmoty. Reakce se potom vyhodnocuje po ovlhčení testovaným systémem podle vzniklého zabarvení.

Diagiootické prostředky mohou věak být také v tesSov8néé systému rozpustné a mohou se napříkled používat ve formě roztoku, lyofilizátu nebo reegenčních tablet, nebo se do tesSovanéhs systému za^i^(^<^jí ve foímě rozpustného filmu, který se nachází na nebo v pevném nooiči. Reagencie se- potom smísí s tesOoveýé systémeé, jakož i popřípadě s dalším rozpouštědlem a reakce se potom v kyvetě fstoéétricky vyhodnnoí·

Pod pojmem testovaný systém se při tom rozumí zkoumaný vzorek, popřípedě za přídavku vhodného rozpouštědla. Pod pojmem systém reagencií se rozumí suma reagujících látek e všech přioomných pomocích látek, jako' je pufr, emmCedlo, látky reag^ící visko žitu, stabilizační prostředky, kontrastní barevné látky, jakož i popřípadě rozpouštědlo a podobně.

V násle^u^ích příkladech je předmět vynálezu blíže objasněn, bez toho, že by jej tyto nějakým způsobem sτnéeovoιly.

Příklad 1

Testovací papírek k důkazu krve (erythrocytů) v moči

Filtrační papír se postupně impregnuje následujícími roztoky a potom se usuší při teplotě 40 °C:

Roztok 1 ,2 m^o^irní citráSooý pufr o pH 5,25 dvojsodná sůl kyseliny etylenniaéintetrasctsoé nisktylnetršuésulfssškcinát 2,5-niéetylhexαn-2,5-nihynrsperoxin (asi 70%) trimorfslin kyseliny fosforečné

35,0 ml

0,1 g

0,5 g .6 g

12,7 g jodičnan sodný

0,5 g etalelkohol

30,0 ml destilovaná voda do - 100,0 ml

Roztok 2

3,3 ',5,5 '-tetrametylbenzidin fenantridin

1-fenylsemikarbazid směs toluenu a metylalkoholu (60:40)

0,3 g

0,2 g

0,02 g do 100,0 ml

Pomocí tohoto testovacího papírku je možno prokázat přítomnost 5 erytrocytů v mm^ ještě za přítomnosti 150 až 200 mg kyseliny askorbové v jednom decilitru moči. U analogického testovacího papírku, který namísto jodičnanu obsahuje 3 . 10^ jednotek askorbátoxidázy, je pozitivní reakce Ještě při koncentraci 30 až 50 mg kyseliny askorbové v jednom decilitru, u papírků bez přísad je pozitivní reakce zřetelná pouze do asi Ю mg kyseliny askorbové v jednom decilitru. Když se testovací papírek podle předloženého vynálezu zahřívá po dobu 3 dnů na teplotu 60 °C, zschovává si svojí citlivost. Papírek s askorbátoxidázou reaguje po tomto zpracování již pouze jako testovací papírek bez žádné přísady.

Příklad 2:

Testovací papírek к semikvantitativnímu stanovení glukózy v moči

Filtrační papír se postupně nasytí roztoky následujícího složení a usuší se při teplotě 50 °C:

Roztok 1 glukozooxidáza (71 jednotek/mg) ¹ ,2 g peroxidáza (66 jednotek/mg)

1,2 m citrátový pufr pH 5

9-(gama-dimetylaminopropy1)-< -dihydrochlorid tartrazin laurolsarkos.in destilovaná voda

Roztok 2 jodičnan tetrametylamonia

0,2 g

50,0 ml chlor-3-aminokarbazol-

2,1 g

0,12 g g

do ΤΟΟ,Ο ml ,4 g etylalkohol do 100,0 ml

Vyrobí se testovací papírek, který je impregnován pouze roztokem 1.

Připraví se vzorky moči s obsahem 100, 300 a 1 000 mg glukózy na jeden decilitr, do kterých se naváží 0, 50, 100 a 200 mg kyseliny askorbové na jeden dl.

Testovací papírky se navlhčí a položí se na savou podložku. Jednu minutu po namočení se jejich reakční zbarvení srovná, přičemž moč bez kyseliny askorbové se zvolí jako standard. Z následující tabulky vyplývá, že poruchy způsobené vlivem kyseliny askorbové se přídavkem jodičnanu odstraní.

231174 ₈

T ebulke 1 (údaje uváděné v mg glukózy ne jeden decilitr)

Jodičnan	0	50	100	200 mg k. askorb./dl
-	100	neg.	neg.	neg·
+	100	ioo	ioo	100
	300	ioo	neg.	neg·
+	300	300	300	300
-	. 1 000	300	ioo	neg·
+	1 000	1 000	1 000	1 000

Příklad 3

Testovací ' papírek k důkazu glukózy v moči

Filtrační papír se nasytí roztokem následujícího složení a při teplotě 50 °C se vysuěí:

glukózooxidáza (71 jednotek/m!)	0,38
peroxidáza (66 jednotek/ml)	0,02
jodičnan draselný	2,00
tartrazin	0,08
o-tolidin	0,42
etylalkohol	33,0
destilovaná voda	do 100,0

S tímto testovacím papírkem dává moč s 50 mg glukózy ne jeden deeClitr, která obsahuje 0, 50, 100 a 200 mg kyseliny eskorbové na jeden deeClitr, prakticky stejné zelené reekční zbarvení.

Analogický testovací papírek bez jodičnanu dává pozitivní reakci pouze s močí bez kyseliny askorbové.

Příklad 4

Testovací film ke stanovení nepatrných obsahů glukózy v krvi nebo séru

Součásti disperze polyvinylacetátpropionátu (Propiofan 70 D) 45,0 g

1,85% roztok natriumlginátu v 0,5 m fosfátového pufru o pH 5,5 35,Og natriumnonylsulfát rozpuštěný v 5,0 ml vody 0,75 g glukózooxidáza (71 jednotek/mg) 0,2 g peroxidáza (66 jednotek/mg) 0,25 g rozpuštěno v 10 ml vody

3,3 ' ,5,5 -tetrametylbenzidin rozpuštěný v 5 ml acetonu 0,68 g jodičnan sodný ¹>0 g

Součásti staěsi se dobře promísí a nanesou se v tloušťce 200 yu na podložku z fólie z umělé hmoty, načež se usuší při teplotě 60 °C po dobu 35 minut.

Stejnou cestou se připraví film, neobsahující přísadu jodičnanu. Vzorky séra obsahující 20 mg glukózy v jednom decilitru a 0, 2,5 a 5,0 mg kyseliny askorbové v jednom decilitru se na film nakopou, po uplynutí jedné minuty se setřou a po uplynutí dalších p minut se měří zabarvení ne běžném remisním fotometru (Reflomat ) za použití lineární stupnice 0 až 100:

Testovací film	0	Sérum 2,5	5,0 mg k. ask./dl
bez jodičnanu	47	43	35
s jodičnanem	46	45	45

Příklad 5

Testovací papír pro důkaz NADH

Filtrační papír (Schleicher & Schiill 23 SL) se impregnuje roztokem o následujícím složení a potom se vysuší při teplotě 50 °C:

jod-nitro-trifenyltetrazoliumchlorid

0,2 g jodičnan sodný 0,5 g nonylfenolpolyglykoleter 0,2 g diaforáza (32 jednotek/mg) 0,05 g

0,15 m fosfátový pufr pH 7 40,0 ml destilovaná voda do 100 ml ю

Stejným způsobem se připraví testovací papírky bez jodičnanu.

Vodnými roztoky NADH se oboje papírky zbarví stejným červeným zbarvením. Když se к roztoku NADH přidá kyselina askorbová, reagují papírky bez jodičnanu silněji.

Příklad 6

Stanovení glukózy v séru

Roztoky

Roztok pro odstranění bílkovin 1

0,16 % hmotnostních uranylacetátu v 0,9% roztoku chloridu sodného

Roztok pro odstranění bílkovin 2

0,16 % hmotnostních uranylacetátu a 0,05 % hmotnostních jodičnanu sodného v 0,9% roztoku chloridu sodného

Reagenční roztok peroxidáza glukózooxidáza kyselina azino-bis-benztiazolonsulfonová

NH₄-sůl fosfátový pufr pH 7

0,8 jedn./ml Ю jedn./ml

1,0 mg/ml

100 mmol/1

Vzorek 1 sérum se 100 mg glukózy na jeden decilitr

Vzorek 2 se^zrum se 100 mg glukózy na jeden decilitr a 20 mg kyseliny askorbové na jeden decilitr

Standard

9,1 mg glukózy na 100 ml vody

Odstranění bílkovin

Podle následujícího schématu se pipetuje příslušný počet mililitrů a centrifuguje se:

roztok pro odstr. bílkovin 1	1 ,00	1 ,00	-	-
roztok pro odstr. bílkovin 2	-	-	1 ,00	1 ,00
vzorek 1	0,10	-	0,10	-
vzorek 2	-	0,10	-	0,10
dává zbytek číslo	1 .1	1 .2	2.1	2.2

1

Analýza:

Podle následující tebulky se pipetuje příslušný počet mililitrů, směs se nechá inkubovat po dobu 30 minut při teplotě 25 °C e měří se extinkce při 436 nm (d = 1).

Tabulka

Složka Nulová hodn. standard Zbytek č.

1 .1	1.2	2.1	2.2
dest. voda	0,1	-	•	-	-	-
standard	-	o,i	-	-	-	-
zbytek	-	-	0,1	OJ	0,1	OJ
reagenční roztok	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
ext.	0,115	0,425	0,424	0,366	0,426	0,423
ext.-nul.hodn.-	-	0,310	0,309	0,251	0,31·	0,308
Výsledky:
Vypočítají	se podle	vztahu C -	100 . ext.	vzorku/ext.	standardu

Zbytek Č.	1.1	1.2	2.1	2.2
kyselina askorbová ve vzorku	-	+	-	4
jodičnan v roztoku pro odstranění bílkovin	-	-	4	4
výsledek (mg/dl)	99,7	89,0	100,3	99,4

Poruchy způsobené ve vzorku 2 vlivem kyseliny askorbové jsou tedy působením jodičnanu zcela potlačeny.,

Příklad 7

Stanovení kyseliny L-gl uniatové

Roztoky

Reagenční roztok 1 i,2 ml Tritonu X 100 jednotek diaforázy

100 mg NAD mg jod-nitro-trifenyltetrazoliumchloridu

100 ml 0,1 m pufru fosforečnan draselný/trietanolamin o pH 8,6

Reagenční roztok 2

000 jednotek glutamátdehydrogenázy ve Ю0 ml vody

Vzorek 1

100 mg kyseliny L-glutamové ve 100 ml vody

Vzorek 2

100 mg kyseliny L-glutamové a 40 mg kyseliny askorbové ve 100 ml vody.

Rozťok jodičnanu

200 mg jodičnanu sodného ve 100 ml vody.

Příprava vzorků

Podle následujícího schématu se pipetuje uvedený počet mililitrů a při teplotě místnosti se směsi nechají stát po dobu 15 minut:

vzorek 1	1 »0	1 ,0	-	-
vzorek 2	-	-	40	40
rozt. jodičnanu	-	1 ,0	-	1 ,0
dest. voda	1,0	-	1 ,0	-
směs číslo	1.1	1.2	2.1	2.2

Analýza:

V následující tabulce jsou uvedena množství pipetovaných směsí (ml), po dvou minutách změřená extinkce E₁ při 492 nm (d = 1 cm). Pomocí reagenčního roztoku 2 se startuje reakce a po 15 minutách se změří extinkce E₂·

Tabulka

	Slepý pokus	1 .1	Směs číslo	2.2
1.2	2.1
reag. roztok 1	1,0	' ,0	1,0	1,0	1 ,0
dest. voda	2,0	1,8	1 ,8	1,8	1,8
směs	-	0,2	0,2	0,2	0,2
^E1	0,058	0,058	0,053	mění se	0,041
reag. roztok 2	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03
^E2	0,062	0,490	0,499	mění se	0,503
ZE (E₂-E, )	0,004	0,432	0,446	-	0,454
ΔE - Δ E slep· pokusu	-	0,428	0,422	-	0,452
Výsledky:
Vyypoítají	se podle vztahu	C = 224 .	, ( ΔΕ - ΔΕ nul. hodnoty) a	jsou uvedeny

v následnicí tabulce

směs číslo	1 .1	1 .2	2.1	2.2
k. askorbové ve vzorku	-	-	+	+
zpracováno jodičnanem	-	+	-	+
výsledek (m^/dl)	95,9	99,0	_-	101 ,2

Měnění extinkce způsobené kyselinou askorbovou (pomalá redukce tetrezoliové soli), které zabraňuje exaktnímu rnmření, se může odstranit předinkubací roztoku vzorku s jodičnanem, bez toho, ž.e by přebytečný jodičnen výsledek analýzy rušil.

Claims

1· Způsob oodsranění rušivého vvivu kksseiny askorbové v testovaném systému při. důkazu oxidačně redukčních reakcí, vyznačený tím, že se do testovaného systému přidává rozpustný jodičnan v mnoožtvv, které odpovídá dvou ež dvacetOníSlonné:riU nolárnwu přebytku, vztaženo na nejvyšší mnnžžtví kyseliny askorbové, přítomné v tesovvanám systému, přičemž hodnota pH testovaného systému je v rozm^i^í 5 až 9.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se do tes hoveného systému přidává odděleně systém ' redox reagencií a jodičoso.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se jodičnan přidává do testovaného systému před systémem redox reagenncí.

4. Způsob podle bodu 1 , vyznačený tím, že se do testovaného systému přidává jodi-čnan společně se tyttémeé. redox reagendí.

5. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačený tím, že se hodnota pH testovaného systému zvýší přídavkem systému redox ^agenccí.

6. Způsob podle bodu 5, vyznačený tím, že se hodnotě pH testovaného systému zvýší z hodnoty v rozmezí 5 až 6 na hodnotu v rozmezí 7 až 9«

7. Diagnostický prostředek к provádění způsobu podle bodů 1 až 7, obsahující systém redox reagencií, vyznačený tím, že obsahuje 0,5 až 2 g rozpustného jodičnanu na 100 ml testovaného systému a pufr s hodnotou pH v rozmezí 5 až 9.

8. Diagnostický prostředek podle bodu 7, vyznačený tím, že systém redox reagencií sestává z indikátoru oxidace, hydroperoxidu, peroxidázy a pomocných látek pro oxidační indikátorové reakce.

9. Diagnostický prostředek podle bodu 7, vyznačený tím, že systém redox reagencií sestává z indikátoru redukce, redukčního činidla, jakož i popřípadě pomocných látek pro redukční indikátorové reakce.

10. Diagnostický prostředek podle bodů 7 až 9, vyznačený tím, že je nanesen na savý nosič, nerozpustný v testovaném systému, například na filtrační papír, nebo je vytvořen ve formě filmu, botnajícím v testovaném systému, který je popřípadě nanesen na pevném nosiči.

11. Diagnostický prostředek podle bodů 7 až 9, vyznačený tím, že je vytvořen ve formě roztoku, jeko lyofilizát nebo ve formě rozpustné reagenční tablety, nebo ve formě v testovaném systému rozpustného filmu, který je nanesen na nebo v pevném nosiči.