CN87102424A

CN87102424A - 茚并嘧啶衍生物

Info

Publication number: CN87102424A
Application number: CN87102424.1A
Authority: CN
Inventors: 肯尼思·史蒂文·赫希; 查尔斯·戴维·琼斯; 埃里克斯·维克托·克鲁姆卡尔恩·斯; 唐纳德·格兰特·桑德斯
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-03-31
Filing date: 1987-03-31
Publication date: 1987-10-07
Also published as: DE3780338D1; IL81978A; ZA872162B; PT84553A; IE59762B1; DK165245B; EP0240263B1; KR890003838B1; IL81978A0; PH23398A; US4769378A; AU7075287A; HU196379B; DK161187A; ATE78251T1; EP0240263A2; CN1013673B; SU1470185A3; EP0240263A3; DE3780338T2

Abstract

5-苯基-5H-茚并[1，2-d]嘧啶及其衍生物对于抑制芳构化酶和治疗或预防与雌激素相关的疾病是有效的。

Description

雌激素是由促成雄性性状的类固醇类合成的。在形成雌激素的生物合成途径中，芳构化是基本的步骤。一般相信如果芳构化酶能被有效地抑制，则对与雌激素相关的疾病就能得到有效的治疗（见Cancer Research，Vol.42，Suppl.8，especially page 3261s et.Seq.（1982））。

确有某些与雌激素相关的疾病能用芳构化酶的抑制剂来治疗。这些疾病包括乳癌、子宫内膜异位、多囊性卵巢病、良性乳腺病以及子宫内膜癌。抗雌激素在乳癌治疗中的有益作用已被证实（见Br.J.Cancer，25，270（1971））。两种已知的芳构化酶抑制剂，睪丸内酯激素和氨基苯乙哌啶酮在治疗乳癌中已显示出有益的作用（见Cancer Research，如上文）。

子宫内膜异位的特点是子宫内膜的异常增生。因为子宫内膜的生长是取决于雌二醇的，故雌激素生成的抑制剂应该能阻止疾病的发展。

良性乳腺病，或常称为纤维囊性乳腺病似乎取决于卵巢的类固醇类。见Cancer，49，2534（1982）。芳构化酶的抑制剂没有在这种疾病上试用过，但似乎用抗雌激素是有益的。见Obstet Gynecol.，54，80（1979）。

多囊性卵巢病是引起妇女不育症的最常见的病因之一，看来是由于类固醇代谢异常所致。对此病的最主要治疗方式是用抗雌激素，氯芪酚胺（Clomiphene）。见Clin Endocrinol.，12，177（1980）。

本发明提供了一些抑制哺乳动物芳构化酶的化合物，因此可用于治疗或预防乳癌和其它取决于雌激素的疾病。

更确切地说，本发明提供了具有式Ⅰ的茚并嘧啶类化合物

式中

Y是氢，甲基，羟基，甲氧基，氯，氟，或-NHCOCH₃;R₁是氢，氯，氟，甲氧基或三氟甲基;

R₂和R₃分别独立地是氢，氯，氟或三氟甲基;

根据式Ⅰ化合物抑制芳香酶的能力，它们可用于医治和予防哺乳动物与雌激素相关的疾病，特别是乳腺癌。

此发明的另一部分是药物配方。该配方由本发明化合物的有效量与适宜的药物载体、稀释剂或赋形剂配合而成。本发明所提供的配方特别适用于治疗与哺乳类的雌激素相关的疾病，如乳腺癌。

在本发明中较好的化合物是具有以下基团的式Ⅰ化合物：

（a）Y是羟基，特别是氢;

（b）R₁是氯或氟，尤其是在8-位上，

（c）R₂和R₃中的一个是氢;和

（d）R₂和R₃的另一个是氯或氟，尤其是在4′-位上。

根据本发明，较好的配方是将本发明的较有效的化合物之一与其药物载体配合。

本发明的化合物可按照工艺上的常规方法来制备，此过程可综合图示如下：

式中Y是氢的本发明的化合物（式Ⅲ）可以用脱水作用由相应的α，α-二苯基-5-嘧啶甲醇Ⅱ制备。根据不同的R取代基的定义，此反应可得出二种或多种具有式Ⅲ的茚并嘧啶类化合物，它们可用已知的如分级结晶或色谱法分离。

Ⅱ的脱水作用可使用工艺上已知的几种通用的方法中的任何一种来完成。例如，一种可取的方法是搅拌嘧啶甲醇Ⅱ在甲磺酸中的溶液。典型的条件是，操作温度为20-30℃，反应在12-24小时内完成。该反应最好在惰性气体中进行。另一种方法是用浓硫酸来代替甲磺酸使用。

式Ⅲ的茚并嘧啶可用工艺中已知的几种氧化方法中的任一种，使之转变为式Ⅳ的醇类。例如，氧化反应可在惰性气体中在惰性溶剂（如，丙酮）内用氧化剂（如高锰酸钾）处理式Ⅲ的化合物来完成。该反应通常在室温下进行，一般在4-18小时内完成。与此相似，氧化反应也可将茚并嘧啶Ⅲ溶于二甲亚砜，加入约1摩尔的强碱（如氢氧化钠）并向此液通入氧气鼓泡来完成。此反应可使式Ⅲ接近定量地转化为式Ⅳ，并且在室温下进行时通常在2-4小时内完成。

将式Ⅳ-醇的化合物与乙腈和甲磺酸混合，该醇可转变为式Ⅴ-乙酰胺衍生物。在温度约为20-30℃时，该反应通常在12-18小时内完成。

氯类似物Ⅵ也可由应用亚硫酰氯处理式Ⅳ醇来制备。在室温下将式Ⅳ醇和亚硫酰氯搅拌2-4小时，该反应很容易完成。

类似的氟化物Ⅶ也可在无反应活性的溶剂（如二氯甲烷）中由式Ⅳ醇用二乙基氨基硫的三氟化物处理来制备。当反应在约0℃和惰性气体中进行时，这一反应完成得最好。在这些条件下该反应一般在4-18小时内完成。

Y是甲氧基的式（Ⅰ）化合物可如例29所说明的那样，用Y是氯的相应于式（Ⅰ）的化合物与甲氧基金属离子源（如在甲醇中的甲氧基钠）起反应来制备。

Y是甲基的式（Ⅰ）化合物可如例30所说明的那样，用Y是氢的相应于式（Ⅰ）的化合物在强碱（如氢化钠）存在下与甲基化试剂（如甲基碘）起反应来制备。其它的甲基化试剂，如硫酸甲酯或磺酸甲酯也可使用。

式Ⅱ的中间体是已知的（美国专利第3，818，009号）。在美国专利第3，869，456号中介绍了一种制备这些化合物的较好的新方法。所需要的其它中间体可用类似的方式制备。在上面的转变中所需的其它试剂都是可买到的或者可用工艺上已知的方法来制备。

正如在该技术中熟悉的人们所认识到的，式Ⅰ的化合物含有一个不对称碳原子。本发明不局限于某一种异构体，而是包括各个对映体以及式Ⅰ化合物的外消旋体。

因此，本发明也提供了制备Ⅰ式化合物的方法。该方法包括：

a）使式（Ⅱ）的α，α-二苯基-5-嘧啶甲醇脱水，得到式

（Ⅰ）化合物，其中Y是氢;或者

b）使Y是氢的式（Ⅰ）化合物氧化，得到Y是羟基的相应于式（Ⅰ）的化合物;或者

c）使Y是羟基的式（Ⅰ）化合物与乙腈和甲磺酸反应，得到Y是-NHCOCH₃的相应于式（Ⅰ）的化合物;或者

d）使Y是羟基的式（Ⅰ）化合物与亚硫酰氯反应，得到Y是氯的相应于式（Ⅰ）的化合物;或者

e）使Y是羟基的式（Ⅰ）化合物与二乙基氨基硫的三氟化物反应，得到Y是氟的相应于式（Ⅰ）的化合物;或者

f）使Y是氯的式（Ⅰ）化合物与甲氧基化金属离子源反应，得到Y是甲氧基的相应于式（Ⅰ）的化合物;或者

g）使Y是氢的式（Ⅰ）化合物在强碱存在下与甲基化试剂反应，得到Y是甲基的相应于式（Ⅰ）的化合物。

下述实例进一步说明本发明的这些化合物的制备方法。

例1

8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶

将含有4.0克α，α-双（4-氯苯基）-5-嘧啶甲醇的25毫升甲磺酸溶液在氮气下搅拌18小时。将此液倒入碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯抽提。用饱和氯化钠溶液洗涤有机抽提液，用硫酸镁干燥，真空浓缩。从乙酸乙酯/异辛烷中重结晶，得到1.95克所需要的标题产物。熔点：158-163℃。

分析 C₁₇H₁₀Cl₂N₂

计算值：C，65.20;H，3.22;N，8.94;

实测值：C，65.03;H，3.29;N，8.73.

例2-6

根据例1的步骤由相应的嘧啶甲醇制备下列化合物。

2、5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率73%，熔点：140-140.5℃。

分析 C₁₇H₁₁ClN₂

计算值：C，73.25;H，3.98;N，10.05;

实测值：C，73.29;H，3.72;N，9.87.

3、8-氯代-5-苯基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率0.3%，熔点：135.5-137℃。

分析 C₁₇H₁₁ClN₂

计算值：C，73.25;H，3.98;N，10.05;

实测值：C，72.19;H，3.81;N，9.87.

4、5-（4-氟苯基）-8-（三氟甲基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率0.8%，熔点：146-148℃。

分析 C₁₈H₁₀F₄N₂

计算值：C，65.46;H，3.05;N，8.48;

实测值：C，65.18;H，3.11;N，8.21.

5、8-氟代-5-〔4-（三氟甲基）苯基〕-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率33%，熔点：169-170℃。

分析 C₁₈H₁₀F₄N₂

计算值：C，65.46;H，3.05;N，8.48;

实测值：C，65.74;H，3.23;N，8.48.

6、8-氟代-5-（4-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率77.7%，熔点：172-174℃。

分析 C₁₇H₁₀F₂N₂

计算值：C，72.85;H，3.60;N，10.00;

实测值：C，73.04;H，3.87;N，9.96.

例7

5-苯基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶

将含有10克α，α-二苯基-5-嘧啶甲醇的50毫升硫酸搅拌约18小时。将此液倒到冰上，过滤回收所生成的固体，得出11克所需要的标题产物。从乙醚中重结晶，得到熔点为148-150℃的物质。

分析 C₁₇H₁₂N₂

计算值：C，83.58;H，4.95;N，11.49;

实测值：C，83.33;H，5.17;N，11.11.

例8-17

按照例7的步骤由相应的嘧啶甲醇制备下列化合物。

8、5-（2，4-二氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率80%，熔点：107-108℃。

9、5-（3-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率21%，熔点：121℃。质子核磁共振谱与所期望的产物的结构一致。

10、5-（2，5-二氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，熔点：145℃。

分析 C₁₇H₁₀Cl₂N₂

计算值：C，65.20;H，3.22;N，8.94;

实测值：C，65.31;H，3.22;N，9.07.

11、5-（3，4-二氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率42%，熔点：151℃。

分析 C₁₇H₁₀Cl₂N₂

计算值：C，65.20;H，3.22;N，8.94;

实测值：C，65.29;H，3.25;N，8.66.

12、5-（4-氯苯基）-7-甲氧基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率58%，熔点：164℃。

分析 C₁₈H₁₃ClN₂O

计算值：C，70.02;H，4.24;N，9.07;

实测值：C，69.85;H，4.50;N，8.84.

13、5-（4-氟苯基）-7-甲氧基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率74%。

分析 C₁₈H₁₃FN₂O

计算值：C，73.96;H，4.48;N，9.58;

实测值：C，73.70;H，4.44;N，9.51.

14、5-（2-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率67%，熔点：124-125℃。

分析 C₁₇H₁₁FN₂

计算值：C，77.83;H，4.23;N，10.68;

实测值：C，77.95;H，4.32;N，10.82.

15、5-（4-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率87%，熔点：128℃。质子核磁共振谱与所期望的产物的结构一致。

16、5-（3-氯苯基）-8-甲氧基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，产率2.6%，熔点：147℃。

分析 C₁₈H₁₃ClN₂O

计算值：C，70.02;H，4.24;N，9.07;

实测值：C，69.74;H，3.95;N，8.85.

17、7-氟代-5-（2-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，熔点：143-145℃。

分析 C₁₇H₁₀F₂N₂

计算值：C，72.85;H，3.60;N，10.00;

实测值：C，72.64;H，3.90;N，9.75.

例18

8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇，

向搅拌着的11.0克8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶在300毫升丙酮的溶液中加入6.32克高锰酸钾。该混合物在氮气下搅拌2小时，此时再加入6.32克高锰酸钾。混合物在室温下搅拌过夜，过滤，真空浓缩滤液。残余物用乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液的混合物溶解。分离各液层，用水洗涤有机层，用硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。残余物先用乙酸乙酯/异辛烷结晶，再用乙酸乙酯结晶，得到3.06克所需要的标题产物，熔点：194-195.5℃。

分析 C₁₇H₁₀Cl₂N₂O

计算值：C，62.03;H，3.06;N，8.51;Cl，21.54;

实测值：C，62.12;H，3.35;N，8.39;Cl，21.58.

例19

5-（2，4-二氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇

将14.0克5-（2，4-二氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶和2克粉状氢氧化钠在100毫升二甲亚砜中的混合物用氧气处理，通过一根位于溶液表面之下并装有多孔玻璃附加物的管子导入氧气。将混合物搅拌1小时，倒入冷水中，用盐酸调节pH至7。过滤回收所产生的固体，用水洗涤，干燥，得到10克所需要的标题产物，熔点：188℃。

分析 C₁₇H₁₀Cl₂N₂O

计算值：C，62.03;H，3.06;N，8.51;

实测值：C，61.73;H，3.23;N，8.24.

例20-22

按照例19的步骤由相应的茚并嘧啶制备下列化合物。

20、5-（4-氯苯基）-7-甲氧基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇，产率78%，熔点：84℃。

分析 C₁₈H₁₃ClN₂O₂

计算值：C，66.57;H，4.03;N，8.63;

实测值：C，66.59;H，4.26;N，8.43.

21、5-（4-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇，产率84.5%，熔点：195℃。

分析 C₁₇H₁₁FN₂O

计算值：C，73.37;H，3.98;N，10.07;

实测值：C，73.14;H，4.05;N，9.96.

22、8-氯代-5-（2-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇，产率17%，熔点：178-179℃。

分析 C₁₇H₁₀Cl₂N₂O

计算值：C，62.03;H，3.06;N，8.51;

实测值：C，61.82;H，3.00;N，8.71.

例23

N-〔8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并-〔1，2-d〕嘧啶-5-基〕乙酰胺

将3.0克8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇和15毫升乙腈、50毫升甲磺酸的混合物搅拌约18小时。将反应混合物加到大量过量的碳酸氢钠溶液中，所得混合物用乙酸乙酯提取。用饱和氯化钠溶液洗涤有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩。从乙腈/水中结晶，得到2.53克所需要的标题产物，熔点：238-241℃。再重结晶两次可得到熔点为245-248℃的物质。

分析 C₁₉H₁₃Cl₂N₃O

计算值：C，61.64;H，3.54;N，11.35;

实测值：C，61.91;H，3.71;N，11.28，

例24-25

按照例23的步骤由相应的茚并嘧啶-5-醇制备下列化合物。

24、N-〔5-（4-氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-基〕乙酰胺，熔点：244℃。

分析 C₁₉H₁₄FN₃O

计算值：C，71.46;H，4.42;N，13.16;

实测值：C，71.67;H，4.45;N，12.90.

25、N-〔5-（2，4-二氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-基〕乙酰胺，产率62%，熔点：290℃。

分析 C₁₉H₁₃Cl₂N₃O

计算值：C，61.64;H，3.54;N，11.35;

实测值：C，61.82;H，3.55;N，11.36.

例26

5-氯代-5-苯基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶

将5克5-苯基-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇在25毫升亚硫酰氯和100毫升苯中在回流温度下搅拌5小时。蒸发除去溶剂，用苯研磨残余物，过滤。将固体从乙醚中结晶，得到3克所需要的标题产物，熔点：119-120℃。

分析 C₁₇H₁₁ClN₂

计算值：C，73.25;H，3.98;N，10.05;

实测值：C，73.11;H，4.12;N，9.84.

例27

5，8-二氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶

按照例26的步骤由相应的醇制备标题产物，产率70.5%，熔点：152-153℃。

分析 C₁₇H₉Cl₃N₂

计算值：C，58.74;H，2.61;N，8.06;

实测值：C，58.51;H，2.81;N，8.02.

例28

8-氯代-5-（4-氯苯基）-5-氟代-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶

将3.0克8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇在50毫升二氯甲烷中的混合物在氮气下冷却至0℃。加入约2.7克二乙基氨基硫的三氟化物，搅拌过夜进行反应。混合物倒入冰冻的碳酸氢钾溶液中，用乙酸乙酯抽提。用碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤有机抽提液，用硫酸镁干燥，真空浓缩。从乙酸乙酯/异辛烷中结晶，得到2.29克所需要的标题产物，熔点：236-237℃。

分析 C₁₇H₉Cl₂FN₂

计算值：C，61.65;H，2.74;N，8.46;

实测值：C，61.88;H，2.97;N，8.58.

例29

8-氯代-5-甲氧基-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇

将由3克8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-〔1，2-d〕嘧啶-5-醇，2.17克SOCl₂和1.5毫升甲苯组成的混合物回流两小时。薄层色谱（TLC）表明，原料转变成具有与5，8-二氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶（例27）相同的比移值（Rf）的物质。蒸发除去混合物中剩余的SOCl₂和甲苯。加入含有0.985克甲醇钠的25毫升甲醇，将此混合物回流20分钟。薄层色谱显示一个具有与例27化合物相同的Rf值的斑点，及一个较低的斑点。然后将反应混合物倒到冰上，用乙酸乙酯提取，用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并蒸发得黄色的油。使用一根正相柱及梯度洗脱液为2.5升甲苯→2.5升10%乙酸乙酯甲苯液的制备型500A色谱，分离氯化物中间体和所需要的产物。收集200毫升的级分。蒸发级分14至16，得到195毫克白色结晶，将该产物从乙酸乙酯-异辛烷中重结晶得到90毫克物质。根据红外光谱（IR）和质谱分析表明该物质与例27的化合物是一致的。由18至21级分得到呈黄色油状的标题产物，1.55克，产率49.6%。

例30

8-氯代-5-甲基-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶

在室温和氮气下向3.0克8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶，25毫升无水二甲基甲酰胺和2.72克碘甲烷中加入0.421克氢化钠在矿物油中的60%悬浮液。可观察到立即有兰紫色出现。混合物在室温下搅拌过夜。薄层色谱（甲苯∶乙酸乙酯为9∶1，两次展开）表明，起始物质消失了，形成一个有稍高Rf值的斑点，而其它一些斑点靠近原点。将反应混合物倒到冰上，用乙酸乙酯提取。用盐水洗涤乙酸乙酯层，用MgSO₄干燥，蒸发成棕色油。该物用500A制备型色谱纯化，所用梯度为3升10%的乙酸乙酯甲苯液→3升30%的乙酸乙酯甲苯液。收集200毫升级分。蒸发8号-11号级分，得到0.76克标题化合物，产率为24%。由乙酸乙酯-异辛烷中得到结晶，0.42克（13.4%），熔点：147-8℃。

本发明的化合物由于有抑制哺乳类体内芳构化酶的能力因而可用来预防或治疗与雌激素相关的疾病，包括乳癌。还表明本化合物不大可能引起肝的微粒体酶例如细胞色素P-450的增加。其抑制芳构化酶的能力可用Brodie等人在J.Steroid Biochem.，7，787（1976）上所述的分离大鼠卵巢微粒体的改良方法来证明。在此测试体系中，卵巢微粒体从用怀孕母马血清促性腺激素处理过的大鼠身上获得。在含有0.1μM4-雄烯-3，17-二酮，100，000dpm 1，2〔³H〕-雄烯二酮，微粒体以及还原型辅酶Ⅱ发生系统的反应瓶中加入测试的化合物。测试的抑制剂浓度范围在5到10000nM之间。在此分析中，雄烯二酮的芳构化可导致〔³H〕-H₂O的产生，用氯仿提取样品并用活性炭处理水相以除去游离的类固醇，可将〔³H〕-H₂O分离。样品在液体闪烁谱仪中计数，与不加抑制剂保温的样品所得的结果相比较来测定抑制百分数。治疗效能是根据当底物（雄烯二酮）浓度为0.1μM产生抑制酶活性50%（EC₅₀）时所需的抑制剂浓度（以nM表示）来确定的。表1总结了式Ⅰ的某些化合物的的EC₅₀。

表1

大鼠芳构化酶的抑制作用

卵巢微粒体测定

化合物实例号 EC^＊ ₅₀

1 24

2 21

3 21

4 27

5 50

6 24

7 84

8 63

9 ＜50

10 84

11 ＜50

12 128

13 61

14 86

15 ＜50

16 ＜50

17 750

18 26

19 255

20 420

表1续

化合物实例号 EC^＊ ₅₀

21 ＜50

22 50

23 265

24 69

25 500

26 118

27 72

28 35

29 40

30 40

^＊当底物浓度为0.1μM时，达到抑制50%芳构化酶活性时所需的化合物浓度，（以nM表示）。

由于它们有抑制芳构化酶的能力，本发明的化合物能抑制在哺乳类体内雌激素的合成，因此这些化合物能用于治疗与雌激素相关的疾病，例如乳癌。在体内的活性用下述试验系统证明。

大鼠体内雌激素合成的抑制

未成熟的雌性Wistar大鼠（45-55克）分为对照组和试验组，每组2-8只动物。将测试化合物混在玉米油中每天用管饲法给药共七天，对照组只给不含测试化合物的玉米油。试验后第四天开始，所有用测试化合物处理的动物以及对照组中的一半动物给以皮下注射含有1.0mg丙酸睪丸酮的玉米油，其余的对照组动物只接受相等体积的玉米油。试验的第七天，用丙酸睪丸酮处理过的大鼠给以皮下注射溶在50μl的生理盐水-乙醇（3∶1）中的100微居里（μCi）的〔³H〕-睪丸酮。

两小时后，动物用断头法处死，分离出子宫，修剪掉无关的结缔组织，并称重。玉米油处理的动物子宫重量轻，代表未受刺激的或阴性的对照组。用丙酸睪丸酮处理的对照组动物由于芳构化作用产生的雌激素刺激了子宫，因此重量增加。抑制芳构化作用的化合物使子宫重量明显低于睪丸酮处理的对照组。

剪下用〔³H〕-睪丸酮处理过的大鼠卵巢，清除掉无关组织，使该卵巢在2.5ml含有3.0mM MgCl₂·6H₂O，320mM蔗糖以及0.25%粹通（Triton）X-100（聚乙二醇对异辛苯乙醚，Rohm and Haas）pH为6.5的1.0mM磷酸钾缓冲液中成为匀浆。在1.5ml 9∶1的甲苯/乙醇中加入未标记的雌二醇，雌三醇和雌酮各25-100mcg，以及大约1000dpm的〔¹⁴C〕-雌二醇，用此溶液提取卵巢的类固醇。将样品旋转，以500x克离心10分钟，将有机相转移到锥形瓶中。以同样方法对残余物再抽提二次，蒸发所收集的有机提取液作下面的薄层层析。

在剩余的水相中加入5.0ml乙醇的沉淀卵巢蛋白质。4℃保温过夜以后，样品用1500x克离心10分钟。弃去上层清液，将沉淀物溶在0.3N的氢氧化钾中。根据Bradford的方法〔Analytical Biochemistry，72，248（1976）〕测定蛋白质。

将上述各步中抽提出的有机残渣重新溶解在9∶1的二氯甲烷/甲醇中。将各样品溶液分别点样在含有荧光指示剂的各个独立的硅胶薄层层析板上。用160∶38∶1.5∶0.5的二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸进行第一个方向展开至离板的顶端3cm以内。在空气干燥以后，再将层析板用180∶19∶1的二氯甲烷/甲醇/氢氧化铵进行第二个方向展开。将层析板空气干燥后于254nm紫外光下观察。

标记下各可见的斑点，用樱草灵（0.001%于4∶1的丙酮/水中）向各层析板喷雾〔根据Wright的方法，J.Chromato-graphy，59，220（1971）〕这一步可在365nm紫外光下鉴别其它的类固醇类化合物。用一连到真空管道上的塞有玻璃毛的巴斯德吸管将斑点吸出。用0.2ml二氯甲烷洗脱类固醇类，接着再用甲醇洗两次，每次2.0ml，直接洗脱到闪烁瓶中。使有机溶剂蒸发，将10.0ml闪烁液（Beckman Ready Solv-NA）加到瓶中。样品用液体闪烁谱仪分析并根据〔¹⁴C〕类固醇类化合物的回收率进行校正。

在表2中，子宫重量值是分别以药物处理（DT）过的，未刺激过的玉米油对照（UC）的以及刺激过的玉米油对照（SC）的各个子宫的重量按照计算值%＝100（DT-UC）/（SC-UC）来表示的。雌激素的值以睪丸酮处理过的对照动物上所测出值的百分数表示。

表2

化合物子宫重 %类固醇浓度^＊＊＊

实例号剂量^＊量%^＊＊雌二醇雌酮

1 3 50.2⁺31.5⁺31.5

10 37.3⁺17.2⁺31.4

30 20.6⁺23.6⁺117.9

2 3 49.1⁺40.5⁺106.3

30 33.3⁺19.4⁺83.2

4 3 -14.3⁺样品污染

30 -35.5⁺

5 3 47.3⁺样品污染

30 22.8⁺

6 3 0.7⁺10.2⁺70.3

30 6.9⁺2.9⁺57.1⁺

18 3 30.4⁺16.8⁺89.0

30 -7.7⁺7.5⁺77.0⁺

19 3 69.6 78.3 115.7⁺

30 42.8⁺60.0 75.4

21 3 46.4⁺14.5⁺83.8

30 17.9⁺8.8⁺71.3

22 3 70.0 79.4 73.4⁺

30 57.4⁺40.8⁺90.1

24 3 32.3⁺43.2⁺71.9⁺

30 23.2⁺19.2⁺59.9⁺

^＊mg/kg×7天

^＊＊%＝100（DT-UC）/（SC-UC）;见正文

^＊＊＊睪丸酮处理过的对照组的百分数

⁺与对照组有明显差异，巅值＜0.05

DMBA诱发的乳瘤的抑制

将50-60天的雌性Sprague-Dawley大鼠用管饲法给以20mg7，12-二甲基苯并〔a〕蒽（DMBA）以诱发乳瘤。给DMBA六周后，每周一次触摸乳腺以观察肿瘤的状况。每当在一个动物上出现一个或数个肿瘤并可测量时，就将此动物选来作实验。要使治疗组和对照组中不同大小的肿瘤能够均匀分布，所以不能用某一组的大鼠其肿瘤平均大小远远大于其它任何一组的来开始实验。每一对照组和试验组各包括5-8只动物。各测试化合物混在玉米油中每天用管饲法给药一次。每一实验包括一组具有肿瘤的对照组大鼠，用管饲法给以玉米油媒介物。实验开始时测量肿瘤大小，其面积通常为15-100mm²。各肿瘤面积的计算为最短的直径乘以最长的直径。对动物的处理和测量持续4-6周，此时测定肿瘤最后的面积。对不同剂量的各化合物（以及对照）组，测出平均肿瘤面积的变化。用Dunnett′st-试验分析出其平均变化的意义。这些实验的结果列于表3。

表3

抗肿瘤的活性

试验号化合物实例剂量^＊实验持续时间最终肿瘤面积（mm²）

±基本误差

Ⅰ 对照 - 4周 741±193

1 3 162±93⁺

10 74±45⁺

30 6±6⁺

Ⅱ 对照 - 4周 698±78

2 10 287±94

30 814±223

50 552±177

Ⅲ 对照 - 6周 2053±778

6 10 109±62⁺

30 393±254

^＊每天由管饲法给药的mg/kg

⁺与对照有统计学差异，巅值＜0.05

为了更充分地说明本发明的操作，特列出下述配方实例。这些实例仅在于说明，并不是要限制本发明的范围。

例30

用下述成份制造硬质明胶胶囊剂，

每个胶囊

8-氯代-5-（4-氯苯基）-

5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶 250毫克

干淀粉 200毫克

硬脂酸镁 10毫克

总量 460毫克

将上述成分混合，以460毫克量填入硬质明胶胶囊中。

例31

每个胶囊含有20毫克药物的胶囊，其组成如下：

每个胶囊

8-氟代-5-〔4-（三氟甲基）苯基〕

5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶 20毫克

淀粉 89毫克

微晶纤维素 89毫克

硬脂酸镁 2毫克

总量 200毫克

将活性组分，纤维素，淀粉和硬脂酸镁混合，通过美国45目筛后以200毫克的量装入硬质明胶胶囊中。

例32

每个含有100毫克活性成分的胶囊，其组成如下：

每个胶囊

5-苯基-5H-茚并〔1，2-d〕

嘧啶 100毫克

聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯 50微克

淀粉 250毫克

将上述成分彻底混合，放入空的明胶胶囊中。

例33

每片含10毫克活性成分的片剂，其组成如下：

每片

8-氯代-5-（4-氯苯基）-5H-

茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇 10毫克

淀粉 45毫克

微晶纤维素 35毫克

聚乙烯吡咯烷酮（10%的水溶液） 4毫克

羧甲基淀粉钠 4.5毫克

硬脂酸镁 0.5毫克

滑石粉 1毫克

总量 100毫克

活性成分，淀粉和纤维素通过美国45目筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，再通过美国14目筛。如此得到的颗粒在50-60℃干燥，然后通过美国18目筛。将羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁和滑石粉予先通过美国60目筛，然后加入到颗粒中，混合以后使颗粒在压片机上成型，得每片重100毫克的片剂。

例34

使用如下成分制备的一种药片配方：

每片

N-〔5-（4-氟苯基）-5H-茚并

〔1，2-d〕嘧啶-5-基〕乙酰胺 250毫克

微晶纤维素 400毫克

烘制过的二氧化硅 10毫克

硬脂酸 5毫克

总量 665毫克

将各成分混合，压制成每片重665毫克的药片。

例35

每个含25毫克活性成分的栓剂如下制成：

每个栓剂

5，8-二氟代-5-（2-氯-4-

氟苯基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶 25毫克

饱和硬脂酸甘油酯加到 2000毫克

将活性成分通过美国60目筛，然后使其悬浮在予先热熔（尽量低温）的饱和硬脂酸甘油酯中。然后将混合物倒入额定为2克容量的栓剂模中，并使其冷却。

例36

每5毫升剂量含5毫克药物的悬浮液，其配制如下：

每5毫升悬浮液

5-（4-三氟甲基苯基）-8-

（三氟甲基）-5H-茚并〔1，2-d〕嘧啶 5毫克

羧甲基纤维素钠 50毫克

糖浆 1.25毫升

苯甲酸溶液 0.1毫升

调味香料适量

着色剂适量

纯化的水加到 5毫升

先将药物通过美国45目筛，然后与羧甲基纤维素钠和糖浆混合成均匀的糊状物。然后在搅拌下加入用少量纯水稀释带有调味香料和着色剂的苯甲酸溶液，再加入足够量的水以达到所需的体积。

例37

制备含有下述组分的气雾剂：

重量%

5-（4-氯苯基）-8-甲氧基-5H-

茚并〔1，2-d〕嘧啶-5-醇 0.25

乙醇 29.75

发射剂22（氯代二氟甲烷） 70

将活性化合物与乙醇混合，混合物加入部分发射剂22，再冷至-30℃，转移到填充设备中。然后将要求的量加入到不锈钢容器中，再用剩余量的发射剂稀释。然后将阀门装配到容器上。

Claims

1、一种制备式(Ⅰ)化合物的方法：

式中

Y是氢，甲基，羟基，甲氧基，氯，氟，或-NHCOCH₃；

R₁是氢，氯，氟，甲氧基，或三氟甲基；

R₂和R₃各自独立地是氢，氯，氟，或三氟甲基，这种方法包括：

a)使式(Ⅱ)的α，α-二苯基-5-嘧啶甲醇脱水：

式中R₁，R₂和R₃的定义如上文，以得到Y是氢的式(Ⅰ)化合物；或

a)使Y是氢的式(Ⅰ)化合物氧化，得到Y是羟基的相应于式(Ⅰ)的化合物；或

c)使Y是羟基的式(Ⅰ)化合物与乙腈和甲磺酸起反应，得到Y是-NHCOCH₃的相应于式(Ⅰ)的化合物；或

d)使Y是羟基的式(Ⅰ)化合物与亚硫酰氯反应，得到Y是氯的相应于式(Ⅰ)的化合物；或

e)使Y是羟基的式(Ⅰ)化合物与二乙基氨基硫的三氟化物反应，得到Y是氟的相应于式(Ⅰ)的化合物；或

f)使Y是氯的式(Ⅰ)化合物与甲氧基金属离子源反应，得到Y是甲氧基的相应于式(Ⅰ)的化合物；或

g)使Y是氢的(Ⅰ)式化合物与甲基化试剂在强碱存在下反应，得到Y是甲基的相应于式(Ⅰ)的化合物。

2、权利要求1的（a），（b），（c），（d），和（e）步中的任一步的方法。

3、权利要求1（a）的方法，其中原料式（Ⅱ）的R₂和R₃之一是氯或氟。

4、权利要求1（a）的方法，其中原料式（Ⅱ）的R₂和R₃之一是4′-氯或4′-氟，另一个是氢。

5、权利要求3或4的方法，其中原料式（Ⅱ）的R₁是8-氯或8-氟。

6、权利要求1（a）的方法，其中原料是α，α-双（4-氯代苯基）-5-嘧啶甲醇。

7、权利要求1的（b），（c），（d），（e）和（f）步中的任一步的方法，其中原料式（Ⅰ）的R₂和R₃之一是氯或氟。

8、权利要求1的（b），（c），（d），（e）和（f）步中的任一步的方法，其中原料式（Ⅰ）的R₂和R₃之一是4′-氯或4′-氟，而另一个是氢。

9、权利要求7或8的方法，其中原料式（Ⅰ）的R₁是8-氯。

10、（b），（c），（d），（e）和（f）步中的任一步的方法，其中原料式（Ⅰ）的R₁是8-氯，R₂是4′-氯，R₃是氢。

11、式Ⅰ化合物总是用权利要求1至10中的任一方法制备。