214 443 1

Vynález sa týká spdsebu izoláele enzýmov cholínesterázového typu, a to acetylcholl-nosterázy (aeetyloholín hydroláza, EC 3,1«1.7) a psoudocholínesterázy (aoetyloholín acyl-hydroláza, EC 3,1.1,8).

Pri izoláoll enzýmov oholíneeterázevého typu sa vychádza z homogenátu tkaniva(acetylcholínesteráza, pseudeoholínesteráza) alebo krvnej plazmy frakcionevanej etanelom(pseudocholíneateráza), Surgenor P.M., Ellias D.t J Amer. Chea, Sec. 76, 6049, 1954,a následnou chromatograflou na géli z fosforečnanu vápenatého, resp. ienomeniči (MalstromB.O., Levln 0., Bomaa H.G.s Acta Chem. Scand., 10, 1077), připadne ďalšou gélovou filtrá-elou (Oas P.K., Llddell J.t Bioohem. J., 116, 875, 1970), Rýehlu metodu Izoláele acetyl-oholíneaterázy z hovadzíoh erytrocytov aflnltnou gélovou chromatograflou na Sepharosea navlazaným d-tubukarinom a elúcll s chloridom sodným poplsujú Jung J. a Belleau B.sMol, Pharmaool., 8, 589, 1972.

Triraetyl(ť»l-amiaofeayl)amóniura chlorid, hydrochlorld ako aflnitný llgand vlazanýna Bio-Cel A poplsujú Berman J.D. a Young M.s Proč. Nat. Acad. Sel. US 68, 395, 1971.Eevýhodou uvedených postúpov je leh zdíhavoat, připadne nákladná příprava aflnltnýchllgandov a v ďalšoa nle jednoduché vlazanle na nosič.

Uvedené nedostatky rieSi postup pódia vynálezu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že biologický roztok obsahujúcl enzým cholíneste-rázevého typu s výhodou aoetylcholíneateráza alebo pseudocholíneateráza sa zriedi tlmi-vým roztokom pH 7,5 až 8,5 na 1%-nu koncentráclu proteinu a nanesle sa na kolonu z poly-saoharidového gélu, s výhodou z celulózy obsahujúcej viazanú p-(^ -aminofenyl)borónovúkyselinu adjustovanú na pH 7,5 tlmivým roztokem s obsahem 0,5 M glýoerolu v objemovou pe-mere nepresahujúeem 1/20 objemu biologického rozteku k objemu polysaoharldového gélu apřečištěný podiel enzýmu oholínést«rázového typu neinhibovaný organofosfátovýml látkamisa eluuje z kolony pri ďalSom premývaní kolony tlmivým roztokom (50 oM) o pH 7,5 s 0,5 Mglycerolom objemovej frakcle eluátu rovnajúcej se 2 až 4 násobku objemu použitého poly-saoharidového gélu.

Postup možno aplikovat v koloně, nakoiko enzým cholínesterázového typu je v desled-ku špecifickej interakcie Specificky zadržiavaný oproti ostatným sprievodným proteinemvo formě komplexu s imobilizovaným borátom oez svoje esteratioké centrum na kolona. Uve-dený postup je vhodné použit v kombinácii s afinitnen metodou izoláele enzýmov cholínes-terázového typu založenéj na interakoli v anionickom centre, kedy možno dosiahnut vysokýstupeň prečistenia enzýmu, a to aj v přítomnosti dalžích enzýmov serínevého typu. Uvedenýpostup je vhadný pro izoláoiu aktívnych enzýmov cholínesterázového typu z homogenátu tka-niva, z erytrocytov alebo krvnej plazmy, nakoiko podiel enzýmu inhibovaný organefosfáto-vými látkami s uvedeným afinitným ligandom neintoraguje. Výhodou uvedeného postupu jet - jednoduchá příprava afinitného liganda - umožňuje Speoifiekú purifikáciu podielu enzýmov cholínesterázového typu, neinhi- 2 214 443 bovanéhe organofosfátovými látkami - afinitný ligand je stály a možno ho použit mnohonásobné - umožňuje dosahovat jednoduchým sposobom mnohonásobná purifikáciu aktívnych cho-líneateráz. Příklad 1

Na stípeo připravený z exirámu sietovanej celulózy s 50/mol naviazanej kyselinyp-(w -aminofenyl)boronovej (20 ml) o veíkosti častíe 0,1 až 0,3 mm, adjustovanej 50mMfosfátovým pufrom o pH 7,5 s obsahom 0,5 M glycerolu sa nanieslo 0,25 ml koňskéj plaz-*my zriedenej 1 ml fosfátového tlmivého roztoku o pH 8, Prakcia aktívnej pseudocholínes-terázy (6,5 jednotiek) sa vymyla elúeiou 50mlí fosfátovým pufrom s 0,5 U glycerolom, ato v podielí medzi 52 až 95 ml, s maximom aktivity v 32 ml.

Vytěsněná frakcia obsahovala 0,68 mg proteinu čím sa dosiahol stupeň prečistenia 10,5. Příklad 2

Tak ako je uvedené v příklade 1, s tým rozdielom, že na stípec sa naniesol nariedě-ný roztok plazmy obsahujúcej pseudocholínesterázu čiastočne inhibovanu malatinom. Afini-tnou chromátografieu na uvedenoj koloně sa zdržal podiel aktívnej pseudocholínesterázy(4,3 jednotky), ktorý sa vymyl 50 mM a 0,5 M glycerolom.

Stupeň purifikácie pseudocholínesterázy bol rovnaký ako v příklade 1. Příklad 3 K izolácii acetylcholínesterázy sa použil extrakt z hovadzích erytrocytov, připra-vený z Tritenu-X-100 postupom podía Ciliv G. a Ozand P.T.: Biochem. Biophys. Acta 234,136, 1972 a pe odcentrifugovaní (lO.OOOg, 30 minút) sa uvedený extrakt (0,5 ml) adjusto-val na pH 7,5 fosfátovým pufrom (l,5 ml, 50 mM) s obsahom 0,5 M glycerolu a naniesol sana stípec připravený zo sietovanej kyseliny pektovej 40 ml, (napúčací objem 6 ml/g) s na-viazanou kyselinou p-(w -aminofenyl)boronovou (62/umol/g), adjustovanou na pH 7,5, 50 mMfosfátovým pufrom s 0,5 M glycerolom.

Aktívna acetylcholínesteráza (l6,5 jednotky) sa uvolnila zo stlpca elúeiou 80 až 165 mlhoře uvedeného fosfátového pufru a 0,5 M glycerolom o celkovom obsahu proteinu 1,95 mg,čo představuje 37,2 násobné prečistenie enzýmu.

Vynález možno uplatnit všade tam, kde je potřebné přečistit aktivně enzýmy cholínesterá-zového typu a to či už v priemyslovej praxi alebo vo výskume a izolovat ich tak od po-dielu inhibevanéhe organofosfátovými látkami.