CS204168B1

CS204168B1 - Způsob odstraňování vysokomolekulárních látek blokujících účinek komplementu z krevní plasmy

Info

Publication number: CS204168B1
Application number: CS753577A
Authority: CS
Inventors: Ivan Stepanek; Alfred Stachy; Ivan Berla; Imrich Banda
Original assignee: Ivan Stepanek; Alfred Stachy; Ivan Berla; Imrich Banda
Priority date: 1977-11-16
Filing date: 1977-11-16
Publication date: 1981-03-31

Description

Vynález řeší způsob odstraňování vysokomolekulárních látek blokujících účinek komplementu, které se vyskytují v gama glofoulinové frakci krevní plasmy izolované etanolem a jsou zodpovědné za část její antikomplementární aktivity. Umožňuje připravit gama globulin se sníženou antikomplemenlární aktivitou, použitelný pro terapeutické účely.

S poznání skutečnosti, že v gama globulinové frakci krevních bílkovin se soustřeďuje protilátková aktivita způsobilo, že izolovaný gama globulin upravený do formy injekčního roztoku pro i. m. aplikaci se stal jedním z nejčastěji užívaných preparátů vyrobených z lidské krevní plasmy.

Základní podmínkou pro klinické použití preparátu na bázi i. v. gama globulinu je technicky zvládnutá izolace gama globulinu ze směsi krevních bílkovin s malou koncentrací látek blokujících účinek komplementu bez ohledu na mechanismus'účinku. Dosud vyráběný gama globulin pro i. m. aplikaci podmínkám pro i. v. aplikaci nevyhovuje, protože obsahuje jednak látky s hypotenzívním účinkem a jednak proměnlivý, ale značně vysoký obsah látek blokujících účinek komplementu tj. látky s antikomplementární aktivitou.

Při studiu mechanismu účinku antikom2 plemsntární aktivity u lidského gama globulinu na morčecí komplement bylo zjištěno, že antikomplementární aktivita gama globulinu významně snižuje koncentraci C‘l a C‘4 složek komplementu u morčecího séra (Marcus M. D.: J. Immunology 84, 273, 1960).

Výsledky provedených pokusů Waldesbuhla a spol., Malgrasa a spol. a Christiana svědčí o tom, že jednou z příčin vzniku antikomplementární aktivity u lidského gama globulinu jsou agregované molekuly gama globulinu (Waldesbuhl M., Allan R., Meylan A., Isliker H.: Immunochemistry 7, 185, 1970; Malgras J., Haupman G., Zorn J. J., Waitz R.: Rev. Franc. Transf. 13, 173, 1970; Christian C. L.: J. Immunol. 84, 117, 1960; Christian C. L.: J. Immunol. 84, 112, 1960). Podle názoru Siegela a Luschera jsou za antikomplementární aktivitu gama globulinu zodpovědné vysokomolekulární látky alfaglobulinové povahy (Slegel A., Lůscher E. F.: Vox Sang. 14, 348, 1968).

Nedostatkem dosud nejužívanější celosvětové technologie je skutečnost, že gama globulin se v současnosti izoluje převážně pomocí Cohnovy metody (Cohn E. J., Gurd F. N. R., Surgenor D. M., Barnes B. A., Brown R. K., Derouaux G., Gillespie j. M., Kahnt F. W., Lever W. F., Liu C. H., Mittelman D.,

Mouton R. F., Schmid K., Uroma E.: J. Amen Chem. Soc. 72, 465, 1950), která získává gama globulin tj. frakci II pomocí extrakce z komplexu frakcí I -J- II -J- ΠΙ, která umožňuje přechod vysokomolekulárních látek alfa globulinové povahy z frakce I jakož i agregátů gama globulinů z precipitátu frakcí I ± III do gama globulinového roztoku a dále potom do gama globulinového precipitátu po srážení gama globulinové pasty například etanolem.

Nově navrhovaná technologie, podle předloženého vynálezu, využívá skutečnost, že agregáty gama globulinu a vysokomolekulárních látek alfa globulinové povahy se strhávají při srážení fibrinogénu etanolem do fibrinogenového precipitátu a jsou spolu s ním oddělovány z roztoku. Čím úplnější je oddělování fibrinogénu z plasmy před precipitací gama globulinu, tím menší je obsah látek s antikomplementární aktivitou ve vyprecipitovaném gama globulinu. Tuto skutečnost lze dokumentovat údajem, že z 5 připravených experimentálních šarží, podle předloženého vynálezu, bylo dosaženo snížení antikomplementární aktivity u lyofillzovaného preparátu o 25 +5 % ve srovnání s tímtéž gama globulinem, který byl získán z téhož výchozího materiálu bez předcházejícího etapovitého oddělování fibrinogenu tj. jenom pomocí extrakce z frakce Ι + Π-(- III. Do první části fibrinogenového precipitátu se strhává cca 16 +2 °/o, do druhé části cca 6 ±2 % a do třetí části cca 3 ±1 % z celkové antikomplementární aktivity gama globulinu.

Podstata odstraňování vysokomolekulárních látek blokujících účinek komplementu z krevní plasmy spočívá podle předloženého vynálezu v tom, že tyto látky se při srážení fibrinogénu etanolem strhávají do fibrinogenového precipitátu, z kterého první část je precipitována při 8 ±1 obj. °/o etanolu z celkového objemu reakční směsi, teplotě —2,5 °C +0,5 °C, pH 7,0 ±0,2 a po následné separaci, například centrifugací, je druhá část fibrinogenového obsahu precipitována ze supernatantu při 8 +1 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi etanolem, teplotě —2,5 %C ±0,5 -C, pH 5,35 ±0,1 a po následné separaci, například centrifugací je třetí část fibrinogenového obsahu precipitována při 19 ±2 obj. % etanolu z celkové objemu reakční směsi při pH 5,85 ±0,1, teplotě —5 °C ±1 °C a po následné separaci například centrifugací je takto získaná bílkovinná pasta suspendována na 1,3 ±0,5% roztok bílkovin v destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +1 °C o iontové síle 0,018 ±0,004, například od chloridu sodného, přičemž část bílkovin, obsahujících fibrinogen je precipitována při 10 ±2 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi při teplotě —2,5 ±0,5 °C a po následné separaci třetí části, například centrifugací, se supernatant obsahující převážně gama globulin podrobí dalšímu zpracování například srážení pomocí etanolu, uvedení gama globulinové pasty do roztoku, odstraňování nízkomolekulárních sloučenin například gelovou filtrací, sterilizaci například filtrací a lyofilizaci nebo zakoncentrování pomocí membrán.

Vynález je dále objasněn na příkladu provedení jímž jeho rozsah není ani omezen ani vyčerpán.

Příklad

Odstraňování vysokomolekulárních látek blokujících účinek komplementu se provádí tím způsobem, že tyto vysokomolekulární látky s antikomplementární aktivitou se spolu srážejí s fibrinogenem pomocí etanolu. Precipitace fibrinogénu pomocí etanolu neprobíhá však kvantitativně a z toho důvodu je potřeba provádět tuto precipitací třístupňové.

Precipitace první části ₍fibrinogénu se provádí z plasmy pomocí 8*±1 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi pří konečné teplotě —2,5 °C ±0,5 °C při pH 7,0 ±0,2. Hlavní podíl fibrinogénu je vysrážen v podobě jemné suspenze, která je separována například centrifugací a ze získaného supernatantu se provede precipitace druhé části fibrinogenového obsahu.

Precipitace druhé části fibrinogénu se provádí ze supernatantu pomocí 8 ±1 obj. procento etanolu z celkového objemu reakční směsi při konečné teplotě —2,5°C ±0,5° Celsia, pH 5,35 ±0,1. Fibrinogen je v tomto případě srážen už jako balastní bílkovina spolu s jinými bílkovinami v podobě suspenzen, která je separována, například centrifugací, a ze získaného supernatantu se provede precipitace třetí části fibrinogenového obsahu.

Precipitace třetí části fibrinogénu se provádí ze supernatantu pomocí 19 ±2 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi při pH 5,85 ±0,1, teplotě -5 °C ±1 °C přičemž po následné separaci vyprecipitovaných bílkovin se bílkovinná pasta suspenduje na 1,3 ±0,5% roztok bílkovin v destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +1° Celsia a iontové síle 0,018 ±0,004, například od chloridu sodného. Z takto připraveného bílkovinného roztoku se pomocí 10 ±2 obj. procenta etanolu z celkového objemu reakční směsi při teplotě —2,5 °C ±0,5 °C je vyprecipitován fibrinogen jako balastní bílkovina ve směsi s jinými bílkovinami. Po následné separaci třetí části fibrinogénu v podobě bílkovinné * pasty, například centrifugací, se v supernatantu nachází převážně roztok gama globulinu, který se podrobí dalšímu zpracování například srážení pomocí etanolu, uvedení gama globulinové pasty do roztoku, odstraňování nízkomolekulárních sloučenin, například gelovou filt204168 raci, sterilizací, například filtrací a lyofilizací nebo zakoncentrování pomocí membrán.

Claims

pRedmEt

Způsob odstraňování vysokomolekulárních látek blokujících účinek komplementu z krevní plasmy, vyznačující se tím, že vysokomolekulární látky se srážejí s fibrinogenem z krevní plasmy etanolem do fibrinogenového precipitátu ve třech stupních, přičemž první část je precipitována při 8 +1 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi, teplotě —2,5 °C +0,5 °C, pH 7,0 +0,2 a po následné separaci, například centrifugám, je druhá část fibrinogenového obsahu precipitována ze supernatantu při 8 +1 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi etanolem, teplotě —2,5 °C +0,5° Celsia, pH 5,35 +0,1 a po následné separaci, například centrifugám je třetí část fibrinogenového obsahu precipitována při 19 + 2 obj. % etanolu z celkového objemu reakční směsi při pH 5,85 + 0,1, teplotě —5 °C

Numerické hodnoty uváděné jako optima jsou vhodné pro technologické provedení, které bylo úspěšně odzkoušeno.

YNALEZU + 1 °C a po následné separaci, například centrifugací, je takto získaná bílkovinná pasta suspendována na 1,3 + 0,5% roztok bílkovin v destilované apyrogenní vodě o teplotě 0 °C až +1°C a iontové síle 0,018+ +0,004 přičemž část bílkovin obsahujících fibrinogen je preciipitována při 10 + 2 obj. proč. etanolu z celkového objemu reakční směsi při teplotě —2,5 °C + 0,5 °C a po následné separaci třetí části, například centrifugám, se supernatant, obsahující převážně gama globulin, podrobí dalšímu zpracování, například srážení pomocí etanolu, uvedení gama globulinové pasty do roztoku, odstraňování nízkomolekulárních sloučenin, například gelo.vou filtrací, sterilizací, například filtrací a lyofilizací nebo zakoncentrování pomocí membrán.